Calreticulin Eksikliği Ribozom Biyogenezini Rahatsız Ediyor ve Embriyonik Böbrek Gelişiminde Gerileme ile Sonuçlanıyor

edmund.chen@wecistanche.com

Soyut

Nefrogenez, hücre büyümesini ve farklılaşmasını kontrol eden karmaşık sinyal yolları tarafından yönlendirilir. Endoplazmik retikulum şaperon kalretikülin (Calr), kalsiyum depolanmasındaki ve glikoproteinlerin katlanmasındaki işleviyle iyi bilinir. rolüböbrekgelişme henüz anlaşılamamıştır. Bu araştırmada Calr'ın nefrogenezdeki önemli rolüne dair kanıtlar sunuyoruz. Calr eksikliğinin, virgül şeklindeki ve s şeklindeki cisimlerin oluşumundaki rahatsızlıkla kanıtlandığı gibi, bozulmamış bir nefrojenik zon oluşumu ve nefrojenezin gecikmesi ile sonuçlandığını gösteriyoruz. Proteomik ve transkriptomik yaklaşımları kullanarak, Wnt sinyalleme anahtar proteinlerindeki bir değişikliğe ek olarak, embriyonikböbreklerCalr'dan // protein sentezi ve nefrogenezdeki bozuklukları ortaya çıkaran ribozomal proteinlerin ifadesinde genel bir bozulma gösterdi. CRISPR/cas9 aracılı nakavt, Calr eksikliğinin, ribozom biyogenezinde birkaç ribozomal protein ve anahtar protein eksikliği ile ilişkili olduğunu doğruladı. Verilerimiz, Calr ifadesi ile ribozom biyogenezi arasında doğrudan bir bağlantı olduğunu vurgulamaktadır.

giriiş

Böbrekorganogenez, hücre büyümesi ve farklılaşması tarafından yönlendirilen bir dizi morfogenetik olayla karakterize edilir. Nefrogenez sırasında, mezenkimal-epitelyal geçiş (MET) ve UB ile metanefrik mezenkim (MM) [1] arasındaki karşılıklı indüksiyonun sonucu olan üreter tomurcuğu (UB) dallanması, nefron oluşumunun itici güçleridir. Bu süreç sırasında, epitel farklılaşmasını ve nefron oluşumunu düzenlemek için çeşitli sinyal yollarının karmaşık ve karşılıklı etkileşimi gereklidir [1-3]. Bu süreçteki anahtar yollar arasında, Ret reseptörü aracılığıyla glia kaynaklı nörotrofik faktör (Gdnf) sinyali, üreter tomurcuklanması adı verilen bir süreç sırasında merkezi bir rol oynar. Bu sinyallemenin bozulması ektopik üretere veyaböbrekagenezi, sinyalleme tamamen olmadığında [4]. Gdnf/Ret sinyalinin yanı sıra, kanonik Wnt/ -katenin sinyallemesinin, birçok yönü koordine ettiği bilinmektedir.böbrekhem MM hem de UB [5] içindeki gelişme ve üreter tomurcuk soyunda ve nefron progenitörlerinde kanonik Wnt sinyalinin inhibisyonu,böbrekagenezi [6]. Nefrogenez sırasında transkripsiyonel yeniden programlamanın sürdürülmesi, kromatin erişilebilirliğine bağlıdır [7]. Gen susturulmasının epigenetik düzenlenmesinde rol oynadığı bilinen heterokromatin proteinlerinin, gelişimin erken aşamasında dallanma aktivatörleri ve inhibitörleri arasındaki dengeyi korumak için vazgeçilmez olduğunu gösterdik [7].

CISTANCH BÖBREK/BÖBREK FONKSİYONUNU İYİLEŞTİRECEK

Calreticulin (Calr), Ca2 artı ER'ye sekestrasyon ve sinyal iletimi, gen ekspresyonu ve protein kaçakçılığı dahil olmak üzere farklı hücresel süreçler için çok önemli olan yüksek kalsiyum bağlama kapasitesine ve düşük afiniteye sahip endoplazmik retikulumun (ER) rastgele bir şaperonudur. [8,9]. Calr'ın hastalıklardaki rolünü ele alan mekanizmalar temel olarak Calr'ın Ca2 artı bağlayıcı C-terminal alanı tarafından Ca2 artı şelasyona ve bunun katlanmamış protein yanıtındaki (UPR) rolüne dayanmaktadır [10,11]. UPR, yanlış katlanmış proteinlerle mücadele sırasında sitoprotektif bir rol oynayabilir veya sürekli UPR sinyallemesinin neden olduğu apoptoz olarak hücrelere zarar verebilir. Calr'ın transkripsiyonun düzenlenmesi yoluyla hastalıklardaki potansiyel rolünü ele alan az sayıda çalışma olmasına rağmen, Calr'ın ER şaperon işlevi, hücrenin kaderi için çok önemli mekanizmalardan biri olmaya devam etmektedir [9,12]. Uzun süreli ER stresi ve protein yanlış katlanması çeşitli durumlarda belirgindir.böbrek hastalıklarıglomerülopatiler gibi akutböbrek hasarı, diyabetik nefropati,böbrekfibrozis ve kronikböbrek hastalığı[13,14]. Calr'ın embriyonik gelişimdeki rolü hala net değil. Calr nakavt, bozulmuş kardiyak gelişim nedeniyle gelişim evresi E14.5 sırasında embriyonik ölüme neden olur [15]. Calr eksikliğinin moleküler mekanizmalar üzerindeki sonuçlarıböbrekAncak embriyonik gelişim henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Bu çalışmada, embriyonik embriyonun karşılaştırmalı transkriptomik ve proteomik analizlerini gerçekleştirdik.böbrekCalr plus / plus , Calr plus // ve Calr// genotiplerinden ve Calr nakavtının nefrogenez ve ribozomal proteinlerin ekspresyonu üzerindeki etkisini vurguladı.

Anahtar Kelimeler:kalretikülin eksikliği; nefrogenez; ribozomal biyogenez, Böbrek, Böbrek

