Diclinanona Calycina (Annonaceae) Kabuğundan Benzillenmiş Dihidroflavonlar ve İzokinolin Türevli Alkaloidler ve Sitotoksisiteleri

Daha fazla bilgi için, iletişimtina.xiang@wecistanche.com

Soyut: Diclinanona calycina RE Halk arasında "enviro" olarak bilinen patates kızartması, Annonaceae familyasının Brezilya'ya özgü bir türüdür. Annonaceae Amazon bitkilerinden biyoaktif bileşikler için devam eden araştırmamızda, D.calycina'nın kabuğu, D. calycina'da ve Diclinanona cinsinde ilk kez tanımlanan on üç bileşiği (alkaloidler ve flavonoidler) veren klasik kromatografi teknikleriyle araştırıldı. Bu izole edilmiş bileşiklerin yapısı, MS ile kombinasyon halinde 1D/2D-NMR spektroskopisi kullanılarak kapsamlı analiz ile oluşturulmuştur. İzole edilen alkaloidlerin alt sınıflara ait olduğu belirlendi: basit izokinolin, thali çevrimiçi (1); aporfin, anonain (2); oksoaporfin, liriodenin (3); benziltetrahidroizokinolinler, (S)-( artı )-retikülin(4); dehidro-oksonorretikülin (3,4-dihidro-7-hidroksi-6-metoksi-1-izokinolinil)(3-hidroksi-4-metoksifenil)-metanon)(5 );( artı )-1S,2R-retikülin Ng-oksit (6); ve ( artı )-1S,2S-retikülin N-oksit (7);tetrahidro protoberberin, koreksimin(8); ve pavine, bisnorargemonine (9). ikenflavonoidlerbenzilatlılara aitdihidroflavonlar, isorhamnetin (10), dichamanetin (11) ve uvarinol (12) ve izouvarinol(13) karışımı. Bileşik 5, literatürde ilk kez doğal bir ürün olarak tanımlanmıştır. Ana izole edilmiş bileşiklerin sitotoksik aktivitesi, kansere ve kanserli olmayan hücre hatlarına karşı değerlendirildi. Test edilen bileşikler arasında en umut verici sonuçlar, test edilenlere karşı orta düzeyde sitotoksik aktivite sergileyen benzillenmiş dihidroflavonlar dichamanetin (10) ve uvarinol (12) ve izouvarinol (13) karışımı için bulundu.kanser hücresiçizgiler(<20.0 ug·ml-)="" and="" low="" cytotoxicity="" against="" the="" non-cancerous="" cell="" line="" mrc-5(="">25.0 ug·mL-I). Dichamanetin (11) 15.78 ug·mL-I(33.70 umol·LI) ve 18.99 ug∶mL-（40.56 umol IC50 değerleriyle HL-60 ve HCT116'ya karşı sitotoksik aktivite gösterdi. L-）, sırasıyla, uvarinol（12） ve izouvarinol (13) karışımı, IC5 değeri 9.74 ugs.mL-1 olan HL-60'e ve IC50'li HCT116'ya karşı sitotoksik aktivite göstermiştir. 17.31 ug değeri. mL-I. Bu sitotoksik aktiviteler, bu moleküllerde bulunan bir veya daha fazla hidroksi benzil grubunun varlığına ve ayrıca bu grupların bağlı olduğu konuma atfedilebilir. Retikülin, anonain ve liriodeninin sitotoksik aktiviteleri, liriodenin en güçlü bileşik olmak üzere daha önce belirlenmiştir.

anahtar kelimeler: Diclinanona calycina; alkaloidler ve benzillenmiş dihidroflavonlar; sitotoksik aktivite

Ürünler hakkında daha fazla bilgi almak için tıklayın

1. Giriş

Annonaceae, yaklaşık 112 cins ve 2440 türden oluşan geniş bir tropikal ve subtropikal ağaç ve çalı ailesidir [1]. Yenilebilir meyveleri ve tıbbi özellikleri ile bilinen çeşitli türler ]2]. Bazı Annonaceae türleri ile yapılan önceki fitokimyasal araştırma, monoterpenler, diterpenler, triterpenler, lignanlar gibi farklı ikincil metabolit sınıflarının izolasyonuna ve karakterizasyonuna yol açmıştır.flavonoidler, asaron türevli fenilpropanoidler, asetogeninler ve esas olarak tipik izokinolin türevli alkaloidler [3-7]. Annonaceae türlerinden izole edilen bu sekonder metabolitlerin bazıları, anti-inflamatuar ve üreaz inhibe edici özellikler [8,9], tripanosidal [10,11], leishmanicidal [11,12], antimalaryal [4,13] gibi önemli biyolojik aktiviteler sergilemiştir. , antimikrobiyal [4,14,15], antioksidan ve antiromatizmal eylemler [9,15] ve özellikle farklı insan tümör hücre hatlarına karşı sitotoksik aktivite [4,6,11,16-21].

Annonaceae familyası ilkel ve üzerinde iyi çalışılmış bir familya olarak kabul edilse de, türleri ile az sayıda fitokimyasal ve/veya farmakolojik çalışma yapılmıştır[3]. Fitokimyasal ve/veya farmakolojik çalışmalar, büyük ekonomik önemlerinden dolayı esas olarak Annona, Asimina ve Cananga cinslerine ve Duguetia, Guatteria ve Xylopia cinslerinin bazı türlerine odaklanmıştır[5]. Fitokimyasal ve farmakolojik çalışmalarla ilgili olarak son 20 yılda büyük büyümeye rağmen, araştırılan türlerin sayısı, çok sayıda tanınan türlerle ilgili olarak hala çok azdır. Şu anda, Web of Science, Scopus ve SciFinder bilimsel veritabanlarına göre, açıklanan Annonaceae türlerinin yalnızca yaklaşık yüzde 15'i karşılık gelen herhangi bir fitokimyasal ve/veya farmakolojik çalışmaya sahiptir.

Az çalışılan türler arasında Diclinanona Diels cinsine ait olanlar vardır. Bu cins, Annonoideae alt familyasının Annoneae kabilesine aittir ve yalnızca tropikal Güney Amerika'da (esas olarak Amazon bölgesinde) bulunur. Sadece üç türden oluşan bir cinstir, Diclinanona calycina(Diels)RE Fries Diclinanona matogrossensis Maas ve Diclinanona tessmannii Diels, ağaç şeklinde [22-24].D.calycina (eş anlamlısı Xulopia calycina Diels) 8 ton Brezilya, Peru ve Venezuela'daki Amazon havzasında yaygın olarak "envireira" ve "enviro" olarak bilinen 30 m boyunda ağaç [23]. D.calycina, uzun ve dar yaprakları olan çiçekleri için yüzeysel olarak Xylopia'ya benzer, ancak odunsu, açılmamış, küresel ve kalın duvarlı monokarpları için farklıdır [23,24].

