Yumurtalıkları Alınmış Sıçanlarda Cistanche Deserticola'dan İzole Edilen Toplam Feniletanoid Glikozit Fraksiyonunun Kemik Mikroyapısı Üzerindeki Faydalı Etkileri

1. Giriş

50 yaşın üzerindeki her 3 kadından 1'inin muzdarip olduğu menopoz sonrası osteoporoz, dünya çapında 200 milyondan fazla kadını etkileyen temel bir sağlık tehlikesi haline geliyor [1]. Menopozda östrojen seviyesindeki keskin düşüş genellikle artan osteoklastogenezin neden olduğu aşırı kemik erimesine yol açar; daha sonra osteoblast kaynaklı kemik oluşumu ile osteoklast kaynaklı kemik erimesi arasındaki denge bozulur ve kemik erimesi hızlanır.kemik erimesisonunda osteoporoza ve hatta kalça veya omurga kırılmasına neden oldu [2]. Nükleer faktör kappa B'nin (RANK) reseptör aktivatörü, RANK'ın ligandı olan RANKL'a bağlandığında osteoklast farklılaşmasının tetiklendiğine inanılıyordu. Bununla birlikte, RANK'ın RANKL'a kombinasyonu, protein tümör nekroz faktörü reseptör ilişkili faktör 6 (TRAF6) buna katılmadıkça [3] ve ardından PI3K/AKT ve NF-κB dahil olmak üzere aşağı yönde sinyal yollarının uyarılması olmadığı sürece etkinleştirilemez. Son olarak, aktive edilmiş T hücreleri c2 (NFAT2) ve c-Fos'un nükleer faktörünün ekspresyonları, kemik rezorpsiyonunun yanı sıra osteoklast farklılaşmasını modüle etmek için düzenlendi [4]. Bu nedenle, osteoklastın aktivasyonu ve farklılaşmasıyla doğrudan veya dolaylı olarak ilişkili faktörler ve düzenleyicilerin, kemik kaybını önlemede önemli hedefler olduğuna inanılıyordu. Aslında postmenopozal osteoporozun tedavisinde etkili olan estradiol valerat gibi bazı klinik ve sentetik hormon replasman tedavisi ilaçları vardır. Ne yazık ki bunlardan bazıları, meme ve endometrial kanserler de dahil olmak üzere ciddi kanser riskini arttırdı [5] ve bu da klinik uygulamalarını sınırladı. Bu nedenle hem etkinliği hem de yan etkileri minimum olan diğer alternatiflerin seçilmesi gerekmektedir. Geleneksel Çin ilaçlarının (TCM) yanı sıra izole edilmiş biyoaktif bileşikler ve fraksiyonların [6-9], menopoz sonrası osteoporoz da dahil olmak üzere çeşitli rahatsızlıklar üzerinde etkili olduğu kanıtlanmıştır. Bu biyoaktif bileşenler ve fraksiyonlar arasında, potansiyel etkinliğe sahip feniletanoid glikozit (PhG) bileşiklerinin, osteoporozun tedavisi için umut verici ajanlar olduğuna inanılıyordu [10-12]. PhG'lerin yapıları, bir glikosidik bağ yoluyla -glikopiranoz, apioz, galaktoz, ramnoz veya ksiloz ile birleştirilen bir hidroksil fenil etil grubu olan sinnamik asit aglikonundan oluşur. Cistanche cinsinin tıbbi türlerinde yaygın olarak bulunurlar [13]. Cistanche Deserticola YC Ma, Çin farmakopesinde kayıtlı resmi bir TCM'dir ve önemli bir TCM olmasının yanı sıra [14], C.deserticola aynı zamanda birkaç yan etkisi olan yaşlanma karşıtı bir tonik bitkidir ve tıbbi likör ve besin sıvısı olarak onaylanmıştır. Devlet Gıda ve İlaç İdaresi. Çin farmakopesi kayıtlarına göre, C. Deserticola geleneksel olarak yerliler tarafından kas güçsüzlüğü ve bel zayıflığı gibi böbrek özü eksikliği sorunlarını ve feniletanoid glikozit bileşiklerini tedavi etmek için kullanılmıştı.ekinekozitve akteozit bu bitkideki ana biyoaktif bileşenlerdir. TCM'nin "böbreği yöneten kemik" teorisine göre, kemik sistemi böbrek özü tarafından yönetilir [15] ve osteoporoz gibi kemikle ilgili sorunlar, böbrek özünü besleme aktivitesine sahip şifalı bitkiler veya bileşiklerle iyileştirilebilir. Bu nedenle, C. Deserticola'dan izole edilen toplam feniletanoid glikozit fraksiyonunun, en azından kısmen, osteoporoz tedavisinde faydalı olduğunu varsaydık. Bu nedenle mevcut deney, yumurtalıkları alınmış (OVX) bir sıçan modeli kullanılarak hipotezimizi doğrulamak için tasarlandı; Tahmin edilmesi gereken kemik rezorpsiyon ve formasyon belirteçlerinin yanı sıra anti-oksidasyon indeksinin yanı sıra RANKL/RANK/TRAF6- kaynaklı PI3K/AKT ve NF-κB sinyal yolları da antiosteoporotik biyoaktivitenin ana mekanizmalarını araştırmak için kullanıldı. .

