Bakteriyel Dış Membran Kesecikleri Arabidopsis'te Bağışıklık Sistemi Aktivasyonuna Doğru Transkripsiyonel Bir Değişime Neden Olur ve Planta'da Patojen Büyümesinin Baskılanmasına Yol Açar
Nov 21, 2023
Soyut
Gram-negatif bakteriler, hücre çevresinde küresel kabarcıklar oluşturur ve bunlar daha sonra bakteri hücre duvarından ayrılarak hücre dışı kesecikler oluşturur. Dış membran kesecikleri (OMV'ler) olarak bilinen bu nano ölçekli yapıların, enfeksiyonu ve hastalığı teşvik ettiği ve hem memeli hem de bitki konakçılarda tipik bağışıklık çıktılarını tetikleyebildiği gösterilmiştir. OMV'lere maruz kaldıktan sonra bitkilerin geçirdiği geniş transkripsiyonel değişikliği daha iyi anlamak için, Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) fidelerini Gram-negatif bitki patojenik bakteri Xanthomonas campestris pv'den saflaştırılmış OMV'lerle tedavi ettik. campestris ve OMV ve sahte tedavi görmüş bitkiler üzerinde tehditten 2, 6 ve 24 saat sonra RNA sekans analizi gerçekleştirdi. En belirgin transkripsiyonel kayma, diferansiyel olarak eksprese edilen genlerin sayısı ve ortalama kat değişiminin yansıttığı gibi, test edilen ilk iki zaman noktasında meydana geldi. OMV'ler, çeşitli bağışıklık reseptörleri de dahil olmak üzere bağışıklıkla ilgili çok sayıda yolu düzenleyerek bağışıklık sistemi aktivasyonuna doğru büyük bir transkripsiyonel kaymayı indükler. Arabidopsis'in OMV'lere ve saflaştırılmış elisitörlere verdiği tepkinin karşılaştırılması, OMV'lerin tekli elisitörlerle benzer gen ve yolak grubunu indüklediğini, ancak diğer elisitörler tarafından değil OMV'ler tarafından aktive edilen yolların tespit edildiğini ortaya çıkardı. Arabidopsis bitkilerinin OMV'lerle ön işleme tabi tutulması ve ardından bunların bakteriyel bir patojenle enfekte edilmesi, patojen büyümesinde önemli bir azalmaya yol açtı. Bitki uzama faktörü reseptörü (EFR), flagellin reseptörü (FLS2) veya brassinosteroide duyarsız 1- ilişkili kinaz (BAK1) yardımcı reseptöründeki mutasyonlar, OMV'lerin immün hazırlama etkisini önemli ölçüde etkilemedi. Bu sonuçlar birlikte, OMV'lerin Arabidopsis'te geniş bir transkripsiyonel kaymayı indüklediğini ve bunun birden fazla bağışıklık yolunun yukarı regülasyonuna yol açtığını ve bu transkripsiyonel değişikliğin bakteriyel enfeksiyona karşı direnci kolaylaştırabileceğini göstermektedir.
ANAHTAR KELİMELER
Arabidopsis thaliana, bakteriyel enfeksiyon, hücre dışı kesecikler, OMV'ler, dış zar kesecikleri, bitki bağışıklığı, RNA-seq, Xanthomonas campestris pv. kampestris
erkekler için cistanche faydaları-bağışıklık sistemini güçlendirir
1. GİRİŞ
Bitkiler sürekli olarak dokularında çoğalan ve normal büyümeyi engelleyen zararlı mikroplarla karşı karşıya kalır. Etkili bir savunma tepkisi büyük ölçüde istilacı mikrobun hızlı ve doğru tespitine ve tanımlanmasına bağlıdır. Bu amaçla bitkiler patojen istilasını izlemek için geniş gözetim sistemleri kullanır (Cook ve diğerleri, 2015). Bitkinin gözetim sisteminin ilk hattının veya bitkilerle mikropların etkileşime girdiği ilk hücresel arayüzün hücreler arası boşluk, yani apoplast olduğu tahmin edilmektedir. Burada, istilacı mikropların tanınmasına, membrana bağlı, hücre dışı olarak maruz kalan desen tanıma reseptörleri (PRR'ler) aracılık eder (Boutrot ve Zipfel, 2017; Couto ve Zipfel, 2016). PRR'ler, birçok mikrop arasında yaygın olarak bulunan ve korunan ve mikrop veya patojenle ilişkili moleküler modeller (MAMP'ler) olarak bilinen mikrobiyal belirleyicileri tanır (Ranf ve diğerleri, 2016). Mikroplar hızlı bir oranda mutajeneze maruz kaldıklarından, evrimsel olarak yararlı bağışıklık reseptörleri, ciddi bir uygunluk maliyeti nedeniyle kolayca atılamayan veya mutasyona uğratılamayan önemli mikrobiyal bileşenlerin yüksek oranda korunmuş bölgelerini tespit edecek şekilde uyarlanır. Örneğin bakteriyel flagellin, patojenler de dahil olmak üzere birçok mikropun fizyolojisinde önemli bir unsurdur ve şu anda en iyi çalışılan MAMP'lardan biridir (Felix ve diğerleri, 1999; Zipfel ve diğerleri, 2004). Flagellinin veya sentetik epitop flg22'nin (flagellum yapı bloğu flagellinin N-terminalinde yüksek oranda korunmuş 22 amino asitten oluşur) aynı kökenli bitki bağışıklık reseptörü flagellin sensing 2 (FLS2) tarafından algılanması, büyük bir transkripsiyonel değişikliğe yol açar ardından enfeksiyonu durduran etkili bir bağışıklık tepkisi gelir (Chinchilla ve diğerleri, 2007; Gómez-Gómez ve Boller, 2000). Bilinen birçok MAMP, mikrobun hücre duvarı ile ilişkilidir. Örneğin, fungal kitin (Fesel ve Zuccaro, 2016), bakteriyel peptidoglikan (PG) (Erbs ve diğerleri, 2008; Gust ve diğerleri, 2007), bakteriyel lipopolisakkaritler (LPS) (Dow ve diğerleri, 2000; Silipo ve diğerleri) ., 2005), flagellin (Boutrot ve Zipfel, 2017; Felix ve diğerleri, 1999) ve daha fazlası. Bununla birlikte, hücre duvarı ile ilişkili bu bileşenlerin plantadaki aynı kökenli bağışıklık reseptörleri ile nasıl etkileşime girdiği tam olarak açık değildir. Bunun hücre ölümü ve/veya hücre duvarının bozulması nedeniyle mi yoksa flagellum gibi bileşenlerin aktif salınımı yoluyla mı meydana geldiği daha fazla araştırmaya ihtiyaç duyan bir konudur (Bahar, 2020).
Gram-negatif bakteriler tarafından hücre duvarı parçalarının aktif salınımının bir örneği, dış zardan çevredeki ortama taşan ve sıkışan hücre dışı keseciklerin (EV'ler) ayrılmasıdır (Kulp ve Kuehn 2010; Théry ve diğerleri, 2018). ). Bu bakteriyel EV'ler genellikle dış membran kesecikleri (OMV'ler) olarak adlandırılır ve bundan sonra bu terminolojiye bağlı kalacağız (Schwechheimer ve Kuehn, 2015). OMV salınımı süreci, konak kolonizasyonu da dahil olmak üzere sürekli olarak ve çeşitli çevresel koşullar altında gerçekleşir (Gurung ve diğerleri, 2011; Ionescu ve diğerleri, 2014; Jin ve diğerleri, 2011). Dış zar (OM) proteinleri, LPS ve lipitler gibi bütünleşik dış zar moleküllerine ek olarak OMV'ler, proteinler, hücre duvarı parçalayıcı enzimler, polisakkaritler ve nükleik asitler gibi çok çeşitli moleküllerden oluşan periplazmik sıvıları kapsüller (Kuehn & & Kesty, 2005). OMV'ler konak kolonizasyonu sırasında salındığından ve yükleri MAMP'lardan oluştuğundan, ortaya çıkan molekülleri aynı kökenden gelen bağışıklık reseptörlerinin yakınına ileten bağışıklık elisitörlerinin taşıyıcıları olarak hareket ettiklerini tahmin etmek cazip gelebilir (Bahar, 2020; Katsir & Bahar, 2017). Aslında OMV'lerin, konakçılarına sunulduğunda hem memeli hem de bitki bağışıklık sistemlerini uyardığı gösterilmiştir (Bahar ve diğerleri, 2016; Ellis ve Kuehn, 2010; Janda ve diğerleri, 2021; McMillan ve diğerleri, 2021). Memeli hücrelerinde hem LPS hem de OMV'lerin protein bileşenleri bağışıklık uyarıcıları olarak görev yaparken (Ellis ve diğerleri, 2010), bitkilerde hangi OMV moleküllerinin ana bağışıklık uyarıcıları olduğu henüz açık değildir.
