Yeni Bir Netrin-1-türetilmiş Peptid, Farelerde Nöronal Ölüme Karşı Korumayı Artırıyor ve İntraserebral Kanamayı Azaltıyor Bölüm 1

Soyut:

Netrin-1'in merkezi sinir sistemindeki yaralanmayı takiben nörolojik korumada rol oynadığı rapor edilmiştir. Bununla birlikte, nörolojik korumayı koruyabilen ancak Netrin'in önemli yan etkilerinden kaçınabilen Netrin-1'in minimal işlevsel alanı hala belirsizliğini koruyor.

Merkezi sinir sistemi, insanların düşüncelerini, duygularını ve eylemlerini kontrol eden, insan vücudundaki en önemli sinir sistemlerinden biridir. Merkezi sinir sistemi hasar gördüğünde kişilerin hafızası da etkilenecektir. Ancak endişelenmeyin, hafızanın yenilenmesine yardımcı olacak bazı olumlu yöntemlere başvurabiliriz.

Öncelikle hafıza hasarının etkisini anlamalısınız. Merkezi sinir sisteminin hasar görmesi, insanların bilişsel yeteneklerini, düşünme süreçlerini ve dikkatini etkileyebilir ve bunların tümü doğrudan insanların hafızasını etkiler. Ayrıca, merkezi sinir sisteminin hasar görmesi duygusal dengesizliğe de yol açarak insanları paniğe, kaygıya ve depresyona daha yatkın hale getirerek hafızanın iyileşmesini etkileyebilir.

Ancak merkezi sinir sistemine verilen hasar bazı olumsuz etkileri beraberinde getirse de hafızanın iyileşmesini teşvik etmek için bazı olumlu önlemler alabiliriz. İlk olarak okuma, yazma ve bulmaca çözme gibi bazı bilişsel antrenmanları deneyebiliriz. Bu aktiviteler beyni yeni nöronlar üretmeye teşvik edebilir ve beynin yeni anılar ve düşünme biçimleri oluşturmasına yardımcı olabilir.

İkinci olarak, bazı fiziksel egzersizlerle hafızanın iyileşmesini de teşvik edebiliriz. Çalışmalar, uygun egzersizin beyni yeni nöronlar ve nöronal bağlantılar üretmesi için uyarabildiğini ve beynin yeni bilgileri işlemesini teşvik edebildiğini göstermiştir. Bu nedenle bazı insanlar koşarken veya yürürken birdenbire iyi bir fikir bulurlar veya zor bir sorunu çözerler.

Son olarak doğru beslenmenin hafıza üzerindeki rolüne dikkat etmemiz gerekiyor. Beynin normal işleyişi, protein, vitaminler ve eser elementler gibi bazı gerekli besin maddelerine ihtiyaç duyar. Yiyeceklerimizde bu besinlerin bulunmaması hafızamızı ve düşünme yeteneğimizi etkileyecektir. Bu nedenle beslenmemizde balık, yağsız et, sebze ve meyve gibi bu besinler açısından zengin bazı besinleri seçmeliyiz.

Kısacası, merkezi sinir sistemindeki hasarın insanların hafızası üzerinde belirli bir etkisi olacaktır, ancak uygun bilişsel eğitim, fiziksel egzersiz ve diyet kontrolü yoluyla hafızanın iyileşmesini destekleyebiliriz. Umarım herkes hayattaki zorluklarla olumlu bir şekilde yüzleşebilir, iyimser bir tutum sergileyebilir ve sağlıklı bir merkezi sinir sistemi ve iyi bir hafızayı yeniden tesis etmek için çabalayabilir. Belleği geliştirmemiz gerektiği görülebilir ve Cistanche hafızayı önemli ölçüde geliştirebilir çünkü Cistanche birçok benzersiz etkiye sahip geleneksel bir Çin tıbbıdır ve bunlardan biri hafızayı geliştirmektir. Cistanche'nin etkinliği, içerdiği tanik asit, polisakkaritler, flavonoid glikozitler vb. dahil olmak üzere beyin sağlığını birçok yönden geliştirebilen çeşitli aktif bileşenlerden gelir.

Kısa süreli hafızayı geliştirmek için Bil'e tıklayın

Burada, Netrin-10'in EGF3 alanından (407-422 artıkları) türetilmiş bir E1 peptidinin nöroprotektif etkisini araştırdık. Nöroproteksiyon sergileyen fokal adezyon kinaz fosforilasyonunu aktive etmek için silinmiş kolorektal karsinom (DCC) ile etkileşime girdiğini bulduk.

