Tu9 Farklılaşmasında BATF3'ün Rolü ve T-hücre güdümlü L Patolojileri MuCOsal(Bölüm 1)

Daha fazla bilgi edinmek için lütfen iletişime geçindavid.wan@wecistanche.com

T yardımcı 9 (T,9) hücreleri inflamatuar ve alerjik hastalıkların gelişimi için önemlidir. TH9 transkripsiyonel ağı, sitokinlerden ve antijen sunumundan gelen sinyalleri birleştirir, ancak tam olarak anlaşılmamıştır. Burada, TNF süper ailesinin bir üyesi olan TL1A'yı, güçlü bir fare ve insan TH9 farklılaşması indükleyicisi olarak tanımladık.mekanik olarak, TL1A, BATF ve BATF3 transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonunu indükledi ve //9 promotörüne bağlanmalarını kolaylaştırdı ve I-9, BATF- ve BATF'nin artan salgılanmasına yol açtı3-eksiklikler IL'yi bozdu{{6} } Tμ9 ve Ty9-TL1A-polarizasyon koşulları altında salgı. İn vivo, bir T hücre transfer modeli kullanarak, TL1A'nın IL-9-bağımlı, T,9 hücre kaynaklı bağırsak ve akciğer iltihabını desteklediğini gösterdik. Nötralize edici IL-9 antikorları, TL1A kaynaklı mukozal iltihabı hafifletti. Batf3-7T_9-TL1A hücreleri inflamasyonu azalttı vesitokin ifadesiin vivo olarak WT hücrelerine kıyasla. Sonuçlarımız TL1A'nın T_9 hücre farklılaşmasını ve işlevini desteklediğini ve BATF3'ün T hücre güdümlü mukozal enflamasyondaki rolünü tanımladığını göstermektedir.

Cistanche hakkında daha fazla bilgi için buraya tıklayın

GİRİİŞ

T yardımcı (T-) hücrelerinin özel alt kümeleri, doku homeostazının korunmasında ve mukozal yüzeylerde inflamatuar hastalıkların gelişimi sırasında bütünleyici bir rol oynar. TH9 hücreleri yakın zamanda, başlıca IL-9 üreten, aynı zamanda IL-10 ve IL-21 üreten bağımsız bir T hücresi alt kümesi olarak tanımlanmıştır.12 Tμ9 hücreleri, alerjik akciğer dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarla ilişkilendirilmiştir. inflamasyon, deneysel otoimmünensefalomiyelit(EAE), kolit, 3- Son zamanlarda, TH9 hücrelerinde parazit solucan enfeksiyonları ve kanser görüldü. inflamatuar bağırsak hastalıklarında (IBD) bir rol oynadığı bildirilmiştir.-9Ülseratif kolit (UC) hastalarında yüksek sayıda mukozal IL-9 artı T hücreleri ve IL-9 reseptörü (IL) bulunur. -9R) bağırsak epitelinde yukarı doğru düzenlenir. IL-9 eksikliği, akut ve kronik hastalıkların gelişimini baskılar.oksazolon kaynaklı kolit, UC'yi taklit eden bir model. Crohn hastalığı (CD) hastalarında, yüksek-8-10 serum IL-9 seviyeleri şiddetli hastalık ile ilişkilidir.

Fig.1 TL1A, murin ve insan TH9 hücrelerinin farklılaşmasını geliştirir. Naif murin CD4 artı T hücreleri, 3 gün boyunca TL1A'lı veya TL1A'sız Ty0-veya T9-polarizasyon koşulları altında ve ]L-9, IL{{9} için bir ELJSA analizi altında farklılaştırıldı. } ve IL-13 salgısı. b Naif insan CD4 T hücreleri (CD4'CD45RACD45ROCD25), sağlıklı donörlerin PBMC'lerinden izole edildi ve 3 gün boyunca TL1A'lı veya TL1A'sız TH9-polarize edici koşullar altında farklılaştırıldı. 48 ve 72. saatlerde insan IL-9 salgısının ELISA analizi. TH9 ve TH9-TL1A ile tedavi edilen hücreler için kültür süpernatanlarındaki IL-9 konsantrasyonlarını gösteren kutu bıyık grafiği. Kutular medyanı ve 25. ve 75. yüzdelikleri temsil eder ve bıyıklar dağılımın minimum ve maksimum değerlerini temsil eder. N=7-9. Veriler, dört bağımsız deneyin (bağımsız deneyler) ortalama ± SD'sini temsil eder. *p< 0.05,***p=""><0.005 determined="" by="" student's="">

