Yumurtalıkları Alınmış Sıçanlarda Cistanche Deserticola'dan İzole Edilen Toplam Feniletanoid Glikozit Fraksiyonunun Kemik Mikroyapısı Üzerindeki Faydalı Etkileri Ⅰ

Bu çalışma, izole edilen toplam feniletanoid glikozit fraksiyonunun antiosteoporotik aktivitesini tahmin etmek için tasarlanmıştır.C. Deserticola(CDP), ovariektomi (OVX) ile indüklenen sıçanlarda ve ilgili mekanizmalarda. 3 aylık oral uygulamadan sonra,kemik mineral yoğunluğunun azalmasıOVX sıçanlarında serum Ca ve P geri kazanıldı ve bozulan trabekülerkemik mikro mimarisiCDP (60, 120 ve 240 mg/kg) müdahalesi ile kısmen iyileştirildi, kemik erimesi belirteçlerinin aktiviteleri azaltıldı ve kemik oluşumu indeksinin biyoaktifliği arttı; Bu arada CDP uygulamasıyla MDA içeriği azaldı ve GSH arttı. Bileşimsel olarak 8 feniletanoid glikozit bileşiği aynıydıfiToplam içerik miktarıyla birlikte CDP'de düzenlenmiştir.fiHPLC yöntemi kullanılarak %50,3 olarak belirlendi. Mekanik olarak CDP, TRAF6, RANKL ve RANK seviyelerini düşürdü, böylece aşağı yöndeki NF-'nin RANKL/RANK/TRAF6- ile indüklenen aktivasyonunu baskıladı.κB ve PI3K/AKT sinyal yollarını ve sonuçta NFAT2 ve c-Fos'un temel osteoklastojenik proteinlerinin aktivitelerini engeller. Yukarıdaki verilerin tümü CDP'nin fayda sağladığını ima ediyordu.fiözel effyumurtalıkları alınmış sıçanlarda kemik mikroyapısını etkiler ve bu etkilerffEtkiler NF- ile ilgili olabilirκRANKL, RANK ve TRAF6'nın bağlanmasıyla tetiklenen B ve PI3K/AKT sinyal yolları.

KEMİK BÜYÜMESİ İÇİN DOĞAL ORGANİK SİSTANÇ

1. Giriş

50 yaşın üzerindeki her 3 kadından 1'inin muzdarip olduğu menopoz sonrası osteoporoz, dünya çapında 200 milyondan fazla kadını etkileyen temel bir sağlık tehlikesi haline geliyor [1]. Menopozda östrojen seviyesindeki keskin düşüş genellikle artan osteoklastogenezin neden olduğu aşırı kemik erimesine yol açar; daha sonra, osteoblast kaynaklı kemik oluşumu ile osteoklast kaynaklı kemik oluşumu arasındaki dengekemik erimesibozuldu ve hızlanan kemik erimesi sonunda osteoporoza ve hatta kalça veya omurga kırılmasına neden oldu [2]. Nükleer faktör kappa B'nin (RANK) reseptör aktivatörü, RANK'ın ligandı olan RANKL'a bağlandığında osteoklast farklılaşmasının tetiklendiğine inanılıyordu. Bununla birlikte, RANK'ın RANKL'a kombinasyonu, protein tümör nekroz faktörü reseptör ilişkili faktör 6 (TRAF6) buna katılmadıkça [3] ve ardından PI3K/AKT ve NF-κB dahil olmak üzere aşağı yönde sinyal yollarının uyarılması olmadığı sürece etkinleştirilemez. . Son olarak, aktive edilmiş T hücreleri c2 (NFAT2) ve c-Fos'un nükleer faktörünün ekspresyonları, kemik rezorpsiyonunun yanı sıra osteoklast farklılaşmasını modüle etmek için düzenlendi [4]. Bu nedenle, osteoklastın aktivasyonu ve farklılaşmasıyla doğrudan veya dolaylı olarak ilişkili faktörler ve düzenleyicilerin, kemik kaybını önlemede önemli hedefler olduğuna inanılıyordu.