2. Malzemeler ve Yöntem

2.1. Bitki Materyalleri ve Hazırlanması.

2015 Eylül'de Yongning İlçesinden 106.026597 ve 38.262816 koordinatlarıyla toplam 30 kg Cistanche Deserticola YC Ma sapı toplandı, Ningxia Eyaleti, Çin. Bitki, Dr Lin Dong (Ningxia Tıp Üniversitesi Farmakognozi Bölümü) tarafından tanımlandı ve buna karşılık gelen bir örnek (#20150901) Tıp Departmanında saklandı. Farmasötik Analiz. İlk olarak, 30,0 kg toz halindeki C. Deserticola, çözücü olarak %70 etanol ile geri akış yöntemi kullanılarak ekstre edildi; Malzemenin solvente oranı 1:10 olarak ayarlandı ve geri akış süresi 3 kez 2 saat oldu. Daha sonra süzüntülerin tümü birleştirildi ve indirgenmiş basınç altında 60 derece C'de yoğunlaştırıldı. İkinci olarak, ön ayırma için AB-8 makro gözenekli reçine kolonları kullanıldı ve sudaki farklı oranlarda etanol (%0, %20, %20, Yıkama için %30, %40, %50 ve %60 (her biri 60 L) kullanıldı. Üçüncü olarak, %40 ve %50 elüentler birleştirildi ve su içinde %0, %20, %30, %40 ve %50 etanol elüentleri ile tekrarlanan AB-8 makro gözenekli reçine kolonları kullanılarak daha da saflaştırıldı ve her yıkama sıvısı 12 L idi. Son olarak, %40'lık fraksiyon toplandı ve azaltılmış basınç altında yoğunlaştırılarak 150 g soluk sarı tortulu C. Deserticola'nın feniletanoid glikozit fraksiyonu (CDP, verim %0,5 idi) elde edildi. İn vivo deneylerde CDP'yi çözmek için %0,5 CMC-Na solventi kullanıldı; hayvanlara oral uygulama 1 mL/100 g vücut ağırlığı olarak ayarlandı; in vitro Western blot analizi için CDP, DMSO ile çözündürüldü ve ardından 0,1 mg/mL, 0,01 mg/mL ve 0,001 mg/mL'lik nihai konsantrasyonları elde etmek üzere DMEM ile seyreltildi. 

KEMİK BÜYÜMESİ İÇİN DOĞAL CISTANCHE ÖzüFENİLETANİD GLİKOZİTLER %75 EKİNAKOSİT %30 AKTEOSİT %12

2.2. Kimyasallar ve Çözücüler.

Estradiol valerat (EV), Delpharm Lille SAS, Fransa'dan geliyordu; alkalin fosfataz (ALP), kemik gla-proteini (BGP), tartrat dirençli asit fosfataz (TRAP) ve deoksipiridinolin (DPD) çapraz bağlı ELISA kitleri, Xinyu Biological Engineering Co. Ltd., Şanghay, Çin, 201605; Nanjing Jiancheng Biyoloji Mühendisliği Enstitüsü, Nanjing, Çin'den malondialdehit (MDA, 20181221), süper oksit dismutaz (SOD, 20121218) ve glutatyon (GSH, 20181221) reaktif kitleri; Elabscience Bioteknoloji Co. Ltd., Wuhan, Çin'den bozulmamış parathormon (l-PTH, NEWASHE7UZ), kalsitonin (2L9ISN7AIU) ve östrojenle ilişkili reseptör alfa (ERR, Y3AY8QEWB3) çapraz bağlı ELISA kitleri; BioVision, Amerika'dan katepsin K ELISA reaktif kiti, 11300141; RANKL (GR3193842-5), RANK (AA02113656), TRAF6 (2), c-Fos (AG12059411), NFAT2 (AO11015648), NF-κB p65 (AH04138226), PI3 kinaz p85 alfa (AC09021266) birincil antikorları , AKT 1 (AF05173234), -aktin (17AV0411) ve ZSGB-BIO, Çin, 136080'den yaban turpu peroksidazı ile konjuge keçi anti tavşan IgG'sinin ikincil antikorları; toplam BCA protein tahlil kiti ve kemik oklast oluşumunun ve fetal sığır serumunun saptanmasına yönelik ticari kit ve HyClone, Logan, UT, ABD'den Dulbecco'nun değiştirilmiş Eagle ortamı (DMEM); Millipore Life Sciences, Billerica, MA, ABD'den poliviniliden florür (PVDF) membran; Gibco, Rockville, MD, ABD'den penisilin ve streptomisin. Kullanılan diğer tüm kimyasal maddeler AR sınıfındaydı.

2.3. CDP'nin HPLC Kantifikasyonu.

CDP'nin bileşimini tanımlamak ve ölçmek için bir Agilent 1220 HPLC cihazı kullanıldı. Kromatografi koşulları şu şekildeydi: C18 kolonu (TSK-GEL, 4.6.id × 250 mm, 5 μm); gradyan elüsyonu, solventler A (asetonitril) ve B (%0,5 asetik asit içeren su) içeriyordu (0-10 dk: %17-20 A; 10-30 dk: %20-25 A; ve 30-40 dk: %25-30 A); tespit dalga boyu 333 nm idi; ortam sıcaklığı; akış hızı 1.0 mL/dak idi; numune enjeksiyon hacmi 5 μL idi. Sekiz PhG bileşiği, yani cistanosid F, ekinakosid, 6'-asetillakteosid, cistanosid C, cistanosid A, akteozid, 2'-asetillakteosid ve izoakteosid tanımlandı; karşılık gelen referans maddeleri ve harici bir standart yöntem kullanılarak yukarıdaki 8 PhG'nin içeriği HPLC analiziyle ölçüldü (Şekil 1).