2. Sonuçlar

2.1. Böbreğin Morfolojik ve Histolojik Anormalliklerinde ve Bozulmuş Böbrek Dallanmasında Calreticulin Nakavt Sonuçları

Farelerde Calr'ın genetik olarak nakavt edilmesi ventriküler septal defektler nedeniyle erken embriyonik ölüme neden olur [15]. Calr nakavtının etkileyip etkilemediğini araştırmak içinböbrekgelişme, E13.5 aşamasındaki fare embriyoları, Calr plus // hamile farelerden hazırlandı (Şekil 1A). Calr// embriyoları, Calr plus / plus ve Calr plus // ile karşılaştırıldığında önemli büyüme değişikliği gösterdi ve embriyonal gelişimde önemli bir bozulma olduğunu ortaya koydu. Embriyoların kaba morfolojisi veböbreklerCalr plus / plus ve Calr-// fareleri arasında boyutta önemli düşüşler gösterdi ve Calr // fareleri en büyük anormalliği gösteriyor (Şekil 1A). Calr nakavtının etkisini göstermek içinböbrekgelişimi ve yapısı, üç farklı gelişim aşamasındaki (E13.5, E14.5, E16.5) ve üç genotipten (Calr plus / plus , Calr plus // ve Calr//) embriyolar feda edildi veböbreklerelde edildi. Doku bölümleri, farklı gelişim aşamalarını gösterdi.böbrek,doku bölümlerinin PAS ve HE boyamasıyla kanıtlandığı gibi karmaşık morfolojik yapılar boyunca ilerler.böbrekleraynı embriyonik aşamadan farklı genotiplerle farklı gelişim seviyeleri gösterdi (Şekil 1B). Ayrıca, önemli farklılıklarböbrekyapılar özellikle Calr // ile Calr plus / plus ve Calr plus // karşılaştırıldığında gözlemlendi. Bu farklılıklar ayrıca nefrogenezin ileri aşamalarında da kalır (Şekil 1B). Calr//böbreklerCalr plus / plus ve Calr plus // ile karşılaştırıldığında ciddi bozulma gösterir (Şekil 1B). E13.5 aşamasında Calr//böbrekdaha küçüktü ve üreter tomurcuğu ve üreter tomurcuk dallarının sayısı önemli ölçüde daha düşüktü. E14.5 ve E16.5 aşamalarında da benzer gözlemler yapılmıştır. Embriyonun organ kültürüböbreklerüç embriyo genotipinden, UB dallanmasında önemli bir bozukluk ortaya çıkardı veböbrekbüyüme. görselleştirmek içinböbrekyapılar, kültürlenmiş esaslar, bazal membran için bir işaretleyici olarak laminin ve UB'yi görselleştirmek için Dolichos biflorus aglutinin (DBA) lektin ile boyandı.

Kültüre edilenin kombine FL floresan boyamasıböbrekİlkeler, Calr eksikliğine eşlik eden ve genel olarak geriliğe neden olan önemli bir dallanma bozukluğu gösterdi.böbrekgeliştirme (Şekil 2A,B). İzolasyon sırasında, Calr//böbrekİlkeler 6–10 UB ipucu gösterirken, Calr plus / plus ve Calr plus // esaslar 20–30 UB ipucu sergiledi. Calr plus / plus ve Calr plus // kültürlenmiş esaslar, kültür periyodu (72 saat) sırasında normal olarak gelişti ve iyi dallanmış bir UB (her biri 85 ± 9, n=6) ​​ve aynı zamanda bilinen farklı yapılar gösterdi. Vivo gelişen böbrek. kültürlüböbrekkanıtlanmış ön boru agregaları,böbrekveziküller ve kap mezenşimi (Şekil 2A,B). Buna karşılık, Calr// esasları normal olarak gelişmedi ve UB dallanmasında (15 ± 3 n=6) önemli bir değişiklik gösterdi (Şekil 2B).

Şekil 2. Calr−/− fareböbrekİlkeler, büyüme ve UB dallanmasında ciddi bir değişiklik gösterir. (A):BöbrekCalr plus / plus Calr plus /− ve Calr−/−'den (E13.5) gelen esaslar izole edildi ve üç gün boyunca ex vivo olarak kültürlendi. Calr-/-böbrekİlkeler, büyümede genel bir değişiklik ve üreter tomurcuk dallanmasında önemli bir değişiklik gösterdi. (B): İmmünofloresan boyamaböbreküç günlük kültürden sonra temeller. Temellerin farklı yapılarını görselleştirmek için laminin (kırmızı) ve DBA lektin (yeşil) birlikte boyaması yapıldı. Dallanma ölçümü, üreter tomurcuğunun dallarının sayısı sayılarak elde edildi. Niceleme, hata çubukları içeren bir çubuk grafik olarak sunulur. Her çubuk, dalın sayı ortalamasını temsil eder ± sd altı kültürlü ilkeden. Önemli farklar: (*) p < 0.05,="" (***)="" p="">< 0.001.="" 2.5×="" 2.5×="" 2.5×="" int.="" j.="" mol.="" bilim="" 2021,="" 22,="" 5858="" 4="" 21="" şekil="" 2.="" calr悆="" fare="" böbrek="" ilkeleri,="" büyüme="" ve="" ub="" dallanmasında="" ciddi="" bir="" değişiklik="" gösterir.="">BöbrekCalr plus / plus Calr plus // ve Calr / (E13.5)'ten alınan esaslar izole edildi ve üç gün boyunca ex vivo olarak kültürlendi. Calr /böbrekİlkeler, büyümede genel bir değişiklik ve üreter tomurcuk dallanmasında önemli bir değişiklik gösterdi. (B): İmmünofloresan boyamaböbreküç günlük kültürden sonra temeller. Temellerin farklı yapılarını görselleştirmek için laminin (kırmızı) ve DBA lektin (yeşil) birlikte boyaması yapıldı. Dallanma ölçümü, üreter tomurcuğunun dallarının sayısı sayılarak elde edildi. Niceleme, hata çubukları içeren bir çubuk grafik olarak sunulur. Her çubuk, dalın sayı ortalamasını temsil eder ± sd altı kültürlü ilkeden. Önemli farklar: (*) p < 0.05,="" (***)="" p=""><>

2.2. Calr Eksikliği Büyük ve Önemli Transkriptom Değişiklikleriyle İlişkilidir

Morfolojik ve histolojik incelemeler,böbrekCalr plus / plus ve Calr plus // ile karşılaştırıldığında Calr/ fare embriyolarında gelişme. Calr nakavtının nefrogenez anahtar proteinlerinin ve yolaklarının ekspresyonunu etkileyip etkilemediğini araştırmak için, tüm transkriptome analizleriböbreküç embriyo genotipinden temel bilgiler yapıldı. Calr plus / plus , Calr plus // ve Calr/ arasındaki diferansiyel olarak eksprese edilen genleri değerlendirmek içinböbrekÖrnekler, okuma sayılarına dayalı nicel testler, çoklu testler için Benjamini-Hochberg ayarlaması ile Fisher'in kesin testi kullanılarak yapıldı. Ek Şekiller S1 ve S2, gen ifadeleri arasındaki karşılaştırmalı analizin ısı haritasını gösterir.böbrekCalr plus / plus , Calr plus // ve Calr / 'dan temel bilgiler. Calr plus / plus ve Calr/böbrek arasındaki gen ekspresyonu değişikliklerine kapsamlı bir genel bakış elde etmek için, Calr plus / plus ve Calr / ila log2 arasındaki ekspresyonun dönüştürülmüş kat değişimi (FC) ile bir MA grafiği oluşturuldu. tüm örneklerde her gen için ortalama ekspresyon seviyesi (Şekil 3A, Ek Şekil S1). MA grafiği, Calr plus / plus'ta Calr / ile karşılaştırıldığında diferansiyel olarak düzenlenmiş genleri gösterir. Düzenlenen genlerin biyolojik sürece göre fonksiyonel olarak sınıflandırılması, Calr/böbrekler(Şekil 3B, Ek Tablo S1). Düzenlenmiş genlerin yol açıklamasına ilişkin daha yakından bir araştırma, iki ana sürecin sapmasını ortaya çıkardı: Wnt sinyali ve düzenlenmiş proteinlerin çoğunluğu olarak protein katlanmasının bu iki ana yola dahil olduğu bulundu (Şekil 3B). İfade profillerinde hiyerarşik kümeleme ve k-araç kümelemesi, embriyonikböbrekCalr plus / plus ve Calr plus // transkriptomları çok benzerdir ancak Calr / transkriptomlarından önemli ölçüde farklıdır (Şekil 3C, Ek Şekiller S1 ve S2).