E1 peptidinin uygulanması, intraserebral kanamanın (ICH) deneysel bir fare modelinde apoptozun azalması yoluyla fonksiyonel iyileşmeyi iyileştirmeyi başardı.

Özetle, ICH sonrası iyileşme sürecine dahil olan Netrin-1'in işlevsel bir dizisini ortaya koyuyoruz ve ICH tedavisi için aday bir peptidi belirliyoruz.

Anahtar Kelimeler: intraserebral kanama; hemin; nörolojik koruma; Netrin-1; peptit.

1. Giriş

İntraserebral kanama (İSK), beyin içindeki serebral kan damarlarının anormal rüptürünü içeren, yüksek mortalite ve morbidite oranına sahip [1-3] yıkıcı bir inme alt tipidir [4,5].

Hemostazın sağlanması ve kafa içi basıncın hafifletilmesi için hematomların cerrahi olarak çıkarılması tercih edilir (6). Bununla birlikte, kalan hematik kalıntılar ve kan parçalama ürünleri, ICH'yi takiben ikincil beyin hasarını teşvik edebilir, nöronal hasara neden olabilir ve fonksiyonel iyileşmeyi geciktirebilir [7-9].

Bu nedenle, ikincil beyin hasarının neden olduğu nöronal hasarı hedef alan etkili stratejilerin geliştirilmesi, felç tedavisi için yararlı olacaktır. Netrin-1, reseptörleriyle etkileşim yoluyla aksonal yönlendirmeyi ve sinaptogenezi [10-12] düzenleyen, üzerinde en iyi çalışılmış proteinlerden biridir. kolorektal kanserde (DCC) ve UNC5H'de (koordine olmayan-5 homolog) hücrenin hayatta kalmasını, farklılaşmasını ve çoğalmasını aktive etmek için silinmiştir [13-15].

Reseptörler, Netrin-1 olmadığında apoptoza aracılık etmek için bir ölüm sinyalini indükler [16]. Netrin-1'nin DCC ile bağlanmasının, DCC'nin dimerizasyonuyla sonuçlandığı ve nörit büyümesini ve aksonal yönlendirmeyi indüklemek için fokal adezyonkinazın (FAK) tirozin 861 fosforilasyonunu başlattığı bilinmektedir [17,18].

Netrin-1'nin DCC'ye bağlanması, Netrin-1'nin EGF3 alanını ve Netrin-1 sinyal yolunun aktivasyonunda DCC'nin FN5 alanını içerir [19,20]. Son zamanlarda Netrin-1'in iskemik bölgelerde nöroprotektif etkiler gösterdiği gösterilmiştir [21].

Hücre apoptozunu inhibe eden ve nöronal rejenerasyonu destekleyen Netrin-1'in serumdaki ekspresyon düzeyi, hastanın iskemik felçten iyileşmesi ile pozitif olarak ilişkilidir [22,23].

İlginç bir şekilde, Netrin-1'yi hasarlı sıçan siyatik sinirine salgılayan kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinin transplantasyonu, aksonal rejenerasyonu başlatır [24] ve motor nöron ölümünü azaltır [25]. Netrin-1 proteininin ventriküllere stereotaksik enjeksiyonu, DCC/APPL1/AKT sinyallemesinin aktivasyonu yoluyla subaraknoid kanama sonrası sinir hücresi ölümünü azaltır [26].

Netrin-1'nin EGF3 alanından türetilen bir polipeptit (amino asitler 423-433), ERK fosforilasyonunu belirgin şekilde aktive eder ve kardiyoprotektif etkileri olan NO üretimini destekler [27,28]. Bununla birlikte, Netrin-1, tümör oluşumu için potansiyel bir biyobelirteç olarak tanımlanmıştır [29-31] çünkü Netrin-1 durumunun düzenlenmesi, çoklu doku kaynaklı kanserlerde bulunur [32].

Netrin-1, DCC veya Unc5H reseptörüne bağlandığında, reseptörler, hayatta kalma, iltihaplanma, anjiyogenez ve anti-apoptoza yol açan pozitif bir sinyal iletir ve bu da tümör oluşumunu düzenler [31].

Bu nedenle, Netrin-1'in nörolojik korumayı koruyabilen ve Netrin-1'in majör yan etkilerinden kaçınabilen minimal işlevsel alanını tanımlamak çok önemlidir. Burada E1 peptidinin (407-422 kalıntıları) bulunduğunu bulduk. Netrin-1'nin EGF3 alanından türetilen, nöronları heminin neden olduğu toksisiteden korumak için DCC ile etkileşime girer.

