Böbreğin Ölçekler Arası 3D Yerinde Görüntülemesi için Hızlı ve Basit Bir Temizleme ve Şişme Protokolü
Mar 23, 2022
Son yıllarda, nano ölçekli yapıların görselleştirilmesi için birçok ışık mikroskobu protokolü yayınlanmıştır.böbrek.Bu protokoller, araştırmacılara hem ayak süreci anatomisini ve silinmesini hem de ayak süreçlerindeki, yarık diyaframdaki ve glomerüler bazal membrandaki protein dağılımlarını değerlendirmek için yeni araçlar sunar. Ancak, bu protokoller ya farklı karmaşık süper çözünürlüklü mikroskopların uygulanmasını ya da uzun numune hazırlama protokollerini içerir. Burada, üç boyutlu görselleştirme için hızlı ve basit, beş saatlik bir prosedür sunuyoruz.böbrekTüm uzunluk ölçeklerinde morfoloji. Protokol, geleneksel bir konfokal mikroskop kullanarak nano ölçekli yapıları çözmek için yeterli, hafif bir şişme üretmek için optik temizleme ve doku genişletme kavramlarını birleştirir. Protokolün hem fare hem de insanda çok çeşitli patolojik özellikleri görselleştirmek için uygulanabileceğini gösteriyoruz.böbrekler. Bu nedenle, hızlı ve basit protokolümüz, geleneksel mikroskobik değerlendirme için faydalı olabilir.böbrekHem araştırmalarda hem de muhtemelen gelecekteki klinik rutinlerde doku bütünlüğü.
CISTANCH BÖBREK/BÖBREK FONKSİYONUNU İYİLEŞTİRECEK
Nano ölçekli yapıların görüntülenmesi için çok sayıda optik protokolböbrekson yıllarda sunulmuştur. I- Filtrasyon bariyeri anatomisini ve patolojisini ölçmek için araçlar olarak bu yeni tekniklerin gücü, grubumuz ve diğerlerinin son yayınlarında örneklendirilmiştir.5, yüzde ,10Güçlü olmasına rağmen, tüm bu optik protokoller, gelişmiş kırınım-sınırsız mikroskopi veya numuneyi değerli kılmak ve/veya fiziksel olarak genişletmek için karmaşık polimer kimyasının numuneye dahil edilmesini içerir. Protokollerin çoğu da zaman alıcıdır ve önemli miktarda uygulamalı emek gerektirir. Bu ekstra karmaşıklık katmanı, bu yeni yöntemlerin hem araştırmacılar hem de klinik patologlar tarafından rutin olarak kullanılmasını engelleyen şey olabilir. Ayrıca, protokollerin çoğu, 5-15 um'un ötesinde derin 3-boyutlu (3D)görüntülemeye (FP'ler) erişimden yoksundur.-1,7,8 Bu nedenle, temizleyen ve uzamsal olarak şişen, büyük ölçüde basitleştirilmiş ve hızlı, tamamen optik bir protokol geliştirinböbrekdoku örneklerinin yerinde 3D yüksek çözünürlüklü analizine izin verecek kadarböbrekNeredeyse tüm yaşam bilimleri ve patoloji kurumlarında bulunan geleneksel bir kırınım sınırlı mikroskobu kullanan anatomi ve patoloji.Önceki protokol basitleştirmeleri, sodyum dodesil sülfat (SDS) klirensinde doku bütünlüğünü korurken, paraformaldehitle sabitlenmiş numunelere akrilamid polimerlerinin eklenmesinin tamamen atlanabileceğini göstermiştir. Başka bir çalışma, doku örneklerinin farklı sulu çözeltilere daldırmaya dayalı basit bir polimer içermeyen protokol kullanılarak 2 kattan fazla genişletilebileceğini göstermiştir.2 Bu nedenle, akrilamid infüzyonunu daha sıkıcı ve karmaşık yayınlanmış protokollerimizden² çıkardık ve hafif (1.3-kat doğrusal) şişmesine izin vermek için numune yerleştirme ortamıböbrekDoku örnekleri. Ayrıca görüntüleme parametrelerini optimize ederek, geleneksel konfokal mikroskopi kullanarak podosit FP'lerinin ve glomerüler bazal membranın (GBM) 3D görselleştirilmesi için yeterince yüksek etkili bir çözünürlük elde ettik.