Şekil 1: CDP'nin HPLC parmak izi. Bu fraksiyonda sekiz feniletanoid glikozit bileşiği bulundu ve toplam içerik, %50,7 olarak belirlendi. Bileşikler ve içerikleri şu şekildeydi: (1) akteozit F (%3,6), (2) ekinakozit (%8,8), (3) cistanosid A (%5,0), (4) akteozit (%13,3), (5) izoacteoside (%3,3), (6) akteosid C (%3,6), (7) 2'-asetillakteosid (%9,9) ve (8) 6'-asetillakteosid (%3,2).

2.4. Hayvan Deney Protokolü.

Ortalama başlangıç ​​vücut ağırlığı yaklaşık 234 ± 25 g olan, Ningxia Tıp Üniversitesi hayvan deneyleri merkezinden toplam 60 adet 3 aylık dişi yetişkin Sprague-Dawley sıçanı amaçlandı. Sıçanlar, alışmaları için 1 hafta boyunca standart spesifik patojen içermeyen bir ortamda barındırıldı. Daha sonra, tüm sıçanlara yalnızca anestezi uygulandı (kloral hidrat, 100 mg/kg, ip) veya sahte ovariektomi uygulandı (SHAM) veya iki yumurtalığın her ikisi de çıkarıldı ve daha sonra rastgele 5 alt gruba ayrıldı: ağızdan araç (%0,5 CMC-) ile tedavi edildi. Na) model grup (OVX), östradiol valerat (1 mg/kg/gün) pozitif grup (EV) ve 60, 120 ve 240 mg/kg/gün CDP düşük (CDPL) olarak belirlendi. sırasıyla orta (CDPM) ve yüksek (CDPH) dozaj grupları. Tüm sıçanlara günlük olarak oral yoldan uygulandı ve tüm vücut ağırlıklarındaki değişime bağlı olarak her 2 haftada bir dozaj ayarlanarak 3 ay süreyle uygulandı. Hayvan deneyinin son gününde metabolik kafesler kullanılarak 24-saatlik idrar elde edildi; anestezi altındaki sıçanların femoral arterinden serum toplandı; sağ uyluk kemiği, kaval kemiği ve tüm organlar parçalara ayrıldı ve ileri analiz için -80 derece C'de saklandı. Yaptığımız hayvan deneyleri Ningxia Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.

2.5. Kemik Mineral Yoğunluğu Tayini ve Mikro-CT Analizi.

İlk olarak, her bir sıçanın sağ femurunun toplam kemik mineral yoğunluğunu tahmin etmek için çift enerjili bir X-ışını absorpsiyometri makinesi (Lunar, ABD) kullanıldı; ikinci olarak, aynı femur, bir mikro-CT tarayıcı aparatı (GE, Amerika) kullanılarak trabeküler kemik mikro mimarisinin 3 boyutlu görüntüsünü tahmin etmek için kullanıldı. İdeal bir 3D görüntü elde etmek için izotropik çözünürlük 14 μm olarak ayarlandı; ilgilenilen bölge (ROI), her numunenin uyluk kemiğinin büyüme plakasında aynı koordinatların ayarlanmasıyla seçilmiştir; ve trabeküler ayrılma (Tb.Sp), trabeküler sayı (Tb.N), trabeküler kalınlık (Tb.Th), kemik mineral içeriği (BMC), doku mineral yoğunluğu (TMD) ve doku mineral içeriği (TMC) dahil olmak üzere kemik morfometrik parametreleri ) ROI analiz edilerek elde edildi.

Şekil 2: OVX'in ve CDP veya EV ile 12 haftalık tedavinin, çift enerjili X-ışını absorpsiyometrisi (n=10/grup) kullanılarak değerlendirilen sıçanların sağ uyluk kemiğindeki toplam kemik mineral yoğunluğu üzerindeki etkileri. Veriler ortalama ± SD olarak sunuldu; OVX grubuna karşı ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 ve ∗∗∗p < 0 001; ###p < 0 001 SHAM grubuna karşı.

Şekil 3: CDP ile tedavi edilen sıçanların sağ uyluk kemiğinin mikro mimarisinin mikro-BT tarama görüntüleri; gösterilen fotoğraflar her gruptaki 4 farklı fareyi temsil ediyordu: (A) OVX grubu; (B) SHAM grubu; (C)EV grubu; (D) CDPH grubu; (E) CDPM grubu; (F) CDPL grubu. Ölçülen parametreler şunları içerir:kemik mineral içeriği(BMC), doku mineral içeriği (TMC), doku mineral yoğunluğu (TMD), trabeküler ayrılma (Tb.Sp), trabeküler sayı (Tb.N) ve trabeküler kalınlık (Tb.Th). OVX sıçanlarında mikro mimari alanda ve trabeküler sayıda kayda değer bir azalma olduğu görüldü. CDP ile tedavi edilen sıçanlar ve EV ile tedavi edilen sıçanlar, 12 haftalık tedaviden sonra yukarıda belirtilen bulguları aynı derecede kısmen tersine çevirdi. Tüm değerler ortalama ± SD olarak sunuldu. OVX grubuna karşı ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 ve ∗∗∗p < 0 001; ###p < 0 001 SHAM grubuna karşı.