D. calycina ile yapılan önceki çalışmalar sadece farmakolojik çalışmaları rapor etmektedir. İlk çalışma, jel difüzyon yöntemi kullanılarak Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli, Streptococcus sanguis, Streptococcus oralis, Staphylococcus aureus ve Candida albicans mikroorganizmalarına karşı metanolik, kloroform ve sulu ekstraktların antimikrobiyal aktivitesinin araştırılmasını anlatmaktadır [25]. İkincisi, mikrodilüsyon broth testi (MDBA) ve disk difüzyon testi (DDA)[26] kullanılarak organik (diklorometan: metanol 1:1) ve sulu ekstraktların mikroorganizma Enterococcus faecalis'e karşı antimikrobiyal aktivitesinin araştırılmasını bildirir. Bu nedenle, Amazon yağmur ormanlarından Annonaceae'den yeni biyoaktif doğal ürünler için sürekli araştırmamızda, bu çalışma D.calycina kabuğunun fitokimyasal ve farmakolojik özelliklerini araştırmayı amaçladı. Bu raporda, on üç bileşik (dokuz alkaloit ve dört benzilatlıdihidroflavonlar) ilk kez D.calycina'da ve Diclinanona cinsinde izole edildi ve tanımlandı. Ayrıca ana bileşiklerin B16-F10, HepG2, K562 ve HL{{'ye karşı sitotoksisitesi araştırıldı. 4}} Alamar mavi tahlilini kullanan tümör hücre hatları.

2. Sonuçlar ve Tartışma

2.1.Bileşiklerin Yapısal Açıklaması

Dragendorff reaktifi kullanılarak metanolik ekstraktta azot içeren bileşiklerin varlığını keşfettikten sonra, Costa ve arkadaşlarının metodolojisine göre asit-baz işlemine tabi tutuldu. [12], alkaloidal ve nötr fraksiyonlara neden olur. Kromatografik analize tabi tutulan alkaloidal fraksiyonda yüksek konsantrasyonda nitrojen içeren bileşikler gözlendi. Ekstraksiyon ve İzolasyon bölümünde açıklandığı gibi ardışık kromatografik ayrımlar, on üç kimyasal bileşenin (1-13, Şekil 1), dokuz izokinolin türevi alkaloidin 1-9 ve dört benzilatlı dihidroflavonun izolasyonu ve tanımlanmasına yol açtı. 10-13. Bu izole edilmiş bileşiklerin yapıları (Şekil 1), MS (Ek Veriler) ile kombinasyon halinde 1D ve 2D NMR spektroskopisi kullanılarak kapsamlı analiz ve ayrıca literatürdeki verilerle karşılaştırma ile oluşturulmuştur.

Bileşik 5, kahverengi amorf bir toz halinde elde edildi ve Dragendorff reaktifi için pozitif olarak test edildi. LR-ESI(artı )MS'de m/z328 [M artı H]''de protonlanmış bir molekülü, moleküler formül C18H1NO5 ile uyumlu gösterdi. 5'in (Tablo 1) 'H ve 13C-NMR spektrumları, nitrojen bağlı metil grubunun (CH3-N) olmaması ve bc 192.8'de bir karbonil grubuna konjüge edilmiş imin grubunun tipik 13C-NMR spektrumunda δc 165.1'de bir sinyal ile değiştirilen konum 1'deki metin grubu. 'H-NMR spektrumunda,δH 6.88（1H,d, J=8.4 Hz, H-5'）,5H7.57（1H,d, J{{33}'de üç aşağı alan hidrojeni }.0Hz, H-2'）ve δH 7.60（1H, dd, J=8.4 ve 2.0 Hz, H-6'） , bir ABX bağlantı sisteminin varlığını ortaya çıkardı. 6H 6.90(1H,s, H-8) ve 6.71(1H, s, H-5)'de iki tekli sinyal 1,2,4,5-tetra ikameli fenil halkasının varlığını gösterdi. Ek olarak, 5'lik H-NMR spektrumu ayrıca bH 3.93 (3H, s) ve 6H 3.95 （3H,s）'de rezonans eden iki metoksi grubu için sinyaller ve δμ 2.79（2H,t'de rezonansa giren iki metilen grubu için sinyaller gösterdi. J=70,8 Hz） ve 6H 3,89(2H,t,/=7,8 Hz), sırasıyla H-4 ve H-3'e atfedilir(Tablo 1) . Bu veriler, alkaloid 5'in bir benziltetrahidroizokinolin iskeletine [28-30] sahip olduğunu gösterdi.

Bu gruplar, HMBC-NMR deneyinden alınan iki ve üç-bağlı 'H-13Korelasyon haritasına dayalı olarak kurulmuştur (Şekil 2 ve Tablo 1). Bu analiz, δH 3.89 （H-3）'deki hidrojenin, 6c130.1（4a） ve δc165'teki karbonlarla üç bantlı bir 'H-13C korelasyonu gösterdiğini ortaya koydu.{ {42}}（C-1）ve iki bağ lH-13C atδc 25.4(C-4) karbon ile korelasyonu, molekülde imin grubunun varlığını doğrular. Öte yandan, δH 7.57 （H-2'） ve δH 7.60（H-6'）'deki sinyaller, δc 124.3（'deki karbonlarla üç bağ lH-13C korelasyonu gösterdi. C-6'）,5c 151,4（C-4'）ve δc192.8（C-7）,and5c116.0（C-2'）,6c 151.4 (C-4')ve c 192.8(C-7'), sırasıyla moleküldeki karbonil grubunu oluşturur (Şekil 2 ve Tablo 1). Bu nedenle, bu NMR verilerine dayanarak, bileşik 5

benziltetrahidroizokinolin alkaloid 34-dihidro-7-hidroksi-6-metoksi-1-izokinolinil)(3-hidroksi-4-metoksifenil)-metanon olarak kurulmuştur. dehidro-oksonorretikülin olarak adlandırılır. Bu alkaloid, literatürde ilk kez doğal bir ürün olarak tanımlanmıştır. İlk ve tek kaydı Dörnyei ve ark. 1982'de 【31】 sentetik kökenli bir ürün olarak. Yalnızca'H-NMR verileri, bazı belirlenmemiş çokluklarla açıklanmaktadır. Bu nedenle, tüm 1H- ve 13C-NMR kimyasal kaymaları için tam atamalar, bir-bağ(HSOC) ve iki ve üç-bağ (HMBC)'H-13C-NMR korelasyon deneyleri ile belirlendi ve şurada tarif edildi: Tablo 1.