Anahtar Kelimeler:fokal segmental glomerüloskleroz; IgA nefropatisi; podosit; böbrek biyopsisi; böbrek patolojisi; böbrek
SONUÇLAR
Böbrek dokusunun optik olarak temizlenmesi ve hafif şişmesiBasit azaltma/şişme protokolü Şekil la'da şematik olarak gösterilmektedir. SDS delipidasyon adımının öncelikle optik şeffaflık için değil, örneklerin yeterli şişmesini sağlamak için eklendiğini unutmayın.7 Ayrıca, delipidasyon atlandığında boyama kalitesi zayıftır (Ek Şekil SlA). 1 saat boyunca 70 derecede hızlı delipidasyonun, daha yüksek sıcaklıklarda meydana gelen numune bozulması olmadan iyi sonuçlar verdiğini gösteriyoruz (Ek Şekil S1B). Murakami ve arkadaşları tarafından bildirildiği gibi, üre ve üre benzeri moleküller doku örneklerini etkili bir şekilde şişirebilir, bu da etkili uzaysal çözünürlüğün artmasıyla sonuçlanır. Bu nedenle, yüzde 80 (ağ/ağ) fruktoz (MEYVE olarak adlandırılır) içeren bir karışıma 4 M üre ekledik, bu da -1.3'lük bir doğrusal şişme faktörü ile sonuçlandı (Şekil lb).
Etiketleme süresini kısaltmak için boya konjuge primer antikorlar kullandık. Başlangıçta, standart bir boyama tamponunda (Tween 20'li fosfat tamponlu salin) boya konjuge nefrin antikorları kullanıldığında, sinyal ve etiketleme verimliliği, tek tek FP'leri özetlemeye yetecek kadar yüksek değildi. Bununla birlikte, alternatif bir boyama tamponu olan HEPES-TSC kullanılarak boyama kalitesi tatmin edici bir dereceye yükseltildi (Ek Şekil S1C). Geleneksel mikroskopi kullanan daha önce yayınlanmış protokollerle karşılaştırıldığında, hızlı ve basit 5-saatlik protokolümüz, birkaç temel parametrede onlardan daha iyi performans gösterdi (Şekil lc-f). Pullman ve diğerleri tarafından sunulan protokol.' genel olarak biraz daha hızlıdır, ancak süper çözünürlüklü yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu gerektirme ve büyük görüntüleme derinliklerine erişimi engelleyen ince kriyoseksiyonlar kullanma dezavantajlarına sahiptir. Not olarak, değerlendirilen tüm parametreler dikkate alındığında protokolümüz standart parafine gömme veya kriyoseksiyondan daha az karmaşıktır.