Şekil 4: OVX ve 12 haftalık CDP veya EV tedavisinin sıçanların idrar ve serum Ca ve P'sinin yanı sıra PTH ve kalsitonin üzerindeki etkileri (n=10/grup). Tüm veriler ortalama ± SD olarak ifade edildi. OVX grubuna karşı ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 ve ∗∗∗p < 0 001; # p < 0 05, ##p < 0 01 ve ###p < 0 001 SHAM grubuna karşı.

2.6. Serum ve İdrar Biyokimyasal Analizi.

Serum katepsin K, TRAP, SOD ve GSH aktivitelerinin yanı sıra serum PTH, kalsitonin, ERR, MDA, BGP ve idrar DPD içerikleri üreticinin talimatlarına göre karşılık gelen reaktif kitleri kullanılarak belirlendi ve alkalin fosfataz (ALP) düzeyi ve serum ve idrar kalsiyum (Ca) ve fosfor (P) içerikleri, otomatik bir makine (Ciba-Corning 550 Diagnostics Corp., Oberlin, OH, ABD) kullanılarak tahmin edildi.

2.7. Western Blot Analizi.

Osteoklastlar, makrofaj koloni uyarıcı faktör (MCSF) ve RANKL ile eklenen RAW 264.7 hücreleri kullanılarak indüklendi. Kısaca, 1 x 107 RAW 264.7 hücresi, 30 ng/mL MCSF ve 25 ng/mL RANKL varlığında bir 6-kuyu plakasında kültürlendi. 6 günlük indüksiyondan sonra olgunlaşan osteoklast hücreleri, ilgili kit ile TRAP boyama yöntemi kullanılarak tanımlandı ve ardından CDP (0,1, 0,01 ve 0,001 mg/mL) ile işleme tabi tutuldu. sırasıyla) 24 saat boyunca; daha sonra hücreler, 0,5 mmol fenilmetilsülfonil florür, proteaz ve fosfataz inhibitörleri içeren bir lizis tamponu ile parçalandı. Lizat daha sonra %10 SDS-PAGE kullanılarak ayrıldı ve AKT1, NF-KB-p65, RANKL, PI3K p85, RANK, NFAT2, TRAF6, c-Fos ve -aktin ile problanan bir PVDF membranına aktarıldı ( 1:400) 2 saat boyunca %5 yağsız süt ile bloke edildikten sonra. Aynı membranlar sırasıyla yukarıdaki 9 karşılık gelen antikorla soyuldu ve tekrar problandı ve ardından sonunda Image Lab yazılımı tarafından tespit edildi. Deneyler üç kez tekrarlandı.

2.8. İstatistiksel analiz.

Ortalama ± SD olarak tanımlanan in vivo ve in vitro deneylerden elde edilen tüm veriler, tek yönlü ANOVA ve ardından Dunnett testi (SPSS 22.0 yazılımı, SPSS, ABD) kullanılarak analiz edildi; p < 0 05 istatistiksel olarak anlamlıydı.

3. Sonuçlar

3.1. CDP'nin Kimyasal Bileşimi.

HPLC yöntemini kullanarak sekizfeniletanoid glikozit bileşikleriŞekil 1'de görüldüğü gibi bu fraksiyonda bulunmuştur. Standart referanslar ve harici bir standart yöntem kullanılarak bileşikler ve içerikleri şu şekilde tanımlandı ve ölçüldü: (1) akteozit F (%3,6), (2) ekinakozit (%8,8), (3)cistanosidA (%5.0), (4) akteozit (%13,3), (5) izoakteozit (%3,3), (6) akteozit C (%3,6), (7) 2'-asetillakteozit (%9,9) ) ve (8) 6'-asetillakteosid (%3,2). Bu sekiz bileşenin toplam içeriği %50,7 olarak belirlendi.

DOĞAL TÜP CISTANCHE ÖZÜKEMİK GELİŞİMİ İÇİNFENİLETANİD GLİKOZİTLER %75 EKİNAKOSİT %30 AKTEOSİT %12

3.2. CDP'nin Kemik Mineral Yoğunluğu ve Trabekül Mikro Mimarisi Üzerine Etkileri.

Farklı alt gruplardaki sıçanların toplam kemik mineral yoğunluğu Şekil 2'de gösterilmektedir. SHAM grubundaki sıçanlarla karşılaştırıldığında OVX model operasyonu yapılan sıçanlarda kemik mineral yoğunluğu içeriğinde azalma eğilimi gözlendi (p < {{ 1}}). CDP ile tedavi edilen tüm sıçanlar, OVX model grubundaki sıçanlarla karşılaştırıldığında sırasıyla %11,2, %12,0 ve %10,7 (p < 0 01) oranında önemli ölçüde artmış kemik mineral yoğunluğu sergilemiştir. Ayrıca, toplam kemik mineral yoğunluğu verileriyle tutarlı olarak, mikro-CT rekonstrüksiyonunun yanı sıra femurun histomorfometrik tespiti, OVX grubundaki sıçanların trabeküler mimaride belirgin bir şekilde azalmış trabekül sayısı ve alanıyla kanıtlanan belirgin bir bozulma gösterdiğini gösterdi. SHAM grubundaki sıçanlarla karşılaştırıldığında belirgin şekilde artan Tb.Sp'nin yanı sıra. CDP tedavisi, trabeküler mimaride OVX'in neden olduğu bozulmayı önledi; Şekil 3'te görüldüğü gibi, BMC, TMC ve Tb.N değerleri önemli ölçüde artmış ve Tb.Sp alanı belirgin şekilde azalmıştır; TMD ve Tb.Th değerleri ise OVX işleminden önemli ölçüde etkilenmemiş gibi görünmektedir ve bizim CDP müdahalesi.