CISTANCH BÖBREK/BÖBREK ENFEKSİYONUNU İYİLEŞTİRECEK

Transkriptom analizi verilerimiz, Calr'ın nakavtına, ana proteinlerin ifadesinde bir değişikliğin eşlik ettiğini gösterdi.böbrekgeliştirme (Şekil 3C ve 4A, Ek Tablo S2), Wnt sinyallemesindeki anahtar proteinlerin yanı sıra çok sayıda nefrojenik gen aşağı regüle edildi veya Calr /böbrekİlkeler (Şekil 3C, Şekil 4A). Diğerlerinin yanı sıra, daha önce nefrojenezin farklı aşamalarında işlev gördüğü bildirilen Six1 ve Six2 gibi transkripsiyon faktörleri, Calr// embriyonik böbrekte önemli ölçüde aşağı regüle edildi. Osr1, Eya1, Pax2, Six2, Sall1 ve GDNF için ekspresyonu gerekli olan genlerden biridir ve Calr/'de bu genin ekspresyonu hemen hemen yoktur. Wnt sinyalinin ve nefrojenik anahtar genlerin değişiminin etkisini araştırmak içinböbrekCalr nakavt farelerde gelişme, embriyonik gelişimin belirteçleri ile immünofloresan boyamaböbrekE14.5 aşamasındaki embriyolardan kesitler. Boyama, Calr /'de incelenen genlerin değişimini açıkça doğruladı (Şekil 4B). Ek olarak, Calr plus / plus ve Calr plus // ile karşılaştırıldığında, Calr /böbrekboyama ile kanıtlandığı gibi net bir nefrojenik bölge (Şekil 4B) yoktur ve bu,böbrekCalr/embriyolarda gelişme.

2.3. Karşılaştırmalı Proteomik Analizler Calr / Embriyonik Böbrek Proteomundaki Önemli Değişiklikleri Belirledi

Morfolojik ve histolojik analizler, Calr kısıtlamasının embriyonik gelişim için sorunlu olduğunu göstermiştir.böbrek. Calr'ın rolünü daha iyi anlamak içinböbrekembriyonik gelişim, embriyonik üzerinde geniş proteom analizleri yapıldıböbrekleriki strateji kullanarak. İlk deneylerde, embriyonik durumu karşılaştırmak için 2D-jel elektroforezi kullandık.böbrekCalr plus / plus ve Calr plus // evre E13.5'ten fare embriyolarından proteomlar. 2D desen, Calr plus'ın proteomunda önemli bir değişiklik gösterdi //böbrekler(p < 0.05)="" (ek="" şekil="" s3a).="" farklı="" olarak="" bol="" proteinlerin="" tanımlanması,="" calr="" plus="" embriyonikte="" stres="" yollarında="" ve="" rna="" metabolizmasında="" yer="" alan="" proteinlerin="" ifadesinde="" bir="" değişiklik="" ortaya="">böbrek(Ek Şekil S3B,C). Calr plus // ve Calr悆 /'deki proteom değişikliğini Calr plus / plus'a kıyasla daha iyi araştırmak içinböbrek, kütle spektrometrisi tabanlı proteom profili çıkardık (Şekil 5, Ek Tablolar S3–S8). Bir örtüşme analizi, genotipler arasında protein tespitinin yüksek tekrarlanabilirliğini gösterdi (Şekil 5A). İstatistiksel analiz, Calr plus / plus ile Calr悆 / (Şekil 5A, Ek Tablolar S3 ve S4, Ek Şekil S4A.), Calr plus // ile Calr/ (Şekil 5A, Ek Tablolar S5 ve S6, Ek Şekil S4B) ve Calr artı / artı vs. Calr artı // (Şekil 5A, Ek Tablolar S7 ve S8, Ek Şekil S4C). İmmünofloresan boyama, Calr'ın Calr'da nakavt olduğunu doğruladı //böbrekler. Ek olarak, Calr / : Calbindin 1(Calb-1) ve Superoxide dismutase 1 (Sod1) içindeki iki aşağı regüle protein için proteomik bulgularını doğruladık. Sod1 durumunda, hem proteomik hem de transkriptomik veriler, Calr悆 // embriyonikte bir Sod1 nakavtını ortaya çıkardı.böbrekve immünofloresan boyama, Calr / embriyonikte Sod1 eksikliğini doğruladı.böbrek(Şekil 5B). Sod1, hücresel katalazlar tarafından daha fazla detoksifikasyon için serbest süperoksit radikallerini hidrojen peroksite dönüştürerek reaktif oksijen türlerinin (ROS) detoksifikasyonunda önemli bir rol oynayan ve böylece toksisiteyi önleyen bir antioksidan metalloenzimdir. Calb-1, distal kıvrımlı tübüldeki (DCT) ana hücre içi kalsiyum bağlayıcı proteindir ve hücrelerarası Ca2 artı yeniden emiliminde anahtar bir rol oynar. Bir hücre içi Ca2 artı -tampon ve Ca2 artı -geçiş proteini olarak, Calb-1, hücre içi Ca2 artı -konsantrasyonunda önemli bir değişiklik olmaksızın Ca2 plus'ı apikalden bazolateral tarafa taşır. Calr nakavtı ile her iki proteinin ekspresyonundaki değişiklik arasındaki bağlantı net değildir ve daha fazla araştırma gerektirir.

Şekil 3. Calreticulin nakavt farelerin karşılaştırmalı gen ekspresyonu analizi. (A): Calr plus / plus farelere karşı Calr /'de geniş ölçekli yukarı regüle ve aşağı regüle edilmiş genleri gösteren MA grafiği. Kat değişiminin kantitatif testleri (normalleştirilmiş log-dönüştürülmüş okuma sayısına dayalı olarak), bir Benjamini-Hochberg düzeltmesi (p < 0.05)="" ile="" fisher'in="" kesin="" testi="" kullanılarak="" yapıldı="" ve="" anlamlı="" olmayan="" genler="" gri="" renkle="" temsil="" edildi.="" ma="" grafiği,="" calr="" plus="" plus'a="" karşı="" calr="" de="" diferansiyel="" olarak="" eksprese="" edilen="" genleri="" görüntülemek="" için="" kullanılır.="" (b):="" calr'da="" aşağı="" regüle="" edilmiş="" genlerin="" biyolojik="" süreçlerinin="" dağılımı/calr="" plus="" plus="" -="" ile="" karşılaştırıldığında.="" tanımlanan="" genlerin="" sınıflandırılması,="" bir="" david="" biyoinformatik="" aracı="" kullanılarak="" gerçekleştirildi.="" gen="" sembolü,="" örneğin="" biyolojik="" süreçler="" gibi="" gen="" ontolojisi="" açıklamalarını="" kategorize="" etmek="" için="" kullanıldı.="" (c):="" üç="" genotip="" (calr="" plus="" plus="" ,="" calr="" plus="" ve="" calr/)="" arasında="" önemli="" ölçüde="" düzenlendiği="" bulunan="" en="" iyi="" genlerin="" zenginleştirme="" analizi.="" karşılaştırmalı="" analiz="" bir="" ısı="" haritası="" (fc=""><2 and="" fc="" >="">

