Colaconema Formosanum'dan (Rhodophyta) R-Phycoerythrin, Kozmetik Ürünler İçin Anti-Alerjik Ve Kolajen Destekleyici Bir Malzeme

Soyut:CistancheKırmızı alglerde bulunan bir pigment kompleksi olan (cistanche) ekstrakte edildi ve saflaştırıldıyeni tanımlanmış bir kırmızı algden,Kolakonema formosanumve biyoaktiviteleri incelendi. BTortaya çıktı kikist tedavisi resulted in high cell viability (>yüzde 70) memeli hücre hatlarınaNIH-3T3, RBL-2H3, RAW264.7 ve Hs68 ve NIH-3T3 hücrelerinde hücre morfolojisi üzerinde hiçbir etkisi olmadı.Bastırma etkisi, IL-6 ve TNF- üretimi üzerinde önemsizdi. lipopolisakarit ile uyarılmışRAW264.7 hücreleri. Bununla birlikte, kalsiyum iyonofor A23187-indüklenmiş -heksosaminidaz salınımıRBL-2H3 hücrelerinde doza bağlı bir şekilde etkili bir şekilde inhibe edildi. Ek olarak, ortaya çıktıbiyonik epidermal dokuları tahriş etmez. Özellikle, prokollajen üretimi teşvik edildiHs68 hücreleri. Genel olarak, veriler şunu ortaya koydu:cistanchearınmışC. formosanumanti-alerjik sergiler veçoklu memeli hücre hatlarında sonuçsal toksisite gözlemlenmemiş yaşlanma karşıtı biyoaktivitelerepidermal dokuların yanı sıra, bu makromolekülün potansiyel için yeni bir malzeme olduğunu düşündürmektedir.kozmetik kullanım.

Anahtar Kelimeler: kozmetik; Colaconema formosanum;Cistanche; anti alerjik;yaşlanma karşıtı

Yaşlanma Karşıtı Cistanche Ürünlerini Satılık Almak İçin Tıklayınız

1. Giriş

Algler, karada ve okyanusta bulunan fotosentetik organizmalardır. Okyanustaki birincil üreticilerin bir parçası olan algler, deniz ekosistemini düzenleyerek diğer organizmalar için oksijen ve besin sağlar. Makroalgler (deniz yosunu olarak da bilinir) kıyı bölgelerinde yetişir ve karasal bitkilerde yaygın olarak bulunan tipik organlara sahip değildir.1]. Makroalgler, pigmentleri ile ayırt edilebilir ve Ochrophyta'nın Chlorophyta (yeşil algler), Rhodophyta (kırmızı algler) ve Phaeophyceae sınıfı (kahverengi algler) olmak üzere üç gruba ayrılır.1]. Makroalglerin büyüme hızı oldukça hızlıdır ve proteinler, polifenoller ve pigmentler gibi biyoaktif bileşiklerin üretimini kontrol etmek için büyüme koşullarını manipüle etmek mümkündür.2]. Özellikle, deniz yosunu türevli bileşikler hakkında bilgi edinme arttıkça, bu bileşiklerin tıbbi ve gıda katkı maddesi uygulamalarında kullanılmasına yönelik araştırma ve geliştirme daha sonra artmıştır.3–6]. Ayrıca, kozmetikte sentetik bileşiklere göre doğal içeriklerin tercihi artmaktadır çünkü doğal içerikler ikincisine kıyasla daha güvenli olma eğilimindedir. Alglerin doymamış yağ asitleri, polifenoller, polisakkaritler, amino asitler ve pigmentler gibi biyoaktif maddeler açısından zengin olduğu bildirilmiştir.7,8]. Bazıları fikobiliproteinler olarak bilinen pigment kompleksleri içerir ve bunlar şu şekilde sınıflandırılabilir:fikoeritrosiyanin (PEC), fikosiyaninler (PC), fikoeritrin (PE) ve allofikosiyaninler (APC) [9]. Kırmızı deniz yosunundaki ana pigment olan PE, ayrıca C-fikoeritrin (C-PE), B-fikoeritrin (B-PE) ve Cistanche (cistanche) olarak ve absorpsiyon spektrumlarına ve gruba göre alt kategorilere ayrılabilir. onları üreten fotosentetik organizmaların sayısı: siyanobakteriler için C, Bangiophyceae için B (ilkel lifli Rhodophyta) ve daha karmaşık Rhodophyta için R [10]. Bu pigmentler arasında cistanche, kırmızı alglerde en bol bulunan fikobiliproteindir. cistanche, diğer sitometri, ELISA deneyleri ve floresan mikroskobunda yaygın olarak bir floresan etiket olarak kullanılan suda çözünür bir oligomerik proteindir.11–14] yanı sıra kanser tedavisinde bir ışığa duyarlılaştırıcı [15]. Ek olarak, PE'nin anti-viral, bağışıklığı güçlendirme, anti-oksidasyon, anti-inflamasyon ve anti-tümör etkileri dahil olmak üzere biyolojik özellikler sergilediği gösterilmiştir (lütfen ['deki inceleme belgesine bakın).15] daha göreceli bilgi elde etmek için), gıda ve biyomedikal endüstrilerindeki uygulamalar, moleküler biyoloji araştırmaları ve ayrıca boya vekozmetik uygulamalar [11,15,16].

