2.6. Kaspaz-3 ve Kaspaz-6'ın İfadesi

Cistanche glikozidi ayrıca kalp ve karaciğer dokularındaki SOD aktivitesini artırabilir ve her dokudaki lipofuscin ve MDA içeriğini önemli ölçüde azaltabilir, çeşitli reaktif oksijen radikallerini (OH-, H₂O₂, vb.) etkili bir şekilde temizleyerek ve neden olduğu DNA hasarına karşı koruma sağlayabilir. OH radikalleri tarafından. Cistanche feniletanoid glikozitler, serbest radikalleri güçlü bir şekilde süpürme yeteneğine, C vitamininden daha yüksek bir indirgeme kabiliyetine sahiptir, sperm süspansiyonunda SOD aktivitesini geliştirir, MDA içeriğini azaltır ve sperm zarı işlevi üzerinde belirli bir koruyucu etkiye sahiptir. Cistanche polisakkaritleri, D-galaktozun neden olduğu deneysel olarak yaşlanmış farelerin eritrositlerinde ve akciğer dokularında SOD ve GSH-Px aktivitesini artırabilir, ayrıca akciğer ve plazmada MDA ve kollajen içeriğini azaltabilir ve elastin içeriğini artırabilir. DPPH üzerinde iyi bir temizleme etkisi, yaşlanmış farelerde hipoksi süresini uzatır, serumdaki SOD aktivitesini geliştirir ve deneysel olarak yaşlanmış farelerde akciğerin fizyolojik dejenerasyonunu geciktirir Hücresel morfolojik dejenerasyonla, deneyler Cistanche'nin iyi antioksidan yeteneğe sahip olduğunu göstermiştir. ve cilt yaşlanması hastalıklarını önleyen ve tedavi eden bir ilaç olma potansiyeline sahiptir. Aynı zamanda, Cistanche'deki ekinacoside, DPPH serbest radikallerini temizleme konusunda önemli bir yeteneğe sahiptir ve reaktif oksijen türlerini temizleme ve serbest radikal kaynaklı kollajen bozulmasını önleme yeteneğine sahiptir ve ayrıca timin serbest radikal anyon hasarı üzerinde iyi bir onarım etkisine sahiptir.

Antioksidan İçin Cistanche Tubulosa'yı Bilmek İçin Buraya Tıklayın

【Daha fazla bilgi için:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

TgAPP fareleri, kaspaz{{0}} gen ifadesinde (Şekil 8C1, H1) bir artış gösterdi ve bu, WT farelerinin hipokampüsüne kıyasla anlamlı ve yüzde 30'dan fazlaydı (Şekil 8H1; p < 0.05). Kaspaz-6 ifadesine gelince, transgenik ve transgenik olmayan fareler arasında hiçbir fark gözlenmedi (Şekil 8C2, H2).

Quercetin ve rutin tedavileri, hipokampustaki kaspaz{{0}} mRNA düzeylerini istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde düşürmeyi başardı (Şekil 8H1; p < 0.05), yaklaşık yüzde 17'lik engelleme yüzdeleri ve sırasıyla dişi ve erkek fareler için yüzde 27. Serebral kortekste, sadece erkeklerde rutin tedavisinde önemli farklılıklar gözlendi (Şekil 8C1; p < 0.05).

Kaspaz-6 hakkında, quercetin ve rutin tedavileri, kortekste veya hipokampüste istatistiksel olarak anlamlı herhangi bir etki göstermedi (Şekil 8C2, H2), ancak ikincisinde TgAPP erkeklerindeki Kaspaz-6, azalma (Şekil 8H2).

2.7. Enflamasyon Belirteçleri

Enflamatuar aracılar IL-1, TNF- ve IFN-'nin gen ekspresyonu için elde edilen sonuçlar Şekil 9'da gösterilmektedir.

TgAPP'de, WT farelerine kıyasla her iki cinsiyette de korteks ve hipokampusta IL{{0}} gen ifadesinde yaklaşık yüzde 20 oranında önemli bir artış oldu (Şekil 9C1, H1; p < 0,05). TNF- ile ilgili olarak, TgAPP'de daha yüksek mRNA seviyeleri gösterilmesine rağmen, bunlar WT farelerinde istatistiksel olarak anlamlı değildir (Şekil 9C2, H2). IFN- ile ilgili olarak, erkeklerde ifadesinde sadece kortekste istatistiksel olarak anlamlı olan yaklaşık yüzde 30'luk bir artış oldu (Şekil 9C3; p < 0.05).

Hem kadınlarda hem de erkeklerde quercetin ve rutin ile yapılan tedaviler, kontrol TgAPP farelerine kıyasla serebral korteks ve hipokampusta IL{{0}} ifadesini azaltabildi (Şekil 9C1, H1; p < {{8 }}.05), WT farelerininkine benzer değerler elde ediyor ve özellikle erkek farelerin hipokampuslarında daha düşük (Şekil 9H1; p < 0.05).

Her iki flavonoid muamelesinin IL{{0}} ifadesi üzerindeki genel etkisi, TNF- veya INF- ile gözlenmedi. Böylece, kuersetin tedavisi alan TgAPP erkeklerinde hipokampal TNF-'de (Şekil 9H2; p < 0.05) ve kortikal IFN- ifadesinde (Şekil 9C3; p < 0.05) önemli bir azalma görüldü.