TH9 hücreleri, TGF- 1 ve IL-4 varlığında saf CD4 artı T hücrelerinden farklılaşır. IRF4, STAT6, GATA3, PU.1, NF- dahil olmak üzere TH9 hücrelerinin farklılaşması için T-hücresi reseptörü (TCR), TGF- 1 ve IL-4 reseptörlerinin akış aşağısında çeşitli transkripsiyon faktörleri gereklidir. kB ve temel lösin fermuar transkripsiyon faktörü ATF benzeri (BATF.11-15 Ancak, Tμ9 hücrelerinin farklılaşmasını sağlayan transkripsiyonel program ve inflamatuar tetikleyiciler hala iyi anlaşılmamıştır ve lL ile ilişkili bir soy tanımlayıcı faktör{{ 17}} ifadesi tanımlanmadı.

BATF transkripsiyon faktörleri ailesi aşağıdakilerden oluşur:BATF, BATF2, veBATF3ve JUN ve FOS'u içeren AP-1 transkripsiyon faktörleri ailesine aittir. BATF ailesindeki transkripsiyon faktörleri, bir DNA bağlama alanı ve lösin fermuar motifinden oluşur, ancak bir transaktivasyon alanından yoksundur ve başlangıçta AP-1 aktivitesinin negatif düzenleyicileri olarak tanımlanmıştır." Bununla birlikte, son çalışmalar BATF ailesi üyelerinin IRF4 ve IRF8 dahil olmak üzere IRF transkripsiyon faktörleri ile etkileşime girer ve T hücrelerinde ve dendritik hücrelerde hedef genlerini düzenlemek için AP-1-IRF kompozit element dizilerine bağlanır.BATF'nin Ty9 hücrelerinin gelişimi için de gerekli olduğu gösterilmiştir 15,19BATF3'ün CD8a plus ve CD103 plus dendritik hücrelerin gelişimini kontrol ettiği açıklanmıştır. gösterdi. Ek olarak, CD4 artı Tu hücrelerinde BATF3 yolunu aktive edebilen hücre dışı uyaranlar açıklığa kavuşturulmamıştır.

Şekil 2 TL1A, T,9 farklılaşması sırasında BATF ve BATF3 ifadesini yukarı doğru düzenler. RNA dizilimi ile TH9 ve TH9-TL1A hücrelerinin transkripsiyonel profili. En büyük IQR'ye (çeyrekler arası aralık) sahip ilk 100 geni kullanarak RNA dizileme verilerini gösteren ısı haritası. Isı haritasının solundaki ve üstündeki dendrogramlar, genlerin (sıralar) ve örneklerin (sütunlar) kümelenmesini temsil eder. b Naif CD4 artı T hücreleri, 3 gün boyunca farklı TH alt kümelerine ve Treg'lere farklılaştırıldı. Göreceli BATF mRNA ifadesi PCR,c ile analiz edildi Naive CD4 artı T hücreleri, belirtilen zaman periyotları için TL1A ile veya TL1A olmadan TH0- veya TH9-polarizasyon koşulları altında farklılaştırıldı. Göreceli BATF mRNA ifadesinin PCR analizi, d BATF ve IRF4'ün birlikte boyanması (üst). BATFIRF4 hücrelerinin yüzdelerinin kantitatif analizi(altta).e BATF ve IL'nin birlikte boyaması-9. fg

TL1A. f 48h.g'de IL-9 ve BATF'nin temsili hücre içi boyamasıBATFfIL-9 artı T hücreleriTy9 ve T9-TL1A koşulları altında farklılaştırılmıştır. Araçlar gösterilir. Her sembol bireysel bir bağışçıyı temsil eder. N=4. h Farklı murin Th alt kümelerinde ve Treg'lerde bağıl Batf3 mRNA ifadesi, belirtilen zaman noktalarında qPCR.I Göreli Batf3 mRNA ifadesi ile analiz edildi. j BATF3 ve IL'nin temsili birlikte boyaması-9. k FrekansBATF3IL-9 artı T hücreleriTy9 ve TH9-TL1A koşulları altında farklılaştırılmıştır. Araçlar gösterilir. Her sembol ayrı bir deneyi temsil eder. N=3. Im Naive insan CD4 artı T hücreleri, TL1A'lı veya TL1A'sız T,9-polarizasyon koşulları altında farklılaştırıldı. I IL-9 ve BATF3'ün 48 saatte temsili hücre içi boyaması. m BATF3L-9 artı TH9 ve TH9-TL1A koşulları altında farklılaşan T hücrelerinin frekansı. Araçlar gösterilir. Her sembol bireysel bir bağışçıyı temsil eder. N=4. Veriler, iki (a) veya en az üç (bd. i. k) bağımsız deneyden bir bağımsız deneyin ortalama±SD'sini temsil eder.*n<0.05. n=""><0.01.***n <="" 0.005="" as="" determined="" by="" student's="">