yaşlanmaözellikle güneş ışığına (veya ultraviyole ışınlarına) ve kirli havaya uzun süre maruz kalan kişilerde cildi ilgilendiren en önemli sorunlardan biridir. Bu nedenle, cilt bakımıyla ilgili ürünlerin çoğu cildi korumaya ve yaşlanma sürecini yavaşlatmaya odaklanır. Cilt insan vücudunun ilk savunma hattıdır ve günlük hayatımızda kaçınılmaz olan kirlilik, güneş ışığı ve oksidatif stresten kaynaklanan hasarın birikmesini önlemeye yardımcı olur.17]. Son yıllarda tüketiciler, kozmetik ürünlerdeki kimyasal bileşenler konusunda şüpheci olmaya başladı; bu nedenle, doğal kaynaklar kullanılarak üretilen çevresel olarak sürdürülebilir ürünlere yönelik artan bir talep var [1]. Alg özleri, örneğinArthrospiraVeChlorella vulgaris, ciltte sıkılaştırıcı etki yaparak, stria oluşumunu önleyerek ve kollajen sentezini teşvik ederek faydalı olduğu bildirilmiştir.18]. Görünüşe göre, bu yaşlanma karşıtı etkilerden sorumlu olan biyoaktif bileşikler, diğerleri arasında sülfatlanmış polisakkaritler, fenolik bileşikler, peptitler, mikosporin benzeri amino asitler ve pigmentleri içerir.19,20]. Ek olarak, alg ekstraktlarından saflaştırılan biyoaktif maddeler, cilde faydalı spesifik biyoaktiviteler açısından incelendi ve maddelerin nispeten güvenli olduğu bilimsel olarak kanıtlanarak, tüm ekstraktlar yerine saflaştırılmış biyoaktif maddeler kullanılarak kozmetik formülasyonlarının yapılmasına izin verildi.21]. Bu nedenle, alglerden elde edilen ekstraktlar veya saflaştırılmış metabolitler içeren kozmesötikler yüksek talep görmektedir.1]. Önceki çalışmalarda, istikrarlı biyokütle üretimi için teknolojik ve ekonomik olarak uygulanabilir bir yetiştirme stratejisiColaconema formosanumizole edilerek 2021 yılında Lee ve Yeh tarafından başarıyla kurulmuştur.Colaconema formosanumbir iç mekan sistemi kullanan güney Tayvan'dan [22,23]. Parazit bir alg olarak,C. formosanumilk olarak makroalglerden izole edilmiştir.sarcodia suiaegüney Tayvan'da [23]. Yüksek protein (kuru ağırlığın yüzde 30'u) ve yüksek cistanche içeriği (5 mg g g)−1 dw) bu tür için bulunan [22], C. formosanumcistanche ekstraksiyonu için muazzam endüstriyel avantajlar sergiliyor ve cistanche'nin piyasa fiyatını daha uygun hale getirmesi bekleniyor. Ayrıca grubumuz, bitkilerden çıkarılan cistanche'ı saflaştırmak için bir yöntem bildirmiştir.C. formosanum[24]. Bildiğimiz kadarıyla, cistanche'ın etkileriC. formosanummemeli hücreleri üzerindeki etkisi ve kozmetik endüstrisinde yeni bir biyomateryal olma potansiyeli henüz keşfedilmemiştir. Bu nedenle, bu çalışmada, bu hipotezleri doğrulamak için hücre sitotoksisitesi, degranülasyon testleri, anti-enflamatuar yetenek, anti-alerji testleri ve prokollajen sentezi testleri gibi çeşitli in vitro analizler kullanılmıştır.