2.8. Dejenere Nöronların ve Projeksiyonlarının Değerlendirilmesi

WT farelerine kıyasla, transgenik TgAPP farelerinin test edildiği yaşta hiçbir karakteristik nörodejenerasyon belirtisi gözlenmedi ve quercetin ve rutin ile yapılan tedaviler, TgAPP'ye kıyasla 4 hafta boyunca herhangi bir değişiklik göstermedi (Şekil S1, Ek veriler).

2.9. İyonotropik Glutamat Reseptörlerinin İfadesi

Kontrol TgAPP fareleri için elde edilen değerler ile WT fareleri için elde edilen değerler karşılaştırıldığında, reseptör ifadesinde önemli bir fark bulunmadı. Quercetin veya rutin tedavisi varlığında bu iyonotropik reseptörlerin ekspresyonu üzerinde de kayda değer bir etki olmamıştır (Tablo S5, Ek veriler).

3. Tartışma

Mevcut çalışmamızın amacı, nörodejenerasyon ve/veya bilişsel işlev üzerindeki etkilerinden bağımsız olarak, AD patogenezinin ilk aşamalarında iki flavonoidin, quercetin ve rutinin etkisini değerlendirmekti. Korteks ve hipokampus, AD'de en çok etkilenen beyin yapıları oldukları için analiz edilen beyin bölgeleriydi. Quercetin ve rutinin, bir AD hayvan modelinde, aktif bir bileşen içeren sağlıklı bir insan diyetinin alımını taklit etmek için iki flavonoidden birini içeren formüle edilmiş bir diyet yoluyla uygulandığı dikkate alınmalıdır.

Özellikle C57B6 faresindeki transgen APPswe, GSH/GSSG oranı, MDA seviyeleri, antioksidan enzim kapasitesi, APP ifadesi, BACE1 aktivitesi ve kaspaz-3 ve IL-1 ifadesi üzerinde önemli bir etki yaptı. İnsanlardaki APP mutasyonları genellikle tipik AD ile sonuçlanırken, bunlar ağırlıklı olarak APP transgenik farelerde yalnızca amiloid patolojisi ile bağlantılıdır ve transgenik farelerimiz TgAPP'de gözlemlenen hiçbir karakteristik belirti olmadığından belirgin bir nörodejenerasyon yoktur [14,15]. WT fareleri (Ek veriler, Şekil S1). Hipokampal nöronların 40 -6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile zıt boyaması, bu bileşik nükleik asitler için bir floresan boya olduğundan, nükleer morfolojiyi gözlemlememizi sağladı. Tipik olarak apoptotik olan parçalanmış veya lobüler çekirdekler gözlemlemedik; WT bölümleriyle ilgili olarak kontrol transgenik çizgi TgAPP'nin hipokampal histolojik bölümlerini karşılaştırırken dikkate değer herhangi bir farklılık gözlemlemedik; kontrol TgAPP fareleri ile ilgili olarak quercetin ve rutin tedavileri arasında da herhangi bir fark gözlemlemedik.

Analiz edilecek AD biyokimyasal özellikleri panelinde, GSH seviyelerinin tükenmesi AD'deki en önemli erken biyokimyasal belirteçlerden birini temsil ettiğinden, öncelikle iki flavonoid diyetinden herhangi birinde GSH/GSSG oranını belirlemeye odaklandık [16,17 ] ve patogenezi ve hastalık ilerlemesi sırasında gözlenmiştir. Beyin GSH düzeylerinin [18] ve daha yakın zamanda kan GSH düzeylerinin [19] ölçülmesi, AD'nin erken evreleri için tanısal belirteçler olarak ümit verici olmuştur. Ayrıca, endojen GSH depolarını kendileri veya öncülleri tarafından desteklemek için de çaba gösterilmiştir [20-22]. Çalışmamızda, WT hayvanlarıyla ilgili TgAPP farelerinde, hem erkek hem de dişilerde ve beynin her iki bölgesinde hücresel indirgeme gücünde (GSH/GSSG) bir düşüş gözlendi. Hem WT hem de TgAPP farelerinin korteks ve hipokampüsünde, GSH/GSSG oranı erkeklerde dişilerden daha düşüktü. Quercetin ve rutin diyetler, tedavi edilmemiş TgAPP farelerine kıyasla GSH/GSSG oranını önemli ölçüde artırdı ve bu artış hipokampüste daha belirgindi. Erkeklerde quercetin veya rutin tedavisi sonrası GSH ve GSSG düzeylerindeki ve GSH/GSSG oranındaki değişimler redoks gücünü artırmaya bağlı olarak kadınlara göre daha belirgindi. Belirlemelerimizden elde edilen sonuçlar, bir yandan makromoleküllerin oksidatif hasarına duyarlılıkta Tg2576 farelerinde cinsiyete bağlı farklılıkların altında yatan önemli bir temeli ortaya çıkarabilir, çünkü glutatyon sistemi çoklu biyolojik fonksiyonlarda çok yönlü bir indirgeyicidir ve önleyici etkide Flavonoid diyetler ise fizyolojik durumunu geri kazanmada. Bu tartışma boyunca göreceğimiz gibi, GSH/GSSG oranındaki artışı, TgAPP farelerinde gözlemlenen etki dizisini açıklayabilecek ana eksen olarak belirledik.