ICH farelerinin deneysel bir modelinde, davranış analizleri ile belirlendiği üzere, E1 peptidinin uygulanması fonksiyonel iyileşmeyi iyileştirmiştir. Ayrıca peptid E1, ICH sonrasında nöronların dejenerasyonunu önleyebilir.

Bu sonuçlara dayanarak, ICH sonrası iyileşmede yer alan işlevsel bir Netrin-1 dizisi belirledik ve bu peptidin ICH tedavisinde kullanılabileceğini belirledik.

2. Sonuçlar

2.1. EGF3 Alanı Netrin-DCC Etkileşimi İçin Kritiktir

Netrin-1 bir VI alanı, üç EGF tekrarı ve bir C-terminal alanından oluşur [33]. İnsan Netrin-1/DCC kompleksinin kristal yapısı, Netrin-1 EGF3 alanının Netrin-1/DCC etkileşimi için önemli olduğunu, ancak EGF1 ve EGF2 alanlarının olmadığını ortaya koymaktadır [34].

EGF3 alanındaki anahtar amino asit kalıntılarının (His407, Gln442 veya Gln443) mutajenezi, Netrin-1/DCC bağlanmasını tamamen bozmuştur [19]. Unc5 DCC ile bir arada bulunduğunda çekici sinyallemeyi itici sinyallemeye dönüştürmek için EGF1/2 alanları gereklidir [20].

Böylece, ilk önce tam uzunlukta ve EGF3-silinmiş (Netrin-1 ∆407–443) Netrin-1 yapılarını (Şekil 1A) oluşturduk ve bu yapıları GSTpulldown için kültürlenmiş HEK293T hücrelerinde geçici olarak ifade ettik. .

Netrin-1'yi ifade eden ancak Netrin-1(∆407–443)'ü ifade etmeyen yapılar için bağlanma gözlendi (Şekil 1C). Bu sonuçlar, Netrin-1'nin DCC ile etkileşiminden 407-443 aminoasitlerini içeren EGF3 bölgesinin sorumlu olduğunu göstermektedir. EGF3 alanının Netrin-DCC'deki rolünü araştırmak için ilk olarak myc-taggedNetrin{{12'i saflaştırdık. }} veya kesik Netrin-1 (∆407–443) (Şekil 1B).

Daha sonra HEK293T hücreleri, DCC cDNA taşıyan bir plazmid ile transfekte edildi ve Netrin-1 proteini ile inkübe edildi ve daha sonra Netrin-1 bağlanması, immün boyama yoluyla değerlendirildi.

Tam uzunluktaki Netrin-1'in, ancak kesik olmayan Netrin-1'in plazma membranında DCC'ye bağlanabildiğini bulduk (Şekil 1D). EGF3 alanının DCC ile etkileşime girip giremeyeceğini belirlemek için, DCC'yi aşırı eksprese eden lize edilmiş hücreleri aşağı çekmek için bir GST-EGF3 yapısı oluşturduk. DCC'nin GST-EGF3 ile spesifik bağlandığını gözlemledik (Şekil 1E).

Ayrıca FITC etiketli peptid EGF3'ü sentezledik ve tam uzunluktaki Netrin-1 gibi bunun da plazma zarında DCC'ye bağlanabildiğini doğruladık (Şekil 1F). Birlikte ele alındığında verilerimiz, Netrin-1'in DCC ile etkileşiminden EGF3 alanının sorumlu olduğunu göstermektedir.

2.2. EGF3 Alanı, Netrin-1'in Aşağı Akış Yollarının Fosforilasyonunu İndükler

Netrin-1 ve DCC'nin etkileşimi, FAK, SFK ve ERK dahil olmak üzere birçok sinyal yolunu aktive eder [16,35]. Fokal adezyon kinaz (FAK), Netrin-1/DCC sinyallemesine bağlı başlıca tirozinfosforilasyon aktivitelerinden biridir.

Netrin-1, FAKfosforilasyonunu ve Src ailesi protein tirozin kinazlarının (SFK'ler) fosforilasyonunu aktive eder [17]. Hem FAK hem de SFK sinyal yolakları, sinir sisteminin gelişim aşamasında ve yaralanma onarımında önemli bir rol oynar [36,37]. Ayrıca Netrin-1, Mitojenle aktifleşen proteinkinaz (MAPK) yolunun etkisine aracılık eden hücre dışı sinyalle düzenlenen kinaz-1/2'yi (ERK1/2) aktive edebilir [38-40].