Konakçının bağışıklık tepkisini modüle etmenin yanı sıra, OMV'lerin virülans faktörleri taşıdıkları ve çok sayıda sürece dahil oldukları da gösterilmiştir. Buna hücre-hücre iletişimi (Deatheragea & Cooksona, 2012; Mashburn & Whiteley, 2005; Raposo & Stahl, 2019), toksinlerin hedef hücrelere verilmesi (Ellis & Kuehn, 2010; Kadurugamuwa & Beveridge, 1996), biyofilm oluşumu (Schooling) dahildir. & Beveridge, 2006), antimikrobiyal bileşiklerin söndürülmesi (Manning & Kuehn, 2011), strese tepki (MacDonald & Kuehn, 2013), yatay gen transferi (Fulsundar ve diğerleri, 2014; Velimirov & Ranftler, 2018) ve virülans (Ellis) ve Kuehn, 2010; Kunsmann ve diğerleri, 2015). Bu örneklerin çoğu memeli bakteriyel patojenlerle ilgili çalışmalardan gelirken, bitki patojenik bakterilerle yapılan son çalışmalar da OMV'lerin bakteriyel virülansı ve bitki kolonizasyonunu desteklediğini desteklemektedir. Ionescu ve ark. (Ionescu ve diğerleri, 2014), ksilem damar kolonizasyonu sırasında bitki patojeni Xylella fastidiosa tarafından OMV üretiminin, bitkinin su ileten elemanlarına (ksilem) bakteriyel tutunmayı engellediğini ve bitkinin sabit ve hareketli formları arasındaki dengeyi bozduğunu gösterdi. Patojenin mobil forma doğru ilerlemesi. Bu formun ksilemdeki hücre dağılımını teşvik ettiğine ve bitkinin daha hızlı azalmasına yol açtığına inanılmaktadır (Ionescu ve diğerleri, 2014). Diğer iki çalışma, tip II tarafından salgılanan lipazlar/esteraz ve ksilanaz ve tip III tarafından salgılanan efektörler gibi virülans faktörlerinin OMV'lerle birlikte salgılandığını göstermiştir (Chowdhury ve Jagannadham, 2013; Sidhu ve diğerleri, 2008; Solé ve diğerleri). ., 2015) OMV'nin bakteriyel virülansta önemli bir role sahip olabileceğini düşündürmektedir. OMV'lerin moleküler karmaşıklığı, konakçıdaki ikili ve muhtemelen karşıt fonksiyonlarıyla (bağışıklığı teşvik etmek ve virülansı teşvik etmek) birlikte, bizi Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) bitkilerinin OMV mücadelesine karşı daha geniş transkripsiyonel tepkisini incelemeye ve bu transkripsiyonel değişikliğin olup olmadığını test etmeye teşvik eder. sonraki bakteriyel enfeksiyona karşı direnç veya duyarlılığa neden olabilir.
2 MATERYAL VE YÖNTEM
2.1 Bitki materyali ve büyüme koşulları
Bu çalışmada Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) vahşi tip Col-0 çizgisinin yanı sıra şu mutant çizgiler kullanıldı: bak- (Schlesinger ve diğerleri, 2011) ve düşmeler ever (Nekrasov ve diğerleri, 2009). Arabidopsis tohumları yüzey sterilizasyonuna tabi tutuldu ve açıklandığı gibi Murashige ve Skoog (MS) agar plakalarına ekildi (Bahar ve diğerleri, 2016). Plakalar 2-4 gün boyunca 4◦C'de karanlıkta tutuldu ve daha sonra 5-8 gün boyunca çimlenme için 22◦C'ye taşındı. Benzer büyüklükteki çimlendirilmiş fideler, %1 (ağ:hacim) sakaroz (Duchefa Biochemie) içeren 1 ml MS ortamı içeren 24-kuyucuklu plakalara (oyuk başına iki fide) aktarıldı ve 8-10 gün daha büyütüldü. aşağıda açıklandığı gibi elisitör ile sınanmadan önce aynı koşullar. Hazırlama deneyleri için, Arabidopsis yabani tip Col-0 soyunun ve mutant soyların (düşen ve geri dönen) tohumları yukarıda anlatıldığı gibi çimlendirildi ve daha sonra karışım içeren 7 x 7 x 6 cm'lik saksılara (1 fide/saksı) nakledildi. toprak Yeşil #7611 (Evenari, Ashdod, İsrail) ve 22–24˚C'de 9,5 saatlik bir fotoperiyotta büyütüldü. Bitkiler
2.2 Bakteriyel dış membran keseciklerinin saflaştırılması
Xanthomonas campestris pv'nin gliserol stokları. campestris(Xcc) 33913, Nutrient Agar (Difco, NA, Becton, Dickinson ve Company) plakalarına çizgi halinde ekildi ve 28˚C'de 2-5 gün büyütüldü. Tek koloniler toplandı ve 10 ug/ml sefaleksin hidrat (Cp, Sigma-Aldrich) içeren bir 3-mL YEB (maya ekstraktı et suyu) başlatıcısını aşılamak için kullanıldı. Başlatıcılar gece boyunca 28◦C'de 185–200 devir/dakika çalkalanarak büyütüldü ve ardından 500 ml PSB (pepton sakaroz besiyeri) ortamını antibiyotiklerle (yukarıda açıklandığı gibi) 2-L Şişelerde aşılamak için kullanıldı ~1:1000 (v:v) oranında. Kültürler yukarıda açıklandığı gibi 0,6-0,8'lik bir OD600'e kadar büyütüldü ve ardından bakteri hücreleri döndürüldü ve OMV'ler açıklandığı gibi süpernatandan ekstrakte edildi (Mordukhovich ve Bahar, 2017). Ham OMV preparatı daha sonra açıklandığı gibi saflaştırılmış OMV'ler elde etmek için Optiprep gradyan santrifüjüne tabi tutuldu (Bahar ve diğerleri, 2016; Mordukhovich ve Bahar, 2017). Her OMV partisi 1.5-L bakteri kültüründen saflaştırıldı ve son olarak 1 ml PBS (pH 7.3) içerisinde yeniden süspanse edildi. Saflaştırılmış OMV'ler hemen kullanıldı veya kullanımdan 7 gün öncesine kadar 4◦C'de saklandı. OMV'lerin boyut dağılımı, dinamik bir ışık saçılım cihazı (Zetasizer Nano ZS, Malvern Panalytical, Worcestershire, UK) kullanılarak ölçüldü ve ortalama çapı 121,7 ± 55,43 nm (SD) idi. Parçacık konsantrasyonu benzer şekilde ölçülmüş ve aşağıdaki her deney açıklamasında verilmiştir.
cistanche tubulosa-bağışıklık sistemini iyileştirir
2.3 OMV'lerle Arabidopsis fide mücadelesi
Arabidopsis'in OMV tehdidine karşı transkripsiyonel tepkisini incelemek için yukarıda açıklandığı gibi 24-kuyu plakalarında yetiştirilen Col-0 fideleri kullanıldı. OMV yüklemesinden bir gün önce, MS ortamı plakalardan çekilmiş ve yerine 250 ul steril dH20 konmuş ve plakalar gece boyunca tezgahta bırakılmıştır. Ertesi sabah, her bir oyuğa 20 ul saflaştırılmış OMV (oyuk başına 1.44 x 109 partiküle karşılık gelen ml başına 30 ug) veya sahte olarak steril dH2O ilave edildi. Fideler, yüklemeden 2, 6 ve 24 saat sonra toplandı, kağıt üzerinde kurutuldu ve 2-mL Eppendorf Safe-Lock tüpleri (Hamburg, Almanya) içinde sıvı nitrojen ile anında donduruldu. Her zaman noktasında, her zaman noktasında her tedavi için dört biyolojik kopyayı temsil eden dört OMV ile tedavi edilen ve dört sahte tedavi edilen kuyucuk toplandı.
2.4 RNA saflaştırması
Üreticinin talimatlarına göre TRIzol reaktifi (Invitrogen) kullanılarak Arabidopsis fidelerinden RNA ekstrakte edildi. RNA, üreticinin talimatlarına göre Turbo DNA içermeyen Kit (Ambion, Thermo Fisher Scientific) ve RNA Temizleme ve Konsantrasyon Kiti (Norgen Biotek) kullanılarak daha da saflaştırıldı. Saflaştırılmış RNA numuneleri, TapeStation 2200 makinesi (Agilent Technologies), RNA Screen Tape ve RNA Screen kullanılarak konsantrasyon ve kalite analizlerine tabi tutuldu.
2.5 RNA kütüphanesi yapımı ve sıralaması
Her tedavi ve zaman noktası için, analiz için en yüksek saflığı gösteren iki örnek seçildi. PolyA yakalamalı TruSeq mRNA kütüphaneleri (Illumina), Weizmann Bilim Enstitüsü'ndeki (Rehovot, İsrail) Crown Genomik Enstitüsü'nde seçilen RNA örneklerinden hazırlandı. Her numune etiketlendi ve numunelerden bir havuz hazırlandı. Bu havuz daha sonra iki NGS hattına yüklendi ve Illumina HiSeq sıralama makinesinde yüksek çıkışlı çalışma modunda, tek okuma (SR) 60 (v4) ile çalıştırıldı.
2.6 Sıralama ilk işlemeyi okur
The raw sequence reads were cleaned with Trimmomatic software v 0.36 (Bolger et al., 2014), removing low-quality reads and remaining adapter sequences. The clean reads were mapped to the reference Arabidopsis TAIR10 reference genome (Lamesch et al., 2012) using bowtie2 (Langmead & Salzberg, 2012) and quantification of gene expression was done using RSEM (Li & Dewey 2011). Principal component analysis and sample correlation matrix were calculated with the function cor() and pre-comp (), respectively, of the R base package version 3.6.1. DEGs were determined using the DESeq2 tool (Love et al., 2014). The FDR (false discovery rate) cutoff chosen was FDR < 0.05. The LogFC (Log of the fold change) cutoff for the up-regulated and the downregulated genes, was >
2.7 Gen ontolojileri ve gen açıklamaları
Gen Ontolojileri (GO), TAIR'in GO Ek Açıklamaları (//www.arabidopsis.org/tools/bulk/go/index.jsp) kullanılarak elde edildi. Gen modellerine göre gen tanımlamaları, TAIR'in gen tanımlama araştırması (http://www.arabidopsis.org/tools/bulk/genes/) kullanılarak elde edildi. GO zenginleştirmesi, Arabidopsis genom lokusu (TAIR10) referans olarak kullanılarak AgriGO web aracı (http://bioinfo.cau.edu.cn/agriGO/index.php) kullanılarak hesaplandı.