Şekil 5: OVX ve 12-haftalık CDP veya EV tedavisinin, OVX sıçanlarının (n=10}/grup) serum TRAP, katepsin K, DPD, ALP ve BGP aktiviteleri üzerindeki etkileri. Tüm değerler ortalama ± SD olarak sunuldu. OVX grubuna karşı ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 ve ∗∗∗p < 0 001; # p < 0 05, ##p < 0 01 ve ###p < 0 001 SHAM grubuna karşı.

3.3. CDP'nin İdrar ve Serum Biyokimyasal Parametreleri Üzerine Etkileri.

Şekil 4'te gösterildiği gibi, OVX model grubundaki sıçanlarda idrar P düzeyi ve serum kalsitonin içeriğinde önemli azalma eğilimleri tespit edildi; bu, SHAM sıçanlarına göre yaklaşık %30 ve %60 daha azdı (p < 0 001 ), sırasıyla, OVX ve SHAM grupları arasında idrar Ca ve serum Ca düzeylerinin yanı sıra serum P ve serum PTH düzeylerinde belirgin bir artış veya azalma eğilimi gözlenmedi. CDP ile tedavi, OVX sıçanlarında serum P ve Ca kaybını önemli ölçüde önledi; bu, OVX model grubundaki sıçanlarla karşılaştırıldığında serum P ve Ca düzeylerinin belirgin şekilde yukarı regüle edilmesiyle (p < 0 05) kanıtlanmıştır. Ek olarak, OVX model grubuyla karşılaştırıldığında CDP'nin hem düşük hem de yüksek dozaj gruplarında artmış ancak istatistiksel olmayan anlamlı kalsitonin eğilimleri gözlemlendi.

Şekil 6: OVX ve CDP veya EV ile 12-haftalık tedavinin sıçanların ERR ifadesi, vücut ağırlığı ve rahim ve vajina ağırlıkları üzerindeki etkileri (n=10/grup). Veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur. OVX grubuna karşı ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 ve ∗∗∗p < 0 001; ###p < 0 001 SHAM grubuna karşı.

3.4. CDP'nin Kemik Oluşumu ve Kemik Rezorpsiyon Belirteçleri Üzerindeki Etkileri.

CDP'nin kemik oluşum indeksi üzerindeki yararlı etkilerinin yanı sıra kemik oluşumu üzerindeki inhibisyon etkilerikemik erimesikemik oluşumu belirteçleri ile ilgili olarak, serum BGP seviyeleri yumurtalıkları alınmış ameliyattan neredeyse hiç etkilenmezken, tedavi edilen tüm gruplarda gözlenen anlamlı olmayan değişikliklerle kanıtlanmıştır, oysa hem düşük hem de düşük (6) serum ALP'sinde istatistiksel olarak anlamlı iyileşmeler elde edilmiştir. SHAM grubundaki farelerle karşılaştırıldığında CDP müdahale gruplarının 0 mg/kg) ve orta (120 mg/kg) dozajları (p < 0 01). Kemik rezorpsiyon indeksi ile ilgili olarak, OVX model grubundaki sıçanlarda serum katepsin K ve DPD'nin yanı sıra TRAP düzeyleri de SHAM sıçanlarıyla karşılaştırıldığında sırasıyla yaklaşık %75,0, %41,4 ve %21,0 oranında önemli ölçüde arttı. ve CDP ile, özellikle de 60 mg/kg'lık düşük dozajla tedavi edildiğinde, OVX model grubunda katepsin K ve DPD'nin yanı sıra TRAP'ın özellikleri de sırasıyla %67,3, %41,4 ve %25,9 oranında belirgin şekilde inhibe edildi. OVX model grubundaki sıçanlarla karşılaştırıldığında.

KEMİK BÜYÜMESİ İÇİN DOĞAL TÜP CISTANCHEFENİLETANİD GLİKOZİTLER %75 EKİNAKOSİT %30 AKTEOSİT %12

3.5. CDP'nin Vajina ve Rahim ile Tüm Vücut Ağırlıkları Üzerindeki Etkileri.

Altı grupta tedaviden önce sıçanların başlangıçtaki tüm vücut ağırlıklarında anlamlı olmayan farklılıklar gözlendi (Şekil 6). Bununla birlikte, yumurtalıkları alınmış operasyon, OVX model grubundaki sıçanların nihai vücut ağırlığında yaklaşık %36.0 oranında önemli bir artışa neden olurken, rahim ve vajina ıslak ağırlıkları yaklaşık 9{{4} kadar büyük ölçüde azaldı. SHAM fareleriyle karşılaştırıldığında sırasıyla %}.0 ve %60,0 (p < 0 001). Her ne kadar ERR içeriği OVX ve SHAM grupları arasında anlamlı bir fark göstermese de CDP ve EV dahil tüm tedavi gruplarında ERR düzeyini anlamlı düzeyde arttırdı. Ayrıca, EV ile tedavi edildiğinde, yukarıda belirtilen tüm vücut ağırlıklarının yanı sıra OVX sıçanlarının vajina ve rahim ağırlıklarındaki kayıplar kısmen tersine çevrildi (p < 0 001), ancak CDP müdahalesinden etkilenmedi.