2.4. Gen Ontoloji Sınıflandırması ve Protein-Protein Etkileşim Ağı Analizleri

Volkan grafikleri ve pasta grafiği analizleri, Calr ifade değişikliğinin embriyonik dönemde küresel değişikliklerle sonuçlandığını gösterdi.böbrekproteom (Ek Şekil S4). Embriyonik ile ilişkili biyolojik mekanizmalar hakkında daha fazla bilgi edinmek içinböbrekCalr / farelerde gelişim değişikliği, DAVID biyoinformatiklerini UniProt ve GenBank veritabanlarında bulunan proteinlerin varsayılan işlevi hakkındaki bilgilerle birleştirdik. Tanımlanan proteinlerin biyolojik süreçlere katılımlarına göre sınıflandırılması, dokuz yüksek oranda temsil edilen kategoriyle yirmi kategoriyle sonuçlandı (Ek Şekil S4D). Ana kategorilerden biri, bu gruba ait 1000'den fazla tanımlanmış protein ile gelişim süreciydi. Protein-protein etkileşimleri, gelişme, olası protein-protein etkileşimleri hakkındaki bilgilerin çıkarılması ve Calr plus // ve Calr/ embriyonikteki düzenlenmiş proteinleri birbirine bağlayan yol düzenlemesi dahil olmak üzere hemen hemen tüm biyolojik süreçler için anahtar mekanizmalar olduğundan.böbrekCalr eksikliği koşulları altında bozulan süreçler hakkında önemli bilgiler sağlayabilir. Bu amaçla, STRING 11.0 (http://string.embl.de, erişim tarihi 24 Mart 2021) kullanılarak düzenlenen proteinler arasındaki etkileşim ağlarını araştırdık. Yalnızca Calr plus / plus ve Calr plus // olarak ifade edilen proteinlerin daha fazla analizi, RNA metabolizması ve oksidatif fosforilasyon olan iki ana işlemde yer alan proteinlerden iki güçlü etkileşim düğümü ortaya çıkardı (Ek Şekil S5A). Bu, Calr / embriyonikböbrekRNA metabolizmasında bir anormallik ve enerji kıtlığından muzdarip olabilir. Calr plus / plus ve Calr plus // içinde aşırı eksprese edilen proteinler arasındaki etkileşim ağlarının Calr/ ile karşılaştırıldığında araştırılması, varsayımlarımızı güçlü bir şekilde desteklemektedir çünkü ağlar üç güçlü etkileşim düğümü göstermektedir. Düğümlerden ikisi, RNA metabolizması ve oksidatif fosforilasyonda yer alan proteinleri biriktirirken, üçüncü düğüm ribozomal proteinleri içerir ve ribozom oluşumunda ve protein cirosunda bozulma olduğunu ortaya çıkardı (Ek Şekil S5B). Düzenlendiği bulunan ribozomal proteinlerin yakından incelenmesi, hem büyük hem de küçük ribozomal alt birimlerden gelen proteinlerde önemli değişiklikler olduğunu gösterdi ve bu, ribozomal biyogenez ve protein sentezindeki ciddi bozukluğu ortaya çıkardı (Şekil 6A-D).

2.5. Calr Nakavt Sonuçları, Ribozomal Protein Ekspresyonunda Bir Değişiklik 

Transkriptomik ve proteomik veri analizleri, embriyonik Calr/farelerde ribozomal proteinlerin ekspresyonunda önemli bir değişiklik gösterdi.böbrekler. Western blot analizi ve embriyonik MS kantifikasyonuböbrekÜç genotipten elde edilen protein özleri, Rps10, Rps19 ve Rps26'nın önemli ölçüde aşağı regülasyonunu doğruladıböbrekler(Şekil 7A) ve Rps12, Rps13, Rps14 Rps15, Rps17 ve Rps19 (Ek Şekil S6A,B) Calr/. Ayrıca, embriyonik boyanmaböbrekbölümler, ribozomal proteinlerin ekspresyonundaki değişikliğin kapsamını doğruladı; Calr/embriyonikte Rps10 veya Rps6 tespit edilemediböbrekbölümler (Şekil 7B). Calr nakavt ve ribozomal protein ekspresyonu arasındaki bağlantıyı araştırmak için MDCK'da bir in vitro Calr nakavt modeli kurduk.böbrekCRISPR/cas9 endonükleaz sistemini kullanan tübül hücreleri. Western blot analizleri, MDCK hücrelerinde Calr ekspresyonunun doza bağlı aşağı regülasyonunu doğruladı ve ribozom biyogenezinde bir bozukluğu ortaya çıkaran Rps10 ve Rps19 proteinlerini kodlayan 40S ribozomal alt biriminde önemli bir tükenme olduğunu gösterdi. Ayrıca, protein sentezi için temel bileşenlerin ifadesi, örneğin uzama, başlatma faktörü eEIF5a'nın Calr nakavt MDCK hücrelerinde önemli ölçüde azaldığını ortaya çıkardı (Şekil 7C). Calr nakavtına önemli morfolojik, proteomik ve transkriptomik değişiklikler eşlik etti. İn vivo ve in vitro araştırmalarımız ayrıca bu sapmalara ribozom biyogenezinde önemli bir düşüşün eşlik ettiğini vurguladı. Calr nakavtında ribozomal protein ekspresyonundaki azalmaböbrekembriyonik aşamalarla sınırlı değildi, aynı zamanda yetişkinlerden türetilen hücrelerde de gösterilebilirdi.böbrekler, Calr'ın ribozomal biyogenezdeki potansiyel rolünü ortaya koyuyor.

Şekil 7. Calr eksikliği, ribozomal protein ekspresyonundaki aşağı regülasyon ile ilişkilidir. (A): Calr plus / plus , Calr plus // ve Calr // embriyonik protein ekstraktlarında ribozomal proteinler Rps10, Rps19 ve Rps26'nın Western blot analizleriböbrekler. Embriyonik böbrekler, üç farklı hamile Calr plus /- faresinden toplandı. Genotiplemeden sonra, aynı anneden ve genotipten gelen embriyolar birlikte gruplandırıldı ve embriyonik yapılarıböbrekprotein özleri bir araya toplandı. Protein tahmininden sonra, araştırılan her protein için Western blot analizleri üç kopya halinde yapıldı. Örneklerin karşılaştırmalı analizi için tek yönlü ANOVA kullanıldı. Sonuçlar, en az üç bağımsız deneyden elde edilen ortalama ± sd olarak sunulur. p < 0.05="" olduğunda="" farklılıklar="" istatistiksel="" olarak="" anlamlı="" kabul="" edildi.="" (b):="" calr="" plus="" plus="" ve="" calr悆="" mbriyonik="" böbrek="" dokusu="" kesitlerinde="" 20×="" büyütme="" ile="" rps10="" ve="" rps6'ya="" karşı="" immünfloresan="" boyama.="" (c):="" mdck="" hücrelerinden="" (solda)="" protein="" ekstraktının="" western="" blot="" analizi="" ve="" mdck="" hücrelerinde="" (sağda)="" calr'ın="" nakavt="" edilmesinden="" sonra="" mrna="" niceleme.="" calr,="" iki="" farklı="" sgrna'lı="" crispr/cas9="" sistemi="" kullanılarak="" nakavt="" edildi.="" western="" blotlar,="" calr,="" gapdh,="" rps10,="" rps19="" ve="" eif5a="" antikorları="" ile="" problanmıştır.="" sgcalr-2="" numunesindeki="" calr="" ve="" rps10="" mrna="" miktarları,="" qpcr="" kullanılarak="" gerçekleştirilmiştir.="" calr'ın="" crispr/cas9="" sistemi="" kullanılarak="" aşağı="" regülasyonu,="" calr="" eksikliği="" ile="" ribozomal="" protein="" ekspresyonundaki="" değişiklik="" arasında="" bir="" ilişki="" olduğunu="" ortaya="" çıkardı.="" önemli="" farklar:="" (**)="" p="">< 0.01,="" (***)="" p="">< 0.001,="" (****)="" p=""><>