2.8 Kantitatif PCR ve RNA sekans doğrulaması
RNA-seq verilerini doğrulamak için, cDNA sentezi için sahte ve OMV ile karşı karşıya kalan fidelerin RNA örnekleri kullanıldı, ardından tarif edildiği gibi gene özgü primerler (Ek Tablo S4) kullanılarak kantitatif PCR (qPCR) yapıldı (Bahar ve ark. , 2016). Genel olarak, RNA-seq veri kümesinden 17°, OMV veya sahte işlem görmüş fidelerin RNA'sının dört biyolojik kopyası kullanılarak test edildi. Test edilen genlerin göreceli ekspresyonu, açıklandığı gibi (Bahar ve diğerleri, 2016) 7500 Fast gerçek zamanlı PCR makinesi (Applied Biosystems) kullanılarak ubikuitin ekspresyonuyla karşılaştırıldı.
2.9 Arabidopsis'in MAMP'lara ve OMV'lere transkripsiyonel tepkisinin karşılaştırılması
OMV'nin indüklediği veri setimiz, flg22, (Denoux ve diğerleri, 2008) elf26 (Zipfel ve diğerleri, 2006), PGN (Willmann ve diğerleri, 2011), OG (Davidsson ve diğerleri, 2011) ile mücadele edilen mevcut Arabidopsis transkriptomlarıyla karşılaştırıldı. , 2017) ve LPS (Livaja ve diğerleri, 2008). Veri karşılaştırması için GO terimleri zenginleştirmesi gerçekleştirildi ve indüklenen GO'lar, yukarıda açıklandığı gibi Venn diyagramları ile görselleştirildi.
2.10 Arabidopsis hazırlama deneyleri
Xcc OMV'lerin Pseudomonas syringae pv ile enfekte olmuş Arabidopsis üzerindeki hazırlama etkisini test etmek. domates DC3000 (Pst), Zipfel ve diğerleri tarafından açıklanan prosedürü takip ettik. (2004). Kısaca, yukarıda açıklandığı gibi büyütülen 6-8 haftalık Arabidopsis bitkilerinin yapraklarına 50-100 ul saflaştırılmış Xcc OMV'ler (30 ug/ml, 3.6-7.2 x 109 parçacığa karşılık gelir) sızdırıldı. yaprak başına), 1 μM flg22 veya iğnesiz bir şırınga kullanılarak su. Her muamele için 5 yaprak/bitki ve üç bitki kopyası kullanıldı. Pst aşısı, bakterinin King's B orta plakaları (20 g/L pepton, 1,5 g/L MgSO4 x7H2O, 10 ml/L gliserol ve 15 g/L agar) üzerinde 28˚C'de 2-3 gün kültürlenmesiyle hazırlandı, ve daha sonra kolonilerin su ile yeniden süspansiyon haline getirilmesi ve aşı konsantrasyonunun 105 CFU/ml'ye ayarlanması. Pst aşısı, hazırlamadan 24 saat sonra, iğnesiz bir şırınga kullanılarak (her yaprağa yaklaşık 100 ul süzüldü) hazırlanmış yapraklara süzüldü. Bakteriyel büyüme, aşılanmış yaprakların toplanması ve tartılması, bunların 1 ml 10 mM MgCl2 içinde yumuşatılması ve King's üzerine 10- kat seri seyreltmelerin kaplanması yoluyla 0°C'de (aşılamadan 1 saat sonra) ve aşılamadan 2 gün sonra (dpi) belirlendi. B agar plakaları. Her plakadaki CFU sayısı 2 gün sonra belirlendi ve yaprak gramı başına hesaplandı.
ŞEKİL 1 Arabidopsis'in tehdit sonrası 2, 6 ve 24'te OMV'lere transkripsiyonel tepkisi. Arabidopsis fidelerinin OMV'ye transkripsiyonel tepkisinin temel bileşen analizi (A) ve örnek korelasyon matrisi (B) veya denemeden 2, 6 ve 24 saat sonra sahte
2.11 İn vitro bakteriyel büyüme analizleri
Saflaştırılmış Xcc OMV'lerin in vitro Pst büyümesi üzerindeki etkisini değerlendirmek için, Pststarter'lar King's B sıvı ortamında 28˚C'de 24 saat büyütüldü ve daha sonra her biri 12 ml King's B ortamı içeren üç farklı kültürü {{3'te) aşılamak için kullanıldı. }}mL Falcon tüpleri 1:100 oranında. Bakteri kültürleri 30 ug/ml OMV'lerle (sırasıyla 1:50 veya 1:100, ml başına 1,44 x 109 veya 7,2 x 108 partiküle karşılık gelir) veya kontrol olarak PBS ile değiştirildi ve 20 saat boyunca 28°C'de inkübe edildi. Bakteriyel büyüme, 22 saat boyunca 600 nm optik yoğunlukta (OD) bir spektrofotometre (Amersham Biosciences) kullanılarak ölçüldü.
3. SONUÇLAR
3.1 RNA-seq analizi, OMV tehdidine yanıt olarak farklı şekilde ifade edilen geniş bir Arabidopsis gen kümesini ortaya koyuyor
OMV tehdidini takiben Arabidopsis'teki transkripsiyonel değişikliği incelemek için Arabidopsis fidelerini bakteriyel patojen Xanthomonas campestris pv.'den saflaştırılmış OMV'lerle tedavi ettik. campestris 33913 (Xcc) ve tehditten 2, 6 ve 24 saat sonra (hpc) bitki RNA'sı toplandı. OMV ve sahte muamele görmüş numunelerden elde edilen RNA daha sonra Malzemeler ve Yöntemler bölümünde açıklandığı gibi dizilendi ve analiz edildi. Temel korelasyon (Şekil 1A) ve örnek korelasyon matris analizleri (Şekil 1B), her tedavi kümesindeki biyolojik kopyaların birbirine yakın bir şekilde çoğaldığını, biyolojik kopyalar arasındaki genel transkripsiyonel yanıt benzerliğinin bir göstergesi olduğunu gösterir. OMV, 2 ve 6 hpc kümesindeki örnekleri bir arada işledi; bu, OMV işleminin transkripsiyon tepkisi üzerinde örnekleme süresinden daha büyük bir etkiye sahip olduğunu gösteriyor (Şekil 1B). Öte yandan, OMV ile muamele edilmiş numuneler, 24 hpc'de ilgili sahte muameleyle birlikte kümelenir; bu, bu zaman noktasında OMV'ler tarafından indüklenen transkripsiyonel değişikliğin azaldığını ve sahte muamele görmüş bitkilere benzer olduğunu gösterir.
cistanche tubulosa-bağışıklık sistemini iyileştirir
Test edilen her zaman noktasında, OMV ile tedavi edilen fideler, sahte olarak tedavi edilen fidelerle karşılaştırıldı ve diferansiyel olarak eksprese edilen genler (DEG'ler) ekstre edildi. Tüm zaman noktaları birleştirildiğinde, toplam 984 ve 175 genin sırasıyla yukarı veya aşağı regüle edildiği (Log kat değişimi > 1 veya ← 1, p değeri ve FDR < 0.05) anlamlı düzeyde olduğu bulundu. OMV mücadelesine yanıt olarak (Şekil 2A; Ek Tablo S1). Gen ifadesi Günlük katlama değişimi (LogFC), 500-kattan fazla değişime karşılık gelen maksimum 9,08 (AT1G26410, 6 hpc) ile -5,73 (AT3G17520, 24 hpc) arasında değişmektedir. En yüksek DEG sayısı 2 ve 6 hpc'de bulundu ve burada sırasıyla toplam 647 ve 876 DEG belirlendi (yukarı ve aşağı regüle edilmiş birleştirilmiş). 24 hpc'de 121 derece bulundu. OMV tehdidinden 2 ve 6 saat sonra yukarı regüle edilen genlerin %50'sinden fazlası aralarında paylaşıldı (Şekil 2B). Geçici gen ekspresyonu değişimini incelemek için, tüm zaman noktalarında (37 gen) bulunan tüm yukarı regüle edilmiş DEG'leri çıkardık ve zaman içindeki kat değişimlerini karşılaştırdık (Şekil 2C). Bu genlerin kat değişimi ifadesi, farklı zaman noktaları arasında önemli ölçüde farklıydı (tek yönlü ANOVA; F2,108=8.1633, p=0.0005). Tukey Kramer HSD testi kullanılarak yapılan post-hoc karşılaştırma, LogFC'nin hem 2 (M=3.45, SD=1.72) hem de 6 hpc (M=3.87, SD) olduğunu gösterdi.=1.98), 24 hpc'den önemli ölçüde daha yüksekti (M=2.32, SD=1.31) (p=0.0145 ve p=0 0,0005, sırasıyla) (Şekil 2D). 6 hpc'deki ortalama LogFC ifadesi 2 hpc'den daha yüksek olmasına rağmen istatistiksel olarak farklı değildi (p=0.5413). Bu nedenle, test edilen üç zaman noktasında DEG'lerin sayısı ve genel LogFC geni dikkate alındığında, en önemli transkripsiyonel değişikliğin OMV tehdidinden 2 ve 6 saat sonra meydana geldiği sonucuna varabiliriz. RNA sekansı sonuçlarının geçerliliğini incelemek için, yukarı regüle edilmiş 17 genin ekspresyonu, spesifik primerlerle kantitatif PCR (qPCR) kullanılarak belirlendi. Test edilen genlerin 14'ü, RNA sekans analizindekiyle aynı modeli sergiledi ve sahte genlerle karşılaştırıldığında önemli ölçüde yukarı regüle edildi. Test edilen genlerden üçü daha yüksek bir göreceli ifadeye sahipti ancak bu yöntemle sahte olanlardan önemli ölçüde farklı değildi (Ek. Şekil S1).