Bileşikler 6 ve 7, sırasıyla benziltetrahidroizokinolin alkaloidleri (artı )-1S,2R-retikülin-N-oksit ve( artı )-1S,2S-retikülin-N-oksit olarak tanımlandı. Bu alkaloitlerin H-NMR verileri, Lee ve diğerleri tarafından açıklanan verilerle karşılaştırıldı. [28]aynı döteryumlu solventi (CD3OD) kullanarak ve bazı tutarsızlıklar gözlemlendi (Tablo 1), özellikle H-1, H-8 ve H, C-NO ile ilgili. Literatürde bu alkaloidler için tarif edilen 13C-NMR verisi bulunmamaktadır. Sınırlı 1H- ve 13C-NMR verilerinin yanı sıra bu moleküller için gözlemlenen belirsizliklere dayanarak, doğru atamalarını ve çokluklarını belirlemek için 'H ve 13C 1D ve 2D NMR deneyleri yapıldı.

Her iki izomer 6 ve 7'nin hidrojen H{{0} ve H-1'sinin doğru konumu, HMBC'den alınan üç bağ 'H-13C korelasyon haritasına dayalı olarak belirlendi. -NMR deneyi （Şekil2）. İzomer 6 için analiz, δH 5.78（H-8）'deki hidrojenin, 6c 79.8（C-1）,δc120'deki karbonlarla üç bağ 'H-13C korelasyonu gösterdiğini ortaya çıkardı. .6（4a） ve δc 149.4 （C-6） iken, δH 4,13 （H-1）'deki hidrojen, karbonlarla üç bağ 'H-13C korelasyonu gösterdi. c 60.7（C-3）,6c 115.7 （C-8）,δc 120.6（C-4a） ve 131.2 （C-1'）'de, böylece izomer 6 için H-8 ve H-1 hidrojenlerinin doğru konumları. Bu ilişki, üç bağ gösteren δH 6.76（H-5） hidrojen analiziyle daha da doğrulanabilir. H-13C, 27.0（C-4）,δc 127.1（C-8a） ve δc 145.7 （C-7）（Şekil2） karbonlarıyla H-13C korelasyonu. İzomer7 için analiz, δH 6.30 （H-8）'deki hidrojenin, δc 79.4（C-1）,δc 122.8（'de karbonlarla üç bağ 'H-13Korelasyon gösterdiğini ortaya çıkardı. 4a） ve δc 148.9 （C-6） iken, δH 4.46 （H-1）'deki hidrojen, δc 62.9 （C'deki karbonlarla üç bağ H-13C korelasyonu gösterdi{ {82}}）,5c 115.5（C-8）, bc 122.8（C-4a） ve 131.4（C-1'）, böylece H hidrojenlerinin doğru konumlarını belirler. İzomer 7 için -8 ve H-1. Bu ilişki, δH 6.71 （H-5）'de üç bağ lH-13C gösteren hidrojenin analiziyle de doğrulandı. δc26.3（C-4）, δc 126.9（C-8a） ve6c 146.1（C-7）'deki karbonlarla korelasyonlar(Şekil 2). NOESY deneyi de doğru stereokimya ofisomerleri6 ve 7'yi oluşturmak için gerçekleştirilmiştir. Bu deneyde, H-1（δH 4.13）ve H, CN(5 3.15)'in güçlü NOE korelasyonu şunu göstermiştir. - izomer 6'daki oksijenin oryantasyonu Öte yandan, 7 için 2D-NOESY deneyinde H-1(6H 4.46) ve HAC-N(5H 3.20) arasında belirgin bir NOE korelasyonu bulunamadı, izomer 7'deki oksijenin yönelimini gösterir(Şekil 2). Bu izomerlerin kimyasal kaymalarındaki bu küçük farklılıklar, oksijenin konumlarından ve konumlarından etkilenen nitrojenin stereokimyası nedeniyle açıkça gözlenir. Bileşik 6 ve 7 için elde edilen H- ve 13C-NMR verilerinin heksapetalin A ve heksapetalin B [30] gibi yakın yapılara sahip moleküllerin verileriyle karşılaştırılması, Tablo 1'de açıklanan verileri belirsizlik olmadan destekler.

1-4 ve 8-13 bileşikleri, talifolin (1) [32], anonain (2) [33]liriodenin (3)[10,34], (S)-( artı )-retikülin ( 4)[27], koreksimin (8) [34,35], bisnorargemonin (9)[36], izokamanetin (10) [37], dichamanetin (11) [37] ve bir uvarinol (12) ve izouvarinol karışımı (13) [37], spektroskopik profillerine ve literatürdeki değerlerle karşılaştırmasına dayanmaktadır. lH- ve 13C 1D ve 2D-NMR spektrumları ve ayrıca tüm izole edilmiş bileşiklerin kütle spektrumları, Ek Malzemeler olarak mevcuttur.

Kemofenetik (bitki kemosistematiği/bitki kemotaksonomisi için yeni bir terim) bakış açısından, C-benzile flavanonların ve C-benzile dihidrokalkonların varlığının, iyi bilinen flavanon pinocembrin'den türetilen özel bir flavonoid türü olduğuna dikkat etmek önemlidir. ve özellikle Annonaceae familyasına [3,38-42] ait Uoaria cinsinin türlerinde tanımlanmıştır. D. calycina'da bu bileşiklerin varlığı, Uoaria ile yakın kemofenetik ilişkiler olduğunu düşündürür. Öte yandan, bu kemofenetik ilişkiyi doğrulamak için bitkinin diğer kısımları ve diğer Diclinanona türleri ile daha fazla araştırma yapılmalıdır. Flavanonlar ve kalkonlar yüksek bitkilerde yaygındır, ancak benzil gruplarının eklenmesi oldukça nadirdir ve Annonaceae'de Uoaria [3,39-42]ve şimdi Diclinanona cinsiyle sınırlı görünmektedir. Benzil grupları muhtemelen bir C6-C1 yolundan ortaya çıkar, ancak o-hidroksi işlevselliği olağandışıdır. Uoaria ve Diclinanona'nın tüm bu flavonoidlerinde B halkasında sübstitüentlerin bulunmaması, Popowia cauliflora'nın flavonoidleri ile ilgili önceki gözlemle ilişkilendirilebilir [38].