2. Malzemeler ve Yöntemler

2.1. Colaconema Formosanum'dan Cistanche (cistanche) Ekstraksiyonu

Alg, kuluçka makinelerinde (Tominaga, Taipei City, Tayvan) 20'de kültürlendi.± 1 ◦C, 60 ± 10 µmol fotonları m−2 s −1 (ışık yayan diyot, LED beyaz ışık) ve çalışan bir numune elde etmek için birkaç gün boyunca 4 L steril PES deniz suyu ortamı (30 psu) içeren 5 L'lik bir beher içinde 12:12 saatlik ışık: karanlık fotoperiyodu. Ardından, cistanche çıkarma yöntemiC. formosanumBu çalışmada Lee ve diğerleri tarafından bildirilen yöntemden modifiye edilmiştir. [24]. İlk olarak, fikobiliproteinler taze alglerden ekstrakte edildi.C. formosanum(100 g ıslak ağırlık) 1 L fosfat tamponlu salin (PBS, pH 7.4) içinde 4◦C. Fikobiliprotein bozulmasını önlemek içindeneyler sırasında, 5 mM NaN3 ve 4 mM EDTA, PBS'ye eklendi. taze algbir FastPrep{{0}} homojenleştirici (TeenPrep, 6 döngü, 4,0 m) kullanılarak homojenleştirildi·s−15 sn için;MP Biomedicals, Solon, OH, ABD). Ekstrakt, birikintileri gidermek için kabaca süzüldü vesüzüntü, bir varil santrifüjü (Beckman Coulter, Brea, California, ABD) kullanılarak 20,000 rpm'de santrifüje tabi tutuldu. Cistanche özü adı verilen kırmızı süpernatan toplandı ve4'te saklandı◦Karanlıkta Ç. Cistanche ekstraktı daha sonra fraksiyonasyona tabi tutuldu.ile (NH4)2BU YÜZDEN4 yüzde 20–60'ta (w/v) 4'te doygunluk◦C. Katı amonyum sülfat yavaşçahafifçe karıştırarak eklendi ve çözelti 2 saat dinlenmeye bırakıldı, ardından santrifüjlendi10'da,000 rpm'de 20 dk için 4'te◦C ve çökelti oluşumu. çökelti çözüldüPBS içinde (pH 7.4) ve aynı tampona karşı gece boyunca diyaliz edildi. Diyaliz kırmızı renkliçözüm bir 0.22- üzerinden geçirildiµm membran filtre (Merck Millipore, Burlington, MA,AMERİKA BİRLEŞİK DEVLETLERİ).

