Yaşlanma Karşıtı -Klotho Geni ile Aktive Edilen İskele, İnsan Adipozu Kaynaklı Kök Hücrelerde Gençleştirici Yara İyileştirme Tepkisini Teşvik Eder

anahtar kelimeler:yaşlanma karşıtı; -Klotho; genle etkinleştirilen yapı iskelesi; yağ kaynaklı kök hücreler; damarlanma;matris biriktirme;gençleştirici şifa

Yaşlanmayı Geciktirici ve Yara İyileştirici Herb Cistanche Almak İçin Buraya Tıklayın

1. Giriş

Yara iyileşmesi, çoklu hücresel olayların sıkı bir şekilde düzenlenmesini gerektiren karmaşık bir biyolojik süreçtir.1]. Ancak yaşlanan popülasyonda hücresel olaylar bozulur ve bu da iyileşmede gecikmeye neden olur.2]. İyileşme mekanizmalarındaki bozulma, kısmen progenitör hücrelerin kemik iliğinden ve diyabet gibi diğer yaygın metabolik hastalıklardan azalması nedeniyle ortaya çıkar.3,4]. Yara yönetiminde, biyomateryal yapı iskelelerinin uygulanması bir tedavi olarak daha yaygın hale gelmektedir. Biyomateryal yapı iskeleleriYarayı enfeksiyondan koruyun, yara eksüdalarını emdirin ve doku nekrozunu önlemek için yarayı nemli tutun.5]. Terapötikler ayrıca biyomateryal yapı iskelelerine yüklenebilir ve iyileşmesi zor yaralarda daha hızlı iyileşmeyi destekler.1]. Bununla birlikte, tek başına biyomateryal yapı iskeleleri, yara içinde meydana gelen çoklu sinyalleşme basamaklarını etkili bir şekilde yönetemeyebilir. Kök hücrelerin iletilmesi bazen yaradaki karmaşık sinyalleşme olaylarını hafifletmek için bir çözüm olarak önerilmektedir.6]. 

Kök hücreler, parakrin faktörleri salgılar ve çoklu doku soylarının hücrelerine farklılaşabilir.7]. Kök hücreler tipik olarak intradermal enjeksiyonlar yoluyla yaraya verilir.6], topikal püskürtme [8] veya doku mühendisliği ürünü greftler [9]. Son yıllarda, kronik yara iyileşmesi için doku mühendisliği greftlerinin uygulanması, yaraları hızlı bir şekilde iyileştirme yeteneklerinden dolayı giderek daha geniş bir kabul görmüştür.9–11]. apligraf® ve Dermagraft® kronik yara tedavisi için yaygın olarak kullanılan Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) onaylı biyomühendislik yapılarından ikisidir [12,13]. Bununla birlikte, bu greftlerin üretimi, yüksek hücre sayıları üretmek için uzun süreli hücre kültürü gerektirir.14]. Kök hücreler kullanılırken, uzun süreli kültür, hücresel yaşlanmayı artırabilir ve kök hücrelerin köklüğünü azaltabilir.15,16]. Bu nedenle, kök hücrelerin köklüğünün korunması, optimal terapötik yanıtın elde edilmesinde merkezi öneme sahiptir. Viral olmayan vektörler kullanılarak kök hücrelere terapötik gen aktarımı, kök hücrelerin işlevselliğini artırmak için potansiyel bir stratejidir [17]. Geleneksel olarak, hücreler 2 boyutlu kültürlerde transfekte edilir ve daha sonra in vivo olarak nakledilir.18]. Bununla birlikte, terapötik transgeni taşıyan nanopartiküller ile işlevselleştirilmiş biyomateryal iskelelerden oluşan genle aktive edilen iskeleler gibi platformlar [19], grubumuzun öncülük ettiği, bir 3-D ortamında hücrelerin transfekte edilmesi için alternatif bir çözüm sunar. Bu çalışma, bileşimi Integra'nın klinik olarak onaylanmış Dermal Rejenerasyon Şablonuna (DRT) benzer olduğundan, muazzam klinik çeviri potansiyeline sahip olan 3D kolajen-kondroitin sülfat (coll-CS) yapı iskelesinin genle etkinleştirilen bir versiyonunu geliştirmeye odaklandı. kronik yara iyileşmesi için yapı iskelesi [20]. Stromal türevli faktör -1 alfa ve sinir büyüme faktörü gibi büyüme faktörü genlerini kodlayan DNA plazmitlerini yoğunlaştırmak ve bunları yüklü nanopartiküller halinde birleştirmek için öncelikle polietilenimin (PEI) adı verilen katyonik bir polimer kullanıyoruz [21–23]. Bu yüklü nanoparçacıklar daha sonra, genle etkinleştirilen yapı iskelelerini oluşturmak için coll-CS yapı iskelemize ıslatılarak yüklenir. Daha önceki çalışmalarımız, PEI bazlı genle aktive edilen yapı iskelesinin, bir dizi yara iyileştirici hücrede terapötik transgenin geçici aşırı ekspresyonuna neden olabileceğini ve bunların rejeneratif yeteneklerini teşvik edebileceğini göstermiştir.21,24,25]. Geleneksel olarak, genle aktive edilen yapı iskelesi, konakçı hücreleri hedeflemek ve yerel onarımı desteklemek için geliştirilmiştir.26]. Bununla birlikte, ortaya çıkan kanıtlar, hücre yüklü genle etkinleştirilen iskelelerin, karmaşık doku yapılarını yeniden oluşturmak için tek başına genle etkinleştirilen iskelelere göre daha üstün bir potansiyele sahip olduğunu göstermektedir.27]. 