3. Tartışma

buböbreklerkarmaşık büyüme ve farklılaşma süreçlerini içeren ve yeni oluşan mezenkimal bölmedeki çevreleyen hücrelerden gelen sinyaller tarafından yönlendirilen bir süreç olan dallanma morfogenezi yoluyla gelişir [16]. Geçtiğimiz yıllarda, birkaç anahtar gen ve yolböbrekgelişme tespit edilmiştir. Trofik faktörler, özellikle GDNF, kemik morfogenetik proteinleri (BMP'ler) ve fibroblast büyüme faktörleri (FGF'ler) dahil olur.böbrekbüyüme ve farklılaşma. UB dallanma morfogenezinde ve ayrıca embriyonik dönemde nefrojenik mezenşimin korunmasında ve farklılaşmasında yer alan sinyalleri yönetirler.böbrek[17]. Calr nakavt, işlevsiz kardiyak gelişim nedeniyle embriyonik ölüme neden olur [15]. Normal kardiyomiyositlerde kardiyak miyofibrillojenezi sağlamak için sitoplazmik Ca2 artı konsantrasyonundaki artışlar gereklidir. Ca2 plus konsantrasyonundaki bu vazgeçilmez değişiklik Calr'a bağlıdır ve Calr eksikliği koşulları altında yoktur [18]. ER şaperonunun ve kalsiyum bağlayıcı protein Calr'ın nefrogenezdeki fonksiyonel rolü henüz araştırılmamıştır. Calr'ın embriyonik dönemdeki potansiyel rolünü araştırmak içinböbrekCalr eksikliğinin nefrogenez üzerindeki gelişimi ve etkisi, karşılaştırmalı bir transkriptomik ve proteomik analiz gerçekleştirdik. Genel olarak, Calr eksikliği böbrek gelişiminin gecikmesine ve önemsiz transkriptom ve proteom değişikliklerine neden oldu. Ayrıca, verilerimiz, Wnt sinyalleme anahtar proteinlerinin (örneğin, Wnt7a, Wnt11, Wnt10b, Fzd10, Fzd9, Prkcb, Prkcq ve Kremen2) önemli ekspresyon değişiklikleri tanımlandığından, Calr eksikliğinin nefrojenez yollarında ciddi bozuklukları tetiklediğini ortaya koydu. Üreter tomurcuğu epiteli ile metanefrik mezenkim arasındaki endüktif sinyalleşme, esas olarak Wnt geri besleme sinyali tarafından düzenlenir [19,20]. Calr, hücresel kalsiyum homeostazının önemli bir parçası iken, aynı zamanda hücre sinyalizasyonu ve gen ekspresyonunda yer alan glikoproteinlerin ve proteinlerin katlanması ve ticareti için gerekli bir ER şaperonudur [21]. Calr'ın nakavt edilmesi, protein katlanmasının ve ER stresinin bozulmasına neden olabilir, bu da translasyon makinelerinde rahatsızlığa neden olur. Bu, homozigot farelerde böbrek gelişiminde gözlenen gecikmeyi açıklayabilir.

Verilerimizin vurguladığı şaşırtıcı ve ilginç yönlerden biri, ribozomal proteinlerin ifadesindeki değişikliktir. 40S ve 60S ribozomal alt birimlerinin birkaç proteininin neredeyse tamamen tükendiğini gösterdik. Ayrıca, in vitro deneylerimiz, Calr'ın aşağı regülasyonu ile ribozomal protein ekspresyonunun bozulması arasındaki korelasyonu doğruladı. Ribozom biyogenezi iyi organize edilmiştir ve sıkı düzenlemelere tabidir. Gelişmekte olan çalışmalar, ribozomun sadece normal hücre fizyolojisinde değil, aynı zamanda uyaranlara tepkide ve hastalıkların patogenezinde de önemli bir rol oynadığını göstermiştir. Ayrıca, ribozom biyogenezi hücre büyümesini kontrol eder ve ribozomlardaki proliferasyon ve değişiklikler, hücre proliferasyonunun, hücre döngüsünün durması, apoptoz ve patolojik tezahürün sapması olarak yansıtılır [22,23].

Ribozom biyogenezindeki rollerine ek olarak, ribozomal proteinlerin, örneğin hücre büyümesi ve çoğalması, DNA onarımı ve hücresel farklılaşma ve gelişme gibi çeşitli ekstra ribozomal işlevleri yerine getirdiği bulunmuştur [24-31]. Ribozomal protein fonksiyonlarındaki bozulma, hematolojik ve metabolik bozukluklarla ilişkiliydi ve kardiyovasküler hastalıklar ve kanser ile sonuçlanabiliyordu [32-36]. Ribozomal proteinleri kodlayan genlerdeki mutasyon, örneğin Diamond-Blackfan anemisi (DBA) [37] ve 5q-sendromu [38] gibi klinik sendromlarla sonuçlanan eritropoez anormalliği ile ilişkilidir. RPS10'daki mutasyonlar Diamond-Blackfan anemisi ile ilişkilidir ve bu hastaların yüzde 30'unda at nalı veya sigmoid vardır.böbrekler[39]. İlginç bir şekilde, Diamond-Blackfan hastalarının Calr geni ekson 9 mutasyonu ile ilişkili miyelodisplastik sendrom geliştirme şansı daha yüksektir [40-42]. Translasyon mekanizmasının bu yeniden şekillenmesi, gelişim sürecinde büyük anormalliklere neden olur ve sadece ürogenital değil, aynı zamanda dolaşım ve üreme sistemlerini de etkiler ve nihayetinde kalretikülin eksikliği üzerine embriyonik ölüme neden olur. Verilerimiz, Calr/embriyonik dokuda rahatsız edici ribozom biyogenezini ortaya çıkardı.böbrekve Calr'ın protein biyogenezinde önemli bir rolünü vurguladı. Calr eksikliği ve ribozomal protein ekspresyon değişikliği arasındaki ilişkilerin daha iyi anlaşılmasının, Calr'ın ribozom biyogenezisini ve embriyonik gelişimi nasıl etkilediğini anlamak için yeni anlayışlar sağlayacağına inanıyoruz.böbrekgeliştirme ve organ gelişimini yöneten süreçler hakkında yeni görüşlere izin verir.

4. Malzemeler ve Yöntemler

4.1. Hayvanlar

Aynı C57BL/6J genetik geçmişine sahip Calreticulin heterozigoz (Calr plus//) ve vahşi tip (Calr plus / plus) yavru fareler, Profesör Marek Michalak, Alberta Üniversitesi, Edmonton, Alberta, Kanada'dan elde edildi. Fareler, spesifik patojen içermeyen barınma koşulları altında yetiştirildi ve daha önce Michalak ve ark.'da tarif edildiği gibi genotiplendirildi. [15]. Çalışmamız için, hamile Calr artı // fareler embriyonik gelişimin farklı aşamalarında (embriyonik günler 13.5: E13.5; 14,5: E14.5; ve 16.5: E16.5) kurban edildi, embriyolar hasat edildi veböbreklerdisseke edildi. Genotipleme için embriyo kuyruğunun bir parçası kullanıldı. buböbreklerayrıca histokimyasal boyama veya transkriptomik veya proteomik analiz için hazırlandı. Tüm deneysel prosedürler, Alman hayvan bakımı ve etik mevzuatına (NIH standartları) uygun olarak gerçekleştirildi ve Almanya Göttingen Üniversitesi Tıp Merkezi'nin yerel Etik Kurulu tarafından onaylandı (33.14-42502-04-11/0598).