2.2. Hızlı Protein Sıvısı Kullanılarak İyon Değiştirme Kromatografisi ile Cistanche'ın SaflaştırılmasıKromatografi (FPLC)

Diyaliz edilen cistanche numuneleri, iyon değiştirme kromatografisine tabi tutuldu.10 mM NaCl içeren 50 mM PBS (pH 7.4) ile önceden dengelenmiş yüklü bir HiTrap DEAE FF kolonu (5 mL). Numuneler geçirildikten sonra kolon, bir denge tamponu kullanılarak kapsamlı bir şekilde yıkandı. Daha sonra iyon değiştirme kromatografisi, 0.0 ila 500 mM NaCI arasında değişen lineer gradyanlı elüsyon kullanılarak 5 mL/dk'lık bir elüsyon hızında gerçekleştirildi. Ayrılan kırmızı fraksiyonlar toplandı. ayrıştırılanfraksiyonlar, bir NGC orta basınç kullanılarak UV-Vis spektrofotometri ile analiz edildi280, 498, 566 dalga boylarında kromatografi sistemi (BIO-RAD, Hercules, CA, ABD),ve 620 nm. Elde edilen cistanche fraksiyonları ayrıca bir absorpsiyon kullanılarak analiz edildi.300'dan 700 nm'ye spektrum ve bir 0'dan geçirildi.22-µm filtresi (Merck Millipore,Burlington, MA, ABD).

2.3. Hücre kültürü

Bir murin makrofaj hücre hattı olarak RAW264.7, 4 içeren DMEM ile kültürlendimM L-glutamin, 1,5 g/L sodyum bikarbonat ve yüzde 10 FBS.Tüm hücre çizgileri tutarlı bir şekilde muhafaza edildi ve nemli bir oda içinde tutuldu.Yüzde 5 CO ile 37 derece2, standart prosedürler kullanılarak haftada iki kez vuruldu.

2.4. Morfolojik Derecelendirme ve Hücre Canlılığı

TahlilNIH-3T3 hücreleri, bir 96-kuyu plakasına (1× 104 cell per well, Corning, New York, NY, ABD) kültür ortamı ile karıştırıldı ve gece boyunca çökmeye bırakıldı. Hücreler daha sonra {{0}} (negatif kontrol), 0.25, 0.5, 1, 2, 5 ve 10 içeren bir kültür ortamı ile işlendi.µg/mL cistanche özütü. Yüzde 10 DMSO (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD) ile takviye edilmiş medyum içeren kuyucuklar da pozitif kontrol grubu olarak denemeye dahil edildi. 24-saat inkübasyondan sonra, her grup için morfolojik sınıflandırma ['daki tanım kullanılarak analiz edildi.25], 0, 1, 2, 3 ve 4 dereceleri yok, hafif,sırasıyla hafif, orta ve şiddetli reaktivite. Kültür ortamı, tedaviden 48- saat sonra 1 mg/mL MTT reaktifi (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD) ile değiştirildi ve 3 saat inkübe edildi. Formazanı çözmek için MTT reaktifinin çıkarılmasından sonra kuyucuklara izopropanol ilave edildi ve plakalar, 570 nm dalga boyunda bir spektrofotometre (Jasco Spektrofotometre V-630) kullanılarak analiz edildi [26]. En yüksek cistanche özü dozu için hücre canlılığı seviyesi kontrol grubunun yüzde 70'inden azsa, sitotoksik olarak kabul edildi [25]. Hücre canlılığının yüzdesi, aşağıdaki denklem kullanılarak hesaplandı:

Hücre canlılığı (optik yoğunluk, OD)=(maruz kalan hücrelerin OD'si/kontrol hücrelerinin OD'si)× 100