ŞEKİL 2 Arabidopsis, OMV tehdidine yanıt olarak genleri farklı şekilde eksprese etti. (A) 2'de diferansiyel olarak eksprese edilen genlerin (DEG'ler) toplam sayısı (yukarı veya aşağı regüle edilmiş, LogFC > 1 veya ← 1, p değeri ve FDR < 0.05), Mücadeleden 6 ve 24 saat sonra. (B) Farklı zaman noktalarında DEG'ler arasındaki örtüşme (sol, yukarı regüle edilmiş; sağ, aşağı regüle edilmiş). (C) Üç zaman noktasının hepsinde bulunan yukarı regüle edilmiş genler, zaman içindeki gen ekspresyonunu gösteren bir LogFC ekspresyon grafiği üzerinde çizildi. (D) Farklı zaman noktalarındaki tüm DEG'lerin LogFC ortalaması. Farklı harfler Tukey-Kramer HSD testiyle p < 0,05'teki istatistiksel farkı gösterir
3.2 Arabidopsis, OMV'lere bağışıklık sisteminin aktivasyonuna doğru transkripsiyonel bir kayma ile yanıt verir
OMV tehdidinden önemli ölçüde etkilenen Arabidopsis yollarını belirlemek için AgriGO web aracını kullandık (Du ve diğerleri, 2010; Tian ve diğerleri, 2017). OMV mücadelesine yanıt olarak birleştirilmiş tüm zaman noktalarında sırasıyla 333 ve 55 anlamlı (FDR < 0.05) yukarı ve aşağı regüle edilmiş gen ontolojisi (GO) terimini belirledik. Yukarı regüle edilen GO'ların yaklaşık %25'i, bitkinin uyarana verdiği tepkiyle ilgiliydi (Şekil 3A). 'Uyaranlara tepki' kategorisinde en baskın GO terimleri stres tepkisi, biyotik uyaranlara, kimyasallar ve endojen uyaranlarla ilişkilendirildi (Şekil 3B; Ek Tablo S2). AgriGO aracı ayrıca 'transferaz aktivitesi', kinaz aktivitesi', 'transkripsiyon faktörü aktivitesi', 'iyon ve metal iyonu bağlanması', 'karbonhidrat bağlanması', 'protein bağlanması', 'katalitik aktivite' dahil olmak üzere önemli ölçüde yukarı regüle edilmiş 103 moleküler fonksiyon tanımladı. , 'Adenil nükleotid bağlanması', 'zar ötesi reseptör aktivitesi' ve daha fazla bağlanma fonksiyonu (Ek Tablo S2). Önemli terimlerin hücresel konumu, çekirdek, vakuol ve iç zar sistemi dahil olmak üzere hücrenin farklı bölümlerindeydi, ancak en belirgin şekilde hücre çevresi ile ilişkiliydi ve 'plazma zarı', 'hücre dışı bölge', 'hücre duvarı' ve 'hücre duvarı'nı içeriyordu. 'apoplast' ontolojileri (Ek. Tablo S2). Öte yandan, önemli ölçüde aşağı regüle edilen GO'lar, 'toksin katabolik ve metabolik süreç', 'su ve su yoksunluğuna tepki', 'lipid taşınması ve lokalizasyonu' ve diğer terimlerini içeriyordu (Ek Tablo S2). Biyotik uyarana verilen yanıtla ilgili GO'lar, aşağı regüle edilmiş genlerde zenginleştirilmemiştir. Önemli ölçüde aşağı regüle edilmiş moleküler fonksiyonlar, 'oksidoredüktaz aktivitesi', 'hem bağlama', 'demir iyonu bağlama', 'lipid bağlama', 'oksijen bağlama' ve daha fazla oksijenle ilgili fonksiyonlar gibi birçok redoks terimini içeriyordu (Ek Tablo S2) . Aşağı Düzenlenmiş terimler ayrıca hücre dışı bölgede de bulunuyordu. En yüksek ifadeye sahip DEG'lerin hangi GO terimlerine ait olduğunu belirlemek için, LogFC'si 4'ten yüksek veya -4'den küçük (16- kat farkına karşılık gelen) genleri seçerek orijinal DEG listesini filtreledik. . Bu kriterleri karşılayan 117 gen belirledik; bunların 115'i tüm zaman noktalarında yukarı regüle edilmiş ve 2'si aşağı regüle edilmiştir. LogFC'si -4'den düşük olan az sayıda aşağı regüle edilmiş gen nedeniyle, önemli ölçüde bastırılmış hiçbir GO tanımlanmadı. Öte yandan, önemli ölçüde yukarı regüle edilmiş 72 GO tanımlandı; bunların en önemlileri 'dış biyotik uyaranlara yanıt', 'diğer organizmalara yanıt', 'oksijen seviyelerine hücresel yanıt', 'savunma yanıtı' ile ilgilidir. , 'strese tepki' ve daha fazla bağışıklıkla ilgili GO'lar (Şekil 3C).
ŞEKİL 3 Xcc OMV tehdidine yanıt olarak zenginleştirilmiş Arabidopsis gen ontolojisi (GO) terimleri. Yukarı düzenlenmiş Biyolojik Süreç (A) ve Uyarıcıya Tepki (B) GO terimlerindeki kategori dağılımının pasta grafik gösterimleri. (C) OMV tehdidine yanıt olarak LogFC'si >4 olan Arabidopsis genlerinin listesi. Genler, DEG'lerin tüm veri kümesinden filtrelendi ve AgriGo web aracını kullanarak zenginleştirilmiş GO terimlerini tanımlamak için kullanıldı. FDR sınırı < 0.05
3.2 OMV mücadelesi bağışıklık reseptörlerinin yukarı regülasyonuna yol açtı
MAMP algılama ve MAMP'lara karşı bitki tepkisi, büyük ölçüde, patojen algısına ve enfeksiyonun etkili bir şekilde hafifletilmesine aracılık eden membrana bağlı PRR'ler aracılığıyla sağlanır. PRR'ler genellikle iki grup reseptör kinaz (RK'ler) ve reseptör benzeri proteinler (RLP'ler) olarak sınıflandırılır (Boutrot ve Zipfel, 2017). OMV'lere yanıt olarak farklı şekilde ifade edilen PRR'leri tanımlamak için DEG setimizi önceden oluşturulmuş Arabidopsis RK listeleriyle (Kemmerling ve diğerleri, 2011; Mott ve diğerleri, 2016) ve RLP'lerle (Wang ve diğerleri, 2008) karşılaştırdık. Veri setimizde sırasıyla tüm zaman noktalarında sırasıyla 33 ve 10 adet yukarı regüle edilmiş RK ve RLP belirledik (Tablo 1). Aşağı regüle edilmiş 175 genden oluşan listemizde hiçbir RK veya RLP bulunamadı. Kemmerling ve ark. (2011), ekspresyonu flg22 ve NLP (nekroz ve etileni indükleyen peptit 1-benzeri protein) gibi MAMP'ler veya patojen tedavisi tarafından önemli ölçüde indüklenen 49 RK'dan oluşan bir liste tanımladı. Bu listeyi deneyimimizdeki yukarı regüle edilmiş RLK'lerle karşılaştırdık ve Kemmerling ve ark. tarafından tanımlanan RK'ların %45'inin olduğunu bulduk. (2011) ayrıca OMV'lere yanıt olarak uyarıldı. Bunlar arasında dikkat çekenler FRK1, SOBIR1, SERK4, RLK/IKU2, PSKR1, HAESA, EFR, BIR ve IOS1'dir (Tablo 1). RK grubu arasında FRK1, sırasıyla 7,11 ve 5,2 LogFC ile hem 2 hem de 6 hpc'de en yüksek ifadeye sahipken, tüm RK'ların ortalama LogFC'si 2 ve 6 hpc'de sırasıyla 2,11 ve 2,13 idi. Membrana bağlı RK'lar ve RLP'ler çoğunlukla istilacı mikropların hücre dışı algılanmasına aracılık ederken, nükleotid bağlanma bölgesi lösin açısından zengin tekrar (LRR) reseptörleri (NLR'ler) hücre içi immün reseptörlerdir. OMV mücadelesine yanıt olarak 2 ve 6 hpc'de yukarı regüle edilmiş 7 farklı NLR geni bulduk, hiçbiri 24 hpc'de bulunamadı (NLR listesi TAIR'den çıkarıldı, 102 gen) (Tablo 1).