CISTANCH BÖBREK/BÖBREK AĞRILARINI İYİLEŞTİRECEK

4.2. histokimyasal boyama

Embriyonun histolojik boyanması içinböbrekler, kesilmişböbreklergece boyunca yüzde 4 tamponlu formaldehit solüsyonunda sabitlendi ve ardından parafin bloklarına gömüldü. Parafine gömülü kesitler deparafinize edildi ve rehidre edildi ve üreticinin protokolüne göre hematoksilen solüsyonu Gill III ve eozin Y solüsyonu (Merck, Darmstadt, Almanya) ile boyandı.

4.3. Embriyonik Böbreğin Ex-Vivo Organ Kültürü

Ex vivo organ kültürü, Davies ve arkadaşlarına [43] göre gerçekleştirilmiştir. Hamile fareler embriyonik gelişimin E13.5 aşamasında feda edildi, embriyolar toplandı veböbreklerdisseke edildi. Genotiplemeden sonra, 6böbrekher genotipten (Calr plus / plus , Calr plus // ve Calr/ ) esaslar 0.4 uM gözenek boyutuna (24 kuyu, BD Falcon) sahip şeffaf bir PET membran üzerine kaplandı. Membran, 400 uL içeren 24 oyuklu bir plakanın bir oyuğuna yerleştirildi.böbrekkültür ortamı (KCM, DMEM, yüzde 10 inaktive FCS). Bu etkinleştirdiböbrekonu boğmadan ortamla temasa geçmek. Bu şartlar altında tutmak mümkündü.böbrek37 ◦C'de ve yüzde 5 CO2'de en az 144 saat kültürlendi.

4.4. Kültürlenmiş Böbreklerin İmmünofloresan Boyanması ve Böbrek Kesitlerinin İmmünohistolojik Analizi

embriyonikböbrekler72 saat boyunca ex vivo olarak kültürlendi, ardındanböbrekesaslar, 30 dakika boyunca t 20 ◦C'de soğuk metanol içinde sabitlendi. Fiksasyon aşamasını, her biri PBS içinde 5 dakika olan 3 yıkama aşaması takip etti. Birincil antikor tavşan monoklonal anti-laminin antikoru (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, ABD) PBS içinde seyreltildi ve gece boyunca 4 ◦C'de inkübe edildi. kültürlüböbrekesaslar 4 saat boyunca PBS içinde yıkandı ve ikincil antikor (Molecular Probes Alexa Fluor 555 keçi anti-tavşan IgG (1:500)) 4 ◦C'de gece boyunca ilave edildi. UB, en az 3 saat boyunca lektin Dolichos biflflorus aglutinin (DBA) kullanılarak boyandı. İnkübasyondan sonra,böbreklerPBS içinde 3 saat yıkandı ve mikroskobik analiz için gömüldü. Deparafinize ve rehidrate embriyonik hayvanların immüno-lekelenmesiböbrekçeşitli proteinlerin ekspresyonunu ve dağılımını tespit etmek için bölümler yapıldı. Kesitler, bir buharlı yemek pişiricisinde 25 dakika önceden ısıtılmış bir antijen alma solüsyonu (1.8 uM sitrik asit ve 8.2 uM sodyum sitrat) ile işlendi. Kesitler, 1 saat süreyle PBS içinde yüzde 10 keçi serumu ile bloke edildi ve gece boyunca 4 ◦C'de birincil antikorlarla inkübe edildi (Aşağıdaki birincil antikorlar kullanıldı: tavşan monoklonal anti-Calbindin-1, anti-Wt1, anti- Six2, anti-Pax2, anti-Calr (Abcam, Cambridge, UK), tavşan monoklonal anti-Rps6, antiRps10 (Invitrogen) ve tavşan monoklonal anti-Sod1 antikoru (Abnova, Taipei, Tayvan) Birincil antikorlar floresan ile tespit edildi. etiketli sekonder antikorlar (Molecular Probes Alexa Fluor 555 keçi anti-fare IgG antikoru ve Alexa Fluor 555 keçi anti-tavşan IgG) oda sıcaklığında 1 saat. Negatif kontroller için doku kesitleri sadece sekonder antikor ile inkübe edildi. Slaytlar monte edildi çekirdekleri karşı boyamak için DAPI ile Vectashield montaj ortamında lamellerle (Vector Laboratories, Burlingame, CA, ABD).

4.5. Hücre kültürü

Madin-Darby köpekböbrek(MDCK) hücreleri, American Type Culture Collection'dan (ATCC) elde edildi ve 37°C'de Dulbecco's Modifified Eagle's Medium (DMEM), yüzde 10 fetal bovin serumu (FBS), yüzde 1 Penisilin/Streptomisin ve yüzde 1 L-Glutamin içinde çoğaltıldı. yüzde 5 CO2-atmosferde. Hücreler, T25 şişelerinde kültürlendi ve haftada iki kez bölündü. Hücre geçişi için, hücre yapısının değişmesini önlemek için MDCK hücresi kısa bir süre tripsinize edildi.

4.6. Nakavt Hücrelerin Üretimi

Canis lupus türleri için Calr'ın (XM8622117) sgRNA dizileri, çevrimiçi araç BlueHeronBio (Origene, Herford, Almanya) kullanılarak tasarlanmıştır. sgRNA dizisi 50 GTAGATGGCGGGTTCGGCAG 30, pLenti-Cas9-Calr yapısını oluşturmak için BamHI ve BsmBI kısıtlama enzimleri ile pLenti-Cas-Guide plazmidine (Addgene plazmitleri #3931646) yerleştirildi, daha sonra Sanger dizilimi ile doğrulandı. MDCK hücrelerinde Carl'ı nakavt etmek için pLenti-Cas9-Calr geçici transfeksiyonu yapıldı. Transfeksiyondan bir gün önce, 200,000 hücre/mL, MEM ortamı ile 6 oyuklu plakalara ekildi. Transfeksiyondan önce kültür ortamı, FCS içermeyen Opti-MEM ortamına değiştirildi. Hücreleri transfekte etmek için Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, ABD) kullanıldı. Lipofektamin plazmit DNA karışımı, eğitmenin protokolüne göre OptiMEM ile hazırlandı. 6 oyuklu plaka transfeksiyonu için, 250 uL Opti-MEM ortamına ayrı ayrı 4 ug plazmit DNA ilave edildi ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edildi. Daha sonra DNA karışımı Lipofectamine 2000 karışımına eklendi ve hücrelere eklenmeden önce 30 dakika inkübe edildi. Transfeksiyon başarısı Western blot kullanılarak değerlendirildi.