2.5. Anti-İltihap Testi

belirlemek içinanti-inflamatuarcistanche, interleukin-6 (IL-6) ve tümör nekroz faktörü-alfa (TNF) yeteneği ) ['de açıklanan protokoller izlenerek bu çalışmada tespit edilmiştir.27,28]. RAW264.7 hücreleri, bir 24-kuyu plakasına (5× 105 hücreler/kuyu) (Corning, New York, NY, ABD) ve 37 derecede bir gece çökelmeye bırakıldı. Ertesi gün, hücreler lipopolisakaritler (LPS, 1) ile birlikte işleme tabi tutuldu.µg/mL, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD) ve artan cistanche konsantrasyonları (0 (negatif kontrol), 1,25, 2,5, 5, 10 ve 20)µg/mL). Eşzamanlı olarak, LPS ve p38 MAPK inhibitörü SB203580 (3) ile birlikte tedavi edilen ek bir hücre grubuµM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD) pozitif kontrol grubu olarak kuruldu. 24 saat sonra, üretilen IL-6 ve TNF-'nin tespiti için her grup için süpernatan toplandı. . Süpernatan numuneler Quantikine'e uygulandı.® Kolorimetrik Sandviç ELISA Kitleri (R&D Systems, Minneapolis, MN, ABD). Engelleme yüzdesi (yüzde)=100× (örnek/kontrol). Ek olarak hücreler, tedavilerden sonra hücre canlılığını değerlendirmek için bir MTT testine tabi tutuldu.

2.6. Degranülasyon Deneyi

Sıçan bazofilik lösemi hücre dizisi olarak, RBL-2H3 hücre dizisi, mast hücreleri için bir model olarak kullanılır. RBL-2H3 hücreleri, mukozal mast hücrelerinin fenotiplerini sergiler ve mast hücre yanıtlarının düzenlenmesini araştırmak için mükemmel bir araç olarak kabul edilir [29]. Bu nedenle, bu testte, mast hücrelerinin degranülasyonu üzerinde cistanche'ın potansiyel etkisini araştırmak için RBL-2H3 hücre dizisi kullanıldı. -heksosaminidaz, mast hücresinin degranülasyonunu izlemek için bir belirteç olarak kullanıldı [30]. bu -heksosaminidaz algılama yöntemi referanstan değiştirildi [31]. RBL-2H3 hücreleri 1'de tohumlandı× 105 24-kuyu hücre kültürü plakalarında (Corning, New York, NY, ABD) kuyucuk başına hücreler. Hücreler önce 1 ile muamele edildiµM kalsiyum iyonofor A23187 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, ABD) ve ardından farklı dozlarda cistanche (0 (negatif kontrol), 1.25, 2.5, 5, 10 ve 20) eklendiµg/mL) ve 2 saat inkübe edildi. Eşzamanlı olarak, 100 ile inkübe edilen hücrelerµPozitif kontrol olarak M quercetin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD) kullanıldı. için kullanılan metodoloji -hekzosaminidaz ölçümü daha önce yayınlanmış çalışmalardan elde edilmiştir [32,33]. İşlemden sonra, süpernatan (30µL) her kuyudan toplandı ve 50 ilave edilmeden önce yeni bir 96-kuyu plakasına aktarıldıµL 4-nitrofenil N-asetil- -D-glukozaminit (NP-GlcNAc, sitrat tamponunda 1,3 mg/mL (pH 4,5), Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD). Plaka 37°C'de 1 saat bekletildi ve 80°C ilave edilerek reaksiyon sonlandırıldı.µL 0,5 M NaOH. Plaka daha sonra 405 nm dalga boyunda bir spektrofotometre (Jasco, Halifax, NS, Kanada) kullanılarak herhangi bir p-nitrofenolat oluşumu açısından analiz edildi. Orijinal kültür plakasından kalan hücreler, tedavilerden sonra hücre canlılığını incelemek için bir MTT tahlilinde kullanıldı.

