Klinik Olarak İlgili Bir Saçmalık Mutasyonun Neden Olduğu Ataksi Telanjiektazinin Yeni, Ataksik Fare Modeli(Bölüm 1)

Daha fazla bilgi edinmek için lütfen iletişime geçindavid.wan@wecistanche.com

Soyut

Ataksi Telanjiektazi (AT) ve Oküler Apraksi Tip 1(AOA1) ile Ataksi, sırasıyla AT mutasyona uğramış (ATM) ve Aprataksin (APTX) genom stabilite genlerindeki boş mutasyonların neden olduğu yıkıcı nörolojik bozukluklardır. Bu bozuklukların tedavisine yönelik mekanik anlayışımız ve terapötik repertuarımız, büyük ölçüde, benzer boş mutasyonlara sahip önceki hayvan modellerinin karakteristik motor koordinasyon kaybını (yani, ataksi) ve ilişkili serebellar kusurları özetlemedeki başarısızlığından dolayı ciddi şekilde eksiktir. artırarakgenotoksikAynı hayvanda hem Atm (saçma) hem de Aptx (nakavt) genlerinde boş mutasyonların eklenmesi yoluyla stres, ilk kez serebellar moleküler atrofi ile ilişkili ilerleyici bir şiddetli ataksik fenotip geliştiren yeni bir fare modeli oluşturduk. katman. Serebellar Purkinje nöronlarının biyofiziksel özelliklerinin önemli ölçüde bozulduğunu (örneğin, azaltılmış zar kapasitansı, daha düşük aksiyon potansiyeli eşikleri, vb.), sinaptik girdilerin özellikleri büyük ölçüde değişmeden kaldığını bulduk. Bunlartedirginliklerspontan aksiyon potansiyeli ateşlemesinde ilerleyici bir azalma da dahil olmak üzere Purkinie nöron nöral aktivitesini önemli ölçüde değiştirir

hayvanın yaşamının ilk yılında hem serebellar atrofi hem de ataksi ile ilişkili olan sıklık. Çift mutant fareler ayrıca kanser (timomalar) ve bağışıklık anormallikleri (bozulmuş erken timosit gelişimi ve T-hücre olgunlaşması), AT'nin karakteristik semptomlarını geliştirmeye yüksek bir yatkınlık sergiler. Son olarak, Atm'ye klinik olarak ilgili anlamsız tipte bir boş mutasyon ekleyerek, Küçük Molekül Okuması (SMRT) bileşiklerinin ATM üretimini geri yükleyebileceğini ve gelecekteki bir AT terapötik olarak potansiyellerini gösterdiğini gösterdik.

Cistanche hakkında daha fazla bilgi için buraya tıklayın

1.0 Giriş

Ataksi Telenjiektazi (AT), kansere yatkınlık, immün yetmezlik ve yüksek oranda penetran ilerleyici ve şiddetli ataksi ile karakterize otozomal resesif geçişli bir genetik bozukluktur. serebellar atrofiye (Rothblum-Oviatt ve ark. 2016; Boder ve Sedgwick 1958; Levy ve Lang 2018). AT hastaları tipik olarak yaşamlarının ikinci veya üçüncü on yılında (Crawford ve ark. 2006) lenfatik kanserler, solunum yolu enfeksiyonları veya ataksinin komplikasyonlarından ölürler - ne yazık ki hayatta kalma oranı 1950'lerden bu yana önemli ölçüde değişmemiştir (Micol ve ark. 2011; Rothblum- Oviatt ve ark.2016). Hastalığın ilerlemesi ve ölüm nedeni hastalar arasında büyük farklılıklar gösterse de, motor koordinasyondaki oldukça nüfuz edici ilerleyici düşüşün, bir hastanın yaşam kalitesi üzerinde en büyük olumsuz etkiye sahip olduğu bildirilmektedir (Jackson ve ark. 2016). Bakım genellikle kanserleri veya enfeksiyonları azaltmaya, sınırlamaya veya ortadan kaldırmaya yönelik palyatiftir. Ataksi ve ilişkili serebellar disfonksiyon ve atrofiyi tedavi etmek için uzun süreli tedaviler mevcut değildir. AT, ATM'nin eksikliğinden veya işlevsizliğinden kaynaklanır(AT mutasyona uğradı) protein (Savitsky ve diğerleri, 1995). Anlamsız mutasyonlara neden olan erken sonlandırma kodonu (PTC), hatalı anlamlılık ve silme mutasyonlarının da katkıda bulunduğu bilinen vakaların yarısına kadar sorumludur (Concannon ve Gatti 1997; Sandoval ve diğerleri. 1999). ATM, DNA hasar yanıtında (DDR) kilit rol oynayan ve hücreleri her gün meydana gelen on binlerce DNA lezyonundan koruyan bir serin/treonin PIKK ailesi kinazıdır (Lindahl ve Barnes 2000; Kastan ve Bartek 2004; Shiloh ve Ziv). 2013).Aktif monomerik formda, ATM, yeni DNA üretimini durduran (hücre döngüsü durması)(Ando ve diğerleri.2012) birkaç anahtar proteini fosforile eder ve ardından hasarın ciddiyetine bağlı olarak, DNA onarımını veya programlanmış hücreyi başlatır. ölüm (yani, apoptoz)(Ando ve diğerleri.2012; Rashi-Elkeles ve diğerleri.2006). ATM'nin birkaç aşağı akış DDR yolu hedefi, p53, CHK2, BRCA1, SMC1 ve NBS1 (Matsuoka ve diğerleri.2007) dahil olmak üzere tanımlanmıştır. ATM'nin DNA onarımındaki rolü, katkıda bulunmasının önerildiği normal bağışıklık sistemi gelişiminde de rol oynar. T- ve B-lenfosit olgunlaşmasında genin yeniden düzenlenmesi sırasında meydana gelen doğal DNA eklemesinin rekombinasyonuna (Chao, Yang ve Xu 2000; Matei, Guidos ve Danska 2006; Vacchio ve diğerleri.2007; Schubert, Reichenbach ve Zielen 2002) ). Rolleri hala ortaya çıkmakta olsa da ATM, oksidatif stres homeostazında (Guo ve ark. 2010) ve mitofajide (Valentin-Vega ve Kastan 2012; Pizzamiglio, Focchi ve Antonucci 2020) de yer almıştır. ATM eksikliğinin neden ataksiye neden olduğu açık değildir, ancak Aprataksin gibi ataksi ile bağlantılı tek DDR proteininden çok uzaktır.APTX) (Aicardi et al.1988), Meiotic rekombinasyon 11 homolog 1(MRE11)(Sedghi et al.2018), Nibrin (NBS1)(van der Burgt et al.1996), Senataxin (SETX) (Moreira et al.2004) ve Tyrosyl-DNA Phosphodiesterase 1 (TDP1)(Takashima ve ark. 2002) olmadığında veya işlevsiz olduğunda serebellar ile ilişkili ataksiye neden olabilir. Bu, henüz mekanik olarak kanıtlanmamış olmasına rağmen, genom kararsızlığı sendromlarının nörolojik özelliklerinin ortak bir altta yatan nedene sahip olduğunu göstermektedir (McKinnon 2009; Rass, Ahel ve West 2007). ATM gibi DDR proteinlerinin kaybının neden seçici olarak serebellumu etkilediğini ve ilerleyici ataksiye neden olduğunu tanımlama yeteneğimizi sınırlayan önemli bir faktör, bu nörolojik semptomları özetleyen bir hayvan modelinin olmamasıdır (Lavin 2013). Son birkaç yılda, protein işlev bozukluğuna (kinaz aktivitesi eksikliği) veya tam eksikliğe neden olan gen mutasyonlarının eklenmesiyle birkaç AT kemirgen modeli oluşturulmuştur (Herzog ve diğerleri.1998; Xu ve Baltimore 1996; Elson ve diğerleri.1996; Spring ve diğerleri. 2001; Campbell ve diğerleri 2015; Quek ve diğerleri 2016; Tal ve diğerleri 2018; Lavin 2013); yakın zamanda bir mini domuz da rapor edilmiştir (Beraldi ve ark. 2017). Bununla birlikte, tiroid kanserleri, kısırlık ve bağışıklık anormallikleri gibi bozukluğun diğer yönleri gelişse bile, hiçbiri insan hastalığını özetleyen serebellar disfonksiyon ve atrofi ile açık, ilerleyici ataksi geliştirmez. Bu önceki hayvan modellerinin neden ilerleyici ataksik fenotipi gösteremediği belirsizliğini koruyor (Lavin 2013). Farelerde türe özgü moleküler telafilerin, beyindeki ATM eksikliğinin etkilerini en aza indiren artıklıklar veya alternatif yollar sağlaması mümkündür (El-Brolosy ve Stainier 2017). Önceki modellerin kısaltılmış ömrünün (Barlow ve ark. 1996), serebellar disfonksiyon ve atrofiyi harekete geçiren stokastik mekanizmalar için birikip motor davranışı etkilemesi için çok kısa olması da mümkündür. Diğer zorluklar arasında, düşük ATM protein seviyeleri veya kalıntı kinaz aktivitesine sahip aktif fragmanlar ile sonuçlanan ve böylece nöropatolojiyi sınırlayan potansiyel olarak sızdıran genetik manipülasyonlar yer alır (Li ve ark. 2011). Böylesine önemli bir hayvan modelini kaçırmanın etkisi,