Hücresel bolluk, doku mühendisliği ile üretilmiş greftlerin üretimi için en önemli gereksinimlerden biridir.28]. Yağ dokusu, çok sayıda kök hücre sağlayabilen zengin bir kaynaktır. Yağ dokusu, kök hücre ekstraksiyonu için geleneksel bir doku kaynağı olan aynı kemik iliği kütlesi için 500 kat daha fazla kök hücre içerir.29]. Ayrıca, kök hücreler minimal invaziv bir liposuction işlemi kullanılarak yağ dokusundan ekstrakte edilebilir.29]. Son çalışmamız, insan adipozdan türetilmiş kök hücrelerin (ADSC'ler), coll-CS iskelesiyle mükemmel biyouyumluluk gösterdiğini buldu. Pro-anjiyojenik genle aktive edilen bir iskele kullanmak, ADSC'lerin rejeneratif tepkilerini daha da geliştirdi [30]. Bununla birlikte, ADSC'ler genişleme üzerine köklerini kaybetme eğilimindedir [31]. Daha önce, yaşlanmayı geciktiren bir protein bulmuştuk -Klotho, sağlıklı ve diyabetik insan ADSC'lerinin çoğalmasını önemli ölçüde artırabilir [32]. Çoğu çalışma genellikle birincil varyantı kullanır -Klotho [33–35] ve proteinin telomeraz transkripsiyonel aktivitesini aktive ederek ADSC'lerin ömrünü artırabildiğini göstermiştir [33]. -Klotho aşırı eksprese eden MSC'lerin ayrıca Wnt/'nin inhibisyonu yoluyla böbrek hasarında güçlü anti-fibrotik etkiler gösterdiği bulunmuştur. -katenin sinyali [36]. Bununla birlikte, rolü - Kök hücrelerdeki klotho nispeten keşfedilmemiş durumda.