erkekler için cistanche faydaları-bağışıklık sistemini güçlendirir
3.3 OMV'ler birden fazla WRKY transkripsiyon faktörünün ekspresyonunu indükler
WRKY transkripsiyon faktörlerinin (TF'ler), hem MAMP ile tetiklenen bağışıklık (MTI) hem de efektörle tetiklenen bağışıklık (ETI) tepkilerine katılarak bitki bağışıklık tepkilerinde rol oynadığı bulunmuştur (Birkenbihl ve diğerleri, 2018; Rushton ve diğerleri, 2010). ). OMV mücadelesi, 20 farklı WRKY TF'nin (liste TAIR'den çıkarılan, 70 gen) yalnızca 2 ve 6 HPC'de yukarı regülasyonuna yol açtı (Tablo 1). Aşağı regüle edilmiş gen setimizde WRKY TF'ler yoktu. OMV tehdidinden etkilenen diğer bir TF ailesi, biyotik ve abiyotik stresler de dahil olmak üzere birçok sürece dahil olduğu bilinen MYB alanı içeren proteinlerdir (Tsuda ve Somssich, 2015). Genel olarak, 9 farklı MYB TF (liste TAIR'den çıkarıldı, 211 gen), OMV mücadelesine yanıt olarak 5'i yukarı regüle edilmiş ve 4'ü aşağı regüle edilmiş olarak farklı şekilde eksprese edildi (Tablo 1). Tespit edilen diferansiyel olarak ifade edilen TF'lerin ek sınıfları Tablo 1'de listelenmiştir.
3.4 Arabidopsis'in OMV'ye verdiği transkripsiyonel yanıtın, saflaştırılmış MAMP'lara verilen yanıtla karşılaştırılması
Arabidopsis'in saflaştırılmış elisitöre karşı ham ve moleküler açıdan karmaşık bir yapıya (OMV'ler) verdiği yanıttaki farklılıkları öğrenmek için, RNA-seq verilerimizi, flg22 dahil bilinen MAMP'lara Arabidopsis yanıtının mevcut transkriptomik verileriyle karşılaştırdık (Denoux ve diğerleri, 2008) elf26 (Zipfel ve diğerleri, 2006), PGN (Willmann ve diğerleri, 2011), OG'ler (Davidsson ve diğerleri, 2017) ve LPS (Livaja ve diğerleri, 2008). Zenginleştirilmiş GO'lar yukarıda belirtilen veri kümelerinden yukarıda açıklandığı gibi çıkarıldı (Ek Tablo S3) ve OMV mücadelesinin ardından zenginleştirilen GO'larla karşılaştırıldı. Genel olarak, OMV'ler tarafından indüklenen Arabidopsis GO terimleri, tekli, proteinli ve proteinli olmayan MAMP'lar tarafından indüklenenlere benzerdi; OMV'nin indüklediği GO'ların sırasıyla %56, %51 ve 47'sini flg22, elf26 ve PGN tarafından indüklenen GO'larla paylaşıyordu. Öte yandan, LPS ve OG'lerde indüklenen GO'larda daha düşük bir örtüşme görüldü ve OMV'nin indüklediği GO'larla sırasıyla %24 ve %33 paylaşıldı (Şekil 4A). Özellikle, LPS'nin neden olduğu bağışıklık tepkilerinin bir özelliği olan patogenezle ilişkili 1 (PR1) geni (At2g14610) (Silipo ve diğerleri, 2005, 2008), test edilen tüm zaman noktalarında OMV'nin neden olduğu gen listesinde yoktu. Kırk bir GO'nun burada test edilen diğer MAMP'lardan herhangi biri tarafından değil, OMV tarafından indüklendiği bulundu (Şekil 4B). Bu liste 'apoptoz', 'ilaca yanıt', 'ilaç taşınması ve 'çoklu ilaç taşınması' ve 'lipaz aktivitesi' ile ilgili GO'ları içeriyordu (Ek Tablo S3, yıldız işaretleri ve kalın yazı tipiyle gösterilmiştir).
3.5 OMV'ler bakteriyel enfeksiyona karşı Arabidopsis direncini indükler
Burada ve daha önce (Bahar ve diğerleri, 2016), Arabidopsis bağışıklık sisteminin OMV tehdidiyle uyarıldığını gösteren kanıtlar sunmuştuk. Bu OMV aracılı bağışıklık indüksiyonunun etkili bir bağışıklık tepkisine çevrilip çevrilmediğini incelemek için Arabidopsis bitkilerinin OMV'lerle ön işleme tabi tutulduğu ve ardından bakteriyel aşılamanın yapıldığı bir planta bakteriyel büyüme testi (Zipfel ve diğerleri, 2004) kullandık. Pseudomonas syringae pv'de 10-kattan fazla önemli bir azalma. domates DC3000 (Pst) CFU/g yaprağı, aşılamadan iki gün sonra, sahte ön işleme kıyasla hem OMV- hem de flg22-ön işleme tabi tutulan bitkilerde gözlendi (Şekil 5A). Pst'nin in vitro büyümesi, ortama OMV'lerin eklenmesinden olumsuz bir şekilde etkilenmedi; bu, plantadaki Pst büyümesinin azalmasının, OMV'nin hazırlama etkisiyle ilişkili olduğunu ve OMV'lerin bakteriler üzerinde doğrudan bir etkisi olmadığını ortaya koyuyor (Ek. Şekil). S2). Pst'ye karşı OMV'nin neden olduğu dirence FLS2, EFR veya BAK1'in aracılık edip etmediğini test etmek için bu deneyi Col-0, bak-mutant ile tekrarladık ve çift mutant soyu efr'e düşüyor. Her iki mutant çizgide de OMV ön işlemi, sahte işlem görmüş bitkilerle karşılaştırıldığında Pst CFU/g yaprağında önemli bir azalmaya neden oldu (Şekil 5B-C). Beklendiği gibi, flg22 ile işleme tabi tutulan fls efr ve bak-mutant soyları, flg22'ye tepkisiz oldukları bilindiğinden, işlenmemiş bitkilerle benzer Pst titrelerine sahipti. Col-0'deki patojen titresindeki nispi azalmayı, prime edilmiş bitkilerdeki bağışıklık reseptörü mutant çizgileri ve bak ile karşılaştırıldığında karşılaştırmak için, üç bağımsız deneyde OMV ile ve sahte olarak tedavi edilen bitkilerde Pst titresindeki farkı hesapladık (Supp). Şekil S3). OMV ile ön işleme tabi tutulan arka bitkilerde Pst titresindeki ortalama azalma, Col-0 bitkilerinde gözlemlenenden daha küçüktü (bak ve Col-0 için sırasıyla 0,89'a karşılık 1,14 Log CFU/gr yaprak azalması, bir- yol ANOVA; F2,4=4.3781, p=0.0523). fls efr mutant hattında benzer bir azalma görmedik (fls efr ve Col-0 için sırasıyla 1,26'ya karşı 1,32 Log CFU azalması, tek yönlü ANOVA: F1,4=0.0352, p=0.5698) (Şekil 5D-E).