CISTANCH BÖBREK/BÖBREK YETMEZLİĞİNİ İYİLEŞTİRECEK
Ayak işlemlerini çözmek için protokolümüzün optimizasyonu ve doğrulanmasıProtokolümüz yalnızca 1.3'lük orta düzeyde bir şişme faktörü verdiğinden, görüntüleme FP'leri için yeterli çözümleme gücü elde etmek için konfokal görüntüleme parametrelerinin optimize edilmesi gerekiyordu. Fareböbreknumuneler protokole göre muamele edildi ve farklı floroforlar kullanılarak nefrin için boyandı. Bir konfokal mikroskobun çözünürlüğü, uyarım/emisyon ışığının hem iğne deliği boyutuna hem de dalga boyuna bağlıdır.15 Bu nedenle, daha küçük bir iğne deliği çapı 0.3 Havadar birim (AU) yeşil ışık yayan ile birlikte kullandık. boya, Alexa Fluor 488 ve bu şekilde vahşi tip (WT) farede FP'leri çözmek için yeterli çözünürlük elde edildiböbrekler(Şekil 2a). Bu nedenle, ne zaman fare FP'leri görselleştirilecekse, maksimum uyarma dalga boyu 488 nm olan floroforlar kullanılır. Bu optimize edilmiş görüntüleme koşulları altında, tek tek FP'leri çözmek için yeterince iyi olan -115 nm'lik etkili bir çözünürlükte tüm fare glomerüllerini 3D olarak görselleştirebildik(Şekil 2b-e). Ayrıca, hızlı etiketleme （Ek Şekil S2A-C ile en az 70 μm'lik bir antikor penetrasyon derinliğine ulaşıldığını gösteriyoruz. Düzeltme bileziğine sahip bir gliserol objektifi kullanmak, daha önce geliştirilmiş protokollerin herhangi birinden daha büyük Z-derinliklerine erişim sağlar.temizleme/uyarılmış emisyon tükenme protokolü. Bir konfokal mikroskobun eksenel çözünürlüğü, yanal çözünürlükten kabaca 3 kat daha kötü olduğundan, kılcal damarlar, FP'leri en iyi şekilde çözmek için xy düzleminde yönlendirilmelidir. Protokolümüzle, her glomerülde görüntüleme için bol (25'e kadar) alan bulabileceğimizi gösteriyoruz (Ek Şekil S2D), sızma bariyer yapılarındaki ince varyasyonları da tespit etmek için büyük miktarda veri toplamamıza izin veriyor. Bu, glomerüler sağlığın yüksek verimli nicel analizlerini gerçekleştirirken derinlik boyutuna erişmenin önemini gösterir. Önemli olarak, insan FP'lerinin daha büyük boyutları nedeniyle farelere kıyasla daha az zor olan insan hasta materyalinde (Şekil 2f ve g) FP'leri çözme protokolünü de doğruladık. Ayrıca, FP'lerin glikokaliksine afinitesi olan buğday tohumu aglutinin (WGA)lektin kullanarak, hem fare hem de insan numunelerinde FP'leri kesitsel bir şekilde çözebildik(Şekil 2h ve i). Ek olarak, yarık membranda beklenen lokalizasyon ile nefrin için maliyetlendirme yaptık, bu da morfolojik bilgilere ek olarak protein lokalizasyonu hakkında veri alabileceğimizi gösterdi.
Fare örneklerinde filtrasyon bariyeri patolojisiDaha önce bildirildiği gibi,'-,5,6,9,10 yarık diyaframın yüz FP görüntülemesi, FP silinmesini görselleştirmek ve ölçmek için kolayca kullanılabilir. Bu yaklaşımın, fokal segmental glomerüloskleroz (FSGS)(Şekil 3) için yakın zamanda yayınlanan bir fare modelini kullanarak yeni protokolümüzle de uygulanabileceğini onaylıyoruz. Nefrin için boyama ile yarık diyafram modeli, WT ve mutasyona uğramış farelerin tüm glomerüllerinde 3 boyutlu olarak görselleştirilebilir (Şekil 3a ve b). Daha önce bildirildiği gibi,5, alan başına yarık diyafram uzunluğu yarı otomatik olarak ölçülebilir ve bu analiz, bu fare çizgisi için daha önce yayınlanmış olanla tutarlı bir sonuç sağlar'(Şekil 3c). Ayrıca, hem FP'lerin silinmesini hem de GBM'deki değişiklikleri gösteren kesitlerde glomerüler kılcal damarlar görüntülendi(Şekil 3d-f); GBM ölçümlerinin ayrıntıları için Ek Yöntemler ve Şekil S3'e bakın.