Son zamanlarda, GSH/GSSG oranının, basitçe bir redoks tamponu olarak işlev görmek yerine, ana düzenleyici mekanizma olarak işlev göreceği ve proteinlerin, hücrenin tiyol-disülfür dengesini sıkı bir şekilde kontrol ederek doğal konformasyonlarına ve işlevselliklerine ulaşmalarına izin vereceği öne sürülmüştür. proteom. Kısacası, glutatyon sistemi, sağlıklı bir proteomu korumak için gerekli olarak ortaya çıkar ve glutatyon redoks homeostazının bozulmasının (yani, genetik veya farmakolojik olarak) otofajinin etkinliğindeki bozukluklar nedeniyle protein agregasyonunu arttırdığını gösterir [23]. Bu nedenle, glutatyon redoks homeostazını sürdürmeyi amaçlayan stratejiler, AD gibi protein agregasyonu ile ilişkili hastalıklarda terapötik potansiyele sahip olabilir. AD'nin patogenezinde yer alan ubikuitin-proteazom yıkım mekanizması, proteomun korunmasıyla yakından ilişkilidir. Proteazom, oksitlenmiş ve kümelenmiş proteinlerin katabolizması dahil olmak üzere nöronal homeostazın sürdürülmesinde çok önemli olan çoklu substratları seçici olarak bozar. BACE1 ubikuitinasyona uğrar ve ubikuitin-proteazom yolunun bloke edilmesinin BACE1 bozulmasını önleyeceği ve sonuç olarak BACE1 enzimatik aktivitesinin artmasına, daha fazla bölünme ürünü C99'a ve hem A 1-40 hem de A {'da artışa yol açacağı gösterilmiştir. {8}} nöronal ve nöronal olmayan hücrelerde [10]. Önceki çalışmalarımız, hem flavonoidlerin, quercetin hem de rutinin, nöroblastoma hücrelerinde proteazom fonksiyonunun modülasyonu ile ilişkili çeşitli sinyal yollarını ve moleküler ağları etkilediğini bulmuştur [9]. Ek olarak, indirgenmiş glutatyon (GSH) ile desteklenmiş nöronların proteazom aktivitesini geri kazandığı ve agregat oluşumunu azalttığı gösterilmiştir [11], çünkü proteazom fonksiyonu redoks durumu tarafından düzenlenir [24]. Bu nedenle, bir quercetin veya rutin diyete sahip hayvanlar tarafından deneyimlenen GSH/GSSG oranındaki artış, daha önce ex vivo olarak gösterilen, quercetin ve rutin tarafından proteazomun modülasyonu ile tutarlıdır.

Daha önce bahsedildiği gibi, redoks dengesizliği, proteazom bozukluğuna yol açan agregatlar oluşturma ve biriktirme eğiliminde olan yüksek oranda oksidatif olarak modifiye edilmiş proteinlere yol açar [25]. Bu nedenle, oksidatif stresin AD patogenezindeki kritik rolü göz önüne alındığında, lipid peroksidasyonu (MDA seviyeleri) ve antioksidan enzimler dahil olmak üzere oksidatif stresin biyobelirteçleri, TgAPP ve WT farelerinde korteks ve hipokampüste değerlendirildi. SOD, CAT, GR ve GPx oksijen serbest radikallerine karşı etki gösteren ve vücuttaki serbest radikallerin metabolizmasını düzenleyen ve serbest radikal temizleme sisteminde rol oynayan, vücuttaki hücreleri lipid peroksidasyonundan koruyan en önemli antioksidan enzimlerdir. . Çalışmamızda, APP aşırı ekspresyonunun bir sonucu olarak, TgAPP farelerinde, WT farelerine kıyasla, CAT için istatistiksel olarak anlamlı olan, antioksidan enzim aktivitelerinde genel bir azalma gözlendi. Düşen GSH seviyeleri ile uyumlu olarak, lipid peroksidasyonu TgAPP farelerinde önemli ölçüde artmıştır. İnsan AD'sindeki oksidatif stresin kaynağı oldukça karmaşık ve çok faktörlü iken, farelerde geliştirilen amiloid patolojisi, beyinde oksidatif stresin artmasına yol açan patolojik süreci başlatmak için yeterli görünmektedir [26]. Rutin ile tedavi edilen hayvanlar, hem erkeklerde hem de dişilerde kortekste CAT aktivitesinde ve hipokampüste GR aktivitesinde bir artış yaşadı. Sadece rutin ile tedavi edilen hayvanlar, hem erkeklerde hem de dişilerde korteks ve hipokampusta CAT ve GR gen ekspresyonunda ve dişi farelerin hipokampisinde GPx'te değişiklikler yaşadı. Bu bağlamda, birkaç doğal bileşiğin, proteazom ve redoks düzenlemesi arasındaki çapraz karışmayı etkilediği gösterilmiştir. Daha kesin olarak, quercetin, proteazom fonksiyonunun uyarılması yoluyla antioksidan özellikler sergileyen, oksidatif stres direncini artıran ve hücre ömrünü uzatan bilinen bir Nrf2 aktivatörüdür [27].