Bu çalışmada izole edilen ve açıklanan izokinolin türevli alkaloidler, farklı cinslerde Annonaceae'nin çeşitli türlerinde zaten kayıtlıdır. Liriodenin ve anonain gibi bunlardan bazıları kemofenetik belirteçler olarak kabul edilir ve bu alkaloidlerin D.calycina'da bulunması, bu kemofenetik belirteçlerin Annonaceae familyasındaki ilişkisini daha da güçlendirir [5-7,15,20,27, 33-35,43].

Zidorn'a [44] göre, kemofenetik çalışmaların, daha önce yayınlanmış birçok çalışmada [5-7,15,20 gözlemlendiği gibi, belirli bir taksondaki özelleşmiş ikincil metabolit dizisini tanımlamayı amaçlayan çalışmalar olarak tanımlandığını belirtmekte fayda var. ,27,33-35,43-46]. Bu nedenle, kemofenetik çalışmalar, "doğal" sistemlerin kurulması için büyük öneme sahip olduğu kabul edilen ve günümüzde son derece önemli olmaya devam eden anatomik, morfolojik ve karyolojik yaklaşımlara benzer şekilde taksonların fenetik tanımına katkıda bulunur. modern moleküler yöntemlerin yardımıyla sınıflandırılmış organizmaların tanımı [44].

2.2. Sitotoksik Test

Bileşik 2, 3,5 ve 8 (düşük verimlerinden dolayı) hariç, izole edilmiş bileşiklerin (Tablo 2) in vitro sitotoksik aktivitesi, karşı değerlendirildi.kanser hücresiHL-60 (insan promyelositik lösemi), MCF-7(insan meme adenokarsinomu), HepG2(insan hepatoselüler karsinomu), HCT116(insan kolon karsinomu) ve kanserli olmayan hücre dizisi MRC{{5} }(insan akciğer fibroblastı) 72 saatlik inkübasyondan sonra Alamar mavi testi kullanılarak.

Among the compounds evaluated (Table2), the most promising results were verified for benzylated dihydroflavones dichamanetin (10), and the mixture of uvarinol (12)and isouvarinol (13), which showed moderate cytotoxic activity against the tested cancer cell lines and low cytotoxicity against the non-cancerous cell line MRC-5(>25.0 ug.mL-1). Dichamanetin (11) 15.78 ug·mL-1（33.70 μmol·L-1） IC50 değerleriyle HL-60 ve HCT116'ya karşı sitotoksik aktivite gösterdi. ve sırasıyla 18.99 ug·mL-1（40.56 umol.L-1）. Uvarinol (12) ve izouvarinol(13) karışımı, ICs0 değeri 9.74ug∶mL-1 olan HL-60 ve ICs0 değeri 17.31 ug∶mL{ olan HCT116'ya karşı sitotoksik aktivite göstermiştir{ {30}}. Benzillenmiş dihidroflavonlar arasında sadece izorhamnetin (10), 19.79 ugs:mL-1(54.65 umol.L-1) IC50 değeri ile HepG2'ye karşı sitotoksik aktivite gösterdi. Literatüre göre, benzillenmiş dihidroflavonlar sitotoksik özellikler [39-42] ile tanımlanmaktadır. Bu çalışmada açıklananlar arasında, isorhamnetin (10), dichamanetin (11) ve uvarinol (12), nazofarenks (KB) ve P-388 lenfositik löseminin insan tümör hücre dizilerine karşı in vitro sitotoksik özellikler tarif edilmektedir. (PS) IC50 değerleri sırasıyla 5.3 ve 4.1,4.8 ve 1.8 ve 5.9 ve 9.7, ug.mL-1 ile [39,40]. Bu farklı aktiviteler, moleküllerde bulunan bir veya daha fazla hidroksi benzil grubunun varlığına ve bu grupların bağlı olduğu konuma atfedilebilir. Ancak, bu gözlemi doğrulamak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.

İzokinolin türevli alkaloidler olan anonain (2), liri-adenin (3) ve (S)-( artı )-retikülinin (4) in vitro sitotoksik aktivitesi Menezes ve arkadaşları tarafından yakın zamanda tanımlanmıştır.[2{{16] }}], Souza ve ark. [6] ve Costa ve ark. [43] kanser hücre hatlarına karşı güçlü sitotoksik aktivite sergileyen liriodenine vurgu yaparak B{{10}}F10(fare melanomu), HepG2(insan hepatoselüler karsinomu), HL{{13 }} (insan promyelositik lösemi) ve K562(insan kronik miyelositik lösemi） ile IC5s0 değerleri 10.0 μmol.L-1【43】'ün altında.Anonain B16-F10, HepG2, HL60'a karşı orta düzeyde aktivite gösterdi , ve IC50 değerleri 19.0 umol.L-1[20]'den düşük olan K562.(S)-( artı )-Reticuline, 15.35 umol L-1 IC50 değerleri ile sadece HepG2'ye karşı orta düzeyde aktivite gösterdi. 6,20】.