İnsan numunelerinde filtrasyon bariyeri patolojisiOlası klinik kullanım için protokolümüzü daha fazla doğrulamak için, onu farklı tipte kanser teşhisi konan hastalardan insan dokusuna uyguladık.böbrek hastalığı. Konjenital nefrotik sendromlu iki hasta, ya NPHS1 geninde (nefrin kodlayan) homozigot mutasyonu veya TRPC6 ve NPHS2 genlerinde trans-ilişkili mutasyonları (TRPC6 kanalı ve podosini kodlayan) olan iki hasta. Ayrıca FSGS ve minimal değişiklik hastalığı teşhisi konan 2 hastayı da analiz ettik. tipik özelliklerini görselleştirebilir ve ölçebiliriz.böbrek hastalığıFP silinmesi ve GBM değişiklikleri gibi(Şekil 4). Görüntüler hem yandan (Şekil 4a-e) hem de yandan (Şekil 4g-k) alınabilir. Ayrıca, NPHS1 mutasyonu olan hastanın yarık diyaframlarında beklenen nefrin yokluğunu gözlemledik(Şekil 4b ve h).Fare örneklerinde olduğu gibi
(Şekil 3), görüntüleme verileri nicel olarak değerlendirilebilir (Şekil 4f ve l ve Ek Şekil S4A ve B).
Dikkat çekici bir şekilde, teşhis edilen hastalarda kontrollerle karşılaştırıldığında beklenmedik şekilde hafif GBM kalınlaşması gözlendi. Nefrektomize edilmiş kontrolböbrekŞekil 4'te daha yaşlı bir hastadan alınmıştır, diğer tüm örnekler ise bebeklerden veya çocuklardan alınmıştır. GBM kalınlığı yaşla birlikte arttığından (Ek Şekil S5A-E), aynı yaştaki kontrol hastalarıyla karşılaştırıldığında muhtemelen daha belirgin bir kalınlaşma gözlenecektir. Ayrıca protokolümüz (Ek Şekil S5F-H) tarafından yaşa bağlı hiçbir şişme eserinin sunulmadığını ve ayrıca farklı bir GBM ölçüm stratejisinin benzer sonuçlar verdiğini doğruladık (Ek Şekil S5I ve D).
Fare ve insan örneklerinde büyük ölçekli patolojiÇünkü sadece filtrasyon bariyer ölçeği değil, aynı zamanda histolojik değişiklikler deböbrekMorfoloji, hem araştırmacılar hem de klinisyenler için yüksek ilgi görüyor, floresan tabanlı histolojik analiz yoluyla büyük ölçekli morfolojiyi değerlendirmek için protokolümüzü kullanma olasılığını araştırdık. Daha düşük büyütme hedefleri kullanarak, hem insan numunelerinde (Ek Şekil S6) hem de fare numunelerinde (Ek Şekil S7) protein ekspresyonundaki büyük ölçekli patolojileri ve farklılıkları tespit edebileceğimizi gösteriyoruz.
FSGS ve IgA nefropatisi teşhisi konan hastalarda patolojik değişikliklerin görselleştirilmesiHasta örneklerinde protokolün olası kullanımını daha fazla örneklendirmek için hücresel tipte FSGS'nin patolojik özelliklerini tespit edip edemediğimizi araştırdık. Fokal total/segmental stenoz, tübüler atrofi ve glomerüler kapillerlerde endotel hiper-sellülerliği dahil olmak üzere patoloğun açıklamasında bahsedilen patolojik özelliklerin çoğunu mevcut altın standart yöntemlerle karşılaştırdık (Şekil 5a-j). Elektron mikroskobu (EM) ile niteliksel ve niceliksel bir yan yana karşılaştırma, her iki yöntemi de kullanarak benzer sonuçlar gösterdi (Şekil 5k ve l ve Ek Şekil S4; FP genişlik ölçümlerinin bir tartışması için Ek Yöntemlere bakın).