önemliydi, deneysel çalışmaları hücresel ve moleküler mekanizmaları tanımlamaktan ve klinik öncesi geliştirmeyi ve çok ihtiyaç duyulan terapötiklerin test edilmesini engellemekten ciddi şekilde sınırladı. Burada, yalnızca Atm genine değil, aynı zamanda ilgili Aptx genine de boş mutasyonlar yerleştirerek artan genotoksik stresin, serebellar disfonksiyon, atrofi ve ilerleyici ataksi gelişimini gösteren daha temsili bir fare modeline yol açıp açmadığını test ediyoruz. Aptx'i ek olarak devre dışı bırakmayı seçtik çünkü eksikliği insanlarda ataksi adı verilen AT benzeri bir bozukluğa neden olur ve oküler apraksi tip 1(AOA1), which does not feature A-T's other system defects that could increase the potential for prenatal lethality or early death (e.g., immunodeficiency and cancer predisposition)(Coutinho P 2002).Moreover, APTX is a phosphodiesterase involved in DNA reassembly after double-and single-stranded repair, and has a function downstream of—but not directly regulated by or related to—ATM (Gueven et al.2004; Schellenberg, Tumbale, and Williams 2015; Ahel et al.2006).We hypothesized that the functional expression of both proteins would have an additive effect and induce neurological dysfunction. Our results indeed demonstrate that mice deficient in ATM and APTX develop cerebellar dysfunction, atrophy, and progressive and profound ataxia, while mice deficient in either protein alone do not Additionally, double mutants displayed other characteristic symptoms of A-T, including defects in immune maturation and a high incidence of cancer (thymomas), making it the most representative model, from a phenotypic standpoint to date. Finally, we designed this new mouse model to test our recently developed Small Molecule Read-Through Compounds(SMRT)that enable translation through premature termination codons(Du et al.2013). Thus, we inserted a premature termination-causing nonsense mutation (103C>T) büyük bir Kuzey Afrika AT hastaları ailesinde ortak olan Atm geninde (Gilad, Bar-Shira, et al.1996). Bu mutasyon, normalde amino asit 35 olacak olan bir erken sonlandırma kodonuna (PTC) ve ATM translasyonunun kaybına neden olur. Burada, AT fare modeline dahil edilen klinik olarak ilgili genetik mutasyonların bileşikleri baştan sona okumaya uygun olduğunu ve dolayısıyla SMRT bileşiklerinin klinik öncesi testi için uygun olduğunu gösteren ilke kanıtı deneylerini rapor ediyoruz.