3. Malzemeler ve Yöntemler

3.1. Genel Deneysel Prosedürler

Metanol (MeOH) içindeki optik rotasyonlar, 589 nm'de bir P{{0}} polarimetre (Jasco, Tokyo, Japonya) ile kaydedildi. 1D ve 2D NMR deneyleri CDCl'de elde edildi. (kloroform-d) veya CDCl artı 11,75 T'de çalışan bir AVANCE I HD NMR spektrometresinde (Bruker, Billerica, MA, ABD) 298 K'de CD, OD (metanol-du ve CD, COCD3(aseton-d6) damlası (El 13C, sırasıyla 500 ve 125 MHz'de) ve 14,1 T'de çalışan bir Bruker AVANCE I 600 NMR spektrometresinde('H ve13Cat 60{) Sırasıyla {63}} ve 150 MHz). Tüm lH- ve 13C-NMR kimyasal kaymaları （δ）, dahili referans olarak 0.00 ppm'deki tetrametilsilan sinyaline göre ppm olarak sunulur ve birleştirme sabitleri(D) Hz cinsinden verilmiştir NMR spektrometresi bir z-gradyanlı 5-mm çok çekirdekli ters algılama probu(1D ve 2D NMR deneyleri) ile donatılmıştır.Tek bağ(HSQC) ve iki ve üç bağ (HMBC)1H-13C-NMR korelasyon deneyleri, ortalama birleştirme sabiti' JcH ve LRJ(sırasıyla 140 ve 8 Hz'lik cH) için optimize edildi.Düşük çözünürlüklü kütle spektrometrisi (LC-MS) analizi için izole edilmiş bileşiklerin örnekleri metanol (HPLC dereceli) içinde yeniden süspanse edildi ve stoc oluşturuldu. k çözelti(1 mg·mL-1). Stok çözeltilerin alikuotları (5 uL) ayrıca 5 ug.mL'ye seyreltildi ve elektrosprey iyonizasyon ile donatılmış TSO Quantum Access modeli (Thermo Scientific, San Jose, CA, ABD) üçlü dört kutuplu kütle spektrometresine doğrudan infüzyonla analiz edildi. (ESI) veya atmosferik basınçlı kimyasal iyonizasyon (APCI) kaynakları. ESI-MS koşulları: püskürtme gerilimi, 5kV; kılıf gazı, 10 isteğe bağlı birim(arb); yardımcı gaz, 5arb;süpürme gazı,0arb;kılcal sıcaklık, 250 derece; kapiler voltaj,40 V;tüp lensi, 70 V;kütle aralığı, m/z 100 ila 1000.APCI-MS koşulları: deşarj akımı,5 μA; buharlaştırıcı sıcaklığı, 350 derece; kılıf gazı basıncı,25 isteğe bağlı birim （arb）; iyon süpürme gazı basıncı,0.0 arb; yardımcı gaz basıncı, 10 arb; kılcal sıcaklık, 250 derece C; tüp lens ofseti, 70 V; skimmer ofset, 0 V; kütle aralığı,m/z 100 ila 1000. Çarpışma gazı olarak argon kullanıldı ve MS/MS spektrumları, 25 ila 30 eV arasında değişen çarpışma enerjileri kullanılarak elde edildi. Kolon kromatografisi (CC) için silika jel60 (Sigma-Aldrich, San Luis, MO, ABD, 70-230 ağ) kullanıldı, silika jel 60 F254 (Macherey-Nagel, Düren, Almanya, 0,25 mm, alüminyum) ince laver kromatografisi(PTLC)(Macherey-Nagel, 1.00 mm, cam) ile analitik ve hazırlayıcı olarak kullanılmıştır. Bileşikler, UV254/365 ışığı altında maruz bırakılarak, p-anisaldehit reaktifi püskürtülerek ve ardından sıcak bir plaka üzerinde ısıtılarak ve Dragendorff reaktifi püskürtülerek görselleştirildi.

3.2.Bitki Materyali

Mevcut araştırmada, D.calycina'nın botanik materyali (kabuğu) 27 Mayıs 2017'de Adolpho Ducke Rezervi'nde toplanmıştır (coğrafi koordinatlar: 02 derece 53'36.1S ve 59 derece 58'28.9"W), Manaus, Amazonas Eyaleti , Brezilya ve Universidade Federal do Amazonas (DB/UFAM) Biyoloji Bölümü bitki taksonomisti Prof. erişim (numune) Sistema Nacional de Gestao do Patrimonio Genetico e do Conhecimento Tradicional Associado'da (SISGEN) A70EDCD kaydı ile tescil edilmiştir.

3.3. Ekstraksiyon ve İzolasyon

D.calycina'nın kabuğu ilk olarak oda sıcaklığında 24 saat kurutuldu ve daha sonra hava sirkülasyonlu bir fırında 48 saat 40 derece sıcaklıkta kurutuldu ve ardından dört bıçaklı bir öğütücüde (Marconi, Piracicaba, SP) toz haline getirildi. , Brezilya) toz haline getirilmiş malzemeyi elde etmek için (1340 g). Daha sonra, heksan (8x4 L) ve ardından MeOH (8x4 L) ile kapsamlı bir maserasyon gerçekleştirildi. Elde edilen özütleme çözeltileri, sırasıyla heksan (24.85 g) ve MeOH (199.43 g) özlerini verecek şekilde indirgenmiş basınçta (40-50 derece) döner bir buharlaştırıcıda konsantre edildi.

Dragendorff reaktifi ile ortaya çıkan TLC analizi, MeOH özünde yüksek oranda alkaloid varlığına işaret etti. Bu nedenle, bir MeOH özütü (188.30 g) alikotu, alkaloidal (5.46 g) ve nötr (4.47 g) fraksiyonlar vermek üzere başlangıçta bir asit-baz ekstraksiyonuna tabi tutuldu. Daha sonra, alkaloidal fraksiyonun bir kısmı (5.0g), daha önce yüzde 10'luk bir NaHC03 çözeltisi [12] ile muamele edilmiş, heksan (yüzde 100), heksan-CHCl, (90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 ve 10:90,v/o), CH2Cl2 (yüzde 100), CH2Cl 2-EtOAc(90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 ve 10:90,0/u), EtOAc (yüzde 100), EtOAc-MeOH(95:05, 90:10,85:05, 80:10,75:25, 70:30,60:40, 50:50,40:60, 30:70,20 :80 ve 10:90, v/o) ve son olarak 250 fraksiyon (her biri 30 mL) veren MeOH. 95:05, 90:10 oranlarında bir CH2Cl2-MeOH karışımı kullanılarak TL Değerlendirmesinden sonra, 85:15 ve 80:20 eluent sistemi (v/o) olarak, benzer numuneler toplanarak 16 fraksiyon elde edildi (F1 ila F16).

Heksan-CH,Cl2 (50:50 ila 10:90,v/o) ile ayrıştırılan ilk CC'den Fraksiyon F5 (181.2 mg), heksan (yüzde 100), heksan ile yıkanmış yukarıdaki aynı metodoloji kullanılarak yeni bir silika jel CC'ye tabi tutuldu. -CH,Cl2 (90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 ve 10:90,v/o), CH,Cl ,(yüzde 100 ), CHCl2-EtOAc(90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 ve 10:90 ,o/),EtOAc(yüzde 100), EtOAc-MeOH(85:15,70:30,50:50, 30:70 ve 15:85, /o) ve MeOH (yüzde 100), 118 fraksiyon (yüzde 100) verir. 95:05 ve 90:10 oranlarında bir CH2Cl2-MeOH karışımı kullanılarak TLC analizi değerlendirmesine göre 12 alt fraksiyonda (F5.1 ila F5.12) havuzlandı. Alt fraksiyon F5 .1 (28.9 mg) heksanla (yüzde 100) ayrıştırılmış bir hazırlayıcı TL'ye tabi tutuldu CH2Cl-MeOH (95:05, v/v, iki yıkama) ile 2(1.4 mg) ve 3 (1.7 mg) elde edildi, sırasıyla. Alt fraksiyonlar F5.4 (21,5 mg) heksan-CH,C(80:20,ha) ile ayrıştırıldı, F5.5 (16,7 mg)heksan-CH,Cl(80:20.70:30.60;40. ve 50:50) ile ayrıştırıldı ,v/) ve heksan-CHCl2 (50:50,40:60 ve 30:70, v/o) ile ayrıştırılan F5.6(15.4 mg) havuzlandı (53.6 mg) ve ayrıca elute edilmiş hazırlayıcı bir TLC'ye tabi tutuldu. CH,Cl-MeOH (95:05, v/u, iki elüsyon) ile 3 (8.9 mg) elde edildi.