BACE1'in dokuya özgü ifadesi, normal APP işlemesi için kritiktir ve düzensizliği ifadesi, AD patogenezinde rol oynayabilir. BACE1 ağırlıklı olarak hipokampal nöronlarda, kortekste ve serebellar granüler tabakada eksprese edilir [10]. Daha önceki çalışmaların, İsveç mutant APP transgenik farelerinin kararlı bir durumda A'nın beyin seviyelerini önemli ölçüde artırdığını gösterdiğine dikkat edilmelidir [29], bu da BACE1'in AD patogenezinde amiloidojenik yolda önemli bir rol oynadığını ve iyi bir terapötik hedef olduğunu düşündürmektedir. AD tedavisi için. Çalışmamızda, farelerde A birikiminin azalmasına katkıda bulunabilecek şekilde, quercetin ve rutin tedavileri üzerine BACE1 aktivitesinde önemli bir azalma gözlemledik. Proteazom aktivitesinin geri kazanımını artırma hipotezine dayanarak, yalnızca enzim, quercetin ve rutinin BACE1 inhibitörleri olarak çalışmaktan daha fazlasının, GSH/GSSG oranındaki bir artışa bağlı olarak BACE1 aktivitesinde bir azalma uygulayabileceğini savunuyoruz. Bu anlamda, BACE1 inhibitörlerinin APPswe'nin -klevaj bölgesine (İsveç mutasyonu) hedeflenmesinin, plazma zarına ulaşmadan önce gerçekleştiği, APPwt'nin (Wild-type) ise hücre yüzeyinden kaynaklanan erken bir endozomda işlendiği bilinmektedir. Bu nedenle, APPwt'yi parçalayan BACE1 bazen APP işlenmeden önce hücre yüzeyindeki BACE1 inhibitörüne bağlanır, ancak APPswe'yi işleyen enzim değildir [30]. Bu nedenle, APPswe işlemenin anormal lokalizasyonu, BACE1 inhibitörleri olarak kuersetin ve rutinin gücünü önemli ölçüde azaltabilir. Bu nedenle, bu in vivo modelde BACE aktivitesinin azalmasının enzimin inhibisyonundan çok GSH/GSSG oranındaki artıştan kaynaklandığını destekleme eğilimindeyiz. Her durumda, azalmış BACE1 aktivitesi, TgAPP farelerinde -amiloid üretimini azaltmak için varsayılan bir girişim olarak yorumlanabilir. Hipokampusta quercetin ve rutinin BACE1 aktivitesinin zayıflaması üzerindeki en dikkat çekici etkisine gelince, korteksin hipokampustan önemli ölçüde daha yüksek nöron yoğunluğuna sahip olduğunu [31] ve AD patolojik fenotipindeki proteazomun seçici bozukluğunun korteks hipokampustan daha hassastır ve etkilenmiştir [32].

Tedavilerin BACE1 enzim aktivitesi üzerindeki etkisini belirledikten sonra ekspresyonunu değerlendirmekle ilgilendik. Merakla, WT farelerine kıyasla TgAPP fareleri arasında BACE1 ekspresyonunda anlamlı bir fark bulunmadı ve quercetin veya rutin tedavisi ile gözle görülür bir değişiklik gözlenmedi. Bu nedenle, BACE1 enzim aktivitesindeki artışın, ekspresyondaki artışla ilişkili olmadığı görülmektedir. Bu bağlamda Apelt ve ark. [14], 9 ila 13 aylık Tg2576 farelerinde kortikal BACE1 aktivitesinde bir artış bulurken, BACE1 proteini ve mRNA'nın ekspresyon seviyesinin yaşla değişmediğini bulmuşlardır. Ayrıca, çözünür amiloid A 1-42'den ziyade fibriler amiloid A 1-42'nin BACE1 protein ekspresyonunu yukarı regüle edebildiğini ve dolayısıyla amiloid izoformlarının oranındaki küçük modifikasyonların amiloid agrega konformasyonlarını ve hücre hasarını modüle edebileceğini destekleyen kanıtlar bulunmuştur. 33]. Bu nedenle, aktivitesinde bir artış olduğunu bulduğumuz BACE1 ekspresyonunda değişiklik olmaması, fare modelimiz TgAPP'de çözünür amiloid A 1-42'nin fibriler amiloid A 1-42 izoformu üzerindeki prevalansını açıklayabilir.