2.0 Sonuçlar

2.1 Creation of a new A-T mutant mouse model expressing a clinically relevant nonsense mutation To create a more clinically relevant mouse model of A-T we used a gateway recombination cloning and site-directed mutagenesis method to recapitulate a c.103C>T(p.R35X) mutation in the ATM gene found in a large population of North African A-T patients(Fig.1A and Methods)(Gilad, Khosravi, et al. 1996). The insertion of thymine in place of cytosine at this site in exon 3 results in a premature termination codon(PTC)-causing nonsense mutation in the ATM gene. Since the c.103C>T mutasyonu, fare Atm'sine kıyasla insan geninde farklı PTC'lerle sonuçlanırgen—TGA vs. TAG, respectively—we created two different mice by exchanging the mouse Atm exon 3 with either a human or mouse exon 3 variant with the c.103C>T mutation(Fig.1B). In the human variant, a 103C>T mutation of the mouse codon, where the arginine(R) encoding codon(CGA) becomes a TGA stop codon, results in a mouse we denote as AtmR35×(officially Atm'm103cAc)rGAMag). In the mouse variant, the c.103C>T mutasyonu, glutamin (Q) kodlayan CAG kodonunu bir TAG durdurma kodonuna dönüştürür ve Atm235×(resmi olarak Atmm1.103c)zamanı ile gösterilir. PTC'nin mevcudiyeti, ATM ekspresyonunun kaybıyla sonuçlanır, bu ya bir normal fare kopyasını eksprese eden heterozigotta yaklaşık yarı yarıya azalır.

veya Atm Q35v35×) (Şekil veya Atm 835×) veya tamamen homozigotta (Atm?35×R35×Atm geninde (Atm35× artı 1C).

Atm35x7R35×; Aptx^(çift mutant) fareler, ilk olarak tek mutant AtmF3xR3x (C57BL/6J arka planında konjenik) ve Aptx' (karışık C57BL/6J ve 129 arka plan) fareleri ile Aptx* farelerinin çaprazlanmasıyla oluşturulmuştur. F1-5 littermate Atm"; Aptx* fareleri daha sonra, farklı miktarlarda ATM ve APTX kaybının hayvanın fenotipini nasıl etkilediğini belirlemek için istenen deneysel ve kontrol genotiplerinden yeterli sayıda oluşturmak üzere yavrular içinde heterozigot Atm oluşturmak üzere çaprazlandı( Şekil 1D).

Önceki ATM eksikliği olan AT fare modellerinde olduğu gibi, ATM veya APTX eksikliği tek başına ataksili farelerle sonuçlanmadı (Video 1 ve 2). Bununla birlikte, her iki proteindeki (Atm35k35x; Aptx') eksiklik, ciddi ve ilerleyici bir ataksik fenotipin gelişmesine neden olur (Şekil 1E, Video 3 ve 4).

2.2 ATM eksikliği olan fareler, hayatta kalma oranını ve yüksek timoma insidansını azalttı

Farklı ATM ve APTX seviyeleri ifade eden kontrol ve deney farelerinin genel sağlığını ve gelişimini değerlendirdik(Şekil 2). Atm735xR35×'i bulduk; Aptx^'fareler yaklaşık yüzde 55 daha yavaş büyüdü ve kontrol genotiplerinden (log-rank, n=21 ila 40,p) yaklaşık yüzde 35 daha az olan tahmini plato ağırlıklarına ulaştı<0.0001; fig.="" 2a).="" these="" differences="" in="" weight="" were="" a="" postnatal="" phenomenon,="" as="" no="" significant="" weight="" differences="" were="" detected="" just="" after="" birth="" (p8)="" across="" all="" genotypes(1-way="" anova,n="5" to="" 23,="" p~0.23).="" adolescent="" double="" mutant="" mice="" at="" postnatal="" day="" 45(p45)weighed="" on="" average="" 30%="" less="" than="" male="" mice="" [double="" mutant:14.4±1.0g="" (n="13)vs." wildtype:20.2±0.5="" g(n="16),"><0.0001] and="" 25%less="" in="" females="" [double="" mutant:12.7±0.6g="" (n="17)" vs.wildtype:17.0±0.2g(n="15)," test,=""><0.0001; fig.="" 1a].differences="" across="" the="" control="" genotypes="" were="" observed,="" but="" they="" were="" small="" and="" not="" consistent="" across="" time="" points="" or="" sex="" and="" therefore="" judged="" to="" not="" be="" physiologically="" relevant="" (fig.="" 2a).="" survivability="" of="" the="" atm735xr35×;="" aptx*="" mice="" was="" significantly="" reduced="" compared="" to="" atm*;="" aptx*="" mice,="" with="" 53%="" of="" mice="" still="" alive="" at="" 400="" days="" of="" age,="" compared="" to="" 97%="" of="" atm*;="" aptx*="" mice="" at="" the="" same="" time="" point="" (fig.2b).atm="" deficiency="" alone="" was="" sufficient="" to="" reduce="" survivability;="" as="" compared="" to="" atm*;="" aptx*="" mice,="" both="" atm35xr35×;="" aptx*="" and="" atm735x/r35x;="" aptx*="" mice="" had="" significantly="" reduced="" survivability="" [42%,log-rank,xu5="13.49,p=0.0002" and="" 52%,log-rank,xu,53)=""><0.0001,respectively]. no="" significant="" difference="" in="" survivability="" between="" atm-deficient="" mice="" with="" partial="" or="" complete="" aptx="" deficiency="" was="" detected="" [log-rank,="" x(2.85)="1.01,p=0.6]." conversely,="" mice="" harboring="">

least one functional copy of the Atm gene had normal survivability, regardless of whether they expressed APTX or not [log-rank, X(3 131)=3.08, p=0.4]. No significant difference between male and female mice was observed, and thus data were pooled [log-rank, p>0.4 tüm ikili karşılaştırmalar için; Şekil.2-şek.S1B]. Genel olarak, ATM eksikliği olan farelerin üçte biri, göğüs boşluğunda bulunan büyük timik kanserler (timoma) ile ilgili komplikasyonlardan öldü (Şekil 2C). APTX'in varlığı veya yokluğu kanser prevalansını etkilemedi ve en az bir Atm transkripti olan fareler en az P400'e kadar kansersizdi. Genel olarak, APTX eksikliği değil, ATM'nin farelerin sağlığı ve hayatta kalması üzerinde ciddi etkileri oldu.