EGF3 alanının, Netrin-1'nin DCC'ye bağlanması yoluyla aşağı akış sinyal yollarının aktivasyonu açısından kritik olup olmadığını araştırmak için, ilk önce EGF3 alanının FAK'ın tirozin 861 fosforilasyonu üzerindeki etkisini inceledik (Şekil 2A) . EGF3'ün silinmesinin, kültürlenmiş kortikal nöronlarda FAK fosforilasyonunu inhibe ettiğini bulduk (Şekil 2B, C), böylece Netrin-1 sinyal yolunda EGF3'ün önemli bir rolünü doğruladık.

Daha sonra kültürlenmiş kortikal nöronlar, GST-EGF3füzyon proteini ile 20 dakika süreyle uyarıldı ve western blotlama, GST-EGF3 füzyon proteini ile tedavinin FAK, ERK ve SFK fosforilasyonunu indüklediğini doğruladı (Şekil 2D-G).

Bu sonuçlar, Netrin-1'in EGF3 alanının, aşağı yöndeki sinyal yollarını aktive etmek için güçlü bir uyarıcı olarak işlev gördüğünü göstermektedir.

Şekil 1. Netrin-1'nin EGF3 alanı, Netrin-1/DCC etkileşimi için kritik bölgedir. (A) Netrin-1yapılarının çizimleri. Netrin-1 yapıları Netrin-1 tam uzunlukta, Netrin-1-(∆407–443) ve GST-EGF3'tür. (B) Saflaştırılmış Netrin-1-(∆407–443)-Myc/His, BSA standart eğrisiyle karşılaştırılarak ölçüldü. (C) Aşağı çekme fraksiyonunun GST-DCC FN5 alanı füzyon proteini ve tek başına GST ile immünoblotlanması. (D) Kontrol ortamı, Netrin-1-myc/his ve Netrin-1-(∆407–443) -Myc/his ile 30 dakika boyunca inkübe edilen 293T hücrelerini eksprese eden Flag-DCC'nin immünofloresan görüntüleri ve kantitatif analiz. Ölçek çubuğu, 10 µm. (E) Aşağı açılan fraksiyonun GST-EGF3 füzyon proteini ve GST ile immünoblotlanması. (F) Sırasıyla 30 dakika boyunca kontrol ortamı ve FITC etiketli Pep EGF3 ile inkübe edilen 293T hücrelerini eksprese eden Flag-DCC'nin immünofloresan görüntüleri ve kantitatif analiz. Ölçek çubuğu, 10 µm.

Şekil 2. EGF3 alanı, Netrin-1'in aşağı akış yollarını etkinleştirir. (A) Deneysel prosedür. (B) Kortikal nöronlar (E17 ve DIV3), 20 dakika boyunca Netrin-1, Netrin-1-(∆407–443) veya kontrol ortamı ile uyarıldı. Netrin-1 aktivitesini doğrulamak için hücre lizatları bir anti-p-FAK-861 antikoruyla inkübe edildi. (C) Western blot sonuçlarının kantitatif analizi (B)'de gösterilmektedir. n= 3. (D) Kortikal nöronlar (DIV3), 20 dakika boyunca 1,5 uM GST (+), 1,5 uM GST-EGF3 füzyon proteini (+) veya 1,5 uMNetrin-1 (+) ortamı ile tedavi edildi. Hücre lizatları, anti-p-FAK-861, anti-p-SFK-418 ve anti-p-ERK-202/204 ile inkübe edildi.(E–G) Western'in kantitatif analizi (D)'de gösterilen leke sonuçları. n=3. Veriler ortalama ± SEM olarak sunulmuştur. Bu şekilde gösterilen tüm istatistiksel analizler için tek yönlü ANOVA kullanılmıştır (* p < 0,05, ** p < 0,01; ns, anlamlı değil). Veri analizinin ayrıntıları Ek Tablo S1'de görülmektedir.

2.3peptid E1 ve E2, Netrin'in Aşağı Akım Sinyal Yolunu Etkinleştirmek için DCC ile Etkileşime Girer-1

Daha önce açıklandığı gibi, Netrin-1'in (amino asitler 423-433) EGF3 alanından türetilen küçük bir peptit, ERK fosforilasyonunu indüklemiştir [27]. Netrin-1'nin EGF3 alanından türetilen E1 (407-422 numaralı kalıntılar) ve E2 (423-433 numaralı kalıntılar) peptitlerini sentezledik (Şekil 3A).

Peptit E1'in kuluçkalanmasının kültür hücrelerinde fosforile edilmiş FAK ve SFK (Şekil 3B, D, E) düzeylerini doza bağlı bir şekilde arttırdığını ancak fosforile edilmiş ERK düzeylerini değiştirmediğini bulduk (Şekil 3B, F).