Heksan-CHCl(10:90,v/)), CH2Cl, (100 ile ayrıştırılmış ilk CC'den Fraksiyon F6(2099,1 mg) yüzde ) ve CH,Cl2-EtOAc (90:10 ila 10:90, o/o), yukarıdaki aynı metodoloji kullanılarak 140 fraksiyon (30 her biri mL). Eluent sistemi (o/o) olarak 95:05, 90:10 ve 85:15 oranlarında bir CH2Cl2-MeOH karışımı kullanılarak yapılan TLCdeğerlendirmesinden sonra, benzer numuneler 13 alt fraksiyon (F6) verecek şekilde havuzlandı. .1 ila F6.13). Alt fraksiyon F6.6 (1541.3 mg), TLC ile analiz edilen (yukarıdaki aynı metodoloji kullanılarak) 120 fraksiyon (her biri 30 mL) veren aynı solvent sistemleri ile ayrıştırılan yukarıdaki aynı metodoloji kullanılarak yeni bir silika jel CC'ye tabi tutuldu. alt fraksiyonlar (F6.6.1 - F6.6.12). Heksan-CH2Cl(60:40 ve 50:50,v/v) ile ayrıştırılan F6.6.2(17.0 mg) alt fraksiyonu, hazırlayıcı bir TLC2CI2-MeOH(90:10, v/o, bir elüsyon) 3 (1.4 mg) ile sonuçlanır. Alt fraksiyon F6.6.3(643.3 mg), heksan-CH2Cl2(50:50, 40:60, 30:70, 20:80 ve 10:90) ile elüe edildi, o/v), CH2Cl2 (yüzde 100) ve CH2Cl2-EtOAc(90:10 ve 80:20,o/o), CH2Cl2-MeOH (90 :10, vfo, bir elüsyon) EtOAc-MeOH(90:10, v/o, bir elüsyon) ile 4(148.2) veren yeni bir hazırlayıcı TLC'ye tabi tutulan yeni bir F6.6.3.1(161.8 mg) alt fraksiyonu verdi. mg). CH2Cl2-EtOAc (70:30 ve 60:40,o/o) ile ayrıştırılan F6.6.4 (90.2 mg) alt fraksiyonu, CH2Cl-MeOH (90:10, v/o, bir elüsyon) sırasıyla 1(1.4 mg) ve 4 (50.1 mg) verdi. CH,Cl-EtOAc(60:40 ve 50:50, o/o) ile elüte edilen F6.6.5 (83.4 mg) alt fraksiyonu ayrıca CH,Cl2-MeOH(90:10, ufo, bir elüsyon) tekrar sırasıyla 1(1.5 mg) ve 4(45.5 mg) verdi. CH,Cl2-EtOAc (50:50 ve 40:60, v/) ile elüte edilmiş F6.6.6 (101.4 mg) alt fraksiyonu CH,Cl-MeOH (90: 10, vfo, bir elüsyon) 8(3.4 mg) ve diğer alt fraksiyon F6.6.6.1'i (48.8 mg) verir. Bu alt fraksiyon (F6.6.6.1) bir hazırlayıcıya tabi tutulmuştur. :15, vo, bir elüsyon) ve arkada CHCl-MeOH(90:10,v/v,bir elüsyon) ile sonuçlanarak yine 4(37.4 mg) elde edilir. Bu prosedür için, kromatografik plaka başlangıçta hareketli faz EtOAc-MeOH (85:15, v/o, bir elüsyon) ile ayrıştırıldı. Bu elüsyondan sonra, kromatografik plaka, çözücüyü yeniden hareket ettirmek için kurutuldu ve ardından, 4.Alt Fraksiyon F6.6.7 ( CH,Cl2-EtOAc(40:60,30:70,20:80 ve 10:90,vfo) ile ayrıştırılan 109,0 mg) CH,Cl2-MeOH ile ayrıştırılan hazırlayıcı bir TLC'ye tabi tutuldu (90:10,vo, bir elüsyon) başlangıçta EtOAc-MeOH (85:15, v/o, bir elüsyon) ve daha sonra elüte edilen yeni bir hazırlayıcı TLC'ye tabi tutulan başka bir F6.6.7.1 (24.8 mg) alt fraksiyonu vererek CH2Cl2-MeOH (90:10,vfo,bir elüsyon)sonuç olarak 9 (11.1 mg). 9 için kullanılan izolasyon prosedürü, daha önce 4 için tarif edilenle aynıydı. EtOAc-MeOH(60:40 ve 50:50, v/o) ile elüte edilen F6.6.10(92.0 mg) Alt Fraksiyonu, CH ile Celute edilmiş bir hazırlayıcı TL'ye tabi tutuldu, Sırasıyla 5(1.7 mg) ve 6(7.8 mg) veren Cl,-MeOH (90:10, v/o, bir elüsyon). EtOAc-MeOH(50:50,40:60,30:70,20:80 ve 10:90,v/o) ile ayrıştırılan F6.6.11 (326.0 mg) alt fraksiyonu bir hazırlayıcıya tabi tutuldu. MeOH (90:10, v/o, bir elüsyon) sırasıyla 1(2.4 mg) ve7 (12.5 mg) içermektedir.

EtOAc(yüzde 100) ve CHCl2-EtOAc (95:05,90:10,85:15 ve 75:25,ofo) ile ayrıştırılan ilk CC'den Fraksiyon F7 (692.4 mg), yeni bir silika jele tabi tutuldu. 110 fraksiyon (her biri 30 mL) veren aynı solvent sistemleri ile ilk CC için tarif edilenle aynı metodolojiyi kullanarak. TL Değerlendirmesinden sonra 95:05, 90:10 ve 85 oranlarında CH2Cl2-MeOH karışımı kullanılarak :15 eluent sistemi (o/o) olarak, benzer numuneler 12 alt fraksiyon (F7.1 ila F7.12) verecek şekilde bir araya getirildi. EtOAc (yüzde 50:50,40:60 ve 30:70,v/o), CHCl-MeOH(95:05, vfo, bir elüsyon) ile elüte edilen hazırlayıcı bir TLC'ye tabi tutuldu ve 10(5.4 mg) ve 11(5,4 mg) verdi. 120,6 mg), sırasıyla. CHCl{53}}EtOAc (30:70, 20:80 ve 10:90, yüzde v/o) ile ayrıştırılan F7.9(144,2 mg) ayrıca CH,Cl,-MeOH( 95:05,vo, bir elüsyon) sırasıyla 11 (91.2 mg) ve 12 ve 13'ün (39.4 mg) bir karışımını verdi.