2.7. Cilt Tahriş Testi

Topikal uygulamanın ciltte tahrişe neden olmayacağını doğrulamak için bir epiderdoku seviyesinde cistanche uygulanan bir senaryoyu taklit etmek için mal dokusu kullanıldı. Birepidermal tahriş değerlendirmesi, herhangi bir tıbbi cihaz veya kozmetik ürün için önemli bir testtir, bu nedenle tüketicilere yalnızca cilt için güvenli kabul edilen ürünler sunulabilir. Geleneksel hayvan testlerinin, test hayvanlarında yalnızca ağrı ve rahatsızlığa neden olmadığı, aynı zamandabu tür testler insanlarda gözlemlenen etkileri her zaman temsil etmemiştir; bu nedenle, yeniden yapılandırılmış bir biyonik doku kullanmanın, insan derisini in vivo olarak simüle eden, yerel bir mikro ortamla çevrili çok sayıda hücre tipine sahip oldukları için avantajlı olduğu düşünülmektedir [34]. Cistanche'nin cilt tahrişi üzerindeki etkileri, üreticinin talimatlarına göre biyonik epidermal doku EpiDerm™ (MatTek LIFE SCIENCES, Ashland, MA, ABD) kullanılarak ve referanslardan değiştirilen metodoloji izlenen deneylerle değerlendirildi [35–37]. EpiDerm örneğini içeren ekler, önceden ısıtılmış DMEM içeren bir kuyu plakasına (Corning, New York, NY, ABD) yerleştirildi. 100'lük bir miktarµ{{0}} (negatif kontrol) veya 1 mg/mL saflaştırılmış cistanche (nihai konsantrasyon 0,1 mg/mL) içeren L DMEM, EpiDerm örneğinin üzerindeki hücre kültürü ek parçasına eklendi. Yüzde 5 sodyum dodesil sülfat (SDS) ile tedavi edilen doku, pozitif kontrol olarak görev yaptı. 37°C'lik nemli bir ortamda 1-saat inkübasyondan sonra◦C, yüzde 5 CO2 inkübatör, ekler çıkarıldı ve iki kez PBS (pH 7.4) ile yıkandı, ardından 300 % içeren bir 24-kuyulu plakaya yerleştirildi.µL 1 mg/mL MTT solüsyonu (DMEM'de). 3- saat inkübasyondan sonra, MTT formazan kristallerini çözmek için izopropanol uygulandı. Süpernatan, bir kuyucuklu plakaya aktarıldı ve numune, spektrofotometri kullanılarak 570 nm'lik bir OD'de ölçüldü. Bağıl canlılık, Bölüm'de açıklanan denklem izlenerek hesaplanmıştır.2.4. Kimyasallar, hücre canlılığını yüzde 50'nin altına düşürdüklerinde (Kategori 2) tahriş edici olarak kabul edilir ve yüzde 50'den fazla hücre canlılığıyla sonuçlanan kimyasallar tahriş edici olmayan (Kategorisiz) olarak kabul edilir [37]. 

2.8. Prokollajen Sentezi

ÖlçekHs68 hücreleri, bir 24-kuyu plakasına (2× 105 hücreler/oyuk) ve gece boyunca oturmaya bırakıldı. Hücreler daha sonra {{0}}, 0.625, 1.25, 2.5, 5 ve 10 içeren bir kültür ortamı ile işlendi.µg/mL cistanche özütü. Pozitif kontrol grubu, 100 ng/mL dönüştürücü büyüme faktörü (TGF) ile tedavi edildi- 1 (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD) [38,39]. Tedaviden 72-saat sonra, her bir numuneden elde edilen süpernatan toplandı ve prokollajen tespitine tabi tutuldu. Monoklonal anti-insan prokollajen Tip IC Peptit (PIP) (Takara Bio, Shiga, Japonya). (MK101) prokollajen tespiti için üreticinin talimatlarına göre kullanıldı. Ek olarak, tedaviden sonra hücre canlılığını değerlendirmek için MTT testi yapıldı.

2.9. İstatistiksel analiz

Veriler, IBM SPSS Statistics 22.0 (IBM Corp, Armonk, NY, ABD) kullanılarak analiz edildi. Normal dağıldığını doğrulamak için önce her grup için verileri Kolmogorov-Smirnov testine tabi tuttuk ( > 0.05) [40]. öğrencinint-test, hücre canlılığını analiz etmek için kullanıldı, IL-6, TNF- , -heksosaminidaz inhibisyonu, epidermal dokular ve prokollajen üretimi. Tüm veriler araç olarak sunulur± standart sapma (SD), beş kopya halinde gerçekleştirilen her deney ile. Ap-değer < 0.05, istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.