2.3 Hem ATM hem de APTX eksikliği ilerleyici motor işlev bozukluğu oluşturmak için gereklidir

Şiddetli ataksinin ilerleyici gelişimi, Atm'de özetlenen AT'nin ayırt edici bir özelliğidir? 35/R35x; Aptx' fareleri, ancak test ettiğimiz diğer kontrol genotiplerinin hiçbiri. Genel olarak, Atm735Xk3x'te doğumdan sonra 210 ile 400 gün arasında motor koordinasyon eksikliklerinin ortaya çıktığını bulduk; Aptxmice'i deneyin ve Atm veya Aptx geninin en az bir kopyasına sahip farelerde ataksi kanıtı bulun (Şekil 3A, B). Dikey kutup testi için Atm735xR3x×; Aptx' farelerinin P400'a inmesi, Atm*;Aptx*,Atm*; Aptx',Atm735xR35×; Aptx* veya Atm35×*; Aptx' fareler [Erkek:29,1±0,9s(n=3) vs 7,5±0,4s(n=12),12,5±2,5s(n=9),9,2±0,9s (n=10),8.6±0.9s(n=11),1-yol ANOVA,F4.40=19.9,p<0.001;female:19.0±4.0s(n=4)was.7.5±0.4s(n=12),7.8±0.4s(n=10),10.5±1.2s(n=6), 8.2±0.5="" s(n="8),1-way" anova,="" f4,="" 35="13.9,"><0.0001]. an="" examination="" of="" gait="" indicated="" thatatm?35×r35×;="" aptx^="" mice="" at="" p400,="" but="" not="" p210="" need="" additional="" stabilization="" during="" ambulation,="" as="" they="" spend="" twice="" as="" much="" time="" with="" 3="" paws,="" rather="" than="" the="" normal="" 2,="" in="" contact="" with="" the="" ground="" as="" they="" walk="" across="" the="" gait="" analysis="" platform="" [male:="" 56.2="" vs.="" 26.4="" to="" 32.2="" %,1-way="" anova,="" f4.54)="14.3,"><0.0001; female:="" 58.4="" vs.18.9="" to="" 28.8="" %,1-way="" anova,="" f3.178)="95.5,"><0.0001; fig.3b].="" atm35xr35×;="" aptx'="" also="" display="" a="" slower="" cadence="" and="" average="" speed="" across="" the="" platform="" compared="" to="" all="" other="" genotypes="" at="" p400="" [cadence,="" male:9.5="" vs.="" 13.3="" to="" 15.9="" steps/s,="" 1-way="" anova,="" f3.204)=""><0.0001;female: 9.1="" vs.14.2="" to="" 15.9="" steps/s,1-way="" anova,f,204)="39.7,"><0.0001;speed, male:8.8="" vs.22="" to="" 26="" cm/s,1-way="" anova,="" f4.50)=""><0.0001;female: 58.4vs.18.9="" to="" 28.8="" cm/s,1-way="" anova,="" f3.178)="39.7,"><0.0001;fig.3b; fig.3-fig.="" s1].="" this="" difference="" in="" speed="" and="" cadence="" is="" unlikely="" to="" be="" caused="" by="" the="" animal="" size,="" as="" there="" are="" no="" significant="" differences="" in="" these="" parameters="" at="" earlier="" time="" points="" when="" the="" difference="" in="" size="" is="" significant(fig.2a).="" these="" observations="" across="" the="" two="" behavioral="" tests="" were="" found="" in="" both="" male="" and="" female="" mice="" at="" each="" of="" their="" respective="" time="" points,="" consistent="" with="" the="" lack="" of="" sex="" differences="" observed="" in="" a-t="" patients.="" we="" further="" examined="" behavioral="" differences="" between="" the="" atm735xr35x;="" aptx'="" and="" atm*;="" aptx*="" mice="" using="" a="" standardized="" set="" of="" experimental="" procedures="" used="" to="" phenotype="" genetically="" modified="" mice="" (i.e.,="" sherpa;="" fig.3c;="" fig.3-fig.s1)(rogers="" et="" al.1997).="" we="" first="" detected="" differences="" in="" motor="" function="" at="" p8,="" where="" atm35xr35×;aptx'="" mice="" took="" 3-4="" times="" longer="" on="" average="" to="" right="" themselves="" compared="" to="" atm*;aptx*mice="" [male:="" 6.4±1.1="" s(n="24)vs.1.5±0.1" s(n=""><0.0002;female: 11.1±1.9s(n="21)was.2.4±0.3s" (n=""><0.0002;fig.3c bottom].at="" 30="" days="" of="" age,="" we="" detected="" x;="" aptx*="" and="" atm*+;="" aptx**="" mice="" in="" behavioral="" tests="" that="" significant="" differences="" between="" atm735×r35×;="" qualitatively="" measured="" body="" position="" and="" spontaneous="" activity(fig.3c).="" striking="" differences="" in="" atm35×r35×;="" aptx^'="" compared="" to="" atm*;="" aptx*"="" mice="" were="" observed="" at="" p400,="" especially="" for="" behaviors="" related="" to="" movement,="" including="" locomotor="" activity,="" body="" position,="" and="" gait(fig.3c).="" the="" results="" from="" this="" battery="" of="" tests="" demonstrate="" that="" atm35×r35x;="" aptx*mice="" develop="" a="" severe="" change="" in="" behavior="" by="" p400,="" consistent="" with="" purely="" visual="" observations="" of="" significant="" motor="" coordination="" deficits="" in="" the="" mice="" up="" to="" this="" time="" point.="" importantly,="" we="" do="" not="" find="" any="" significant="" differences="" between="" the="" other="" control="" genotypes,="" including="" atm35×;="" aptx*="" mice="" that="" express="" at="" least="" some="" atm="" but="" no="" aptx="" protein="" (fig.="">

2.4 ATM ve APTX eksikliği olan Purkinje nöronlarında membran ve sinaptik özellikler bozulur

Purkinje nöronları (PN), serebellar kortekste bulunan önemli bir nöronal alt tiptir. Önemli içsel uyarılabilirlik sergilerler, beyindeki diğer nöronların çoğundan önemli ölçüde daha yüksek oranlarda (birçok durumda 50 ila 100 Hz daha fazla) aksiyon potansiyellerini kendiliğinden ateşlerler. Aktiviteleri, ön beyin, beyin sapı ve omurilikteki motor koordinasyon merkezlerine yansıyan serebellar çekirdeklerin nöronlarının tonik inhibisyonu yoluyla serebellar çıktıyı şekillendirir. Serebellar PN disfonksiyonu, çeşitli ataksi formları ile ilişkilidir ve AT (Hoxha ve ark.2018: Cook. Fields. ve Watt 2021: Shiloh Aptx*-X/R35X.2020) ile ilişkilidir. Bu nedenle, Atm' serebellumundaki PN'lerin elektrofizyolojik özelliklerinin anormal olup olmadığını inceledik. PN taban çizgisi aktivitesi ve girdiye karşı tepkiye, bir temel pasif ve aktif membran özellikleri seti aracılık ettiğinden (Şekil 4), Atm35XR35×'den hasat edilen akut serebellar bölümlerde PN'lerin membran özelliklerini doğrudan kaydettik ve karşılaştırdık; Aptx* ve Atm*; Aptx* fareler(P350 ila 400). Atm35xR35×'den kaydedilen PN'ler; Aptx fareleri, Atm'den daha yüksek membran giriş dirençleri (Rm) sergileyen, önemli ölçüde "daha sıkı" zarlara sahipti; Aptx* fareleri [47.7±5.6 (n=15) vs.)