Araştırma odakları arasındaki farkın yanı sıra, - Ve -Klotho, yaşlanma karşıtıKlotho proteinleri henüz doku mühendisliği stratejilerine tam olarak dahil edilmemiştir.yara iyileşmesi için. Bu nedenle, bu çalışmada, bir cihazın fonksiyonel etkisini incelemeye çalıştık. -Yara iyileştirme uygulamaları için insan ADSC'lerinde klotho geniyle etkinleştirilen yapı iskelesi. Bizilk olarak klasik pluripotency faktörlerinin transkripsiyon aktivitelerini araştırdı (Ekim-4,Nanog ve Sox-2), çoğalma belirteci (Ki-67) ve yara iyileştirme düzenleyicileri (TGF- 3 ve TGF- 1) ADSC'lerde. Daha sonra şartlandırılmış ortamın biyoaktivitesini değerlendirdik.parakrin potansiyelini değerlendirmek için ADSC yüklü genle aktive edilen yapı iskelesi tarafından üretilir.Son olarak bazal membranın (fibronektin, laminin,ve kollajen IV) ve skarla ilişkili proteinler ( -SMA ve elastin) ADSC yüklüKontrollü doku olgunlaşmasını değerlendirmek için genle aktive edilen yapı iskelesi.

2. Sonuçlar

2.1. -Klotho Gene-Activated Scaffold, İnsan ADSC'lerinin Stemness ve Pro-Reparative Genlerini Geçici Olarak Geliştirir

Gen ekspresyonu analizi ilk önce genle aktive edilen yapı iskelesindeki ADSC'lerin aşırı eksprese ettiğini gösterdi. - 172- kattan fazla Klotho geni (p < 0.01) than the gene-free scaffold group on day 3 (Figure 1A). Bu bulgu, ADSC'lerin genle etkinleştirilen iskele ile verimli etkileşimini doğruladı. Çoğalma işaretçisi Ki-67'nin analizi ayrıca, genle etkinleştirilen yapı iskelesindeki ADSC'lerin 14 gün boyunca güçlü bir çoğalma kapasitesini koruduğunu da doğruladı (Şekil1A). Yaşlanma karşıtı aşırı ifadeyi doğruladıktan sonra -Klotho geni, daha sonra ADSC'lerde "pluripotency" faktörlerinin aktivasyonu yoluyla kök hücrelerin gençleşmesini değerlendirdik. Genel olarak, 14 gün boyunca üç transkripsiyon faktörünün hepsinin geçici bir düzenlemesini kaydettik (Şekil1B). Ancak, ADSC'ler yalnızca 14. güne kadar devam eden Oct-4 geninin ifadesinde önemli bir artış gösterdi. Spesifik olarak, ADSC'ler 2.5-kat (p < 0.05) increase in the expression of the Oct-4 gene on day 3 before subsiding to 1.6-fold (p < 0.05) on day 14 relative to the gene-free scaffold group. The next set of genes we investigated were the transforming growth factors beta 1 and 3, which are crucial for regulating scarless wound healing (Figure 1C). Pro-fibrotik TGF- seviyeleri 1 gen -Klotho aşırı eksprese eden ADSC'lerin, 14 gün boyunca gen içermeyen yapı iskelesi grubununki ile eşit olduğu bulundu. Bununla birlikte, anti-fibrotik TGF- seviyeleri 3 önemli ölçüde (3.6-katlandı,p < 0.05) elevated during the early days (day 3) and, as anticipated, subsided by about 0.4-fold by day 14, showing a controlled expression of the regulatory gene. 

2.2. -Klotho Gen Aktif İskele

İnsan ADSC'lerinin Parakrin Potansiyelini Artırır2.2.1. Pro-Anjiyojenik Biyoaktivite ADSC'ler yüklü genle aktive edilen iskele tarafından üretilen CM'nin biyoaktivite testi, ilk olarak HUVEC'lerde metabolik aktiviteyi geçici olarak kontrol edebildiğini gösterdi. 3. Gün CM, HUVEC'lerdeki metabolik aktiviteyi önemli ölçüde artırırken, 14. günden itibaren eskimiş CM'nin kullanılması HUVEC'in metabolik aktivitesini önemli ölçüde azalttı (Şekil2A). Bunu gözlemledikten sonra CM'nin 3. ve 14. günden itibaren Matrigel'de tohumlanan HUVEC'ler üzerindeki pro-anjiyojenik etkisini test ettik. Beklendiği gibi, genle aktive edilen yapı iskelesi grubundan 3. gün CM önemli ölçüde (p < 0.05) enhanced HUVEC tubule formation capacity and their branching (Figure 2B). Ancak, 3. gün ile karşılaştırıldığında 14. gün ile anjiyojenik aktivitede daha fazla artış olmamıştır. Ayrıca, her iki gruptan 14 CM gün, benzer pro-anjiyojenik etkinlik sergiledi (Şekil2C). Toplu olarak, bulgumuz, genle etkinleştirilen yapı iskelesinin, ADSC'lerin pro-anjiyojenik tepkisini geçici olarak hızlandırdığını gösterir.

pro-fibrotik TGF- 1. ** ve * gösterirp < 0.01 and p < 0.05 respectively. Data represent mean ± standart sapma (n = 3).

Şekil 2. ADSC yüklü genle aktive olan yapı iskelesi CM'nin pro-anjiyojenik parakrin biyoaktivitesi. (A) 14 gün boyunca ADSC yüklü genle etkinleştirilen yapı iskelesi tarafından üretilen CM, HUVEC'lerin metabolik aktivitesini geçici olarak kontrol etme yeteneği gösterdi. (B) Genle etkinleştirilen iskele grubundan 3. Gün CM, endotel tübül oluşumunu ve gen içermeyen iskele grubuna kıyasla dallanmasını önemli ölçüde arttırdı. (C) ADSC'lerden CM'ye maruz kaldıktan 6 saat sonra endotel hücrelerinin tübül oluşumu ve dallanması tohumlanmış genle etkinleştirilen ve gen içermeyen yapı iskelesi, * p < 0.05'i gösterir. Veriler ortalamayı temsil ediyor! standart sapma (n=3)

2.2.2. Dermal Fibroblast İyileşmesi ve Olgunlaşması

Anjiyogenez çalışmasından elde edilen bulgulardan biri, ADSC'ler yüklü genle aktive olan yapı iskelesi olgunlaştıkça, artık anjiyogenezi desteklemediğidir. Ayrıca, 14. günde anjiyojenik güçleri gensiz iskele grubununkine benzerdi (Şekil 2B, C) Bu nedenle, 14. günün CM'sinin dermal fibroblast yara kapanması üzerindeki etkisini araştırdık. Anjiyogenez çalışmasının sonucuna benzer şekilde, her iki grup da 14. gün ile benzer seviyelerde fibroblast yara kapanması gösterdi. Spesifik olarak, her iki grup da yarayı 12 saatte yaklaşık yüzde 40 oranında iyileştirdi (Şekil 3A). Bu bulgu, olgunlaşma sırasında, genle etkinleştirilen iskele grubunun dermal fibroblast yara kapanmasını desteklediğini ancak desteklemediğini ortaya koydu.

Bununla birlikte, fibroblastlar yaşlı CM ile uyarıldığından, yara olgunlaşmasında yer alan matris proteinlerinin ekspresyonunun etkilerinin olup olmadığını inceledik. Beklendiği gibi, gen içermeyen iskele grubundan CM ile uyarılan dermal fibroblastlar, pro-fibrotik kollajen I proteinini bol miktarda ifade etti (Şekil 3B). Aksine, genle aktive edilen yapı iskelesi grubundan CM ile uyarılan fibroblastlar, kollajen I proteininin yüzde 50 daha düşük ekspresyonunu (p < 0.05) gösterdi. Bu arada, her iki grupta da anti-fibrotik kollajen ekspresyonu yoktu ve iki grup arasında fark gözlenmedi. Birlikte ele alındığında, genle etkinleştirilen yapı iskelesinin, olgunlaşma sırasında ADSC'lerin yara modülatör yanıtını geliştirdiği anlamına gelir.

Şekil 3. Dermal iyileşme ve olgunlaşma üzerindeki parakrin etkisi. (A) Her iki gruptan 14. gün CM'si, insan yetişkin dermal fibroblastlarında 12 saatte yaklaşık yüzde 40 benzer seviyelerde yara kapatma aktivitesi gösterdi. (B) Genle etkinleştirilen yapı iskelesinden CM, ifadeyi önemli ölçüde azalttı fibroblastlarda pro-fibrotik kollajen bulunur. ", p < 0.05'i belirtir. Veri, ortalama=standart sapmayı (n=3) temsil eder. Şekil 3B'de GAS ve GFS, sırasıyla genle etkinleştirilen yapı iskelesi ve gensiz yapı iskelesi anlamına gelir.

2.3. B-Klotho Gene-Aktivasyonlu İskele, İnsan ADSC'lerinde Geliştirilmiş anti-Fibrotik Tepki ile Temel Membran Rejenerasyonunu Geliştiriyor

ADSC'lerin işlevselliğini genle etkinleştirilen yapı iskelesinin kontrollü stimülasyonunu gözlemledikten sonra, sonuçta ADSC'lerin dermal matrislerin ve proteinlerin yenilenmesine yönelik tepkisini araştırdık. Genle etkinleştirilen iskele, ADSC'lerin bazal zarının yenilenmesini sağlam bir şekilde geliştirdi. Spesifik olarak, genle etkinleştirilen yapı iskelesi, bazal membran bileşenleri laminin ve kollajen birikimini önemli ölçüde desteklemiştir (IVŞekil 4A). Yarı kantitatif analizden sonra, matris birikiminin gen içermeyen yapı iskelesi grubuna göre bir eğilim izlediğini de not ettik. Gözlenen eğilim şuydu:fibronektin (1.0-kat) < laminin (2.1-kat, p < {{10}}.05) < kolajen IV (8.{13}}kat, p < 0.01). Bazal membranı yenileme yeteneği belirlendikten sonra, azaltılmış yara izi gibi üstün niteliksel iyileşme için çok önemli olan proteinlerin ifadesini değerlendirdik. Genle etkinleştirilen iskele üzerindeki ADSC'ler, yara iziyle ilişkili kasılma proteini a-SMA'nın önemli ölçüde (p < 0.05) azaltılmış bir ifadesini gösterdi. ADSC'lerdeki a-SMA ifadesi, gen içermeyen iskele grubuna göre yüzde 50 daha düşüktü (Şekil 4B). Son olarak azalan a-SMA ifadesini gözlemledikten sonra, elastik matriks protein elastinin ifadesini değerlendirdik. Genle etkinleştirilen yapı iskelesindeki ADSC'ler, gen içermeyen yapı iskelesindeki ADSC'lere kıyasla olgun bir fibröz elastin ağının birikmesi yoluyla nispeten üstün bir nitel elastin ifadesi gösterdi (Şekil 4B).

Şekil 4. 14. günde genle etkinleştirilen yapı iskelesinde ADSC'ler tarafından yara yanlısı iyileştirici matris proteinlerinin biriktirilmesi.(A) Genle etkinleştirilen yapı iskelesindeki ADSC'ler önemli ölçüde yenilenme gösterdi. gen içermeyen yapı iskelesindeki ADSC'lere kıyasla bazal membranın çalışması. ADSC'ler ağırlıklı olarak nispeten olgun bir kollajen IV proteinleri ağı biriktirdi, ardından laminin ve fibronektin geldi.(B) Genle etkinleştirilen yapı iskelesindeki ADSC'ler ayrıca gendeki ADSC'lere kıyasla 2-kat daha düşük SMA proteini ifade etti. -ücretsiz iskele. bodrum mem ile birlikte. zar rejenerasyonu, genle etkinleştirilen yapı iskelesindeki ADSC'ler, niteliksel olarak daha iyi bir elastik matris biriktirdi. Tüm görüntüler, bir IX73 Olympus mikroskobu* kullanılarak 20x objektif aracılığıyla çekilmiştir ve * sırasıyla p < 0.01 ve p < 0.05'i gösterir. Ölçek çubuğu 50um. Veriler, ortalama standart sapmayı temsil eder (n=3).-SMA ve fibronektin, çift immüno-lekelendi.

E-posta:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp artı 86 15292862950