Yakın zamanda, IBD dahil olmak üzere bağışıklık aracılı hastalıklarda önemli bir rol oynayan bir TNF üst ailesi üyesi olan TL1A'nın, Tu17 hücrelerinde IL-9 salgılanmasını indüklediğini gösterdik. "Ayrıca, yakın tarihli bir yayın, TL1A'nın reseptörü DR3 aracılığıyla TA9 farklılaşmasını desteklediğini göstermiştir.IL-2-veSTAT5-allerjik akciğer inflamasyonunda PU'ya bağlıdır.1- ve STAT6-bağımsız mekanizmalar.2' Bununla birlikte, TL1A tarafından indüklenen transkripsiyonel programlar ve TL1A'nın indüklediği TH9 hücrelerinin bağırsak iltihabı ve IBD'deki patojenitesi, henüz aydınlatıldı.

Burada, TL1A'nın yeni bir sinyal yolu aracılığıyla insan ve murin TH9 hücrelerinin farklılaşmasını desteklediğini gösteriyoruz. BATF3'ü, Tp9 hücrelerinin farklılaşması için yeni bir transkripsiyonel düzenleyici olarak tanımlıyoruz. TL1A, lI9 lokusunda kromatinin yeniden şekillenmesine ve IL-9 transkripsiyonel aktivasyonu için önemli bileşenler olan öncü transkripsiyon faktörleri IRF4 ve BATF'nin ve BATF3'ün 9 promotör içindeki korunmuş bölgelere alınmasına yol açar. Ayrıca TL1A, BATF ve BATF3'ün ifadesini STAT6-bağımlı bir şekilde yukarı regüle eder.BATF- ve Batf3-eksik T-9 ve TL1A kaynaklı TH9(T-9-TL1A) ) hücreler, IL-9 üretiminde bozulur.TH9-TL1Ahücreler, barsaklarda ve akciğerlerde, nötralize edici IL-9 antikorları ile tedavi ile zayıflatılmış şiddetli mukozal enflamasyon ile açıklandığı üzere, adaptif olarak Ragi-7-farelerine aktarıldıklarında in vivo olarak yüksek oranda proinflamatuardır. Batf3-/TH9-TL1A hücrelerinin Rag1-7farelere kabul edilebilir transferi, WT TH9-TL1A hücrelerine kıyasla mukozal inflamasyonun ve sitokin üretiminin önemli ölçüde azalmasına yol açar. Verilerimiz, patojenik efektör T,9 hücrelerinin geliştirilmesinde TL1A ve BATF3'ün yeni bir rolü olduğunu göstermektedir ve bu sinyal yolunu, IBD ve alerjik akciğer hastalığı dahil olmak üzere T_9-güdümlü patolojilerde potansiyel bir terapötik hedef olarak tanımlar.

SONUÇLAR

TL1A, fare ve insan Tμ9 hücre farklılaşmasını in vitro olarak geliştirir TL1A'nın TH9 farklılaşması üzerindeki etkisini belirlemek için, TH9 koşulları altında TL1A ile veya TL1A olmadan saf CD4 T hücrelerini uyardık. TL1A, IL-9 salgılanmasını ve I/9 mRNA ifadesini önemli ölçüde arttırdı (Şekil 1a, Ek Şekil 1a). TL1A tek başına IL-9 salgısını indüklemedi, bu da TL1A'nın IL-9 üretimini teşvik etmek için TGF- 1 ve IL-4 ile sinerjik olarak hareket ettiğini düşündürdü. T-9-ilişkili sitokinler L-10 ve IL-13'nin salgılanması ve mRNA ifadesi de TL1A ile geliştirilmiştir (Şekil 1a, Ek Şekil 1a, b). Önceki raporlarla uyumlu olarak, hücre içi IL-9 boyamasının zaman süreci deneyleri, 3. günde T-9 koşulları altında maksimum bir indüksiyon ve günde taban çizgisine geri bir düşüş ile geçici IL-9 ifadesini ortaya çıkardı 5(Ek Şekil 1b).28,2TL1A, kinetikte daha erken ve daha güçlü bir IL-9 indüksiyonuna doğru bir kayma ile deneylerin zaman süreci boyunca önemli ölçüde daha yüksek bir IL-9-üreten hücre yüzdesini indükledi. erken bir zaman noktasında, TH9 koşulları altında indüklenen maksimum IL-9 üretimini aştı (Ek Şekil 1b). Ayrıca TL1A varlığında IL-9 artı IL-10 artı hücrelerin arttığını gözlemledik (Ek Şekil 1b). Diğer Tu alt kümelerine doğru herhangi bir kayma gözlemlemedik (Ek Şekil 1c). TH9 farklılaşmasının TL1A ile arttırılması, tamamen reseptörü DR3'e bağlıydı (Ek Şekil 1d). Birlikte ele alındığında, bu veriler TL1A'nın TA9 farklılaşması ve IL-9 üretiminde TGF- 1 ve IL-4 ile sinerji oluşturduğunu göstermektedir.

TL1A ayrıca, OVA'ya özgü OT-ll hücreleri kullanılarak antijene özgü bir ortamda TH9 farklılaşmasını önemli ölçüde arttırdı (Ek Şekil 1e, f). TL1A, bellek CD4 artı T hücreleri için gösterildiği gibi TH9 farklılaşması sırasında hücre çoğalmasını etkilemedi (Ek Şekil 1g). " Bu veriler, TL1A'nın çoğalmayı etkilemeden TH9 farklılaşmasını arttırdığını gösteriyor. Ayrıca, 3 gün boyunca Ty9 ve TH9-TL1A koşulları altında farklılaştırılan ve anti-CD3'lerle yeniden uyarılmış hücrelerde IL-9 üretimini inceledik. CD28. İkincil uyarımdan sonra TH9 hücrelerine kıyasla TH9-TL1A hücrelerinde IL-9 üretiminin arttığını gözlemledik, bu da TL1A varlığında daha da arttı (Ek Şekil 1h, i).Bu veriler, TL1A'nın ayrıca farklılaşmış TH9 hücrelerinden IL-9 üretimini arttırdı.Daha sonra, TL1A'nın insan Tu9 hücrelerinin farklılaşması üzerindeki etkisini belirledik.Naif CD4 artı T hücreleri, sağlıklı donörlerden PBMC'den izole edildi ve varlığında Tu9 koşulu altında uyarıldı. fare TH9 hücrelerinden elde ettiğimiz verilerimizle uyumlu olarak, TL1A'nın eklenmesi, insan TH9 hücre kültürlerinden IL-9 salgılanmasını önemli ölçüde arttırdı (Şekil 1b).

TL1A, BATF ve BATF3 transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonunu indükler TL1A tarafından indüklenen sinyal yollarını aydınlatmak için, TH9 ve TH9-TL1A hücrelerinde transkriptomik profili değerlendirmek için RNA dizilimi kullandık. TL1A, TL1A'nın küresel olarak TH9 farklılaşmasını çarpıtmadığını gösteren TH9 transkripsiyonel profilini önemli ölçüde değiştirmedi (veriler gösterilmemiştir). Bununla birlikte, 219 gen, TH9-TL1A hücrelerinde diferansiyel olarak eksprese edildi (Şekil 2a, Ek Tablo 1 ve 2). Yol zenginleştirme analizi, T,9-TL1A koşullarında sitokin-sitokin reseptörü ve JAK-STAT sinyal yollarında yer alan genlerde önemli değişiklikler tanımladı (Ek Tablo 1 ve 2, veriler gösterilmemiştir). BATF3 ve birkaç BATF tarafından düzenlenen gen, T,9-TL1A koşulları (Ek Tablo 3) altında önemli ölçüde yukarı doğru düzenlenmiştir; bu, BATF3 ve BATF transkripsiyon faktörlerinin TH9-TL1A hücrelerinin farklılaşmasında rol oynayabileceğini düşündürmektedir. BATF'nin gerekli olduğu açıklanmıştır Tp17 ve TA9 hücrelerinin gelişimini belirlemek için.15,31-34 -TL1A'nın BATF ailesi üyelerini aktive edip etmediğini, önce farklı Tu altkümelerinde BATF ekspresyon seviyesini değerlendirdik ve güçlü BATF mRNA ekspresyonu tespit ettik. TH9 ve TH2 hücreleri (Şekil 2b). TL1A, Tu9 koşulları altında, özellikle TH9 koşullarının tek başına BATF mRNA'yı indüklemek için yeterli olmadığı 1. günde BATF ekspresyonunu daha da arttırdı (Şekil 2c). TL1A tek başına BATF mRNA'yı Tp9 koşullarıyla benzer derecede indükledi (Şekil 2c). BATF için hücre içi boyama, Ty9-TL1A stimülasyonunun BATF artı hücre yüzdesini önemli ölçüde arttırdığını doğruladı (Şekil 2d). Ayrıca, TL1A tek başına BATF artı hücrelerin yüzdesini ve daha da önemlisi TH9 koşullarına kıyasla BATF*IRF4 artı hücrelerin yüzdesini arttırdı, bu da TL1A'nın IRF4-BATF işbirlikçi komplekslerinin oluşumunu artırabileceğini düşündürdü (Şekil 2d). TH9-TL1A stimülasyonu ayrıca BATF artı IL-9 artı hücrelerin yüzdesini arttırdı (Şekil 2e).

Ek olarak, insan TH9 hücreleri, TL1A ile uyarıldığında önemli ölçüde daha yüksek IL-9- üreten hücre yüzdesine sahipti (Şekil 2f, g). Özellikle, IL-9- üreten hücrelerin çoğunluğu BATF'yi birlikte eksprese etti. BATF ve IRF4'ün birlikte boyanması, TL1A ilavesinin insan T-9 farklılaşması sırasında BATF*IRF4 artı hücrelerin yüzdesini arttırdığını gösterdi (veriler gösterilmemiştir), bu da IL-9 üretiminin arttığını düşündürür. BATF sinyal yolu aracılığıyla TL1A, fare ve insan TH9 hücreleri arasında korunur. BATF'nin aksine, BATF3'ün TH hücrelerinin farklılaşmasındaki rolü daha az tanımlanmıştır. RNA-seq verilerimizi doğrulamak için T-9 hücrelerinde ve diğer TH alt kümelerinde Batf3'ün ifade seviyesini belirledik ve Batf3 mRNA ifadesinin T-9, T,1 ve TH2'de en yüksek olduğunu bulduk. hücreler (Şekil 2h). TL1A, T-9 koşulları altında Batf3'ün ifadesini geliştirdi(Şekil 2i). BATF3 için hücre içi boyama, T,9-TL1A stimülasyonunun BATF3 artı IL-9 artı hücrelerin yüzdesini önemli ölçüde arttırdığını doğruladı (Şekil 2j, k). İnsan T9 hücrelerinde TL1A, BATF3 ekspresyonunu önemli ölçüde arttırdı artı IL-9 artı hücreler(Şek.2l, m). BATF'ye benzer şekilde, IL üreten hücrelerin çoğu BATF3'ü birlikte eksprese etti.

Şekil 3 TL1A, Ty9 farklılaşması sırasında BATE IRF4 ve BATF3'ün //9 promotörüne bağlanmasını artırır, a, b Naive murin CD4 artı T hücreleri, TH0- veya Tμ9-polarizasyon koşulları altında farklılaştırılmıştır. veya 2（BATF, IRF4 ve AcH3） veya 3（BATF3） gün için TL1A olmadan. BATF, IRF4, BATF3 veya AcH3'ün korunmuş kodlamayan dizilere (CNS) 1 (a) ve //9'un CNS0 (b) bağlanması için ChP tahlilleri yapıldı. Veriler, iki bağımsız deneyden bir bağımsız deneyin ortalama ±SD'sini temsil eder.*p<><>< 0.005="" as="" determined="" by="" student's="">

BATF ve BATF3, TL1A kaynaklı T_9 farklılaşmasında kritik transkripsiyon faktörleridir

BATF ve BATF3'ün rolünü daha fazla tanımlamak için, iki Il9 korunmuş kodlamayan dizide (II9 CNS1, CNSO) bağlanmayı belirlemek için kromatin immünopresipitasyon (ChIP) testleri gerçekleştirdik. ve TH9-TL1A, BATF bağlanmasını daha da geliştirdi (Şekil 3a). Daha yukarı akış I/9 CNS'de0, TL1A, T,9 koşulları altında BATF bağlanmasını da arttırırken, tek başına TL1A'nın hiçbir etkisi olmadı (Şekil 3b). TL1A, CNS1 ve CNS'de Ty9 koşulları altında geliştirilmiş IRF4 bağlanması0(Şekil 3a, b). İlginç bir şekilde, CNS1 ve CNSO'da asetillenmiş histon 3(AcH3)'ün bağlanması, daha önce TH9 farklılaşması sırasında Il9 lokusunda kromatin yeniden şekillenmesini kolaylaştırmak için tarif edilmiştir, Ty9-TL1A koşulları altında da arttırılmıştır (Şekil 3a,b). BATF3'ün CNS1'e bağlanması, TH9 hücrelerinde yukarı regüle edildi ve bağlanma, TH9-TL1A koşulları altında daha da geliştirildi, BATF3 ise CNS'ye bağlanmadı0 (Şekil 3a, veriler gösterilmemiştir). Bu veriler, TL1A'nın, ll9 ekspresyonunu indüklemek için TH9 koşulları altında //9 promotörüne BATF, BATF3 ve IFR4 bağlanmasını geliştirdiğini göstermektedir. BATF ve BATF3'ün TL1A'ya bağımlı ve Batf3-7-T hücrelerindeki rollerini doğrulamak için. IL-9, IL-Ty9 farklılaşması, Batf7- a 10 kullandık ve IL-13 üretimi, Tμ9 koşulları altında BATF-/-hücrelerinde ciddi şekilde bozuldu （Şek. 4a-d）. Ancak TL1A uyarımı, Ty9 farklılaşması sırasında IL-9 ve IL-13 üretimi için BATF gereksiniminin en azından kısmen üstesinden geldi (Şekil 4a, b, d). BATF3'ün yokluğunda, IL-9 indüksiyonu, özellikle Tμ9-TL1A koşulları altında önemli ölçüde azaldı （Şekil 4e,f, Ek Şekil 2a). BATF'nin aksine, BATF3 gerekli değildi. -10 veya IL-13 ifadesi için (Şekil 4g, h, Ek Şekil 2b, c). TL1A varlığında BATF ve BATF3 upregülasyonuna yol açan sinyal yollarını tanımlamak için Stat{ {79}}ve p50-/hücreler. p50-/TH9 hücreleri, BATF artı IRF4t hücrelerinin yüzdelerini azalttı ve TL1A uyarımı altındaki BATF artı IRF4 artı hücrelerin yüzdelerindeki artış neredeyse tamamen ortadan kalktı (Ek Şekil 3a, b). BATF ve Batf3 mRNA'nın T.9 koşulları altında yukarı regülasyonu p50-bağımsızken, TH9-TL1A koşulları altında BATF ve Batf3 ifadesinin geliştirilmesi tamamen p50-bağımlıydı (Ek Şekil 3c , d). Stat6-/T9 hücreleri, BATFIRF4 artı hücre yüzdelerini azalttı ve Tμ9-TL1A stimülasyonu altındaki artışları tamamen ortadan kalktı（Ek Şekil 4a, b). Benzer şekilde, BATF ve Batf3 mRNA'nın yukarı regülasyonu, TH9 ve TH9-TL1A koşulları altında tamamen STAT6'ya bağlıydı (Ek Şekil 4c, d). BATF veya BATF3 eksikliğinin sırasıyla Batf3 ve BATF ifadesi üzerinde önemli bir etkisi olmadığını gözlemledik, bu da iki transkripsiyon faktörü arasında herhangi bir tazminat olmadığını düşündürdü (Ek Şekil 5). Bu veriler birlikte, BATF ve BATF3'ün TL1A varlığında T_9 farklılaşması sırasında önemli ve farklı roller oynadığını ve TL1A uyarımı altında artan BATF ve BATF3 ifadesinin STAT6'ya ve kanonik NF-KB yoluna bağlı olduğunu göstermektedir. Daha sonra, WT ve Batf3-/-Tμ9-TL1A hücreleri üzerinde RNA dizilemesi gerçekleştirdik. Toplamda, 139 gen, WT'ye karşı Batf3-7Ty9-TL1A hücrelerinde farklı şekilde eksprese edildi (Şekil 4i, Ek Tablo 4). Gen ontoloji yolu zenginleştirme analizi, transkripsiyon, hücre proliferasyonu ve hücre içi sinyal transdüksiyonunun düzenlenmesinde yer alan genlerde önemli değişiklikler tanımladı (Ek Tablo 5 ve 6). Bu sonuçlar, BATF3'ün Ty9-TL1A hücrelerinin farklılaşmasındaki rolünü ortaya koymaktadır. T-9-TL1A hücreleri in vivo yüksek oranda patojeniktir TH9-TL1A hücrelerinin in vivo patojenik potansiyelini belirlemek için, ex vivo farklılaştırılmış CD45.1 artı Tμ9 veya TA9-TL1A'yı uyarlayarak aktardık hücreleri Rag1-'-farelere dönüştürür. Ty9 hücreleri alan farelerde önemli kilo kaybı gelişmedi (Şekil 5a). Bununla birlikte, TH9-TL1A hücreleri alan fareler kilo vermiş ve özellikle ince bağırsakta daha şiddetli bağırsak iltihabı geliştirmiştir (Şekil 5a-c). Ayrıca TA9-TL1A alıcılarında inflamatuar hücrelerin peribronşiyal ve perivasküler hücresel infiltrasyonu ile karakterize edilen şiddetli pulmoner inflamasyon gözlemledik. Alcian Blue periyodik asit-Schiff (AB-PAS) ile boyama, Ty9-TL1A alıcılarının hava yolu epitelinde müsin üreten hücrelerin hiperproliferasyonunu gösterdi (Ek Şekil 6a, b). Dalaklarda ve lamina propria mononükleer hücrelerde (LPMC) daha yüksek selülarite gözlemledik ve TH9-TL1A alıcılarında (Şekil 5d, e) dalak, MLN ve LPMC CD4 artı hücrelerinin daha yüksek yüzdeleri ve mutlak sayıları gözlemledik. 9-TL1A hücreleri, in vivo olarak daha yüksek proliferatif potansiyele sahiptir. Ki67 boyaması, TH9-TL1A alıcılarından MLN, dalak ve LPMC'den alınan hücrelerin, T hücre transferlerinden 6 hafta sonra bile daha proliferatif olduğunu doğruladı (Şekil 5f). TH9-TL1A alıcılarından anti-CD3/anti-CD28-yeniden uyarılmış MLN hücrelerinde IL-13 ve IL-17 önemli ölçüde daha yüksek salgılandığı gözlemlendi (Şekil 5g), ve Ty9-TL1A alıcılarından anti-CD3/anti-CD28-yeniden uyarılmış LPMC'de IL-9 ve IL-13'nin önemli ölçüde daha yüksek salgılanması (Şekil 5h). Dalak ve MLN IL-9 plus , IL-13 plus ve IL-17 plus hücrelerinin mutlak sayısının daha yüksek ve mutlak sayıda MLN, splenik ve LPMC CCR6 plus ve daha yüksek mutlak sayıda gözlemledik. TH9-TL1A alıcılarındaki CD103 artı T hücreleri, bu hücrelerin mukozal yüzeylerdeki rolüyle tutarlıdır (Şekil 5i,j). IL-9, T#9-TL1A hücreleri tarafından yönlendirilen in vivo enflamasyon için gereklidir TH9-TL1A hücreleri tarafından artan IL-9 üretiminin bağırsak ve akciğer iltihabına katkıda bulunup bulunmadığını incelemek için, TH9-TL1A hücrelerini nötrleştirici IL-9 veya kontrol antikorları ile T hücre transfer deneyi süresince tedavi ettik. Histopatolojik analiz, izotip kontrollere kıyasla anti-lL-9- ile tedavi edilen farelerde bağırsak iltihabının önemli ölçüde azaldığını gösterdi (Şekil 6a, b). Ayrıca, anti-lL-9- ile tedavi edilen farelerde azalmış peribronşiyal sızıntılar ve mukus üreten hücrelerde bir azalma ile zayıflamış akciğer iltihabı gözlemledik (Ek Şekil 6c). MLN'deki toplam hücre sayısı ve toplam CD4tCD45.1 artı T hücreleri, izotip kontrollerine kıyasla anti-IL-9- ile tedavi edilen farelerde azaldı (Şekil 6c). Anti-IL-9 tedavisi ayrıca MLN ve dalaklarda IL-13 ve IL-17 üretimini azaltırken, IFN-y üretimi değişmedi (Şekil 6d, veriler gösterilmemiştir). Birlikte, bu veriler T-9-TL1A hücrelerinin güçlü efektör hücreler olduğunu ve in vivo bağırsak ve akciğer iltihabı ile sonuçlandığını ve patojenik etkinin IL-9-bağımlı olduğunu gösterir.