4.7. Transkriptom Analizi

Transkriptome incelemeleri için 3 hamile Calr plus // fare kullanıldı. Embriyolar (8-10/hamile fare) hasat edildi veböbreklerizole edildi. Genotiplemeden sonra,böbrekleraynı genotipten ve aynı anneden bir araya toplandı ve RNA ekstraksiyonu için işlendi. Toplam RNA'lar Calr plus / plus , Calr plus // ve Calr / embriyonik'ten izole edildiböbreklerüreticinin tavsiyelerine göre Trizol (Invitrogen) yöntemini kullanarak. Numuneler daha sonra DNA kontaminasyonunu gidermek için DNAse I (Sigma) ile işleme tabi tutuldu. RNA kalitesi, Agilent 21{{10}}0 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ABD) mikroakışkan elektroforezi kullanılarak belirlendi. Dizileme için RNA örnekleri, üreticinin protokolüne göre (Illumina, San Diego, CA, ABD) "TruSeq RNA Sample Prep Kit" kullanılarak hazırlandı. Tek okuma (50 bp) dizilemesi, bir HiSeq 2000 (Illumina, San Diego, CA, ABD) kullanılarak gerçekleştirildi. Diziler, STAR hizalaması kullanılarak Mus Muscullus'un genom referans dizisine (Ensembl genom derleme 3.2.1; https://www.ensembl.org/info/genome/genebuild/assembly.html, erişilen 24 Mart 2021) hizalandı. yazılım (Cold Spring Labaro tory, Cold Spring Harbor, ABD) (sürüm 2.3.0e, https://github.com/alexdobin/STAR, 24 Mart 2021'de erişildi) [44] 50 bazda 2 uyumsuzluğa izin veriyor. Benzersiz isabetlerin filtrelenmesi ve sayılması için SAMtools paketi (sürüm 0.1.18) ve HTSeq (sürüm 0.6.1p1) kullanıldı [45,46]. Aday genler, minimum 2-kat değişim ve FDR düzeltmeli p değeri < 0.05="" olacak="" şekilde="" filtrelendi.="" gen="" açıklaması,="" biomart="" paketi="" (versiyon="" 2.24.0)="" [47]="" aracılığıyla="" ensembl="" v78'den="" (www.ensembl.org,="" 1="" mart="" 2019'da="" erişildi)="" mus="" muscullus="" kullanılarak="" yapıldı.="" aday="" genler="" için="" go="" zenginleştirme="" analizi,="" standart="" parametreler="" kullanılarak="" goseq="" paketi="" (versiyon="" 1.2)="" [48]="" ile="">

4.8. Böbrek Lizizi, Protein Ekstraksiyonu ve İki Boyutlu Jel Elektroforezi (2-DE)

2D jel elektroforezi için 6 hamile Calr plus // dişi (8-10 embriyo/dişi) embriyoları kullanıldı. 2D jel elektroforezi (2-DE) için protein ekstraksiyonu için,böbrekleraynı embriyonik aşamadaki embriyolardan ve aynı genotipten ve dişiden (8-10 embriyo/hamile dişi) havuzlandı, bir lizis tamponuyla parçalandı (9,5 M üre, yüzde 2 CHAPS (w/v), yüzde 2 amfolitler (w/v) /v), yüzde 1 DTT) ve vortekslendi. Analiz tamponu eklendikten sonra örnekler 4 ◦C'de 30 dakika inkübe edildi. Hücre kalıntılarını gidermek için 13,000×g'de ve 4 ◦C'de 30 dakika santrifüj gerçekleştirildi. Süpernatan, maksimum saflık elde etmek için 13,000×g ve 4 ◦C'de 30 dakika daha santrifüjlendi. Süpernatantlar toplandı ve peletler atıldı ve elde edilen numuneler hemen kullanıldı veya kullanılıncaya kadar -80 ◦C'de saklandı. Tuz kontaminasyonunu azaltmak ve proteinleri zenginleştirmek için Wessel ve Flügge [49]'e göre metanol-kloroform çöktürmesi yapılmıştır. Pelet kurutuldu ve lizis tamponu içinde çözüldü. Toplam protein konsantrasyonu, Bradford'a göre Bio-Rad protein tahlili (Bio-Rad, Hercules, CA, ABD) kullanılarak belirlendi. Standart olarak BSA (Sigma, Steinheim, Almanya) kullanıldı. Deneysel tekrarlanabilirliği garanti etmek için, her birinden üçlü jeller oluşturduk.böbrekhavuz. 2D protein ayrımı, daha önce tarif edildiği gibi gerçekleştirildi [50]. 2-DE jelleri, üretici talimatları izlenerek Flamingo floresan jel boyası (Bio-Rad, Hercules, CA, ABD) ile boyandı. Boyamadan sonra jeller, Fuji FLA-5100 tarayıcıda 50 µm çözünürlükte tarandı. Dijitalleştirilmiş görüntüler Delta 2D 3.4 (Decodon, Braunschweig, Almanya) kullanılarak analiz edildi. Protein görselleştirmesi için 2-DE jelleri ayrıca gece boyunca kolloidal Coomassie mavisi, Roti-Blue (Roth, Karlsruhe, Almanya) ile boyandı.

4.9. Kütle Spektrometrik Analizi ve Protein Tanımlaması

Jellerden belirgin şekilde düzenlenmiş noktalar çıkarıldı ve triptik jel içi sindirim ve peptit ekstraksiyonu, daha önce Dihazi ve diğerleri tarafından tarif edildiği gibi yapıldı. [51]. Kısaca, jel lekeleri iki kez 25 mM amonyum bikarbonat (amBic) içinde ve bir kez suda durulandı, 15 dakika boyunca yüzde 100 asetonitril (ACN) ile küçültüldü ve bir SpeedVac (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD) 20–30 dakika. Eksize edilen tüm noktalar, 12.5 ng/uL sıralama dereceli tripsin (Roche Molecular Biochemicals, Basel, CH) ile gece boyunca 37 ◦C'de 25 mM amBic içinde inkübe edildi. Peptid ekstraksiyonu, ilk olarak yüzde 50 ACN/1 yüzde trifloroasetik asit (TFA) ve ardından yüzde 100 ACN kullanılarak iki kez gerçekleştirildi. Tüm özler bir araya toplandı ve hacim SpeedVac kullanılarak düşürüldü. Triptik peptitler, bir nanoflflow ESI Z-sprey ile donatılmış bir Q-TOF Ultima Global kütle spektrometresi (Micromass, Manchester, UK) kullanılarak kütle spektrometrik sıralamaya tabi tutuldu. Protein tanımlaması, Mascot arama motoruyla MSDB ve Swissprot veritabanlarına karşı bir peptit kütle toleransı ve 0.5 Da'lık parça toleransı kullanılarak gerçekleştirildi.