Aslında postmenopozal osteoporozun tedavisinde etkili olan estradiol valerat gibi bazı klinik ve sentetik hormon replasman tedavisi ilaçları vardır. Ne yazık ki bunlardan bazıları, meme ve endometriyal kanserler de dahil olmak üzere ciddi kanser riskini arttırdı [5] ve bu da klinik uygulamalarını sınırladı. Bu nedenle hem etkinliği hem de yan etkileri minimum olan diğer alternatiflerin seçilmesi gerekmektedir. Geleneksel Çin ilaçlarının (TCM) yanı sıra izole edilmiş biyoaktif bileşikler ve fraksiyonların [6-9], menopoz sonrası osteoporoz da dahil olmak üzere çeşitli rahatsızlıklar üzerinde etkili olduğu kanıtlanmıştır. Bu biyoaktif bileşenler ve fraksiyonlar arasında, potansiyel etkinliğe sahip feniletanoid glikozit (PhG) bileşiklerinin, osteoporozun tedavisi için umut verici ajanlar olduğuna inanılıyordu [10-12]. PhG'lerin yapıları, bir glikosidik bağ yoluyla -glikopiranoz, apioz, galaktoz, ramnoz veya ksiloz ile birleştirilen bir hidroksil fenil etil grubu olan sinnamik asit aglikonundan oluşur. Cistanche cinsinin tıbbi türlerinde yaygın olarak bulunurlar [13]. Cistanche Deserticola YC Ma, Çin farmakopesinde kayıtlı resmi bir TCM'dir ve önemli bir TCM olmasının yanı sıra [14], C Deserticola aynı zamanda tıbbi likör ve besin sıvısı olarak geliştirilmiş, birkaç yan etkisi olan yaşlanma karşıtı bir tonik bitkidir. Devlet Gıda ve İlaç İdaresi. Çin farmakopesi kayıtlarına göre, C. Deserticola geleneksel olarak yerliler tarafından kas güçsüzlüğü ve bel zayıflığı gibi böbrek özü eksikliği problemlerini tedavi etmek için kullanılmıştı ve ekinekosid ve asetonid dahil olmak üzere feniletanoid glikozit bileşikleri bu bitkideki ana biyoaktif bileşenlerdir. TCM'nin "böbreği yöneten kemik" teorisine göre, kemik sistemi böbrek özü tarafından yönetilir [15] ve osteoporoz gibi kemikle ilgili sorunlar, böbrek özünü besleyici aktiviteye sahip şifalı bitkiler veya bileşiklerle iyileştirilebilir. Bu nedenle, C. Deserticola'dan izole edilen toplam feniletanoid glikozit fraksiyonunun, en azından kısmen, osteoporoz tedavisinde faydalı olduğunu varsaydık. Bu nedenle mevcut deney, yumurtalıkları alınmış (OVX) bir sıçan modeli kullanılarak hipotezimizi doğrulamak için tasarlandı; Tahmin edilmesi gereken kemik rezorpsiyon ve formasyon belirteçlerinin yanı sıra, anti-oksidasyon indeksinin yanı sıra RANKL/RANK/TRAF6- ile indüklenen PI3K/AKT ve NF-κB sinyal yolları da antiosteoporotik biyoaktivitenin ana mekanizmalarını araştırmak için kullanıldı. .

2. Malzemeler ve Yöntem

2.1. Bitki Materyalleri ve Hazırlanması.

2015 Eylül'de Yongning İlçesinden 106.026597 ve 38.262816 koordinatlarıyla toplam 30 kg Cistanche Deserticola YC Ma sapı toplandı, Ningxia Eyaleti, Çin. Bitki, Dr. Lin Dong (Ningxia Tıp Üniversitesi Farmakognozi Bölümü) tarafından tanımlandı ve buna karşılık gelen bir örnek (#20150901) Bölümde muhafaza edildi. Farmasötik Analiz. İlk olarak, 30,0 kg toz halindeki C. Deserticola, çözücü olarak %70 etanol ile geri akış yöntemi kullanılarak ekstre edildi; malzemenin solvente oranı 1:10 olarak ayarlandı ve geri akış süresi 3 kez 2 saat oldu. Daha sonra süzüntülerin tümü birleştirildi ve indirgenmiş basınç altında 60 derece C'de yoğunlaştırıldı. İkinci olarak, ön ayırma için AB-8 makro gözenekli reçine kolonları kullanıldı ve sudaki farklı oranlarda etanol (%0, %20, %20, Yıkama için %30, %40, %50 ve %60 (her biri 60 L) kullanıldı. Üçüncü olarak, %40 ve %50 eluentler birleştirildi ve su içinde %0, %20, %30, %40 ve %50 etanol eluentleri ile tekrarlanan AB-8 makro gözenekli reçine kolonları kullanılarak daha da saflaştırıldı ve her yıkama sıvısı 12 L idi. Son olarak, %40'lık fraksiyon toplandı ve azaltılmış basınç altında yoğunlaştırılarak 150 g soluk sarı tortulu C. Deserticola'nın feniletanoid glikozit fraksiyonu (CDP, verim %0,5 idi) elde edildi. İn vivo deneylerde CDP'yi çözmek için %0,5 CMC-Na solventi kullanıldı; hayvanlara oral uygulama 1 mL/100 g vücut ağırlığı olarak ayarlandı; in vitro Western blot analizi için CDP, DMSO ile çözündürüldü ve daha sonra 0,1 mg/mL, 0,01 mg/mL ve 0,001 mg/mL'lik nihai konsantrasyonları elde etmek üzere DMEM ile seyreltildi.