TABLO 1 Arabidopsis fidelerinde OMV'nin neden olduğu RK'ler/RLP'ler ve bağışıklıkla ilişkili transkripsiyon faktörleri
TABLO 1 (Devam)
TABLO 1 (Devam)
4. TARTIŞMA
Bakteriyel dış membran kesecikleri (OMV'ler), bakteriyel dış membrandan kaynaklanan karmaşık nanoyapılardır ve yüzlerce protein ve diğer hücre duvarı bileşenlerinden oluşur. Arabidopsis bitkilerinin, ROS patlaması, immün işaretleyici gen ekspresyonu ve orta alkalizasyon gibi tipik immün tepkilerini aktive ederek OMV tehdidine yanıt verdiği daha önce gösterilmişti (Bahar ve diğerleri, 2016). Bu çalışmada Arabidopsis'in bakteriyel OMV'lere karşı daha geniş transkripsiyonel tepkisini ve bunun sonraki enfeksiyon üzerindeki etkisini inceledik. Bu çalışmada gerçekleştirilen RNA-seq veri analizlerinden elde edilen genel sonuç, Arabidopsis bağışıklık sisteminin, Xanthomonas campestris pv.campestris (Xcc) OMV'lere maruz kalmanın ardından hazırlandığıdır. Bu sonuç farklı ve tamamlayıcı analizlerle desteklenmektedir. İlk olarak, Xcc OMV'lere maruz kalan bitkilerde gen ontolojisi (GO) zenginleşmesi, OMV'lerin Arabidopsis tarafından stres etkenleri olarak algılandığını açıkça göstermektedir. Bitki tepkisinin hücresel konumu, öncelikle hücre çevresi ile ilişkiliydi; bu, zorlu materyal olan OMV'lerin dış hücresel algısını akla getiriyor. Bu, bilinen birçok MAMP'a benzer şekilde, OMV'lerin ve bileşenlerinin hücre dışı reseptörler tarafından algılandığı fikrine daha fazla destek sağlar. İkinci olarak, OMV sorununa yanıt olarak geniş bir RK ve RLP grubunun yukarı doğru düzenlendiğini fark ettik. Bu reseptörlerin çoğunun patojen algısına aracılık ettiği biliniyor veya daha önce bitki bağışıklık tepkisi ile ilişkili olduğu gösterilmişti. FLG22-indüklü reseptör benzeri kinaz 1 (FRK1), en yüksek oranda indüklenen reseptördü. Bu ilginç çünkü Xcc OMV proteomik analizimizde flagellini tespit edemedik (veriler gösterilmemiştir). FRK1'in aynı zamanda diğer immün uyarıcılar tarafından da indüklendiği bilinmektedir, ancak ekspresyonunun neden burada yukarı regüle edilen diğer RK'lardan çok daha yüksek olduğu merak uyandırıcıdır. Öte yandan uzama faktörü reseptörü (EFR) ifadesi, Xcc OMV'lerde EF-Tu bulunmasına rağmen yalnızca 2 saatlik zaman noktasında önemli ölçüde yukarı doğru düzenlenmiştir ve LogFC'si 1,12'dir (Bahar ve diğerleri, 2016). ). Ayrıca OMV tehdidine yanıt olarak yukarı regüle edilen birkaç NLR geni bulduk; bunların yarısı hastalığa direnç proteinleri olarak açıklandı, ancak bunların bitki bağışıklığındaki işlevleri tanımlanmadı. NLR'lerin doğrudan OMV algısına dahil olduğunu varsaymasak da, flg22, elf18 ve LPS gibi saflaştırılmış MAMP'lara yanıt olarak da gözlemlendiği gibi, RK/RLP'lerin OMV moleküllerini algılamasının aşağısında indüklenebilirler (Denoux ve diğerleri, 2008). ; Livaja ve diğerleri, 2008; Zipfel ve diğerleri, 2006). Üçüncüsü, WRKY, MYB ve diğerleri gibi bağışıklıkla ilgili birçok transkripsiyon faktörü, OMV'ler tarafından önemli ölçüde yukarı doğru düzenlenmiştir (Bjornson ve diğerleri, 2021). Çalışmamızda OMV'ye yanıt olarak ana transkripsiyonel değişiklik ilk iki zaman noktasında (2 ve 6 hpc) meydana geldi. Bu, hem önemli ölçüde daha fazla sayıda diferansiyel olarak eksprese edilen genler (DEG'ler) hem de 2 ve 6 hpc'de önemli ölçüde daha yüksek bir Log kat değişimi (LogFC) ile gösterilmiştir. Bununla birlikte, 24 hpc'de bulunan toplam 121 derecenin neredeyse yarısı (52) 2 veya 6 hpc'de bulunamadı. Bu, 24 hpc'deki DEG'lerin yarısının, ekspresyonu 6 hpc'den sonra yukarı veya aşağı regüle edilen geç regüle edilmiş genler olduğunu göstermektedir. Aslında, elisitör zorluklarını takiben farklı ekspresyon dinamiklerine sahip Arabidopsis genleri daha önce tanımlanmıştı (Bjornson ve diğerleri, 2021).
ŞEKİL 4 OMV'ye ve tekli saflaştırılmış MAMP'lara yanıt olarak zenginleştirilmiş Gen ontolojisi (GO) terimlerinin karşılaştırılması. MAMP mücadelesine yanıt olarak Arabidopsis ifade veri kümeleri (elf26, flg22, OG'ler, PGN ve LPS; referanslar için Malzemeler ve Yöntemler bölümüne bakın), AgriGo web aracını kullanarak zenginleştirilmiş GO'ları çıkarmak için kullanıldı. Her MAMP'ın zenginleştirilmiş GO setleri, Venny (A ve Ek Tablo S3) kullanılarak OMV'lere yanıt olarak zenginleştirilmiş GO listesiyle karşılaştırıldı. Yalnızca OMV veri kümelerinde zenginleştirilen GO terimleri (B)'de FDR değerlerine göre sıralanmış olarak gösterilmiştir.
Çalışmamızda OMV'ye yanıt olarak ana transkripsiyonel değişiklik ilk iki zaman noktasında (2 ve 6 hpc) meydana geldi. Bu, hem önemli ölçüde daha fazla sayıda diferansiyel olarak eksprese edilen gen (DEG'ler) hem de 2 ve 6 hpc'de önemli ölçüde daha yüksek bir Log kat değişimi (LogFC) ile gösterilmiştir. Bununla birlikte, 24 hpc'de bulunan toplam 121 derecenin neredeyse yarısı (52) 2 veya 6 hpc'de bulunamadı. Bu, 24 hpc'deki DEG'lerin yarısının, ekspresyonu 6 hpc'den sonra yukarı veya aşağı regüle edilen geç regüle edilmiş genler olduğunu göstermektedir. Aslında, elisitör cchallenges'i takip eden farklı ekspresyon dinamiklerine sahip Arabidopsis genleri daha önce tanımlanmıştı (Bjornson ve diğerleri, 2021). Burada gördüğümüz hızlı ve çoğunlukla geçici gen ekspresyon modeli, Arabidopsis'in MAMP'lara geçici tepkisini test eden diğer çalışmalarla uyumludur. Örneğin Denoux ve ark. (2008) ve Bjornson ve ark. (2021), çeşitli MAMP'lara yanıt olarak Arabidopsis'teki transkripsiyonel değişikliğin dakikalar ila saatler arasında gerçekleştiğini ve çoğu durumda DEG'lerin, bitki tehdidini takip eden 24 saat içinde baz seviyelerine geri döndüğünü göstermiştir. Bir bitki ile bir patojen arasındaki etkileşimin dinamik olduğu ve saflaştırılmış bir MAMP veya OMV'ler gibi canlı olmayan bir örnekle tehdit edildiğinde devam ettiği etkileşimlerden farklı olarak, bitki tepkisinin, en azından transkripsiyonel düzeyde olması beklenebilir. geçici olur ve günlerce sürmez. Geçtiğimiz otuz yıldaki yoğun araştırmalar, mikropların tanınmasından sorumlu çok sayıda bitki bağışıklık reseptörünü ortaya çıkardı. Bu reseptörlerin çoğu, tek mikrobiyal özellikleri tespit etme kapasitesine sahiptir ve patojen algısını, bağışıklık sistemi sinyallerini ve model ve mahsul bitkilerinin tepkisini daha iyi anlamak için ayrıntılı olarak incelenmektedir. Ancak bitkiler aynı anda farklı kaynaklardan gelen çok sayıda mikrobiyal özelliğe maruz kalıyor ve bu da bağışıklık algısını ve tepkisini karmaşıklaştırıyor. Arabidopsis'in tekil saflaştırılmış MAMP'lara karşı transkripsiyonel tepkisindeki, daha doğal ve karmaşık bir mikrobiyal yapıyı temsil eden ancak bir mikrobun kendisinden uzaklaştırılmış bir karmaşıklık derecesini temsil eden OMV'lere karşı farklılıkları incelemekle ilgileniyorduk. OMV'ler, plantadaki bakteriyel büyüme için işlevsel bir role sahip olabilecek virülans faktörleri, parçalayıcı enzimler, toksinler ve diğer biyomolekülleri taşır ve bu nedenle OMV tehdidinin, sentetik MAMP'lar tarafından indüklenmeyen benzersiz GO'ları indükleyip tetiklemediğini test etmek ilginçti.