APP işlemede yer alan enzimlerin gen ekspresyonunun belirlenmesinin ardından, APP'nin amiloidojenik olmayan işlenmesinde yer alan -sekretaz enzimi üzerindeki quercetin ve rutin etkisini değerlendirdik. -sekretazın fizyolojik olarak en önemli yapısal izoformu olduğu için ADAM10'a odaklandık. ADAM10, sAPP ve C-terminal fragmanları (-CTF) [34,35] üretmek için A alanı içinde APP'yi bölerek nörotoksik oligomerik A plaklarının oluşumunu engeller. Çalışmamızda bulunan ADAM10 ifadesindeki değişiklikler istatistiksel olarak anlamlı olmasa da, WT farelerine göre TgAPP farelerinde ADAM10 ifadesinde hafif bir düşüş gözlendi. Ağırlıklı olarak rutin tedavisi, incelenen her iki beyin bölgesinde ADAM10 gen ekspresyonunu artırma eğilimi gösterdi. Postina ve ark. [36], bir AD fare modelinin hipokampüsünde vahşi tip ADAM10'un yukarı regülasyonunun sAPP sekresyonuna aracılık ederek A plak oluşumunun inhibisyonuna yol açtığını gösterdi. Quercetin'in etkisi, tedavi edilmeyenlere kıyasla hipokampusta -sekretazda (ADAM10 ve ADAM17) önemli bir artış gösteren alüminyum klorür kaynaklı AD sıçan modelinde incelenmiştir. Bu, quercetin'in -sekretaz genlerinin aktivasyonu yoluyla amiloidojenik olmayan yolu artırma potansiyeline sahip olduğunu gösterir [37]. Klinik öncesi veriler, beyin sAPP seviyelerini artırmanın AD ile ilişkili semptomları iyileştirmek ve sinaptik eksiklikleri azaltmak için potansiyel bir strateji olduğu hipotezini güçlendiriyor. ADAM10 ve BACE1, APP bölünmesi için rekabet eder, bu nedenle ADAM10 aktivitesini güçlendirmek, nörotoksik amiloid oluşumunu engelleyebilir. Ayrıca sAPP, stres JNK-sinyal yolunun aktivasyonunu önleyebilir, bu da proteazom bozulmasına yol açan NF-κB kaynaklı fosforilasyon aktivitesinin aktivasyonuna yol açar [38]. Bu nedenle, hastalıkla ilişkili protein agregalarının oluşumu ve birikmesi önemli ölçüde azalır ve hücresel proteazom aktivitesi artar, böylece proteostazın düzenlenmesinde sAPP'nin bir işlevi olduğuna dair kanıt sağlanır [39]. Ayrıca, sAPP'nin spesifik olarak glutamat AMPA reseptörü sentezini ve kaçakçılığını yukarı regüle ettiği gösterilmiştir [40]. Çalışmamızda, rutin tedavi üzerine ADAM10 ekspresyonundaki hafif artışın glutamaterjik sinaptik iletim üzerinde bir miktar etkisi olup olmadığını araştırdık. Ek veriler bölümünde gösterildiği gibi, bu iyonotropik reseptörün ekspresyonu üzerinde, muhtemelen AMPA reseptörünün yukarı regülasyonu için yeterli olmayan ADAM10 ekspresyonundaki zayıf bir artış nedeniyle, quercetin ve rutin diyetlerinde önemli bir etki gözlenmedi (Ek veriler , Şekil S2 ve Tablo S5).

In vitro çalışmaların çok çeşitli ADAM10 substratları gösterdiği [41] ve bu nedenle spesifik olmayan ADAM10- hedeflemesi ile elde edilen istenmeyen etkilerin kanser proliferasyonu, hücre adezyonu, ilerlemesi gibi durumlarda bulunabileceği göz önünde bulundurulmalıdır. T hücresi/NK hücresi öncüsü ve inflamasyon vb. [42]. Bu kısıtlamayı aşmak için çalışmamız, sAPP'nin daha fizyolojik olarak salınmasını teşvik etmeyi amaçlayan bir strateji önermektedir. Bu yaklaşım, sağlıklı bir insan diyetiyle tüketilen bir aktif bileşenin (quercetin veya rutin) uzun süreli alımına dayanabilir. Bununla birlikte, ADAM10'daki artışın flavonoid dozuna bağlı olup olmadığını ve potansiyel yararlı etkilerin varsayılan yan etkilerden ağır basıp basmadığını öğrenmek için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.

APPswe'nin ifadesine gelince, insan APP transgeninin fare genomuna eklenmesi, APPswe'nin doğumdan itibaren aşırı ifade edildiğini garanti etse de, APP mRNA ve protein hipokampal seviyelerinin hayvan gelişimi sırasında önemli dalgalanmalar gösterdiği, farelerde maksimum olduğu bildirilmiştir. asemptomatik (1-aylık) ve tam semptomatoloji ortaya çıktığında azalan [43]. Bu soruna rağmen, çalışmamızda hem kortekste hem de hipokampusta APP ifadesi, WT farelerininkine kıyasla önemli ölçüde daha yüksekti. Quercetin veya rutin ile daha fazla tedavi, beynin her iki bölgesinde hem erkek hem de dişi fareler için bu tür ifadeyi önemli ölçüde azaltabildi. Bu bulgular Augustin ve ark. [44], 4-aylık dişi TgAPP farelerinde kuersetin gibi flavonoller açısından zengin standartlaştırılmış bir Ginkgo biloba (Egb761) özütü üzerinde çalışmış ve APP mRNA ve protein düzeylerinin düştüğünü bulmuştur. Tg2576 farelerinde APP translasyonunun yukarı regülasyonunun prodromal ve erken semptomatik aşamalarda [45] meydana geldiği göz önüne alındığında, APP translasyonunun quercetin veya rutin tarafından restorasyonunun TgAPP farelerimizde ve muhtemelen erken dönemde gerçekleşmiş olması muhtemeldir. APP, BACE1 aktivitesi ve kaspaz{10}} aktivasyonunun kortikal ve hipokampal düzeylerinde azalmayla sonuçlanan semptomatik aşama.

Ayrıca, başka bir yerde, Tg2576 farelerinde (nöronal kayıp olmadığında), hafıza bozukluğunun başlangıcında, bizim çalışmamızda da bulunduğu gibi, hipokampusta kaspaz-3 aktivasyonunda bir artış olduğu [46] bildirilmiştir. hücre dışı amiloid birikiminden önce dendritik dikenlerde bir azalma ile birlikte [46]. Sinir sistemindeki kaspazların nöron ölümü olmaksızın apoptotik olmayan rollerini destekleyen kanıtlar vardır [47] ve kaspaz-3 aktivitesi, kalsinörin seviyelerini yükseltebileceği dendritik dikenlerde lokalize edilmiştir. Buna karşılık, kalsinörin tarafından tetiklenen AMPA benzeri reseptörlerin GluR1 alt biriminin defosforilasyonunun, postsinaptik işlev bozukluğuna neden olduğu düşünülmektedir. Transgenezin bir sonucu olarak kaspaz-3 ifadesi değerlerimiz, TgAPP farelerinin hipokampüsündeki dendritik dikenler seviyesinde kaspaz-3 ifadesinde bir artış bildiren diğer araştırmacılar tarafından elde edilenlerle uyumludur. [48]. APP, amino asit sekansında kaspaz-3 için üç farklı bölünme bölgesi içerdiğinden, bunlardan ikisi hücre dışı alan düzeyinde ve biri APP kuyruğunun [49] hücre içi C-terminal kısmında bulunur, hidroliz kaspaz tarafından APP'nin dönüştürülmesi-3, APP'nin proteolitik işlenmesini amiloidojenik yol lehine değiştirebilir [50], bu da 31 amino asit uzunluğunda (C31) bir sitotoksik C-terminalinden türetilmiş peptidin salınmasına yol açar; örnek [51]. Bu, kaspaz-3'nin APP'den toksik parça salımının amplifikasyonuna aracılık edebildiğinden, kaspaz-3 ifadesinin quercetin veya rutin tarafından düşürülmesinin, kümelenmiş proteinin temizlenmesine izin verebileceğini düşündürür. Ek olarak, daha önce bahsedildiği gibi, kalsinörinle aktive olan kaspaz-3'ın GluR1 alt birimini fosforilasyondan arındırma yeteneğine dayalı olarak, glutamaterjik sinaptik aktarımda kaspaz-3 ifadesinin hem artmasının hem de azalmasının etkisini araştırdık. Postsinaptik düzeyde AMPA reseptörlerinin Bu moleküler modifikasyonlar, hipokampustaki dendritik dikenler seviyesinde glutamaterjik sinaptik iletimi ve nöronal plastisiteyi değiştirir [48]. Teorik olarak, TgAPP farelerinde kaspaz -3 aktivitesinin farmakolojik inhibisyonu, AD benzeri fenotipleri sinaptik başarısızlığa neden olan bir mekanizmadan kurtarabilir. Bununla birlikte, TgAPP faremizde kaspaz -3 ifadesindeki artışa rağmen, daha önce bahsedildiği gibi, WT farelerindekine kıyasla AMPA reseptörü ifadesinde anlamlı bir fark bulamadık. Kaspaz -3 ifadesindeki değişiklikler, AMPA reseptör ifadesinde önemli değişiklikler üretecek kadar belirgin olmayabilir (Ek veriler, Şekil S2 ve Tablo S5).

Kaspaz-6 ifadesinin değerlerine gelince, TgAPP ve WT fareleri arasında önemli bir fark bulunmadı. Kaspaz-6 aktivasyonunun, önemli hücre iskeleti proteinlerini (Tau ve -tubulin) bölen, böylece yanlış katlanmış proteinlerin ubikuitin-proteazom bozunmasını ve birkaç aktin düzenleyici post-sinaptik yoğunluğu bozan nöronal stresin önemli bir aracısı olduğu tespit edilmiştir. proteinler [52]. Çalışmamızda değişmeyen kaspaz -6 ifadesi, bu transgenik farelerin değerlendirildiği yaşta, WT farelerine kıyasla karakteristik nörodejenerasyon belirtilerinin yokluğu ile aynı fikirdedir (Ek veriler, Şekil S1).

AD hastalarında, özellikle senil plakların çevresinde, nöroinflamatuvar mediyatörlerde belirgin bir artış gözlenmiştir [53-55]. Astrositler, mikroglia ve nöronların ana GSH tedarikçisidir. Kronik inflamasyon ve oksidatif stres sırasında, astrositler mikroglia ve nörodejenerasyonun aktivasyonunu hızlandırarak toksik inflamatuar aracıları ve serbest radikalleri serbest bırakır [56]. Hücre içi glutatyonun azalmasının, insan mikrogliasında ve astrositlerinde enflamatuar yolların, p38 MAP-kinaz, Jun-N-terminal kinaz (JNK), NF-κB'nin aktivasyonu ile ilişkili olduğunu belirtmekte fayda var [57]. Bu bağlamda, hayvan modelimizdeki IL-1 , IFN- ve TNF- düzeylerini ölçmeye ve quercetin ile rutinin bunlar üzerindeki etkisini belirlemeye karar verdik. Bilindiği gibi enflamasyon, A peptidi ve APP'nin kusurlu işlenmesini teşvik eder, A peptidi agregasyonunu teşvik eder ve ardından A reaktivitesini değiştirir [58]. Bu nedenle, çalışmamızda TgAPP farelerinin, WT farelerine kıyasla proinflamatuar mediatörler IL-1, TNF- ve IFN-'nin mRNA seviyelerini artırdığını gözlemledik; bu, APPswe'nin aşırı ekspresyonunun nöro-inflamatuar kaskadları indükleyebileceğini gösterir. glia ve nöronlarda inflamatuar yanıtı aktive edecek bir dizi moleküler yolu tetikler. Quercetin ve rutin, hem erkeklerde hem de kadınlarda ve incelenen beyin bölgelerinde IL-1 gen ekspresyonunu zayıflatmayı başardı. Birkaç kanıt, quercetin'in CNS seviyesinde uyguladığı antiinflamatuar etkiyi desteklemektedir, çünkü kuersetin, iNOS indüksiyonunda yer alan nükleer faktör-kappa B (NF-κB) [59] gibi transkripsiyon faktörlerinin aktivasyonunu inhibe edebilir ve bu nedenle, IL-1 , TNF- ve IFN- [60] gibi aracıların salınımını azaltın. GSH'nin inflamatuar yanıt üzerindeki etkisi ile ilgili olarak, GSH'nin, proinflamatuar sitokinlerin (TNF- , IL-1 ve IL) ekspresyonunu önleyecek şekilde optimal sitokin seviyelerinin korunmasında yer aldığına dikkat edilmelidir. -6), GSH tükenmesi nedeniyle artarken, anti-inflamatuar sitokinlerin (yani, IL-10) ifadesi değişmeden kaldı. Bu GSH homeostazı değişikliği, nöronal hücre ölümüne doğru uygun apoptotik yol olabilecek NF-κB ve JNK sinyal yollarındaki yukarı regülasyon nedeniyle gerçekleşir [61]. Çalışmamızda, NF-κB'nin quercetin ve rutin tarafından aşağı regülasyonu, GSH/GSSG homeostazını düzeltmek için makul bir mekanizma ve dolayısıyla proinflamatuar ve antiinflamatuar sitokinler arasındaki dengenin nedeni olabilir. Son olarak, BACE1 promotoru bir NF-κB bağlama bölgesine sahip olduğu için, NF-κB'nin enflamasyonun indüklediği aktivasyonu, BACE1 ekspresyonunun yukarı regülasyonunu kolaylaştırır ve ardından A üretimini arttırır [62]. Bu nedenle, kuersetin ve rutin diyetler üzerine NF-κB'nin aşağı regülasyonu meydana gelirse, BACE1 aktivitesi, anti-enflamatuar sitokinlerin değil, proenflamatuar salınım düzenlemesinin bir sonucu olarak azalacaktır.