Thalifolin (1): Kahverengi amorf toz;' H-NMR ve 13C-NMR literatüre göre [32]; LR-ESI( artı )-MS [M artı H]* artı m/z 208.

Anonain (2): Kahverengi amorf toz; 1H-NMR ve 13C-NMR literatüre göre [33]; LR-ESI( artı )-MS [M artı H] artı m/z 266.

Liriodenin (3): Sarı kristaller (CH,Cl-MeOH 3:1);1H-NMR ve 13C-NMR literatüre göre [10,34]; LR-ESI( artı )-MS [M artı H] artı m/z 276.

(S)-( artı )-Retikülin(4): Kahverengi amorf toz; [ ]p25 artı 71,60(c 0.05 g/100 mL, MeOH); 1H-NMR ve 13C-NMR, literatüre göre [27;LR-ESI(artı)-MS [M artı H] artı m/z 30.

3,4-Dihidro-7-hidroksi-6-metoksi-1-izokinolinil)(3-hidroksi-4-metoksifenil)-metanon (Dehidro-oksonorretikülin)(5 ): Kahverengi amorf toz; 'H ve 13C-NMR verileri, bakınız Tablo 1; LR-ESI( artı )-MS [M artı H] artı m/z 328.

( artı ){{0}}S,2R-Retikülin N-oksit(6): Kahverengi amorf toz; [lp25 artı 136.4 (c0.146g/100 mL, MeOH); 1 El 13C-NMR verileri, bkz. Tablo 1; LR-APCI( artı )-MS [M artı H] artı m/2346

( artı ){{0}}S,2S-Reticuline N.-oksit (7): Kahverengi amorf toz; [ ]p25 artı 394.5 (c 0.03 g/100 mL, MeOH);'H ve 13C-NMR verileri, bakınız Tablo 1;LR-APCI(artı)-MS [M artı H] artı m/z346.

Coreximine (8): Açık sarı amorf toz;[ ]p25 artı 201.1(c 0.08g/100mL, MeOH)'H-NMR ve 13C-NMR literatüre göre[34,35];LR- ESI( artı )-MS [M artı H] artı m/z 328.

Bisnorargemonine (9): Kahverengi amorf toz; 1H-NMR ve 13C-NMR literatüre göre [36]; LR-APCI( artı )-MS [M artı H] artı m/z 328.

İzokamanetin (10):Açık sarı amorf toz; [p25-12.4(c 0.5 g/100 mL, MeOH)'H-NMR ve 13C-NMR literatüre[37;LR-APCI(-)-MS [MH]-m/z361.

Dichamanetin (11):Sarı şekilsiz toz;[ ]D25-10.7(c 0.5g/100 mL, MeOH);1H-NMR ve 13C-NMR literatüre göre [37]; LR-ESI(-)-MS [MH]-m/z467.

Bir uvarinol(12)ve izouvarinol(13) karışımı: Sarı amorf toz; H-NMR ve 13C-NMR literatüre göre [37]; LR-ESI(-)-MS [MH]-m/z 573.

3.4.In Vitro Sitotoksik Test

3.4.1.Hücreler

HL-60 (insan promyelositik lösemi), MCF-7 (insan meme adenokarsinomu), HepG2 (insan hepatoselüler karsinomu), HCT116(insan kolon kanseri) ve MRC-5 (insan akciğer fibroblastı) hücre hatları, American Type Culture Collection'dan (ATCC, Manassas, VA, ABD) elde edildi ve ATCC hayvan hücre kültürü kılavuzu tarafından tavsiye edildiği gibi kültürlendi. Tüm hücre hatları, kontaminasyon içermeyen hücrelerin kullanımını doğrulamak için bir mikoplazma boyama kiti (Sigma-Aldrich) kullanılarak mikoplazma için test edildi.

3.4.2. Sitotoksisite Testi

Sitotoksisite tahlili için, hücre canlılığı, daha önce tarif edildiği gibi [{{0}}] Alamar mavi yöntemiyle ölçülmüştür. Tüm deneyler için hücreler, 96-kuyulu plakalara kaplandı. Kimyasal bileşenler dimetil sülfoksit (DMSO, Vetec Ouimica Fina Ltda., Duque de Caxias, RJ, Brezilya) içinde çözüldü ve her bir oyuğa ilave edildi ve 72 saat inkübe edildi. Doksorubisin (doksorubisin hidroklorür, saflık yüzde 95'ten büyük veya eşit, IMA SAIC Laboratuvarı, Buenos Aires, Arjantin） pozitif kontrol olarak kullanıldı. Tedavinin sonunda, 20 μL'lik bir stok solüsyonu (0.312 mg/mL) resazurin (Sigma-Aldrich Co.) her kuyuya eklendi 570 nm ve 600 nm'de absorbanslar bir SpectraMax190 Mikroplaka Okuyucu (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, ABD) kullanılarak ölçüldü.Yarı-inhibitör konsantrasyonu (IC50) lineer olmayan regresyon ile elde edildi. GraphPad Prism (Intuitive Software for Science; San Diego, CA, ABD) yazılımını kullanarak yüzde 95 güven aralığıyla (yüzde CI95).

4. Sonuçlar

D.calycina'nın kabuğunun fitokimyasal incelemesi, on üç bileşiğin (1-13); dokuz izokinolin türevi alkaloid (1-9) ve dörtflavonoidler(10-13). Alkaloidler aşağıdaki alt sınıflara aittir: basit izokinolin, çevrimiçi thali(1);aporfin, anonain (2); oksoaporfin, liriodenin (3); benzil-tetrahidroizokinolinler, (artı )-retikülin(4), de hidro-oksonorretikülin(3,4-dihidro-7-hidroksi-6-metoksi-1-izokinolinil)({{13} }hidroksi-4-metoksifenil)-metanon)(5), 1S,2R-retikülin Ng-oksit(6) ve 1S,2S-retikülin N.-oksit (7); tetrahidro protoberberin, koreksimin (8); ve pavine, bisnorargemonin(9). Flavonoidler benzillenmiş dihidroflavonlara aitken, isorhamnetin (10), dichamanetin (11) ve uvarinol (12) ve izouvarinol(13) karışımı. İzole edilen bileşikler, ilk kez D.calycina'da ve ayrıca Diclinanona cinsinde tarif edilmiştir.