CISTANCH BÖBREK/BÖBREK AĞRILARINI İYİLEŞTİRECEK
Protokolü ayrıca IgA nefropatisi(IgAN)(Şekil 6) teşhisi konan bir hastadan alınan biyopsi örneğine de uyguladık ve birçok tanısal özelliğin görselleştirilmesini doğrulayabildik. Filtrasyon bariyerinde ciddi patolojiler görülmedi (Şekil 6a ve b) ve karşılaştırmalı bir analiz, EM ile protokolümüz arasında belirgin bir farkla sonuçlanmadı (Şekil 6c ve d). Daha sonra, ödünç alınan böbreğin histolojisi hem standart histoloji (Şekil 6e) hem de "floresan histoloji"(Şekil 6f) ile değerlendirildi. Hücrelerin interstisyel infiltrasyonu (Şekil 6g ve h), normal glomerüler kılcal damarlar (Şekil 6i) ve mezangial genişleme/hiperselülerlik (Şekil 6j) gibi patolog tarafından yapılan açıklamada belirtilen değişiklikleri (veya değişiklik yokluğunu) görselleştirebiliriz. Bir IgA antikoru kullanılarak immün boyama, hem büyük ölçekte (Şekil 6k ve l) hem de ayrıntılı olarak (Şekil 6m) standart immünofloresanda görülene eşdeğer bir desenle (Şekil 6n ve o) tortuları açıkça ortaya çıkardı. Son olarak, FP görüntüleme kısmi hafif silinme gösterdi (Şekil 6p ve q). Protokolümüzle tespit edebildiğimiz patolojik özellikler Ek Tablo S1'de özetlenmiştir.
TARTIŞMA
Burada, yüksek verimli görselleştirme için bir protokol sunuyoruz.böbrekFP analizi ve glomerüler filtrasyon bariyeri görüntüleme için daha önce yayınlanmış protokollerden hem daha hızlı hem de daha basit olan tüm uzunluk ölçeklerinde yapılarböbrek, Elde ettiğimiz çözünürlüğün, çoğu araştırma tesisinde ve patoloji laboratuvarında halihazırda mevcut olan standart bir araç olan basit konfokal mikroskopi kullanarak filtrasyon bariyerindeki patolojiler hakkında sonuçlar çıkarmaya yetecek kadar yüksek olduğunu gösteriyoruz. Protokolün 3D özelliği, kantitatif analiz için numunenin uygun bölgelerinin tanımlanmasına ve taranmasına izin veren geniş bir görüntüleme hacmine erişilebildiğinden, FP'lerin görüntülenmesi sırasında önemlidir.
Çalışmamızın önemli bir bulgusu, protokolümüzün yalnızca şu anda standart analiz için kullanılan standart protokollerle karşılaştırıldığında tamamlayıcı ve faydalı bir şekilde performans göstermemesidir.böbrekdoku. Ayrıca bu iş akışlarını, çalışma saatleri ve ihtiyaç duyulan malzeme/reaktifler/ekipman açısından belirgin tasarruflarla tek bir protokolde birleştirebilir. Bununla birlikte, analiz büyük ölçüde antikorlara dayandığından, reaktifleri etiketlemenin maliyeti oldukça yüksektir (numune başına yaklaşık 20e), bu da bu makalede sunulan diğer floresan tabanlı protokoller için geçerlidir (düzenli immünofloresan dahil).