4. Gereç ve Yöntemler

4.1. Deney Hayvanları

İnsan amiloid öncü proteininin (hAPP) İsveç çift mutasyonunu ifade eden bir transgenik fare (Tg2576, B6; SJL-Tg(APPswe)2576 Kha), deneysel AD'nin hayvan modeli olarak kullanıldı [14]. Fare, hamster prion protein promotörünün kontrolü altında çift İsveç mutasyonu (K670N/M671L; Lys670→Asn ve Met671→Leu) ile insan A PP695 izoformunu eksprese eden bir knock-in heterozigot hattıdır [63]. Sonuç olarak, bu fare insan amiloid öncü proteini (A PP) seviyeleri sergiler; bu, bir farenin A PP seviyelerinden altı kat daha fazladır. Ek olarak, bu fare daha yüksek A 40 ve A 42 seviyeleri gösterir. A birikintileri 9 aylıkken başlar [63]. Tg2576 hipokampus ve korteks içinde, APPswe transgen ekspresyonu birincil olarak nöronaldir [64].

Negatif kontrol olarak, aynı koloniden [65,66] vahşi tip (WT) fareler kullanıldı. Tg2576 (B6; SJL-Tg(APPswe)2576 Kha) fare kolonisi, laboratuvarımızda Tg2576 heterozigot erkekler ve vahşi tip dişilerden geliştirilmiştir. Transgenik ebeveynler, Navarra Üniversitesi'ndeki (Pamplona, ​​İspanya) Uygulamalı Tıbbi Araştırma Merkezi'ndeki Nörobilim Bölümü'nden Dr. Diana Frechilla tarafından bağışlanmıştır [67].

Hayvanlar ayrı ayrı havalandırılan kafeslerde barındırıldı ve yüzde 50-60 nemde 12-sa bir aydınlık/karanlık döngüsünde 22-24°C'de tutuldu. Hayvan protokolleri, Madrid Complutense Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır ve bilimsel amaçlarla kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin 2010/63/Avrupa Direktifi ve Hayvan Refahına ilişkin İspanyol mevzuatına tam olarak uygundur ( Kraliyet Kararnamesi 53/2013, 1 Şubat 2013).

4.2. Farelerin Genotipleme Analizleri

Transgenisite doğumdan sonraki 30 gün içinde kuyruk biyopsisi ile belirlendi. Hayvanların genotipleme analizleri PCR ile gerçekleştirilmiştir. Tg2576'nın (TgAPP) heterozigot bir soy olduğu düşünüldüğünde, pozitif reaksiyon kontrolü olarak yerleştirme geni (prion proteininden PrP) kullanıldı. Genomik DNA, NID tamponunda (50 mM KCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.3, 50) proteinaz K (0.1 µg/µL) ile sindirilmiş fare kuyruklarından ekstre edildi mM MgCl2, yüzde 0,05 jelatin, yüzde 0,45 NP-40 ve yüzde 0,4 Tween 20) 56°C'de 3 saat süreyle çalkalandı. DNA fragmanları, izopropanol ile çökeltildi ve yüzde 70 etanol ile yıkandı. DNA çökeltileri, 30 uL TE tamponu (10 mM Tris-1 mM EDTA) içinde çözüldü. DNA'nın saflığı ve konsantrasyonu 260 ve 280 nm'de belirlendi.