3.6. CDP'nin Serum MDA, SOD ve GSH Düzeyleri Üzerine Etkileri.

SHAM ve OVX model grupları arasında serum SOD ve GSH özelliklerinde istatistiksel olarak anlamlı bir fark yoktu; Şekil 7'de açıklandığı gibi, yukarıdaki iki grup arasında GSH'de artan bir eğilim gözlemlenebilir. Ek olarak serum MDA düzeyi, SHAM sıçanlarıyla karşılaştırıldığında OVX model grubundaki sıçanlarda yaklaşık %50 oranında keskin bir şekilde yukarı doğru düzenlenmiştir. SOD aktivitesi CDP tedavisinden etkilenmezken, GSH'nin özelliği CDP müdahalesi ile önemli ölçüde iyileştirildi ve CDP, MDA seviyesini 60 ve 240 mg/kg dozlarında sırasıyla %33,9 ve %42,4 oranında belirgin şekilde azalttı ( p < 0 001).

3.7. CDP'nin Protein İfade Düzeyleri Üzerindeki Etkileri.

Şekil 8'de gösterilen verilerimiz, CDP tedavisinin, kontrole kıyasla TRAF6, RANK ve RANKL'ın protein seviyelerini önemli ölçüde azalttığını ileri sürdü. NF-κB dahil olmak üzere aşağı akış sinyal yolları bastırıldı ve PI3K/AKT, CDP müdahalesi ile uyarıldı; bu, NF-κB-p65 aşağı regülasyonunun ifadesiyle kanıtlanırken PI3K p85 ve AKT1 yukarı regüle edildi. Sonuç olarak, NFAT2 ekspresyonu önemli ölçüde azaldı ve 0.001-0.1 mg/mL konsantrasyonunda CDP ile tedaviden sonra c Fos arttı. Önerilen bir mekanizma Şekil 9'da açıklanmaktadır; burada CDP, RANKL ve RANK düzeylerini aşağı regüle ederek bu ligandın reseptörüne bağlanma miktarlarını azaltmıştır. RANKL'ın RANK ile bağlantısı, TRAF6'nın aşağı regülasyonu ve ardından NF-κB yolu dahil olmak üzere aşağı akış yollarının baskılanmasıyla daha da azaldı. Buna karşılık PI3K/AKT sinyal yolu uyarıldı ve bu da sonuçta NFAT2 ifadesinin azalmasına ve c-Fos seviyesinin artmasına yol açtı.

4. Tartışma

Feniletanoid glikozitlerşifalı bitkiler aleminde yaygın olarak bulunan, doğal olarak oluşan, suda çözünebilen bileşenlerdir [11]. Şimdiye kadar, feniletanoid glikozitlerin bileşikleri, çeşitli insan rahatsızlıkları ve anormallikleriyle baş etmedeki belirgin rollerinden dolayı giderek daha fazla araştırmacının ilgisini çekmiştir [13]. Polifenol ve feniletanoid glikozitler de dahil olmak üzere çok sayıda antiosteoporotik biyoaktif fraksiyon ve bileşik tanımlanmış ve düzinelerce doğal şifalı bitkiden izole edilmiştir [5, 10, 12, 16, 17]

Şekil 8: Farklı CDP konsantrasyonlarının TRAF6 (a), RANKL (b), RANK (c), PI3K (d), AKT (e), NF-κBIA (f), NFAT2 (g), protein ifadeleri üzerindeki etkileri ve c-Fos (h) (n=3/grup); protein ifadesi -aktin'e normalleştirildi ve her sinyal proteininin niceliksel verileri, kontrol değerinin yüzdeleri olarak gösterildi. Veriler ortalama ± SD olarak tanımlandı. ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 ve ∗∗∗p < 0 001 kontrol grubuna karşı.

C. Deserticola, bu yenilebilir TCM'nin güvenlik profilini ima eden "çölün ginseng'i" olarak iyi bilinmektedir [18, 19]. Asya ülkelerinde uzun süredir kullanılan genel bir tonik bitki ve doğal sağlık gıdası olan C. Deserticola, böbrek gücünün arttırılmasında faydalı bir işlev sergilemiştir. Geleneksel olarak böbrek özünü canlandırmak ve korumak için kullanılan TCM'nin genellikle osteoporozu tedavi etmek için kullanıldığı, hem in vitro hem de in vivo yayınlanan verilerin C. Deserticola'nın antiosteoporotik aktivitesini kanıtladığı bulunmuştur [20-23], ve ekinekosid ve akteozid dahil olmak üzere feniletanoid glikozit bileşenleri, bu yenilebilir şifalı bitkide bulunan ana biyoaktif bileşenlerdir; bunların hepsi sadece ekinakozit ve akteozidin kendilerinin değil, aynı zamanda C. Deserticola'da bulunan diğer feniletanoid glikozit bileşenlerinin de bu bitkinin antiosteoporotik özelliğinden sorumlu olduğunun düşünüldüğünü ileri sürdü. Mevcut çalışmamızda, C. Deserticola'dan feniletanoid glikozit fraksiyonunu izole etmek ve zenginleştirmek için uygun bir güvenlik makro gözenekli reçine kullanıldı ve HPLC yöntemini kullanarak sekiz ana feniletanoid glikozit bileşeni, yani akteozit F, ekinakozit, cistanosid A, İzole edilmiş fenil letanoid glikozit fraksiyonunda akteozit, izoakteozit, akteozit C, 2'-asetillakteozit ve 6'-asetillakteozit bulundu ve içerikleri %3,6, %8,8, %5,0, %13,3, %3,3, %3,6, Sırasıyla %9,9 ve %3,2. C. Deserticola'da kaydedilen ana aktivite bileşiklerinden biri olan Echinacoside'nin [14] antiosteoporotik aktiviteye sahip olduğu kanıtlanmıştır; ancak 270 mg/kg'lık dozaj o kadar yüksekti ki, ilerideki klinik uygulamalarını sınırladı [24]. Mevcut deneylerde, OVX sıçanlarında 60-240 mg/kg vücut ağırlığı/- gün gibi daha düşük bir dozaja sahip toplam feniletanoid glikozit fraksiyonu kullanıldı ve belirlenen bileşenlerin içerikleri, bu fraksiyon kullanılarak bu fraksiyonda neredeyse %50 saftı. HPLC yöntemi.