İzole edilen bileşiklerin sitotoksik aktivitesi (anonain, liriodenin, 1,2-dihidro-oksonorretikülin ve koreksimin hariç) kansere (HL-60, MCF-7, HepG2 ve HCT116) ve kanserli olmayan(MRC-5)hücre hatları. Bunlar arasında en umut verici sonuçlar benzillenmiş dihidroflavonlar dichamanetin (10) için gözlendi ve

test edilen kanser hücre hatlarına karşı orta düzeyde sitotoksik aktivite gösteren uvarinol(12) ve izouvarinol (13) karışımı （<20.0μg.ml-1）and low="" cytotoxicity="" against="" the="" non-cancerous="" cell="" line="" mrc-5(="">25.0 ug·mL-'). Dichamanetin (11) 15.78ug·mL-1 （33.70 μmol-L-1） ve 18.99 ug·mL-I（40.56 μmol IC50 değerleriyle HL-60 ve HCT116'ya karşı sitotoksik aktivite gösterdi. .L-1）, sırasıyla uvarinol （12） ve izouvarinol (13) karışımı, IC50 değeri 9.74 ug∶mL-I ile HL-60'ye ve IC50 ile HCT116'ya karşı sitotoksik aktivite gösterdi. 17,31 ug·mL-1 değeri. Tümör hücre hatları üzerindeki bu sonuçlar, benzillenmiş dihidroflavonlar için de ilk kez açıklanmıştır. Retikülin, anonain ve liriodeninin sitotoksik aktiviteleri, liriodeninin en güçlü bileşik olduğu önceden belirlenmişti.

Bu çalışmada elde edilen sonuçlar, Annonaceae familyasının türlerinin sitotoksik özelliklere sahip biyolojik olarak aktif bileşiklerin umut verici bir kaynağı olduğunu ve araştırmalarının diğer biyolojik tahlil modellerinde devam etmesini önermektedir.

Referanslar

1. Couvreur, TLP; Piri, MD; Chatrou, LW; Saunders, RMK; Su, YCF; Richardson, JE; Erkens, RHJ Çiçekli bitki ailesi Annonaceae'nin erken evrimsel tarihi: Sürekli çeşitlendirme ve boreotropik jeo-dağılım. J. Biogeogr. 2011, 38, 664-680. [Çapraz Referans]

2. Corrêa, MP Dicionário das Plantas Úteis do Brasil e das Exóticas Cultivadas; IBDF Ministério da Agricultura: Rio de Janeiro, Brezilya, 1984.

3. Leboeuf, M.; Mağara, A.; Bhaumik, PK; Mukherjee, B.; Mukherjee, R. Annonaceae'nin fitokimyası. Fitokimya 1982, 21, 2783-2813. [Çapraz Referans]

4. Rupprecht, JK; Hui, Y.-H.; McLaughlin, JL Annonaceous asetogeninler: Bir inceleme. J. Nat. Ürün 1990, 53, 237-278. [Çapraz Referans]

5. Lucio, ASSC; Almeida, JRGDS; Da-Cunha, EVL; Tavares, JF; Filho, Annonaceae'nin JMB Alkaloidleri: Oluşumu ve biyolojik aktivitelerinin bir derlemesi. Alkaloidlerde; Knolker, H.-J., Ed.; Elsevier: Amsterdam, Hollanda, 2015; Bölüm 5; Cilt 74, s. 233–409. [Çapraz Referans]

6. Souza, CAS; Nardelli, VB; Paz, WHP; Pinheiro, MLB; Rodrigues, ACBC; Bomfifim, LM; Soares, MBP; Bezerra, DP; Chaar, JS; Koolen, HHF; et al. Duguetia pycnastera (Annonaceae) kabuğundan asarone türevli fenilpropanoidler ve izokinolin türevli alkaloidler ve bunların sitotoksisiteleri. Quim. Yeni 2020, 43, 1397–1403. [Çapraz Referans]

7. Araújo, MS; Silva, FMA; Koolen, HHF; Costa, EV Guatteria olivacea (Annonaceae) kabuğundan izokinolin türevi alkaloidler. Biyokimya. Sist. ekol. 2020, 92, 104105. [CrossRef]

8. Ngouonpe, AW; Mbobda, ASW; Mutlu, GM; Mbiantcha, M.; Tatudom, tamam; Ali, MS; Lateef, M.; Tchouankeu, JC; Kouam, SF Tıbbi bitki Duguetia staudtii'den (Annonaceae) doğal ürünler. Biyokimya. Sist. ekol. 2019, 83, 22-25. [Çapraz Referans]

9. Santos, RC; Souza, AV; Andrade-Silva, M.; Cruz, KCV; Kaşsuya, ÇAL; Cardoso, KAL; Vieira, MC; Formaggio, ASN Duguetia furfuracea (A. St.-Hil.) Benth'den elde edilen ekstrakt ve dicentrinonun Antioksidan, anti-romatizmal ve anti-inflamatuar araştırması. & Kanca. f. J. Etnofarmakol. 2018, 211, 9-16. [Çapraz Referans]

10. Costa, EV; Pinheiro, MLB; Souza, ADL; Barison, A.; Campos, FR; Valdez, Sağ; Ueda-Nakamura, T.; Dias Filho, BP; Nakamura, CV Annona foetida Mart'ın dallarından oksoaporfin ve pirimidin- -karbolin alkaloitlerinin tripanosidal aktivitesi. (Annonaceae). Moleküller 2011, 16, 9714–9720. [Çapraz Referans]

11. Silva, DB; Tül, EKO; Milita, GCG; Costa-Lotufo, LV; Pessoa, C.; Moraes, MO; Albuquerque, S.; Siqueira, JM Duguetia furacea'dan izole edilen ekstrakt ve alkaloitlerin antitümöral, tripanosidal ve antileishmanial aktiviteleri. Bitkisel Tıp 2009, 16, 1059-1063. [CrossRef] [PubMed]

12. Costa, EV; Pinheiro, MLB; Xavier, CM; Silva, JRA; Amaral, ACF; Souza, ADL; Barison, A.; Campos, FR; Ferreira, AG; Machado, GMC; et al. Annona foetida kaynaklı bir pirimidin- -karbolin ve antileishmanial aktiviteye sahip diğer alkaloidler. J. Nat. Ürün 2006, 69, 292-294. [Çapraz Referans]