30.2±1.47(n=23)MQ, t-testi,p-0.008; Fig.4B] ve daha hızlı bir membran zaman sabiti() [3.6±0.4(n=15)vs.5.1±0.3(n=23)ms, t-test, p=0 gösterdi .009;Şek.4B]. Bu sonuçlar, Atm35x/35x;Aptx^PN'lerin toplam membran kapasitansının (Cm=t/Rm) önemli ölçüde azaldığını gösterir [98.25±19.23(n=15)vs.175.6± 12.67(n) =23)pF,t-test,p=0.0025;Fig.4B].Hücresel düzeyde, bu, ATM ve APTX eksikliği olan PN'lerin daha az (yani, azalan alan) olduğunu gösterir. veya daha ince membranlar

vahşi tip PN'lerinkinden daha fazla, gelişimsel bir eksiklik veya nörodejeneratif süreci düşündüren bir sonuç; Aptx/-ve (DellOrco et al.2015). Daha sonra, AtmR35xR3x'te PN'lerin içsel uyarılabilirliğini değerlendirdik;

PN aksiyon potansiyeli (AP) oluşumunu ve dinamiklerini inceleyerek Atm*;Aptx* fareleri. Mevcut enjeksiyona yanıt olarak PN'lerin sürekli olarak ateşlenme yeteneklerinde önemli eksiklikler, Atm?35x3x;Aptx^ farelerinde gözlendi (Şekil 4C). Bu eksiklikler, uyarılmış aksiyon potansiyellerinin amplitüdü, eşiği ve alanındaki önemli pertürbasyonlarla ilişkilendirildi [amplitüd: 66.2± 0.7 (n=14) vs.). 72.1±1.4 (n=13)AmV,t-testi,p=0.003;eşik:-55.2±1.5vs.-48. 61±1.9 mV,t-testi,p=0.0196; alan:17.96±0.6vs.

20.63± 1.0 mV*ms, t-testi, p=0.048; Şekil 4C]. Birlikte, bu deneyler, At/mR35×R35× serebellumunda normal olarak işlev görme yeteneklerini bozan PN fizyolojik özelliklerinde önemli bozulmaları gösterir; Aptx' fareleri.

Daha sonra, dışsal ve/veya sinaptik PN özelliklerinin de AtmR35xR3sx'te etkilenip etkilenmediğini test ettik. Aptx* fareler. İlk önce granül hücre-PN sinapsları (yani paralel fiber girişleri) tarafından oluşturulan spontan uyarıcı sinaptik sonrası akımları (iPSC) inceledik. UPSC boyutunda hiçbir fark saptanmadı, bu da granül hücre akson terminallerinin (yani paralel liflerin) işlevinin AtmR35KR35X'te nispeten normal olduğunu gösterir;Aptx'cerebellum[18.92±1.3(n{{10}}) idi. 23.4±3.3(n=11)pA,t-testi,p=0.477;Fig.4D](Yamasaki, Hashimoto ve Kano 20{{5{{58}) }}}6). Bununla birlikte, sEPSC frekansının önemli ölçüde arttığı bulundu; bu, toplam sinaps sayısındaki bir artışa, kolayca salınabilen sinaptik vezikül havuzunun boyutundaki bir artışa veya nörotransmitter olasılığındaki bir artışa atfedilebilecek bir fenomendir. fAtmR35XR35X'in PN'lerinde serbest bırakma; Aptx'fareler [18.75±2.8Hz(n=11) vs. 11.4±1.0Hz(n=11), t-testi,p=0.{{ 69}}47; Şekil 4D]. Daha sonra, PN'lerden eşzamanlı olarak kayıt yaparak ve granül hücre (yani paralel lifler) veya alt olivary (yani, tırmanan lif) aksonlarını eşleştirilmiş bir darbe patlamasıyla (2- elektriksel olarak uyararak) uyarılmış sinaptik salınım ve kısa süreli plastisiteyi keşfettik. darbeler, 50 ms ayrı). Paralel liflerin sinaptik özellikleri normal bulundu, beklenen kısa vadeli kolaylaştırmada (Atluri ve Regehr 1996) veya uyarılmış EPSC'nin yarı genişlik ve bozulma süresi sabitinde önemli farklılıklar göstermedi [PPR: 1.3±0. 03 (n=10) vs.1.4±{{90}}.{{1{{1{{106}}5}}1 }}5(n=13),t-testi,p=0.162;yarım genişlik:3.9±0.6 vs.4.9±0.4 ms,t -test,p=0.175;zaman sabiti: 3.5±0.5 vs.4.7±0.4 ms,t-test,p=0.054;Şek. 4E]. Karşılaştırıldığında, normalde çift nabız depresyonu (Hansel ve Linden 2000) sergileyen fiber-PN sinaptik tepkilerinin tırmandığını, Atm/3338/R35X;Aptx'mice'de önemli ölçüde daha büyük büyüklüklerde deprese olduğunu bulduk [PPR:0.6±0.03 (n=6)vs.0.7±0.02(n=9),t-test,p=0.03;Fig.4F].Uyandırmanın toplam genişlik ve bozulma süresi sabiti akımlar da daha küçüktü [yarı genişlik: 2.3±0.6(n =6).3.0±0.2(n=9)ms,t-test,p=0.004;zaman sabiti(hızlı) :1.1±0.14 vs.2.9±0.4ms,t-testi, p=0.001]. Bu sonuçlara tırmanan lif akson terminalindeki vezikül depolarının azalması gibi presinaptik bir eksiklik neden olabilirken, EPSC'nin etkilenmeyen başlangıç ​​büyüklüğü [2.4±0.4(n=6) vs.) 1,9 ±0,2 nA (n=9), t-testi, p=0.3], endoplazmik retikulumdan düşük Ca2* akışı gibi daha içsel bir açıklığa işaret eder, bu da uzun süreli etkiyi önemli ölçüde etkileyebilir. - serebellar fonksiyon için kritik olan sinaptik plastisite terimi (Hoxha ve ark. 2018; Kano ve Watanabe 2017). Genel olarak, burada gözlemlediğimiz pasif ve aktif PN özelliklerindeki bozulmalar muhtemelen AtmR35X/R35X'te önemli serebellar disfonksiyona yol açar; Aptx'fareler.