CISTANCH BÖBREK/BÖBREK YETMEZLİĞİNİ İYİLEŞTİRECEK

4.10. Jel Triptik Sindirimde Protein Ekstraksiyonu, SDS-PAGE ve Kütle Spektrometrik Analizleri

Calr/'deki protein değişikliğinin kütle spektrometrik ölçümü içinböbrek, aynı genotip ve aynı anneden alınan örnekler bir araya toplanmıştır. Yeterli havuz oluşturmak ve biyolojik ve deneysel replikasyonu sağlamak için 8-10 embriyo/fare ile 6 farklı hamile Cal plus // kullandık. embriyonikböbreklerüç genotipten embriyolardan hasat edildi ve protein ekstraksiyonu, yukarıda tarif edildiği gibi lizis tamponu kullanılarak gerçekleştirildi. Protein ekstraktları SDS-PAGE ile ayrıldı, jeller Coomassie Blue ile boyandı, her şerit eksize edildi ve eşit büyüklükte 20 dilime kesildi ve dilimler tripsin ile jel içi sindirime tabi tutuldu. Kütle spektrometrik analiz için, numuneler kendi kendine paketlenmiş ters faz-C18 ön sütununda (0.15 mm ID × 20 mm, Reprosil-Pur120 C{{11}) zenginleştirildi }AQ 5 µm, Dr. Maisch, Ammerbuch-Entringen, Almanya) ve analitik ters çevrilmiş faz-C18 kolonu (0) üzerinde ayrıldı.075 mm ID × 200 mm, Reprosil-Pur 120 C{ {21}}AQ, 3 µm, Dr. Maisch) 300 nl dakikada yüzde 5-35 asetonitril/yüzde 0.1 formik asitten (hacim:hacim) oluşan 30 dakikalık bir doğrusal gradyan kullanılarak-1). Eluent, bir FlexIon nanoSpray kaynağı ile donatılmış ve Excalibur 2.4 yazılımı altında veriye bağlı bir toplama yöntemi kullanılarak çalıştırılan bir Q Exactive hibrit dört kutuplu/orbitrap kütle spektrometresinde (ThermoFisher Scientific, Dreieich, Almanya) analiz edildi. Her bir deney döngüsü şu biçimdeydi: 350–1600 m/z aralığında bir tam MS taraması 70,000 FWHM ve 106 AGC hedefi ve maksimum 60 ms dolum süresinde elde edildi. . 2 x 104 yoğunluk eşiğinin üzerinde 2 ila 5 arasında en bol bulunan 12 peptit öncül şarj durumu daha sonra 2.0 FWHM izolasyon genişliğinde sırayla izole edildi, yüzde 25'lik normalleştirilmiş bir çarpışma enerjisi ayarında nitrojen ile parçalandı ve elde edilen ürün iyon spektrumları 17.500 FWHM çözünürlük ayarında kaydedildi ve 2 × 105'lik bir AGC hedefi ve maksimum 60 ms'lik bir doldurma süresi vardı. Seçilen öncül m/z değerleri daha sonra sonraki 15 s için hariç tutulmuştur. Numune başına iki teknik kopya elde edildi. Zirve listeleri, Raw2MSMS yazılımı v1.17 (Max Planck Biyokimya Enstitüsü, Martinsried, Almanya) kullanılarak ham verilerden çıkarıldı. Protein tanımlaması, MASCOT 2.5.1 yazılımı (Matrixscience, London, UK) kullanılarak sağlandı. Proteinler, UniProtKB fare referans proteom v2017.09'a (16930 protein girişi) ve laboratuvarımızda yaygın olarak tanımlanan bir dizi 51 kirleticiye karşı tanımlandı. Arama, enzim olarak tripsin ve sistein bloke edici ajan olarak iyodoasetamid ile yapıldı. Değişken bir modifikasyon olarak en fazla iki kaçırılmış triptik bölünmeye ve metionin oksidasyonuna izin verildi. Arama toleransları öncü kütle için 10 ppm ve fragman kütleleri için 0.05 Da olarak ayarlandı ve alet tipi olarak ESI-QUAD-TOF belirlendi. MS/MS bazlı peptit ve protein tanımlamalarını doğrulamak için Scaffold yazılım versiyonu 4.8.9 (Proteome Software Inc., Portland, OR, ABD) kullanıldı. Percolator algoritması tarafından yüzde 95,0'dan daha büyük bir olasılıkla oluşturulabiliyorsa peptit tanımlamaları kabul edildi. Protein tanımlamaları, minimum 2 güvenle tanımlanmış peptitte yüzde 1'lik bir yanlış keşif oranına kesildi. Benzer peptitler içeren ve ayrıca tek başına MS/MS analizine dayalı olarak ayırt edilemeyen protein isabetleri, tutumluluk ilkelerini karşılamak için gruplandırılmıştır. Önemli peptit kanıtlarını paylaşan proteinler, kümeler halinde gruplandı. Protein bollukları, tüm kopyalar arasındaki toplam toplam normalizasyonun ardından Spektral Sayımları ile tahmin edildi.

4.11. Western Blot Analizi

Western blot analizleri Towbin ve ark. [52]. Eşit miktarlarda protein (50–75 ug), poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile ayrıldı ve nitroselüloz membranlara (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK) aktarıldı. Zarlar, bir TBST tamponunda (20 mM Tris-HCl, pH 7.4 150 mM NaCl yüzde 0.1 Tween 20) yüzde 5 yağsız kuru süt içinde bloke edildi ve birincil antikorlarla (anti-Calr, anti -Rps10, anti-Rps19, anti-Rps26 ve anti-eIF5A) gece boyunca 4 ◦C'de. Protein bantlarını görselleştirmek için floresan etiketli ikincil antikorlar kullanıldı. Eşit protein yüklemesini doğrulamak için lekeler, anti-Actb veya anti-GAPDH antikorları (Sigma, Taufkirchen, Almanya) ile işlendi.

4.12. biyoinformatik

Tanımlanan proteinlerin başlıca bilinen ve varsayılan işlevlerine göre sınıflandırılması, DAVID biyoinformatik (http://david.abcc. ncifcrf.gov, erişim tarihi 21 Şubat 2019) [53,54] kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Gen ontolojisi (GO) açıklamalarını (biyolojik süreçler ve moleküler fonksiyonlar) araştırmak ve kategorize etmek için gen sembolleri kullanıldı. Tanımlanmış proteinlerin bilinen ve tahmin edilen protein-protein etkileşimlerinin ağ analizi, STRING (Etkileşen Genlerin/Proteinlerin Geri Alınması için arama aracı) [55] kullanılarak yapıldı.

4.13. İstatistiksel analiz

{{0}}DE için dijitalleştirilmiş görüntüler analiz edildi ve jeller arasında nokta eşleştirme ve normalizasyon Delta2D 3.4 (Decodon, Braunschweig, Almanya) kullanılarak yapıldı. Delta2D, algılanan her nokta için bir "nokta kalitesi" değeri hesaplar. Bu değer, bir noktanın "ideal" 3D Gauss çan şeklini ne kadar yakından temsil ettiğini gösterir. Ortalama nokta hacmi oranına dayalı olarak, karşılaştırılan örnekler arasında göreli ifadesi en az 2-kat (artış veya azalma) üç kopya olarak değişen noktalar anlamlı olarak kabul edildi. Protein düzenlemesinin önemini analiz etmek için Student t testi yapıldı ve 0.05'ten küçük P değerleri için istatistiksel anlamlılık varsayıldı. Tüm lekeler, ImageJ yazılımı kullanılarak ölçülmüştür. Veriler, yazılım paketi GraphPad Prism, sürüm 8 (San Diego, CA, ABD) ile derlendi. Yazılım, Student t-dağılımı veya tek yönlü ANOVA ile grafik sunum ve analiz için kullanıldı. Sonuçlar, en az üç bağımsız deneyden elde edilen ortalama ± sd olarak sunulur. Farklılıklar, p < 0.05="" olduğunda="" istatistiksel="" olarak="" anlamlı="" kabul="" edildi.="" üreter="" tomurcuk="" uçları="" ve="" nefronlar="" manuel="" olarak="" sayıldı="" ve="" veriler="" graphpad="" prism,="" sürüm="" 8="" yazılım="" paketi="" ile="">