Protokolün en hızlı versiyonunda, FP'leri çözmek için yeterli boyama kalitesi sağlayan boya konjuge primer antikorlar kullanıyoruz. Bununla birlikte, elde edilen sinyal, bir 2-adım birincil/ikincil yaklaşımla karşılaştırıldığında her zaman daha düşüktür. Ayrıca, çalışmada kullanılan birincil konjuge antikorlar ticari olarak mevcut değildir ve kurum içinde konjuge edilmelidir. Bu nedenle, bazı uygulamalar için, protokole 2 saat eklenerek 2-adım birincil/ikincil boyama protokolü tercih edilebilir. Son çalışmalar Airyscan mikroskopisiniböbrekdekonvolüsyon ve sinyal yeniden atama görüntü işleme ile birlikte küçük bir kamera dizisi detektöründe değişken iğne deliği ayarlarını kullanan doku.7,18 Bu çalışmada, hafif şişme ve ardından mükemmel boyama ve görüntüleme koşulları ile geleneksel konfokal görüntülemenin
Kapalı bir iğne deliği, görüntülerin matematiksel olarak sonradan işlenmesine gerek kalmadan yeterli çözünürlük sağlar. Bu çalışmada, hasta örneklerinde patolojinin değerlendirilmesi için protokolümüz ve standart yöntemlerimiz için karşılaştırmalı veriler sunuyoruz. Bununla birlikte, analiz az sayıda hasta üzerinde gerçekleştirildi ve protokolün diğer hastalık türlerinde bulunan çok sayıda patolojik parametreyi tespit etmek için kullanılıp kullanılamayacağını araştırmak için daha ileri çalışmalar çok önemlidir.böbrek hastalıklarıilave olarak. Bunu başarmak için hem patologları, hem numune hazırlama uzmanlarını hem de görüntüleme uzmanlarını içeren odaklanmış bir işbirliği çabası başlatılmalıdır. Bu kapsamlı doğrulama, amacın yüksek çözünürlüklü görüntüleme için hızlı, optik bir protokol geliştirmek olduğu bu ilke kanıtı çalışmasının kapsamında değildi.böbrek.Ayrıca, protokolümüzün çözünürlüğünün EM'den uzak olduğu ve örneğin fibriler birikintileri çözemediği ve bu nedenle bazı durumlarda doğru teşhis için EM'nin hala gerekli olacağı vurgulanmalıdır.
Bu çalışmada, ölçülen yapının (GBM veya FP) ortogonal olmayan optik veya fiziksel kesitinden kaynaklanan kesit artefaktları için düzeltme yapmadan ham uzunluk ölçümleri kullandık. Verilerin bu formda temsil edilmesinin 2 ana nedeni vardır. İlk olarak, nano ölçekli değişiklikler (düzensiz bir "engebeli" GBM gibi) ile ilgili bilgileri korurken, kesit yapılarını düzeltmek kolay değildir. İkincisi, şeffaf örneklerimizde her zaman bir görüntüleme düzlemi seçtik.
incelenen yapının, görüntüleme düzlemine mümkün olduğunca dik hizalandığı. Bu nedenle, kesitleme rastgele değildir ve kesitleme artefakt analizini daha da karmaşık hale getirir. Sonuç olarak, bu çalışmada sunulan ortalama değerler muhtemelen biraz fazla tahmin edilmiştir ve kesitleme artefaktları, verilerin dağılım grafiklerinde yayılmasına katkıda bulunur. Gerçek veri varyasyonu kaybı olmaksızın yapıların gelecekteki kesitleme-düzeltilmiş ölçümleri için, ortogonal kesme yöntemi gibi mevcut kesitleme artefakt düzeltme yöntemlerinin değiştirilmiş versiyonları potansiyel olarak uygulanabilir.!920
Temizlenenlerden patolojik parametreleri çıkarma yeteneğiböbrekHem etiketlenmemiş (otofloresan) hem de floresan etiketli numunelerin kullanıldığı doku yakın zamanda gösterilmiştir.-Ayrıca, yakın tarihli bir çalışma, otofloresan görüntülerdeki öğeler için derin öğrenme ve sinir ağı tabanlı segmentasyon kullanılarak "sanal histolojinin" gerçekleştirilebileceğini göstermiştir. böbrek patolojilerinin sınıflandırılması da gösterilmiştir. Yeni örnek hazırlama yöntemlerini (burada bildirilenler gibi) yeni görüntü analiz araçlarıyla birleştirmek, gelecekte birçok ilginç dijital olasılık sunuyor ve böbrek örneklerini hem araştırma hem de klinikte nasıl hayal ettiğimiz ve analiz ettiğimizde büyük olasılıkla değişiklikler göreceğiz.
MATERYAL VE METOD Fare ve insan böbrek dokusuTüm fare deneyleri, Alman Kuzey Ren-Vestfalya Eyalet Ofisi, Doğa, Çevre ve Tüketici Koruma Departmanı tarafından onaylandı ve Avrupa, ulusal ve kurumsal yönergelere uygun olarak yapıldı. Yüzde 100 C57BL/6N arka planına sahip fareler kullanıldı. Ketamin ve ksilazin ile anestezi indüksiyonundan sonra, farelere Hank'in dengeli tuz solüsyonu ile kardiyak perfüzyon yoluyla ötenazi uygulandı ve aşağıda tarif edildiği gibi sabitlendi.