PrP ve APP genleri, PCR ile büyütüldü. Transgenik fareleri taramak için kullanılan primer dizileri aşağıdaki gibidir: PrP ileri: CCTCTTTGTGACTATGTGGACTGATGTCGG; PrP tersi: GTGGATACCCCTCCCCCAGCCTAGACC; APP tersi: CCAGATCTCTGAAGTGAAGATGGATG. PCR reaksiyonunun adımları şu şekildeydi: 94 ◦C'de 90 saniye denatürasyon, 60 ◦C'de 60 saniye ve 72 ◦C'de 90 saniye 39 döngü, ardından 72 ◦C'de 7 dakika son uzatma.

Tüm durumlarda, APP geninin negatif kontrolleri (DNA küfü olmadan) ve pozitif kontrolleri dikkate alındı. Elde edilen PCR ürünleri, 70 V'ta (sabit voltaj) 0.5X TBE (Tris-Borate-EDTA, Merck KGaA, Darmstadt, Almanya) tamponunda yüzde 1,5'lik agaroz jellerinde elektroforez ile ayrıldı ve daha sonra ile boyanarak görüntülendi. GelRed (Millipore).

4.3. Hayvan Tedavileri

Her ikisi de 6-7 haftalık ve 16.2 ± 0.8 g başlangıç ​​vücut ağırlığına sahip TgAPP fareleri ve vahşi tip çöp arkadaşları, aşağıdaki dört gruba (n=8/grup) randomize edildi: ( a) İşlenmemiş TgAPP; (b) Quercetin ile işlenmiş TgAPP; (c) Rutinle işlenmiş TgAPP; ve (d) İşlenmemiş yabani tip. Hem erkek hem de dişi fareler üzerinde çalışıldığı için iki takım grup oluşturuldu. 45 haftalıkken, fareler 4 hafta boyunca quercetin veya rutin ile tedavi edilmeye başlandı.

Quercetin (3,30,40,5,7-pentahidroksiflavon) ve rutin hidrat (quercetin-3-O-rutinoside hidrat) yüzde 95'ten büyük veya buna eşit saflıktaydı ve Sigma-Aldrich'ten satın alındı. Flavonoidlerin her biri, 30 mg flavonoid/kg vücut ağırlığı/gün alımına karşılık gelen 200 ppm'lik bir konsantrasyonda standart bir diyete (Harlan Ibérica, Barselona, ​​İspanya) dahil edildi. Tedavi edilmeyen fareler, yalnızca takviye edilmemiş standart diyet aldı. Ad libitum alımı için diyetler ve su sağlandı.

4.4. Biyokimyasal ve Histolojik Analizler için Beyin Dokusu Hazırlama

Tedavinin sonunda, fareler gece boyunca aç bırakıldı, servikal dislokasyon kullanılarak ötenazi yapıldı ve tüm beyin hızla çıkarıldı. Beyin, 4 ◦C'de salin içinde durulandı ve araknoid zar dikkatlice çıkarıldı. Daha sonra hipokampus ve korteks izole edildi. Numuneler, bir sonraki kullanıma kadar hemen -80 ◦C'de saklandı.

Bazı hayvanların tüm beyinleri, servikal dislokasyon kullanılarak ötenazi yapıldıktan sonra beyinlerin -80 ◦C'de izopentan içine daldırılarak dondurulduğu histolojik kesitler elde etmek için kullanıldı. Hemen ardından, bir kriyostatta (Leica CM1850, Nussloch, Almanya) koku alma ampulünden serebelluma 120 um aralıkla beynin koronal kesitleri (30 um kalınlıkta) yapıldı. Tüm prosedür -20 ◦C'de gerçekleştirildi. Histolojik kesitler slaytlar üzerinde toplandı ve analize kadar -80 ◦C'de tutuldu (Bkz. Ek Yöntemler).

4.5. glutatyon

Glutatyon testleri için serebral korteks ve hipokampus numuneleri, bir konsantrasyonda bir redoks söndürücü tampon-5 Triklorür asetik asit (yüzde RQB-5 TCA) (daha önce buz üzerinde 15 dakika boyunca N2 ile köpürtülmüş) içinde homojenleştirildi. 25 mg/mL (ağırlık/hacim). Numuneler 10 s sonikasyon ile yeniden süspanse edildi, ardından 12°C'de,000x g'de 10 dakika 4°C'de santrifüjlendi ve süpernatanlar toplandı.

Daha sonra, elde edilen süpernatanda, Senft ve diğ. [68]. GSH ve GSSG değerleri, biyolojik numune yokluğunda spontan reaksiyon için düzeltildi. Her iki durumda da süpernatanlar, oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edildi ve ardından, uyarma filtresi 360 nm'ye (bant genişliği 5 nm) ayarlanmış bir FLUOSTAR mikroplaka okuyucu (BMG LABTECH, Ortenberg, Baden-Württemberg, Almanya) kullanılarak floresans ölçüldü. ve 460 nm'de ayarlanan emisyon filtresi (bant genişliği 5 nm). Her numunedeki GSH ve GSSG konsantrasyonu, bilinen GSH standartlarından enterpole edildi. Hem GSH hem de GSSG konsantrasyonları, glutatyon redoks oranı GSH/GSSG'nin hesaplanmasına izin veren nmol GSH/mg protein olarak ifade edildi.

Geri kalan peletler, standart olarak sığır serum albümini kullanılarak bisinkoninik asit (BCA) yöntemiyle protein konsantrasyonunu ölçmek için 240 uL 0.1 M NaOH içinde tamamen çözülene kadar vortekslendi.

【Daha fazla bilgi için:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】