ŞEKİL 5 Arabidopsis yapraklarının OMV'lerle ön işleme tabi tutulması, sonraki bakteriyel enfeksiyona karşı direnci indükler. Kol-0 bitkileri (A), kontrol olarak OMV'ler, su (sahte) veya flg22 ile ön işleme tabi tutuldu ve 24 saat sonra iğnesiz şırınga infiltrasyonu kullanılarak 105 CFU/ml Pst DC3000 süspansiyonu ile aşılandı. . Aşılanmış yapraklardaki Pst DC3000 hücre titresi, aşılamadan 48 saat sonra seri seyreltme plakaları ile belirlendi. Arabidopsis Col-0 ve fls efr (B) veya bak (C) bitkileri, (A)'da anlatıldığı gibi benzer bir deneyde test edildi. OMV ön işlemini takiben (işlenmemiş bitkilerle karşılaştırıldığında) Col-0 ve efr (D) ve Col-0 ve geri (E) düşüşlerindeki ortalama Log Pst DC3000 CFU/gr düşüşü karşılaştırıldı. Her çubuk, üç bağımsız deneyden elde edilen ortalama Log Pst DC3000 CFU/gr azalmayı temsil eder (bağımsız deneylerin verileri Ek Şekil S3'te sunulmuştur). Farklılıklar istatistiksel olarak anlamlı değildi (İki kuyruklu öğrenci t-testi. p değerleri grafik çubuklarının üzerinde belirtilmiştir). A, B ve C deneyleri benzer sonuçlarla en az üç kez gerçekleştirildi (her deneyde tedavi başına 3 bitki/kopya). Yıldız işaretleri (**), sahte ile karşılaştırıldığında önemli bir farkı gösterir (Dunnet testi p < 0,001)
Transkriptomik karşılaştırmalarımız için, benzer deneysel koşullara sahip, yani bitkilerde ve benzer zaman noktalarında yapılan çalışmalardan elde edilen verileri bir araya getirdik. Arabidopsis'in OMV'ye ve flg22, elf26 ve PGN'ye verdiği yanıtta GO zenginleşmesinde önemli bir örtüşme görüldü. Patojen algılama üzerine etkinleştirilen savunma yollarının çoğunun, spesifik elisitör veya kaynağından bağımsız olarak benzer olduğu bilindiğinden bu beklenmedik bir durum değildir (Bjornson ve diğerleri, 2021; Zipfel ve diğerleri, 2006). Bununla birlikte, bazı benzersiz GO'ların, araştırdığımız diğer MAMP'lar tarafından değil, OMV'ler tarafından yukarı doğru düzenlendiği bulunmuştur. Bunlar arasında, 'lipaz aktivitesi' ve 'glikozil bağlarına etki eden hidrolaz aktivitesi' gibi hücre duvarı bozulmasıyla ilgili GO'lar yer alır; bunlar, bitki savunma sisteminin OMV bozulmasını hedeflediğini gösterebilir. İlginç bir şekilde, ilaç taşınmasıyla ilgili üç GO'nun da OMV mücadelesi tarafından benzersiz bir şekilde yukarı doğru düzenlendiği bulundu. Bu, bitkilerin, muhtemelen OMV aracılı dağıtım yoluyla hücrelerine teslim edilen toksik bileşiklerle karşı karşıya olduğunu gösterebilir. Arabidopsis'in immün uyarıcı peptitlere ve PGN'ye verdiği tepkinin aksine, Arabidopsis'in OMV OG'lere ve LPS'ye verdiği tepki arasında nispeten az örtüşme gözlemledik. Özellikle LPS ile olan bu küçük örtüşme, memeli hücrelerinde LPS'nin OMV'ler tarafından indüklenen konakçı bağışıklık tepkisine güçlü katkıda bulunanlar olarak kabul edildiği göz önüne alındığında biraz şaşırtıcıdır (Ellis ve diğerleri, 2010). Ayrıca, LPS bağışıklık özelliği PR1'in yukarı regülasyonunu bulamadığımız gerçeği (Silipo ve diğerleri, 2005), LPS'nin bakteriyel OMV'lerle bitki bağışıklık etkileşiminin önemli bir uyarıcısı olmadığını öne sürebilir. Ancak bunun daha kapsamlı bir şekilde incelenmesi gerekmektedir. OMV'lerin hem memeli hem de bitki konakçılarının bakteriyel kolonizasyonuna ve bazı durumlarda bakteriyel virülansa katkıda bulunduğu gösterilmiştir. Öte yandan, OMV'ler konakçı bağışıklık sistemini aktive ederek iki ucu keskin bir kılıç gibi davranarak bir yandan bakteriyel hayatta kalmayı ve virülansı teşvik ederken, diğer yandan konakçı gözetim sistemini besleyerek konakçı bağışıklığını etkinleştirir (McMillan ve Kuehn, 2021). ). Hazırlama analizlerimiz, OMV mücadelesinin Pseudomonas syringae pv'nin önemli ölçüde inhibisyonuna yol açtığını gösterdi. planta'da domates DC3000 (Pst) büyümesi, sentetik MAMP'larda görülen hazırlama etkisine benzer (Jung ve diğerleri, 2009). Dolayısıyla bu örnekte, OMV'lerin aşılanmış dokuya önceden uygulanması bakteri kolonizasyonunu teşvik etmedi, bunun yerine bitkileri patojen büyümesini inhibe eden etkili bir bağışıklık tepkisini tetiklemeye hazırladı. Bu sonuç, transkripsiyonel verilerimiz ve önceki çalışmamızla uyumludur ve OMV'lerin Arabidopsis'te güçlü ve etkili bir bağışıklık tepkisi oluşturduğu fikrini desteklemektedir. Son zamanlarda yapılan iki çalışma, Arabidopsis'in patojenik veya komensal bir Pseudomonas türünden OMV'lerle ön tedavisinin, sonraki Pst enfeksiyonunu baskıladığını da göstermiştir (Janda ve diğerleri, 2021; McMillan ve diğerleri, 2021). Bu sonuçlar kümülatif olarak test edilen koşullar altında OMV infiltrasyonunun patojen enfeksiyonunu kolaylaştırmadığını göstermektedir. Önceki bir çalışmada, çoklu immün reseptör mutantlarının Xcc OMV'lere karşı WT yanıtını koruduğunu göstermiştik. Bu mutantlar, proteinli (FLS2, EFR, RLPReMAX) veya proteinli olmayan MAMP'ları (LYM1/LYM3) tanıyan bilinen PRR'leri içeriyordu (Bahar ve diğerleri, 2016). İlginçtir ki, Janda ve ark. (2021), Arabidopsis'in (grip) FLS2 reseptör mutant soyuna Pst'ten gelen OMV'ler uygulandığında FRK1 ifadesinin değişmediğini ve sahte tedavi görmüş bitkilere benzer olduğunu bildirmiştir; bu da FLS2'nin Pst OMV'lere verilen tepkiye aracılık ettiğini öne sürmektedir. Flagellinin Pst OMV preparasyonlarında Xcc 33913 OMV'lerde olduğundan daha fazla bulunması mümkündür ve bu nedenle flagellin reseptörünün uzaklaştırılmasının bitkinin Pst'ye tepkisi üzerinde Xcc OMV'lere göre daha belirgin bir etkiye sahip olması mümkündür.
erkekler için cistanche faydaları-bağışıklık sistemini güçlendirir
Cistanche Enhance Immunity ürünlerini görüntülemek için buraya tıklayın
【Daha fazlasını isteyin】 E-posta:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Farklı bitki bağışıklık analizlerinin farklı sonuçlar verebileceği ve iddia edilen çelişkili sonuçlara yol açabileceği gösterilmiştir. Örneğin, bir yaprak diski ROS patlama analizinde Arabidopsis'in OMV'lere tepkisinin EFR reseptörüne bağlı olduğunu gösterdik, ancak Arabidopsis fideleri ile yapılan immün işaretleyici gen ekspresyon analizinde mutant çizginin OMV'lere olduğu kadar duyarlı olduğunu gösterdik. WT. McMillan ve ark. (2021), OMV'lere uygulanan farklı fiziksel uygulamaların fide büyümesinin engellenmesi gibi belirli aktiviteleri ortadan kaldırdığını göstermiştir. Ancak bitki hazırlama gibi diğer bağışıklık çıktılarını değiştirmedi. Bu nedenle, belirli bir elisitöre karşı bitkinin bağışıklık tepkisinin mümkün olduğu kadar geniş bir görünümünü elde etmek amacıyla farklı bağışıklık çıktılarını test etmek için çeşitli analizleri birleştirmek önemlidir. Bilinen bazı PRR'lerin ve yardımcı reseptörlerin katılımını daha fazla incelemek için, bitki hazırlama tahlilini kullanarak şimdiye kadarki düşmeleri ve bak mutant çizgilerini test ettik. Sonuçlarımız, Arabidopsis çift mutant çizgisi düşüşlerinin, WT bitkileri gibi Xcc OMV tarafından benzer şekilde prime edildiğini göstermektedir; bu, flagellin ve EF-Tu dışındaki MAMP'ların da Xcc 33913 OMV'lerde mevcut olduğu fikrini desteklemektedir. İmmün marker gen ekspresyonu analizlerine dayanarak, daha önce BAK1 yardımcı reseptörünün OMV algısı ve/veya tepkisine dahil olduğunu öne sürmüştük (Bahar ve diğerleri, 2016). Bu çalışmada, hazırlama testini kullanarak bu öneriyi yeniden ele aldık. Burada, bak mutant çizgisi OMV ön işlemiyle prime edildi, ancak WT Col-0 bitkilerinden biraz daha az ölçüde. Bu marj istatistiksel olarak anlamlı olmasa da double fls ever mutant soyunda görülenden daha büyüktü. Bu sonuç aynı zamanda bak mutant hattının, bağışıklık hazırlama deneylerinde WT bitkileri olarak OMV'ye duyarlı olduğunu gösteren yeni bir çalışmayla da uyumludur (Tran ve diğerleri, 2021). Genel olarak bu, BAK1'in OMV algısında yer almasına rağmen, diğer bağışıklık algısı ve sinyal yollarının OMV tarafından hazırlandığını, bunun da etkili bir bağışıklık tepkisine ve patojen büyümesinin baskılanmasına yol açtığını gösterebilir. OMV'lere yanıt olarak BAK1 ve SOBIR1 yardımcı reseptörlerinin dahil edilmesi (Bahar ve ark., 2016), OMV algısında muhtemelen PRR'ler olan çoklu immün reseptörlerin rol oynadığını varsaymamıza yol açtı. Bununla birlikte yakın zamanda yapılan bir çalışma, OMV'ler tarafından bitki immün aktivasyonunun MAMP'tan bağımsız olabileceğini ve OMV entegrasyonunun neden olduğu bitki plazma zarındaki fizyo-kimyasal değişikliklerden kaynaklanabileceğini öne sürdü (Tran ve diğerleri, 2021). Bu, daha fazla ele alınması gereken ilgi çekici bir hipotezdir. İlginç bir şekilde McMillan ve ark. (2021), proteinaz K ile tedavi edilen OMV'lerin bağışıklık hazırlama kapasitelerini koruduğunu bildirdi; bu, bu aktivitenin OMV proteinli kargodan bağımsız olabileceğini gösteriyor. Bu sonuç, Tran ve ark.'nın MAMP'tan bağımsız immün aktivasyon hipotezini destekleyebilir. (2021), LPS ve PGN gibi OMV'lerde bulunan diğer proteinli olmayan MAMP'lar MTI'yi aktive edebilir (Bahar ve diğerleri, 2016; McMillan ve diğerleri, 2021). Ek olarak, proteinaz K ile muamele edilmiş OMV'ler, fide büyümesi inhibisyonunu tetikleme yeteneklerini korudu; bu, büyüme inhibisyonunun, OMV'lerin proteinli kargosuna bağlı olduğunu gösterir (McMillan ve diğerleri, 2021). Toplamda, bu sonuçlar ayrıca OMV'lere verilen bitki tepkisinin karmaşıklığını ve belirli bir elisitörün belirli yollara katılımını test etmek için çeşitli çıktılar kullanmanın önemini vurgulamaktadır.