Peptit E1'den farklı olarak, peptid E2 yalnızca FAK'ın tirozin fosforilasyonunu (Şekil 3C, G) ve SFK'nin tirozin fosforilasyonunu (Şekil 3C, H) indüklemekle kalmadı, aynı zamanda kültürlenmiş kortikal nöronlarda ERK'nin tirozin fosforilasyonunu da indükledi (Şekil 3C, I).

Kontrol peptidinin (Pep Ctrl), FAK, SFK ve ERK'nin tirozin fosforilasyonu üzerinde tespit edilebilir bir etkisi yoktu (Şekil S1). Ayrıca, peptid E1 tarafından indüklenen FAK sinyal yolu bileşenlerinin fosforilasyonunun zamana bağlı olduğunu gözlemledik (Şekil S1). S2). Bu sonuçlar, E1 ve E2'nin Netrin-1'nin minimal fonksiyonel peptitleri olduğunu göstermektedir.

Şekil 3. EGF3 alanının minimal dizileri, Netrin-1'nin aşağı akış yollarını etkinleştirir. (A) Peptitlerin çizimleri. (B) Kortikal nöronlar (DIV3), peptid E1'in gradyan konsantrasyonlarıyla uyarıldı. Hücre lizatları, anti-p-FAK-861, anti-p-SFK-418 ve anti-p-ERK-202/204 ile inkübe edildi. (C) Kültürlenmiş kortikal nöronlar, peptit E2'nin kademeli konsantrasyonları ile tedavi edildi.

Lizatlar toplandı ve FAK, SFK ve ERK'nin fosforilasyonunu ölçmek için belirtilen antikorlarla inkübe edildi. (D – F) Nöronlarda E1 peptidinin neden olduğu FAK, SFK ve ERK fosforilasyonunun boyutunun ölçümü (B)'de gösterilmektedir. n= 3. (G – I) Peptit E2 tarafından indüklenen FAK, SFK ve ERK fosforilasyonunun boyutunun ölçümü (C)'de gösterilmektedir. n= 3. (J) DCC vahşi tip ve homozigot mutant embriyolardan türetilen kortikal nöronlar, Netrin-1 veya Netrin-1-türevli peptitlerle uyarıldı ve parçalandı.

Ortaya çıkan lizatlar immünoblotlamaya tabi tutuldu. (K) DCC mutant nöronlarındaki FAK PY{{0}} ve DCC seviyelerinin niceliği (J)'de gösterilmiştir. n= 3. Veriler ortalama ± SEM olarak sunulmuştur. Bu şekilde gösterilen tüm istatistiksel analizler için tek yönlü ANOVA kullanıldı (* p < 0,05;ns, anlamlı değil). Veri analizinin ayrıntıları Ek Tablo S1'de görülmektedir.

FAK sinyal yolunun aktivasyonunun DCC'ye bağlı olup olmadığını belirlemek için, DCC+/+ ve DCC-/- nöronlarında bu peptitler tarafından indüklenen FAK'ın tirozin fosforilasyonunun boyutunu ölçtük. Hem E1 hem de E2 peptidlerinin DCC-/- nöronlarında FAK'ın fosforilasyonunu indüklemede başarısız olduğunu bulduk (Şekil 3J, K).

Ayrıca sentezlenen N-terminalinde Bayrak etiketli peptitlerin E1 ve E2'nin (Flag-E1 ve Flag-E2) DCCFN5 alanına doğrudan bağlandığını da bulduk (Şekil S3).

2.4. Peptit E1, Nöronları İn Vitro Hemin Kaynaklı Hücre Ölümünden Korur

E1 peptidinin nöronal hasara karşı korumasını göstermek için, intraserebral kanama sonrası sekonder beyin hasarını taklit etmek amacıyla Hemin ile indüklenebilir toksisite reaksiyonunu kullandık [41,42].

Kültürlenmiş GnRH eksprese eden nöron hücreleri (NLT) [43-45] farklı konsantrasyonlarda ve sürelerde hemin ile inkübe edildi. NLT hücrelerinin medial ölümcül dozda (60 uM) hemin ile inkübasyonu, hücrenin hayatta kalma oranında zamana bağlı bir düşüşle sonuçlandı; bu, heminin nöronlar tarafından alındığını ve metabolize edildiğini gösteriyor (Şekil S4).