2.5 ATM ve APTX eksikliği, dendritik ile ilişkili PN nöral aktivitesinde ilerleyici bir bozulmaya neden olur.küçülen ve genel serebellar atrofi Decreased rates of spontaneous PN action potential firing, which can be indicative of PN dysfunction, have been observed in several mouse models of ataxia, including spinocerebellar ataxias (SCA)2,3,5,6,13,27, several models of episodic ataxia (e.g., leaner, ducky, and tottering), and autosomal- recessive spastic ataxia of the Charlevoix-Saguenay (Hourez et al.2011; Hansen et al. 2013; Dell'Orco, Pulst, and Shakkottai 2017; Kasumu and Bezprozvanny 2012; Liu et al.2009; Perkins et al.2010; Shakkottai et al. 2011; Jayabal et al.2016; Stoyas et al.2020; Hurlock, McMahon, and Joho 2008; Shakkottai et al.2009; Bosch et al.2015; Walter et al.2006; Alvina and Khodakhah 2010; Ady et al.2018; Lariviere et al.2019; Cook, Fields, and Watt 2021). We, therefore, used this biomarker to characterize the progression of PN perturbation in Atm35XR35; Aptx'mice and assess whether deficits were restricted to ATM- and APTX-deficient mice, consistent with the behavioral results(Fig.2,3). We additionally examined whether decreased PN activity differed across the cerebellum, as anecdotal clinical pathology reports suggest degeneration may occur asymmetrically across the cerebellum, with the anterior and posterior vermis and middle cerebellar hemispheres affected the most, although no systematic analysis has been performed, and the consistency of results across patients is highly variable (Verhagen et al.2012; De Leon, Grover, and Huff 1976; Amromin, Boder, and Teplitz 1979; Monaco et al.1988; Terplan and Krauss 1969; Strich 1966; Solitare 1968; Solitare and Lopez 1967; Aguilar et al. 1968a; Paula-Barbosa et al. 1983). Using extracellular recording methods in the acute slice, we recorded spontaneous action potentials Aptx^ and 3 others from 3,300 PNs(Fig. 4G) across 188 animals, encompassing Atm35×R35×; genotypes at four different time points (P45, 120,210, and 400). We visually selected "healthy cells (see Methods) located deeper in the slice, that consistently fired during the extent of the 60-second recording period. Qualitatively, tissue and cell quality did not visually differ across genotypes under DIC microscopy. Cells were sampled in a distributed fashion across the lateral, intermediate, and medial (vermis)cerebellum of each mouse to assess whether changes in PN firing activity were ubiquitous or anatomically restricted. Regions were segregated based on gross anatomical domains in the mouse defined by natural anatomical boundaries (e.g., foliation) and their general connectivity with different regions of the nervous system (e.g., forebrain, brainstem, etc.)(Voogd and Glickstein 1998). We found that a complete deficiency of both ATM and APTX, consistent with the behavioral results, was necessary to produce a significantly reduced spontaneous PN firing frequency (Fig. 4G, H). Although the trend of slower PN firing rates were observed across most regions of the cerebellum, some subregions appeared to be less or minimally impacted, including several areas of the lateral cerebellum, including the paraflocculus, paramedian, and crus I and Ⅱ (Fig. 4-fig. S2). Significant age-dependent changes in firing frequency were also commonly observed in AtmR35XR35X; Aptx'mice(Fig. 4H), with the most significant decline occurring betweenP120 and 210 [medial: 50.3±2.4Hz(n=61)vs. 36.9±2.2Hz(n=31),t-test,p=0.0006].No significant difference in PN firing frequency was detected between male and female mice within each genotype, thus the data were pooled (2-way ANOVA, p>0.3 tüm ikili karşılaştırmalarda; Şekil 4-şek. S3). Epizodik ataksi ve çeşitli spinoserebellar ataksi varyantları dahil olmak üzere kalıtsal ataksinin birkaç fare modeli üzerinde yapılan önceki çalışmalar, PN ateşlemesindeki fizyolojik bozulmanın sadece frekansını değil, aynı zamanda düzenliliğini de değiştirdiğini bulmuştur (Kasumu ve Bezprozvanny 2012; Jayabal ve ark. 2016; Stoyas ve diğerleri 2020; Cook, Fields ve Watt 2021). AtmR35X/R35X arasında hem varyasyon katsayısını (CV) hem de bitişik aralıklardaki (CV2) değişkenliği karşılaştırdık; Aptx/ ve kontrol fareleri (Şekil 4-şek.S4, S5). Cinsiyet, yaş veya genotip açısından bu parametrelerde herhangi bir farklılık tespit edilmedi. Davranışsal sonuçlarla tutarlı olarak, serebellar disfonksiyon sadece AtmR35XR35X'te bulundu; ATM veya APTX'in kısmi veya tam ifadesine sahip farelerde değil, ataksi geliştiren Aptx'fareler.