OVX'in osteoporoza neden olabileceği iyi biliniyordu ve OVX sıçanının, insan menopoz sonrası osteoporozunu simüle etmek için klasik ve uygun bir model olduğuna inanılıyordu. Aynı zamanda, ovariektomi ameliyatından sonra kemik mineral yoğunluğunda, trabeküler kemik mikro mimarisinde, rahim ve vajina ıslak ağırlıklarında ve östrojen seviyesinde önemli bir azalmanın yanı sıra kemik erimesinde ve vücut ağırlığında belirgin bir artış gözlendi. kısmen östrojen kaybına bağlıdır [25]. Şu ana kadarki verilerimiz, OVX'in gerçekten menopoz sonrası osteoporozu tetiklediğini ve buna her zaman kemik kalitesinde, kemik mikro mimarisinde ve rahim ve vajina ıslak ağırlıklarında keskin bir düşüşün eşlik ettiğini açıkça gösterdi. EV, klinik uygulamada kullanılan genel bir hormon replasman ajanı olduğundan, in vivo deneyimizde pozitif kontrol olarak kullanılmış ve artan vücut ağırlığı ve atrofiye uterus ağırlıklarının yanı sıra bozulmuş kemik mineral yoğunluğu ve trabeküler kemik mikro mimarisi de incelenmiştir. EV takviyesiyle beklendiği gibi tersine çevrildi. Pozitif kontrolden farklı olarak, OVX model grubundaki sıçanların azalan vajina ve rahim ağırlıklarının yanı sıra kazanılan tüm vücut ağırlığı CDP tedavisinden etkilenmedi; bu, CDP'nin yan etkilere neden olmadan kemik oluşumunu artırabildiğini ima etti. vücut ve uterusun organik dokularında. Her ne kadar CDP tedavisi ile ERR seviyeleri önemli ölçüde yukarı doğru düzenlenmiş olsa da, tıpkı fitoöstrojen etkisi gibi rahim ve vajina organik dokularında herhangi bir yan etki gözlenmedi. Ayrıca CDP tedavisi, OVX sıçanlarında ovariektomi ameliyatı nedeniyle bozulan kemik kalitesini önemli ölçüde güçlendirdi.

Ek olarak, OVX sıçanlarının idrar ve serumundaki P ve Ca seviyeleri de antiosteoporotik etkiyi yansıtmak için kullanıldı ve Ca ve inorganik P konsantrasyonları genellikle kalsitonin ve PTH seviyelerine bağlıydı [26]. Bu çalışmada idrarla atılan Ca düzeyinde anlamlı bir düşüş ya da artış eğilimi olmamasına rağmen,

Şekil 9: Varsayılan moleküler mekanizma: CDP, RANKL/RANK/TRAF6-indüklü NF-κB inaktivasyonu ve PI3K/AKT yollarının aktivasyonu ve ayrıca c-Fos uyarımı ve NFAT2 baskılaması yoluyla OVX sıçanındaki kemik kaybını önleyebilir TRAF6, RANKL, RANK, NF-κBIA ve NFAT2'nin ekspresyon seviyelerinin aşağı regülasyonu ile kanıtlanırken, c-Fos, AKT ve PI3K, kontrol grubuna kıyasla CDP tedavisi ile önemli ölçüde yukarı doğru düzenlenmiştir.

OVX model grubundaki sıçanlarda serum P, serum Ca ve PTH elde edildi ve önemli idrar P ve kalsitonin seviyeleri (p < 0 001) gözlendi. Yumurtalık ameliyatının neden olduğu östrojen eksikliğinin her zaman kandaki kalsitonin düzeyinde azalmaya yol açtığını gösteren yayınlanmış verilerle tutarlı olarak, bu azalan serum kalsitonin, sonunda Ca'nın PTH salgısının ana düzenleyicisi olduğuna inanılan PTH düzeyinde artışa yol açtı. Mevcut çalışmada PTH konsantrasyonu OVX ve SHAM grupları arasında anlamlı bir fark göstermediğinden, hem serum hem de idrardaki Ca seviyesi de yukarıdaki iki grup arasında belirgin bir değişiklik sergilemedi. Bununla birlikte, OVX ve SHAM grupları arasında kalsitonin düzeyinde önemli ölçüde azalma eğilimi elde edildi ve sonuç olarak OVX'in idrarındaki P içeriği güçlü bir şekilde azaldı. Yukarıdaki verilerin, OVX sıçanlarında Ca düzeyinin idrarla atılımının SHAM sıçanlarına kıyasla neden belirgin bir değişiklik göstermediğine ilişkin çelişkili olguyu açıklayabileceğine inanıyoruz ve bu olgu aynı zamanda artan kemik dönüşüm hızıyla da ilişkili olabilir [27] . CDP ile tedaviden sonra serumdaki P ve Ca seviyeleri belirgin şekilde yukarı doğru düzenlendi ve OVX sıçanlarında idrardaki P içeriği aşağı doğru düzenlendi; bu da CDP'nin yalnızca kemik mineral elementi atılımını engellemekle kalmayıp aynı zamanda bu sıçanların serum içeriğini de artırabildiğini yansıtıyordu. Böylece dolaylı olarak kemik kaybını baskılar.

Ayrıca, CDP'nin altında yatan antiosteoporotik mekanizmaları açıklamak için kemik oluşumu ve yıkım belirteçlerinin yanı sıra SOD ve GSH gibi antioksidan enzimler de kullanıldı. Yayınlanan verilere benzer şekilde, OVX model grubundaki sıçanlarda ALP seviyesi, postmenopozal osteoporozda hızlanmış bir kemik dönüşüm hızına işaret eden istatistiksel olarak anlamlı olmayan bir artış eğilimi sergiledi [10]. Ancak CDP (60, 120 ve 240 mg/kg/gün) ile tedaviden sonra ALP'nin özelliği önemli ölçüde arttı. OVX'in östrojen seviyelerinde keskin bir düşüşe neden olduğu iyi biliniyordu; bu da genellikle aşırı kemik rezorpsiyonuna ve oksidatif strese yol açar [28], bu durum TRAP, katepsin K ve DPD'nin yanı sıra MDA'nın sıçanlarda belirgin şekilde yukarı regüle edilmesiyle de kanıtlanmıştır. OVX model grubu. Ancak bu bozulmalar CDP müdahalesiyle kısmen iyileştirildi. Ek olarak, CDP (60 ve 240 mg/kg) ile OVX sıçan tedavisi, GSH aktivitesinde önemli bir artış gösterdi (p < 0 05). Yukarıdaki sonuçlar, CDP'nin OVX kaynaklı osteoporoz üzerinde terapötik bir etki sergilediğini ve bu etkilerin hem kemik oluşumunu arttırarak hem de kemik rezorpsiyonunu baskılayarak ve ayrıca kemik antioksidan sistemini geliştirerek olduğunu ima etti.

RANK'ın RANKL ligandıyla aktivasyonu, PI3K/AKT ve NF-κB sinyali yoluyla NFAT2 ve c-Fos ekspresyonlarını uyardı [29]. NF-κB'nin bozulması, osteoporotik bir fenotip ile bozulmuş bir osteoklast farklılaşmasına yol açabileceğinden ve NF-κB, RANKL / RANK / TRAF kaynaklı osteoklastogenez sırasında c-Fos'u yukarı regüle etti ve NFAT2 ekspresyonlarını aşağı regüle ettiğinden, NF-κB'nin osteoklastogenez için gerekli olduğu kanıtlandı. CDP'nin NFAT2 ve c-Fos aracılı osteoklastogenez üzerindeki yararlı etkisini tahmin etmek için RANKL ve RANK'ın ekspresyon seviyeleri analiz edildi. Beklendiği gibi CDP, NFAT2'yi önemli ölçüde inhibe etti ve RANKL ve RANK ifadelerini aşağı doğru düzenleyerek c-Fos seviyelerini uyardı. Bu arada RANK'ın kendisi, aşağı yöndeki sinyallemeyi tetiklemek için TRAF6 ile birleştirilmediği sürece içsel kinaz özelliğinden yoksundu [3]. CDP aynı zamanda TRAF6 ifadesini de aşağı regüle etti; bu da RANKL ve RANK'ın bağlanma miktarlarının önemli ölçüde azalmasına yol açtı. OVX sıçanlarında CDP'nin hipotezleştirilmiş bir antiosteoporotik mekanizması yukarıdaki sinyal yollarını kapsamıştır ve düzenleyiciler Şekil 9'da açıklanmıştır. Kısaca, CDP TRAF6, RANKL ve RANK seviyelerini düşürmüştür, böylece PI3K/AKT ve NF-κB dahil olmak üzere aşağı akış sinyal yollarını baskılamıştır. RANKL/RANK tarafından tetiklenir ve son olarak önemli osteoklastojenik proteinler NFAT2 ve c-Fos'un ekspresyonlarını ve aktivitelerini azaltır. Bu nedenle, çok sayıda veri ipucu, CDP'nin OVX sıçanlarının kemik metabolizması üzerinde esasen RANKL/RANK/TRAF6-aracılı PI3K/AKT ve NF-κB yolakları yoluyla faydalı etkisine işaret ediyordu.

5. Sonuç

Özetle, C. Deserticola'dan izole edilen toplam feniletanoid glikozitler, OVX sıçanlarının menopoz sonrası osteoporozu üzerinde önemli yararlı etkiler sergiledi ve kemik kaybının baskılanmasındaki terapötik potansiyel, temel olarak kemik oluşumunun uyarılması ve kemik rezorpsiyonunun inhibe edilmesinin yanı sıra kemik antioksidantının iyileştirilmesi yoluyla da sağlandı. sistem; mekanizmalar RANKL/RANK/TRAF6-indüklenen NF-κB aktivasyonu ve PI3K/AKT inaktivasyonunun yanı sıra c-Fos uyarımı ve NFAT2 baskılanmasıyla ilişkili olabilir ve son olarak osteoklastın farklılaşması inhibe edilmiştir.

KEMİK BÜYÜMESİ İÇİN DOĞAL TÜP CISTANCHEFENİLETANİD GLİKOZİTLER %75 EKİNAKOSİT %30 AKTEOSİT %12