Netrin-1 ve DCC ifadesinin, heminin neden olduğu nöronal hücre ölümüne yanıt verip vermediğini incelemek için, kültürlenmiş NLT hücreleri, farklı süreler boyunca hemin ile inkübe edildi. Western blot sonuçları, Netrin-1 ve DCC'nin ekspresyon seviyelerinin, hemin inkübasyonundan 6 saat sonra önemli ölçüde arttığını ve daha sonra kademeli olarak azaldığını gösterdi (Şekil 4A, B).

E1 ve E2 peptidlerinin hemin kaynaklı nöron ölümünü hafifletip hafifletemediğini araştırmak için Netrin-1, PepCtrl, peptid E1 ve peptid E2 ile bir CCK-8 tahlili gerçekleştirdik.

Bu peptidlerin hücre canlılığı üzerinde saptanabilir bir etkisinin olmadığını bulduk (Şekil 4C ve Şekil S5). Pep Ctrl ve peptidE2 ile inkübasyonla karşılaştırıldığında, peptid E1 ve Netrin-1, heminin neden olduğu nöron ölümünü iyileştirdi (Şekil 4D). Canlı ve ölü hücreleri ayırt etmek için ayrıca kalsein-AM ve PI ile de boyandık.

Sonuçlar, hem Netrin-1 hem de peptid E1'in in vitro hemin kaynaklı ölüme karşı koruma sağladığını gösterdi(Şekil 4E–G). Ayrıca 1,5 uM peptid E1, birincil kültürlü nöronlarda hemin kaynaklı ölümü hafifletti (Şekil 4H, I). Toplamda, bu sonuçlar peptid E1'in nöronları hemin kaynaklı hücre ölümünden koruduğunu gösterdi.

2.5. Netrin-1-Türetilmiş Peptid E1, ICH Sonrası İşlevsel İyileşmeyi Destekler

Netrin-1'den türetilen E1 peptidinin, kanama felci sonrasında fonksiyonel iyileşmede önemli bir rol oynayıp oynamadığını araştırmak için, mürekkeple karıştırılmış kolajeni striatuma enjekte ederek farelerde deneysel bir ICH modeli oluşturduk (Şekil S6A).

Üç gün sonra, beyin dilimi görüntülerinin enjeksiyon pozisyonunu ve kollajenaz hacmini mürekkeple takip ettiği gösterildi (Şekil S6B, C). Striatal kanaması olan fareler, beyin hasarı nedeniyle aynı tarafta zayıflık sergiledi (Şekil S7A-C).

ICH'yi takip eden striatumdaki hematom, salin enjeksiyonuna kıyasla görünürdü (Şekil S7D). Perihematomal korteksteki Netrin-1 ve DCC'nin göreceli protein seviyeleri, 2. günde kontrol fareleriyle karşılaştırıldığında ICH farelerinde arttı ve Netrin-1 3. günde hala önemli ölçüde yüksekti; bu da Netrin-1'nin beyin hasarının iyileşmesi için önemlidir (Şekil S7E, F).

Daha sonra, peptid E1'in N-terminalinin bir TAT dizisini ekleyen FITC etiketli TAT-peptid E1 (FITC-Pep TE1), ICH farelerine enjekte edildi ve FITC-Pep TE1'in kan-beyin bariyerini geçtiği gösterildi ( Şekil S8).

ICH ve kontrol farelerine günlük olarak peptit (12 mg/kg) veya eşit hacimde salin (Şekil 5A) intraperitoneal olarak enjekte edildi. Peptit TE1 ile uygulamanın hayatta kalma oranını arttırdığını ve ICH'den sonra vücut ağırlığındaki kusurları kurtardığını bulduk (Şekil 5B, C).

Ayrıca her grupta eşit oranda mürekkeple izlenen kolajenaz hacminin benzer olduğunu bulduk; bu standart ICH kolajenaz modelinin tekrarlanabilir intrastriatal hematomlarla sonuçlandığını doğruladı (Şekil 5D). Peptid TE1, bant çıkarma testinde ICH farelerinin davranışsal puanlarını iyileştirdi (Şekil 5E) ) ve silindir testi (Şekil 5F).

Beklendiği gibi, TE1 peptidi ICH'den sonra enfarktüs hacmini azalttı (Şekil 5G, H). Birlikte ele alındığında bu sonuçlar, peptid E1'in hematom hacmini azaltabildiğini ve ICH'nin fare modelinde fonksiyonel iyileşmeyi geliştirebildiğini göstermektedir.