Şekil.4 BATF ve BATF3 eksikliklerinin TH9 farklılaşması üzerindeki etkileri. ad Batf7or WT farelerinden elde edilen Naif CD4 T hücreleri, 3 gün boyunca TL1A'lı veya TL1A'sız TH0- veya TH9-polarizasyon koşulları altında farklılaştırıldı. IL-9 ve IL-10.b'nin hücre içi boyaması IL-9 üretiminin ELISA analizi.c IL-10 üretiminin ELISA analizi.d IL'nin ELISA analizi{{14} } üretme. eh Batf3-7-veya WT farelerinden Naive CD4 artı T hücreleri, 3 gün boyunca TL1A'lı veya TL1A'sız T,9-polarizasyon koşulları altında farklılaştırıldı. e IL-9 ve IL-10'nin hücre içi boyaması.f IL-9 üretiminin ELISA analizi. g IL-10 üretiminin ELSA analizi. h IL-13 üretiminin ELISA analizi. I RNA dizilimi ile WT ve Batf3′TH9-TL1A hücrelerinin transkripsiyonel profili. p ile diferansiyel olarak ifade edilen genlerin RNA dizileme verilerini gösteren ısı haritası<0.01. the="" dendrograms="" to="" the="" left="" and="" above="" the="" heat="" map="" represent="" the="" clustering="" of="" genes="" (rows)="" and="" samples="" (columns).="" data="" represent="" means±="" sd="" of="" one="" independent="" experiment="" out="" of="" two="" (i)="" or="" three="" (a-h)="" independent=""><0.05,**p <="" 0.01,="" ***p=""><0.005 determined="" by="" student's="">