2021 boyunca, bunun da dahil olduğu (muhtemelen aynı anda gerçekleştirilen) dört bağımsız çalışma, bakteriyel OMV'lerin bitki bağışıklık sistemini modüle ettiğini ve patojen enfeksiyonuna karşı etkili bir yanıt oluşturduğunu bildirdi (Janda ve diğerleri, 2021; McMillan ve diğerleri, 2021; Tran ve diğerleri, 2021). Bu heyecan verici sonuçlar, OMV'leri, hala öğrenilecek çok şeyin olduğu bitki-mikrop etkileşimlerinde yeni ve önemli bir oyuncu olarak konumlandırıyor. Bu çalışmada Arabidopsis'in Xcc OMV'ye verdiği transkripsiyonel yanıtın daha geniş bir görünümünü sunuyoruz. Bitkilerin OMV'leri algılamasında yer alan bileşenleri ve mekanizmaları daha iyi anlamak için tamamlayıcı araştırma yaklaşımlarına ihtiyaç duyulacaktır.
REFERANSLAR
Ambawat, S., Sharma, P., Yadav, NR ve Yadav, RC (2013). Bitki tepkileri için düzenleyiciler olarak MYB transkripsiyon faktörü genleri: Genel bir bakış. Bitkilerin Fizyolojisi ve Moleküler Biyolojisi, 307–321.
Bahar, O. (2020). Bitki patojenik bakterilerden elde edilen membran kesecikleri ve bitki-patojen etkileşimleri sırasındaki rolleri. İçinde: M. Kaparakis-Liaskos ve TA Kufer eds. Bakteriyel membran kesecikleri – Biyogenez, işlevler ve uygulamalar. Springer International Publishing, İsviçre, 119–129.
Bahar, O., Mordukhovich, G., Luu, DD, Schwessinger, B., Daudi, A., Jehle, AK, Felix, G. ve Ronald, PC (2016). Bakteriyel dış zar kesecikleri bitki bağışıklık tepkilerini indükler. Moleküler Bitki-Mikrop Etkileşimleri, 374–384.
Birkenbihl, RP, Kracher, B., Ross, A., Kramer, K., Finkemeier, I. ve Somssich, IE (2018). Erken MAMP ile tetiklenen bağışıklık sırasında Arabidopsis WRKY düzenleyici ağının ilkeleri ve özellikleri. Bitki Dergisi, 487–502.
Bjornson, M., Pimprikar, P., Nürnberger, T. ve Zipfel, C. (2021). Arabidopsis thaliana'nın transkripsiyonel manzarası, bağışıklığı tetikledi. Doğa Bitkileri, , 579–586.
Bolger, AM, Lohse, M. ve Usadel, B. (2014). Trimmomatic: Illumina sekans verileri için esnek bir düzeltici. Biyoinformatik, 2114–2120.
Boutrot, F. ve Zipfel, C. (2017). Geniş spektrumlu hastalık direnci için bitki deseni tanıma reseptörlerinin işlevi, keşfi ve kullanılması. Yıllık Fitopatoloji İncelemesi, 257–286.
Chinchilla, D., Zipfel, C., Robatzek, S., Kemmerling, B., Nürnberger, T., Jones, JDG, Felix, G. ve Boller, T. (2007). FLS2 ve BAK1 reseptörünün flagellin kaynaklı kompleksi, bitki savunmasını başlatır. Doğa, 497–500.
Chowdhury, C. ve Jagannadham, M. v. (2013). Pseudomonas syringae pv'nin dış membran kesecikleri ile ilişkili olarak virülans faktörleri salınır. Normal büyüme sırasında domates T1. Biochimica Et Biophysica Acta-Proteinler ve Proteomikler,(1), 231–239.
Cook, DE, Mesarich, CH ve Thomma, BPHJ (2015). Bitki bağışıklığını istilayı tespit etmek için bir gözetim sistemi olarak anlamak Yıllık Fitopatoloji İncelemesi, 541–563.
Couto, D. ve Zipfel, C. (2016). Bitkilerde örüntü tanıma reseptörü sinyallemesinin düzenlenmesi. Nature Reviews Immunology, (9), 537–552.
Davidsson, P., Broberg, M., Kariola, T., Sipari, N., Pirhonen, M. ve Palva, ET (2017). Kısa oligogalakturonitler, Arabidopsis thaliana'da patojen direnciyle ilişkili gen ekspresyonunu indükler. BMC Bitki Biyolojisi, 1–17.
Deatheragea, BL ve Cookson, BT (2012). Bakterilerde, ökaryotlarda ve arkelerde membran keseciği salınımı: Mikrobiyal yaşamın korunmuş ancak yeterince takdir edilmemiş bir yönü. Enfeksiyon ve Bağışıklık, 1948–1957.
Denoux, C., Galletti, R., Mammarella, N., Gopalan, S., Werck, D., De Lorenzo, G., Ferrari, S., Ausubel, FM ve Dewdney, J. (2008). Arabidopsis fidelerinde OG'ler ve Flg22 elisitörleri tarafından savunma tepki yollarının aktivasyonu. Moleküler Bitki, 423–445.
Dow, M., Newman, M.-A. ve von Roepenack, E. (2000). Bakteriyel lipopolisakkaritler tarafından bitki savunma tepkilerinin indüksiyonu ve modülasyonu. Yıllık Fitopatoloji İncelemeleri, 241–261.
Du, Z., Zhou, X., Ling, Y., Zhang, Z. ve Su, Z. (2010). agriGO: Tarım topluluğu için bir GO analiz araç seti. Nükleik Asit Araştırması, W64–W70.
Ellis, TN ve Kuehn, MJ (2010). Bakteriyel dış membran keseciklerinin virülansı ve immünomodülatör rolleri. Mikrobiyoloji ve Moleküler Biyoloji İncelemeleri,81–94.
Ellis, TN, Leiman, SA ve Kuehn, MJ (2010). Pseudomonas aeruginosa'dan doğal olarak üretilen dış zar kesecikleri, hem lipopolisakarit hem de protein bileşenlerinin birleşik algılanması yoluyla güçlü bir doğuştan gelen bağışıklık tepkisi ortaya çıkarır. Enfeksiyon ve Bağışıklık, 3822–3831.
Erbs, G., Silipo, A., Aslam, S., de Castro, C., Liparoti, V., Flagiello, A., Pucci, P., Lanzetta, R., Parrilli, M., Molinaro, A. , Newman, M.-A. ve Cooper, RM (2008). Agrobacterium ve Xanthomonas patojenlerinden elde edilen peptidoglikan ve muropeptitler, bitkinin doğuştan gelen bağışıklığını ortaya çıkarır: Yapı ve aktivite. Kimya ve Biyoloji, 438–448.
Felix, G., Duran, JD, Volko, S. ve Boller, T. (1999). Bitkiler, bakteriyel flagellinin en çok korunan alanına karşı hassas bir algılama sistemine sahiptir. Bitki Dergisi, 265–276.
Fesel, PH ve Zuccaro, A. (2016). -glukan: Mantar hücre duvarının önemli bileşeni ve bitkilerde bulunması zor MAMP. Mantar Genetiği ve Biyolojisi, 53–60
Fulsundar, S., Harms, K., Flaten, GE, Johnsen, PJ, Chopade, BA ve Nielsen, KM (2014). Acinetobacter baylyi'nin dış membran keseciklerinin gen transfer potansiyeli ve stresin vezikülasyon üzerindeki etkileri. Uygulamalı ve Çevresel Mikrobiyoloji, 3469–3483.
Gómez-Gómez, L. ve Boller, T. (2000). FLS2: Arabidopsis'te bakteriyel elisitör flagellinin algılanmasında rol oynayan LRR reseptör benzeri bir kinaz. Moleküler Hücre, 1003–1011.
Gust, AA, Biswas, R., Lenz, HD, Rauhut, T., Ranf, S., Kemmerling, B., Gotz, F., Glawischnig, E., Lee, J., Felix, G. ve Nürnberger , T. (2007). Bakterilerden türetilen peptidoglikanlar, Arabidopsis'te doğuştan gelen bağışıklığı tetikleyen patojenle ilişkili moleküler kalıpları oluşturur. Biyolojik Kimya Dergisi, 32338– 32348.
Ionescu, M., Zaini, PA, Baccari, C., Tran, S., da Silva, AM ve Lindow, SE (2014). Xylella fastidiosa dış zar kesecikleri, yüzeylere tutunmayı engelleyerek bitki kolonizasyonunu modüle eder. Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Bilimler Akademisi Bildirileri, E3910–E3918.
Janda, M., Ludwig, C., Rybak, K., Meng, C., Stigliano, E., Botzenhardt, L., Szulc, B., Sklenar, J., Menke, FLH, Malone, JG, Brachmann, A., Klingl, A. ve Robatzek, S. (2021). Biyofiziksel ve proteomik analizler, Pseudomonas syringae pv domates DC3000 hücre dışı keseciklerinin bitki enfeksiyonu sırasında bakteriyel büyümedeki fonksiyonlarını göstermektedir. bioRxiv, 2021.02.08.430144.