Şekil 4. Peptid E1, in vitro hemin kaynaklı hücre ölümünü iyileştirir. (A) Hemin'e (60 uM) maruz bırakılan kültürlenmiş NLT hücrelerinde Netrin-1 ve DCC'nin Western blot'u. (B) Western blotresonuçlarının kantitatif analizi (A)'da gösterilmiştir. n= 3. (C) CCK-8 analizleri seri peptidlerin hücre yaşayabilirliğini değiştirmediğini gösterdi. n= 4. (D) 1,5 uM Pep E1, hemine (60 uM) maruz bırakıldıktan sonra iyice eklendiğinde NLT hücresi canlılığını korudu. n= 4. (E) Hemine (60 µM, 6 saat) maruz kalan NLT hücrelerinin canlı (yeşil)/Ölü (kırmızı) tahlili. Ölçek çubuğu, 50 µm. (F, G) (E)'deki canlı/ölü tahlilinin kantitatif analizi. n= 9. (H) CCK-8analizleri Pep E1'in birincil kültür nöronlarında hemin kaynaklı hücre ölümünü azaltabildiğini gösterdi. n=8.(I) Birincil kültür nöronlarının Canlı/Ölü tahlil görüntülemesi (50 µM, 6 saat). Ölçek çubuğu, 50 µm. Veriler ortalama ± SEM olarak sunulmuştur. Bu şekilde gösterilen tüm istatistiksel analizler için Tek Yönlü ANOVA veya İki Yönlü ANOVA kullanıldı (* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001; ns, anlamlı değil). Veri analizinin ayrıntıları Ek Tablo S1'de görülmektedir.

Şekil 5. Netrin-1-türetilmiş peptid E1, ICH sonrasında iyileşme sürecini destekler. (A) Farelerin ICH modellemesinde peptid TE1'in intraperitoneal (IP) enjeksiyonunun deneysel paradigmasının şeması. (B) Her grubun ICH sonrası hayatta kalma oranı kaydedildi ve Kaplan-Meier yöntemi kullanıldı. n= 10. (C) ICH'den 5 gün sonra vücut ağırlığı değişir. n=6.(D) C57 farelerinin striatumuna eşit oranda mürekkep (toplam 0,6 µL) enjekte edilen Kolaj/Tuzlu Su karışımı, mürekkep alanını gösteren temsili görüntüler/ ile tedavi edilen farelerde benzerdi ICH'den peptidsiz TE1 5 gün sonra. (E, F) Peptit TE1'in (12 mg/kg) IP enjeksiyonu, ancak TAT (12 mg/kg) kontrolü değil, bir bant çıkarma görevi (E) veya bir köşe görevi (F) ile izlenen geliştirilmiş davranış.

Tuzlu,n=10 bireysel hayvan; ICH, n=6 bireysel hayvan; ICH + TAT, n=6 bireysel hayvan; ICH + TE1, n=8 bireysel hayvan. (G) ICH'den gün sonra peptit TE1 5 gün ile tedavi edilen/peptit olmadan tedavi edilen farelerde temsili hematoksilin ve eozin lekeli bölümler. Ölçek çubuğu, 1 mm. (H) (G)'de gösterilen beyin bölümlerinde kanama hacminin niceliği.

Tuzlu su, n {{0}} bireysel hayvan; ICH, n=6 bireysel hayvan; ICH + TAT, n=6 bireysel hayvan; ICH + TE1, n=8 ayrı hayvan. Veriler ortalama ± SEM olarak sunulmuştur. Bu şekilde gösterilen tüm istatistiksel analizler için Tek Yönlü ANOVA veya İki Yönlü ANOVA kullanıldı (* p < 0.05, ** p < 0,01, *** p < 0,001; ns, anlamlı değil). Veri analizinin ayrıntıları Ek Tablo S1'de görülmektedir.

2.6. Netrin-1-Türetilmiş Peptid E1, ICH Sonrası Nöronal Apoptozu Azaltır

ICH'nin fonksiyonel iyileşmesi sürecinde peptid E1'in altında yatan mekanizmaları araştırmak. Floro-jade C (FJC) boyama ile perihematomal bölgede nöronal dejenerasyon tespit ettik.

Peptit TE1 uygulamasının, perihematoma bölgelerindeki FJC-pozitif hücrelerin sayısını önemli ölçüde azalttığını bulduk; bu, pep TE1'in, ICH'den sonra nöronal dejenerasyonu inhibe ettiğini gösterir (Şekil 6A, B). TUNEL boyama yaptık ve peptid TE1'in TUNEL pozitif nöronların sayısını önemli ölçüde azalttığını bulduk(Şekil 6C, D).