2.5 ATM ve APTX eksikliği serebellar atrofiye neden olur

In A-T patients, ataxia is usually detected between1 two 2-years of age and is associated with little to no cerebellar atrophy (Tavani et al. 2003; Taylor et all. 2015). Significant structural changes and atrophy are usually first detected via neuroimaging between 5 and to 10-years of age (Demaerel, Kendall, and Kingsley 1992; Tavani et al. 2003). Postmortemclinical histopathology in A-T patients points to significant changes in PN morphology and density, however, these reports primarily detail patients at late stages of the disorder, and the relationship between the severity of PN pathology and ataxia is not clear (Verhagen et al. 2012; De Leon, Grover, and Huff 1976; Amromin, Boder, and Teplitz 1979; Monaco et al. 1988; Terplan and Krauss 1969; Strich 1966; Solitare 1968; Solitare and Lopez 1967:Aguilar et al. 1968a; Paula-Barbosa et al. 1983; Gatti and Vinters 1985). In the Atm735X7k3×; Aptx^ mice, we found the gross size of the cerebellum to be normal early in life, but significant atrophy developed as the severity of ataxia increased (Fig.5A). At early stages(P45-P210), the size of the cerebellum in Atm3xR35×; Aptx^ mice did not differ from mice with at least one copy of the Atm gene(2-way ANOVA, Fa.s52)=1.0, p-0.4). However, by P210, the overall size of the cerebellum in Atm735XR35×; Aptx* mice was significantly reduced(1-way ANOVA, F(3,37= 1.4,p=0.3), with the degenerative process continuing to at least the last time point investigated (P460). To rule out the possibility that reduced cerebellar size was related to the smaller stature of Atm735xR35×; Aptx" mice, we examined, animal weight and cerebellar size and found no correlation [Pearson's correlation, p>0.3, P460, n=10 ila 20'deki 4 genotipin tümü için]. Ayrıca, bu yaştaki genotipler arasında erkekler ve ortalama yüzde 22 daha küçük dişi fareler arasında serebellar boyutun farklılık göstermediğini bulduk [2-way ANOVA, F(2. 153)=1.9, p, p =0.2]. Bu nedenle Atm35XR35×'de serebellar nörodejenerasyon; P120'den sonra başlayan Aptx* fareleri, ATM ve APTX eksikliği ile ilişkilidir. Serebellar atrofinin, PN dendritlerinin bulunduğu moleküler tabakanın genişliğinde seçici bir azalma ile ilişkili olduğunu bulduk (Şekil 5B). Atm35×R35X'te brüt serebellar boyutta, PN ateşleme frekansında ve davranışta, ML genişliğindeki zamansal değişikliklerle tutarlı olarak; Aptx* fareleri genç farelerde normaldi ancak ataksinin şiddeti arttıkça genişlik giderek azaldı 【P400∶120.2±2.1 μm （n=5）vs.140.2±4.8 μm（n=5）,{ {31}}yol ANOVA,Fu42=45.04,p<0.0001;fig.5b, fig.5-figs.s1a】.in="" contrast,="" no="" difference="" in="" the="" width="" of="" the="" granular="" cell="" layer(gcl)across="" age="" was="" observed="" in="" the="" atm35xr3x;="" aptx*mice="" 【p400∶135.5±2.4="" μm（n="6）v.127.5±4.3" μm（n="5）,2-way" anova,fu="" 42="3.3,p=0.08;Fig.5B," fig.5-figs.s1a].="" cerebellar="" atrophy,="" however,="" was="" not="" due="" to="" pn="" cell="" death,="" as="" pn="" density="" did="" not="" significantly="" differ="" between="" atm735×r35x;="" aptx'="" and="" atm*;="" aptx*="" mice="" [p400:4.5="" ±0.3（n="9）vs.4.5±0.2（n=7）PNs/4000" μm²,welch's="" t-test,="" p="0.9;Fig.5C," d="" fig.5-figs.s1b】.moreover,="" we="" found="" no="" evidence="" from="" immunohistological="" experiments="" for="" increased="" levels="" of="" aptx"-="" mice="" (fig.5-figs.s2).="" at="" the="" programmed="" cell="" death="" or="" microglial="" activation="" in="" the="" atm?35x/r35x="" anatomical="" level,="" we="" found="" pathological="" changes="" in="" pn="" morphology,="" as="" the="" somatic="" size="" was="" reduced(15.3±0.3（n="5）vs.17.8±0.1（n=5）μm," welch's="" t-test,="" p="0.0004;" fig.5e）and="" the="" primary="" and="" secondary="" dendrites="" were="" abnormally="" large="" in="" caliber="" in="" the="" atm35xxr35x;="" aptx'mice="" (3.1±0.2(n="6)vs.2.8±0.1" （n="6）μm," welch's="" t-test,="" p-0.003;="" fig.5f,="" fig.5-figs.s2c）.="" overall,="" we="" found="" a="" good="" correlation="" between="" the="" abnormal="" structural="" and="" electrophysiological="" properties="" of="" the="" cerebellum="" and="" the="" progression="" of="" motor="" deficits.="" 2.6="" differential="" disruption="" of="" thymocyte="" development="" in="" atm-deficient="" vs.="" aptx-deficient="">