NPHSI'deki nokta mutasyonları veya TRPC6 ve NPHS2'deki bileşik heterozigot nokta mutasyonları nedeniyle steroide dirençli nefrotik sendromlardan muzdarip 2 çocuğun yanı sıra fokal segmental glomerüloskleroz, minimal değişiklik hastalığı ve IgA nefropatisi teşhisi konan 3 hastadan hasta materyali alındı. , sırasıyla. nedeniyle nefrektomi uygulanan hastalardan kontrol insan dokusu toplanmıştır.böbrektümörler. Tümör olmayan kutbundan diseke edilen doku örnekleriböbrekrutin histolojik incelemede normal bir histolojik resim gösterdi. Tüm prosedürler Köln Etik Komisyonu ve Stockholm bölgesel Etik Kurulu tarafından onaylandı ve Helsinki Bildirgesi'ne uygun olarak yürütüldü. Uygulanabilir olduğunda, hasta veya hastanın vasisi bilgilendirilmiş onam verdi.
FSGS için fare modeli2 bileşik-heterozigot nokta mutasyonuna sahip fareler, Pod8asicyAzv, daha önce tarif edildiği gibi üretildi." Fareler, yukarıda belirtildiği gibi 20. haftada aşındırıldı.fiksasyoninsan ve fareböbrekler1-3 saat boyunca oda sıcaklığında 1 x fosfat tamponlu tuzlu su içinde yüzde 4 paraformaldehit içinde sabitlendi. nefrektomize insanböbrekDubosaq-Brasil solüsyonunda 3 saat fikse edildi.kesitNumuneler yüzde 3 agaroz içine gömüldü ve bir vibratom kullanılarak 300 μm kalınlığa kadar kesildi.delipidasyonNumuneler bir temizleme solüsyonunda (200 mM borik asit ve yüzde 4 SDS,pH 8.5) 70°C'de 1 saat boyunca 500 pm'de çalkalanarak inkübe edildi.etiketlemeEtiketleme protokolü ve bir antikor/sonda listesi Ek Malzemede verilmiştir.MontajNumuneler, 37 derecede 4 M üre içeren fruktozun yüzde 80 oranında 500 rpm'de 15 dakika çalkalanarak inkübe edildi ve daha sonra bir MatTek kabına (MatTek) yerleştirildi. , Ashland, MA) görüntülemeden önce (buharlaşmayı önlemek için) üstte bir lamel ile,görüntülemeGörüntüler, bir Leica SP8 konfokal sistemi (şekil açıklamalarında belirtilen hedefler) (Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL) kullanılarak elde edilmiştir. 100× objektifle görüntüleme, aksi belirtilmedikçe her zaman 03 AU (594-nm ışık için hesaplandığı gibi) bir iğne deliği ayarı anlamına gelir. Standart histoloji görüntüleme, bir Leica DM3000 sistemi(Şekil 5) veya bir Olympus BX45 sistemi(Olympus, Tokyo, Japonya)(Şekil 6) kullanılarak yapıldı. Standart immünofloresan, bir Nikon Microphot-FXA (Nikon, Tokyo, Japonya) kullanılarak yapıldı ve EM, bir Zeiss 912(Şekil 5) veya Hitachi 7700 (Hitachi, Tokyo, Japonya)(Şekil 6) transmisyon elektron mikroskobu ile yapıldı.Görüntü işleme ve analizAksi belirtilmediği sürece, Fiji/ImageJ (Ulusal Sağlık Enstitüleri, Bethesda, MD) kullanılarak her piksel değeri 3×3 komşuluğunun ortalaması ile değiştirilerek görüntüler düzeltildi. Morfometrik analizler Ek Yöntemlerde açıklanmış ve Ek Şekil S4'te gösterilmiştir.