TUNEL-pozitif astrositlerin sayısı, peptit TE1 tedavisinden sonra saptanabilir bir değişiklik değildi (Şekil 6E, F). Ek olarak, kan-beyin bariyerinin (BBB) ​​geçirgenliğini belirtmek için FITC etiketli 4 kDa dekstranı atraser olarak kullanarak, TE1 peptidinin BBB geçirgenliğinin iyileşmesini etkilemediğini bulduk (Şekil S9A, B).

Serum ham floresan birimleri (RFU'lar) seviyeleri benzerdi ve analiz edilen tüm hayvanlarda enjekte edilen izleyicinin varlığını doğruladı (Şekil S9C). Ayrıca mikrodamarları etiketlemek için floresan etiketli lektin kullandık ancak TE1 tedavisinden sonra herhangi bir iyileşme gözlemleyemedik (Şekil S9D, E). Her şeyden önce bu bulgular, E1 peptidinin, nöronal apoptozu inhibe ederek ICH sonrasında nöronal iyileşmeyi desteklediğini göstermektedir.

Şekil 6. Netrin-1-türetilmiş peptid E1, nöron ölümü ve dejenerasyona karşı koruma sağlayabilir, ancak ICH'den sonra astrositleri koruyamaz.(A) ICH'den 5 gün sonra TE1 ile/te1 olmadan tedavi edilen farelerde temsili Floro-yeşim C ile boyanmış bölümler. Ölçek çubuğu, sırasıyla 50 μm ve 10 μm. (B) Perihematomal bölgedeki Floro-yeşim C pozitif hücrelerin miktarının belirlenmesi (n=4). (C) ICH başlangıcından 5 gün sonra TE1'in ikincil beyin hasarı (SBI) üzerindeki etkilerini gösteren TUNEL boyama. Saline, ICH, ICH + TAT ve ICH + TE1 gruplarından temsili görüntüler.

Salin grubu dışındaki her grup ICH'ye tabi tutuldu. Ölçek çubuğu, sırasıyla 50 μm ve 10 μm. (D) TUNEL-pozitif nöronların yüzdesine ilişkin kantitatif analizler (C)'de gösterilmektedir. n= 4. (E) ICH'den 5 gün sonra TUNEL'in GFAP ile kolokalizasyonu. Saline, ICH, ICH + TAT ve ICH + TE1 gruplarından temsili görüntüler. Ölçek çubuğu, sırasıyla 50 μm ve 10 μm. (F) TUNEL-pozitif astrositlerin yüzdesine ilişkin kantitatif analizler (E)'de gösterilmektedir. n= 4. Veriler ortalama ± SEM olarak sunulmuştur.

Bu şekilde gösterilen tüm istatistiksel analizler için tek yönlü ANOVA kullanılmıştır (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001; ns, anlamlı değil). Veri analizinin detayları Ek Tablo S1'de görülmektedir.

3. Tartışma

Çalışmamız, ICH sonrasında işlevsel iyileşme için çok önemli olan Netrin-1'in bir çekirdek peptid dizisini tanımladı. Bu Netrin-1-türevi peptit, DCC ile etkileşime girerek, ICH'den sonra ikincil hasara bağlı nöron ölümüne karşı koruma sağlar ve dolayısıyla ICH için umut verici bir tedavidir.

Yüksek molekül ağırlıklı bir protein olan Netrin-1'in terapötik uygulaması, aşağı yönde sinyallemeyi destekleyen Netrin-1'nin minimal işlevsel dizisinin tanımlanmasını gerektirir. Çalışmamızda Netrin-1'nin EGF3 alanından türetilen sırasıyla E1 (407-422 numaralı kalıntılar) ve E2 (423-433 numaralı kalıntılar) peptidleri üretildi. Peptit E1'in (407-422 artıkları) ICH sonrası nöron ölümüne karşı koruma sağladığını bulduk.

Hemin tedavisinden sonra NLT hücrelerinde Netrin-1 ve DCC ekspresyon seviyelerinin arttığını bulduk. Hemin, ICH'den sonra hemoglobinden salınır ve hem glia hem de nöronal hücrelerde ikincil hasara neden olur [46-48].

Ek olarak, deneysel ICH'yi takiben Netrin-1 ve DCC'nin protein seviyelerinin de arttığını gözlemledik. Ek olarak, deneysel ICH'yi takiben netrin-1 ve DCC'nin protein seviyelerinin arttığını da gözlemledik.

Bu sonuçlar, netrin-1'in ICH sonrası iyileşmede önemli bir rol oynadığını gösteren önceki sonuçlarla tutarlıdır [49].

For more information:1950477648nn@gmail.com