2.2. Kimyasallar ve Çözücüler.

Estradiol valerat (EV), Delpharm Lille SAS, Fransa'dan geliyordu; alkalin fosfataz (ALP),kemik gla-proteini(BGP), tartrat dirençli asit fosfataz (TRAP) ve deoksipiridinolin (DPD) çapraz bağlı ELISA kitleri, Xinyu Biological Engineering Co. Ltd., Şangay, Çin, 201605; Nanjing Jiancheng Biyoloji Mühendisliği Enstitüsü, Nanjing, Çin'den malondialdehit (MDA, 20181221), süper oksit dismutaz (SOD, 20121218) ve glutatyon (GSH, 20181221) reaktif kitleri; Elabscience Bioteknoloji Co. Ltd., Wuhan, Çin'den bozulmamış parathormon (l-PTH, NEWASHE7UZ), kalsitonin (2L9ISN7AIU) ve östrojenle ilişkili reseptör alfa (ERR, Y3AY8QEWB3) çapraz bağlı ELISA kitleri; BioVision, Amerika'dan katepsin K ELISA reaktif kiti, 11300141; RANKL (GR3193842-5), RANK (AA02113656), TRAF6 (2), c-Fos (AG12059411), NFAT2 (AO11015648), NF-κBp65 (AH04138226), PI3 kinaz p85 alfa (AC09021266) birincil antikorları, AKT 1 (AF05173234), -aktin (17AV0411) ve ZSGB-BIO, Çin, 136080'den yaban turpu peroksidazı ile konjuge keçi anti tavşan IgG'sinin ikincil antikorları; toplam BCA protein tahlil kiti ve kemik oklast oluşumunun ve fetal sığır serumunun saptanmasına yönelik ticari kit ve HyClone, Logan, UT, ABD'den Dulbecco'nun değiştirilmiş Eagle ortamı (DMEM); Millipore Life Sciences, Billerica, MA, ABD'den poliviniliden florür (PVDF) membran; Gibco, Rockville, MD, ABD'den penisilin ve streptomisin. Kullanılan diğer tüm kimyasal maddeler AR sınıfındaydı.

2.3. CDP'nin HPLC Kantifikasyonu.

CDP'nin bileşimini tanımlamak ve ölçmek için bir Agilent 1220 HPLC cihazı kullanıldı. Kromatografi koşulları şu şekildeydi: C18 kolonu (TSK-GEL, 4 6 I d × 250 mm, 5 μm); gradyan elüsyonu, solventler A (asetonitril) ve B (%0,5 asetik asit içeren su) içeriyordu (0-10 dk: %17-20 A; 10-30 dk: %20-25 A; ve 30-40 dk: 25-30% A); tespit dalga boyu 333 nm idi; ortam sıcaklığı; akış hızı 1.0 mL/dak idi; numune enjeksiyon hacmi 5 μL idi. Sekiz PhG bileşiği, yani cistanosid F, ekinakosid, 6'-asetillakteosid, cistanosid C, cistanosid A, akteozid, 2'-asetillakteosid ve izoakteosid tanımlandı; karşılık gelen referans maddeleri ve harici bir standart yöntem kullanılarak yukarıdaki 8 PhG'nin içeriği HPLC analiziyle ölçüldü (Şekil 1).

Şekil 1: CDP'nin HPLC parmak izi. Bu fraksiyonda sekiz feniletanoid glikozit bileşiği bulundu ve toplam içerik, %50,7 olarak belirlendi. Bileşikler ve içerikleri şu şekildeydi: (1) akteozit F (%3,6), (2) ekinakozit (%8,8), (3) cistanosid A (%5,0), (4) akteozit (%13,3), (5) izoacteoside (%3,3), (6) akteosid C (%3,6), (7) 2'-asetillakteosid (%9,9) ve (8) 6'-asetillakteosid (%3,2).