BATF3, TH9-TL1A hücreleri tarafından yönlendirilen in vivo inflamasyona katkıda bulunur BATF3'ün in vivo Tu9-güdümlü patolojilerde bir rol oynayıp oynamadığını belirlemek için, ex vivo-farklılaştırılmış WT veya Batf3-'yı benimseyerek aktardık /-TA9-TL1A'yı Bez1-/-farelere dönüştürün. Batf3-'- TA9-TL1A hücreleri alan fareler, önemli ölçüde daha az pulmoner (Şekil 7a, b, Ek Şekil 6e) ve bağırsak iltihabının azalmasına yönelik bir eğilim geliştirir (Histoscore: 3.6'ya karşı 1.2)( Şekil 7a). WT TH9-TL1A alıcılarına kıyasla, akciğerlerde ve LPMC'de azalmış hücresellik ve Batf37′-TL1A alıcılarında MLN ve akciğer CD4 artı T hücrelerinin daha düşük yüzdelerini gözlemledik (Şekil 7c, Ek Şekil 6d). Belirgin bir şekilde, Batf3-'-Ty9-TL1A alıcılarından dalak, MLN ve akciğerlerdeki IL-13 plus ve IL-17 plus hücrelerinin daha düşük yüzdeleri gözlendi (Şek. 7d). Toplu olarak, verilerimiz BATF3'ün in vitro IL-9 üretiminde ve T#9 gelişiminde ve in vivo Tp9-TL1A ile yönlendirilen mukozal inflamasyonda bir rol oynadığını göstermektedir.

Şekil 6 IL-9, Ty9-TL1A hücreleri tarafından tahrik edilen in vivo mukozal inflamasyon için gereklidir. T,9 veya Ty9-TL1A hücreleri, Rgg1-7farelerine enjekte edildi ve farelere, haftada üç kez anti-IL-9 antikoru veya izotip kontrolü, Temsili H&E boyamaları ile tedavi edildi. duodenum, Ölçek çubuğu;200 μm. b Bağırsak için histoloji puanları.c Toplam MLN hücre sayısı （sol）, CD45.1 ve hücre sıklığı （orta） ve CD45.1 artı hücrelerin toplam hücre sayısı (sağ).d IL'nin ELISA analizi{{15} }, IL-17 ve anti-CD3 ve anti-CD28 ile ex vivo yeniden stimülasyondan sonra MLN'den IL-13 üretimi. Veriler, iki bağımsız deneyden bir bağımsız deneyin ortalama ± SD'sini temsil eder. n=4-5/grup.*p<><0.01, as="" determined="" by="" student's="" t-test="" (b)="" or="" mann-whitney="" u="" test="" (c,="">