İmmün yetmezlik ile ilişkili kronik sinopulmoner enfeksiyonlar AT hastalarında önde gelen ölüm nedenlerinden biridir (Morrell, Cromartie ve Swift 1986; Bhatt ve Bush 2014). İmmün yetmezlik, sırasıyla kemik iliği ve timusta bu hücrelerin oluşumu sırasında antijen reseptör gen yeniden düzenleme süreçlerindeki kusurlarla bağlantılı olan B- ve T-lenfositlerin üretimindeki eksikliklerle bağlantılıdır (Staples ve ark. 2008). Olgun lenfosit sayılarında ortaya çıkan kusurlar, CD4t yardımcı T hücrelerinde ve öldürücü CD8* T hücrelerinde azalmaları içerir (Schubert, Reichenbach ve Zielen 2002). Bu nedenle, periferik kandaki T hücrelerinin ve Atm35xR35× timusundaki farklı alt popülasyonların yüzdelerini inceledik; Aptx*' fareleri, T-hücre antijen reseptörü (TCR) ve CD4/CD8 ko-reseptör ekspresyonu kullanılarak. Periferik kanda, ATM ekspresyonu azalmış veya hiç olmayan farelerde vahşi tip farelere kıyasla CD3*T hücrelerinin toplam fraksiyonunda önemli bir azalma gözlemledik (Şekil 6). Bu azalma, APTX'in eşlik eden eksikliği ile daha da arttı. ATM ve APTX eksiklikleri, vahşi tip kontrollere kıyasla periferik kandaki T hücrelerini yüzde 65'in üzerinde azalttı. APTX eksikliğinin etkisi, ATM eksikliğinin etkisine ekti ve bu iki proteinin her biri için T-hücresi oluşumu üzerinde farklı bir etki mekanizması olduğunu düşündürdü. Periferik kandaki T hücrelerinin yüzdesindeki azalma, çoğunlukla CD4 artı yardımcı T hücre popülasyonundaki bir azalma ile ilişkilendirildi (Şekil 6B). İlgi çekici olan, CD8 artı T hücrelerinin oranı yalnızca AtmR35X/R35x'te arttırıldı; Aptx* fareleri(Şekil 6B). Yine, bu mutasyonların toplam T-cel fraksiyonu üzerindeki etkileri için görüldüğü gibi ATM ve APTX eksikliklerinin farklı bir etkisini gözlemledik. Kandaki T hücre popülasyonlarındaki azalma göz önüne alındığında, daha sonra timustaki T hücre gelişimini değerlendirdik. Bu organda, kemik iliğinden türetilen T-hücresi progenitörleri, MHC kısıtlaması için pozitif seçim ve otoreaktif klonların negatif seçimi tarafından takip edilen TCR gen yeniden düzenlemesinden geçer. Timosit gelişiminin aşamaları, timositlerde CD4 ve CD8 ekspresyonunun izlenmesiyle takip edilebilir. Bu gelişimsel programın ilerlemesi, çift negatif (CD4CD8) timositlerden çift pozitif (CD4*CD8) timositlere ve ardından tek pozitif (CD4* veya CD8*) timositlere doğru gider. Ek olarak, çift negatif aşamada, DN1(CD44*CD25),DN2 (CD44*CD25*), DN3 (CD44 CD25*) ve DN3 (CD44 CD25*) olarak bilinen CD25 ve CD44 ifadesine dayalı olarak dört farklı alt popülasyon tanımlanabilir. DN4 (CD44 derece CD25) (Germain 2002). Timosit gelişimi sırasında gen yeniden düzenlenmesi iki kez meydana gelir - bir kez CD25*CD44 aşamasındaki çift negatif timosit aşamasında (Krangel 2009) ve daha sonra ayrı CD4* ve CD8t tek pozitif popülasyonlarına ilerlemeden önce tekrar çift pozitif timosit aşamasında (Livak ve ark. . 1999). ATM eksikliği, farelerde her iki yeniden düzenleme nöbetindeki kusurlarla ilişkilendirilmiştir (Vachio 2007, Hathcock 2013). Bu nedenle, ATM eksikliği olan ve kontrol farelerimizde bu farklı gelişimsel hücre yüzeyi belirteçlerini ifade eden timustaki hücrelerin oranını karşılaştırdık (Şekil 7). AtmR35xR35×; Aptx ve Atm35×; Aptx^ ama AtmR35XR35 değil; Aptx* fareleri, vahşi tipe kıyasla önemli ölçüde yüksek CD44*CD25, CD44*CD25t ve CD44CD25* hücre oranlarına sahipti (Şekil 7A) Bu artan oranlar, kısmen CD44 CD25t hücrelerinin CD44 CD25 çift negatif hücrelere olgunlaşmasının engellenmesinden kaynaklanıyor gibi görünmektedir, Atm735xR35x'ten CD44 CD25 hücrelerinin fraksiyonu olarak; Aptx' ve Atm35× plus ; Aptx'fareler, vahşi tipten önemli ölçüde daha düşüktür (Şekil 7A). İlgi konusu, APTX eksikliğinin kendi başına DN4 hücrelerinin kaybı üzerinde en büyük etkiye sahip olması, bu etkiden ATM eksikliğinden ziyade APTX eksikliğinin sorumlu olduğunu düşündürmektedir. Bildiğimiz kadarıyla, bu bulgu, TCR rekombinasyonu süreci sırasında gen yeniden düzenlenmesinde ilk kez APTX'i içerir. Daha sonra, bu dört farklı suşta CD4tCD8 ve CD4CD8 artı tek pozitif timositlere kıyasla CD4*CD8t timositlerinin oranlarına baktık. Kandaki ve önceki çalışmalarda elde ettiğimiz sonuçlarla uyumlu olarak, ATM eksikliği olan farelerin kontrol farelerinin değil, CD4*CD8 ve CD4CD8* tek pozitif timositlerin ekspresyonunun azaldığını bulduk (Şekil 7B). Bu sonuçlar, timosit gelişimi sırasında TCR a/δgen yeniden düzenlenmesinde ATM'nin rolünü desteklemektedir (Bredemeyer ve ark.2006), erken timosit olgunlaşmasında APTX'in oynadığı rolden bağımsız bir rol.

2.7 Okuma molekülleri, ATM ifadesini geri yüklemek için PTC'nin üstesinden gelir

Atm genine klinik olarak anlamlı bir saçma mutasyon eklemek için birincil gerekçemiz, yeni bir SMRT bileşikleri setinin kritik klinik öncesi testlerine uygun bir fare oluşturmaktı. SMRT bileşiklerinin, anlamsız mutasyonların neden olduğu erken sonlandırma kodonlarının (PTC) üstesinden gelerek AT hastadan türetilen lenfoblastoid hücre dizilerinde ATM proteini üretimini geri kazandığını daha önce göstermiştik (Du ve ark. 2013). Bu yeni AT hayvan modelinin SMRT bileşik testi için uygunluğunu göstermek için, in vivo teslimatla ilgili zorlukları (örneğin biyoyararlanım, teslimat yolu, vb.) ortadan kaldıran bir eksplant yaklaşımı kullanarak ATM ifadesini geri yükleme yeteneklerini doğrudan incelemeyi seçtik. ATM ekspresyonu, ATM'nin normalde yüksek seviyelerde eksprese edildiği dalaktan ve bozukluk için önemli bir hedef doku olan serebellumdan alınan numunelerde ölçülmüştür. Homozigot Atm?35× ve Atm'den hasat edilen bu eksplant dokularını ortaya çıkardık mı? Bir aday SMRT bileşiği (GJ103) veya önceden okuma özelliklerine sahip olduğu bilinen bir aminoglikozit (G418) içeren ve daha sonra restorasyonu değerlendirmek için immünoblot ile ATM ekspresyonunu ölçen 35 fare. ATM eksikliği olan farelerin her iki tipinde de ATM ekspresyonu, hem G418 hem de GJ103 tarafından dalakta ve beyincikte tutarlı bir şekilde restore edildi (Şekil 8). Bu sonuçlar, SMRT bileşiklerimizin PTC'lere neden olan 3 olası anlamsız mutasyondan en az 2'sinin okunmasını sağlayabildiğini ve takip eden çalışmalarda in vivo etkinlik testi için gerekçe sağladığını göstermektedir.