2.4. Hayvan Deney Protokolü.

Ortalama başlangıç ​​vücut ağırlığı yaklaşık 234 ± 25 g olan, Ningxia Tıp Üniversitesi hayvan deneyleri merkezinden toplam 60 adet 3 aylık dişi yetişkin Sprague-Dawley sıçanı amaçlandı. Sıçanlar, 1 hafta boyunca alışmaları amaçlanan standart, spesifik patojen içermeyen bir ortamda barındırıldı. Daha sonra, tüm sıçanlara yalnızca anestezi uygulandı (kloral hidrat, 100 mg/kg, ip) veya sahte ovariektomi uygulandı (SHAM) veya iki yumurtalığın her ikisi de çıkarıldı ve daha sonra rastgele 5 alt gruba ayrıldı: ağızdan araç (%0,5 CMC-) ile tedavi edildi. Na) model grup (OVX), estradiol valerat (1 mg/kg/gün) pozitif grup (EV) ve 60, 120 ve 240 mg/kg/gün CDP düşük (CDPL) olarak belirlendi. sırasıyla orta (CDPM) ve yüksek (CDPH) dozaj grupları. Tüm sıçanlara günlük olarak oral yolla uygulandı ve tüm vücut ağırlıklarındaki değişime bağlı olarak her 2 haftada bir dozaj ayarlanarak 3 ay süreyle uygulandı. Hayvan deneyinin son gününde metabolik kafesler kullanılarak 24-saatlik idrar elde edildi; anestezi altındaki sıçanların femoral arterinden serum toplandı; sağ uyluk kemiği, kaval kemiği ve tüm organlar parçalara ayrıldı ve ileri analiz için -80 derece C'de saklandı. Yaptığımız hayvan deneyleri Ningxia Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.

2.5. Kemik Mineral Yoğunluğu Tayini ve Mikro-BT Analizi.

İlk olarak, her bir sıçanın sağ femurunun toplam kemik mineral yoğunluğunu tahmin etmek için çift enerjili bir X-ışını absorpsiyometri makinesi (Lunar, ABD) kullanıldı; ikinci olarak, aynı femur, bir mikro-CT tarayıcı aparatı (GE, Amerika) kullanılarak trabeküler kemik mikro mimarisinin 3 boyutlu görüntüsünü tahmin etmek için kullanıldı. İdeal bir 3D görüntü elde etmek için izotropik çözünürlük 14 μm olarak ayarlandı; ilgilenilen bölge (ROI), her numunenin uyluk kemiğinin büyüme plakasında aynı koordinatların ayarlanmasıyla seçildi; ve trabeküler ayrılma (Tb.Sp), trabeküler sayı (Tb.N), trabeküler kalınlık (Tb. Th), kemik mineral içeriği (BMC), doku mineral yoğunluğu (TMD) ve doku mineral içeriği (TMC) dahil olmak üzere kemik morfometrik parametreleri ) ROI analiz edilerek elde edildi.

2.6. Serum ve İdrar Biyokimyasal Analizi.

Serum katepsin K, TRAP, SOD ve GSH aktivitelerinin yanı sıra serum PTH, kalsitonin, ERR, MDA, BGP ve idrar DPD içerikleri üreticinin talimatlarına göre karşılık gelen reaktif kitleri kullanılarak belirlendi ve alkalin fosfataz (ALP) düzeyi ve serum ve idrar kalsiyum (Ca) ve fosfor (P) içerikleri, otomatik bir makine (Ciba-Corning 550 Diag nostics Corp., Oberlin, OH, ABD) kullanılarak tahmin edildi.

2.7. Western Blot Analizi.

Osteoklastlar, makrofaj koloni uyarıcı faktör (MCSF) ve RANKL ile eklenen RAW 264.7 hücreleri kullanılarak indüklendi. Kısaca, 1 x 107 RAW 264.7 hücresi, 30 ng/mL MCSF ve 25 ng/mL RANKL varlığında bir 6-kuyu plakasında kültürlendi. 6 günlük indüksiyondan sonra olgunlaşan osteoklast hücreleri, ilgili kit ile TRAP boyama yöntemi kullanılarak tanımlandı ve ardından CDP (0,1, 0,01 ve 0,001 mg/mL) ile işleme tabi tutuldu. sırasıyla) 24 saat boyunca; daha sonra hücreler, 0.5 mmol fenilmetilsülfonil florür, proteaz ve fosfataz inhibitörleri içeren bir lizis tamponu ile parçalandı. Lizat daha sonra %10 SDS-PAGE kullanılarak ayrıldı ve AKT1, NF-KB-p65, RANKL, PI3K p85, RANK, NFAT2, TRAF6, c-Fos ve -aktin ile problanan bir PVDF membranına aktarıldı ( 1:400) %5 yağsız süt ile 2 saat boyunca bloke edildikten sonra. Aynı membranlar sırasıyla soyuldu ve yukarıdaki karşılık gelen 9 antikorla tekrar incelendi, ardından sonunda Image Lab yazılımı tarafından tespit edildi. Deneyler üç kez tekrarlandı.

2.8. İstatistiksel analiz.

Ortalama ± SD olarak tanımlanan in vivo ve in vitro deneylerden elde edilen tüm veriler, tek yönlü ANOVA ve ardından Dunnett testi (SPSS 22.0 yazılımı, SPSS, ABD) kullanılarak analiz edildi; p < 0 05 istatistiksel olarak anlamlıydı.

Wecistanche Destek Hizmeti

E-posta:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Daha Fazla Özellik İçin Alışveriş Yapın Detaylar:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop