Calpastatin, Otofajinin Bakımı Yoluyla Anjiyotensin II Aracılı Podosit Hasarını Önler

daha fazla bilgi için:ali.ma@wecistanche.com

Imane Bensaada^1,3, Blaise Robin^1,3, Joe¨lle Perez², Yann Salemkour¹, Anna Chipont¹, Deniz Camus¹,Mathilde Lemoine¹, Lea Guyonnet¹, He'le'ne Lazareth¹, Emmanuel Letavernier², Carole He'nique¹,Pierre-Louis Tharaux¹ve Olivia Lenoir¹

¹Université de Paris, PARCC, Inserm, Paris, Fransa; ve²Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité, Paris, Fransa

Kronik glomerüler patolojilerde proteinürinin güçlü prediktif değeri ve anjiyotensin II'nin değişmiş glomerüler fi-filtrasyon bariyeri, podosit hasarı ve glomerül skarlaşması ile glomerüler hastalığın ilerlemesini destekleyen patojenik rolü kesin olarak belirlenmiştir. Burada kronik anjiyotensin II ile indüklenen hipertansiyonunotofajifare glomerüllerinde akıntı. Atg5'in (otofajiyi içeren bir proteini kodlayan bir gen) özellikle podositte silinmesi, hızlanmış dangio tensin II ile indüklenen podositopati, vurgulanmış albüminüri ve glomerüloskleroz ile sonuçlandı. Bu, otofajinin bu durumda podositte önemli bir koruyucu mekanizma olduğunu gösterir. Podositlerde anjiyotensin-II ile indüklenen kalpain aktivitesini inhibe ederotofajiakış. Endojen kalpain inhibitörünün transgenik ekspresyonuna sahip farelerden alınan podositlerkalpastatingörüntülenen daha yüksek podositotofajibaşlangıçta anjiyotensin II'ye bağlı inhibisyona dirençliydi. Ayrıca, sürekli otofaji ilekalpastatinsınırlı podosit hasarı ve albüminüri. Bu bulgular, hipertansiyonun kısmen kalpainlerin aktivasyonu yoluyla podosit otofajisinin bloke edilmesine yol açan glomerüler yapı ve fonksiyon üzerinde patojenik etkilere sahip olduğunu göstermektedir. Bu bulgular, anjiyotensin II aracılı hipertansiyonun, kalsiyum kaynaklı kalpain alımı yoluyla otofajiyi inhibe ettiği orijinal bir mekanizmayı ortaya çıkarır.kalpastatinaktivite. Böylece kalpain aracılı bir azalmanın önlenmesiotofajiyüksek renin-anjiyotensin sistem aktivitesi ile ilişkili nefropatiler için umut verici yeni bir terapötik strateji olabilir.

ANAHTAR KELİMELER: anjiyotensin II;otofaji; kalpastatin; hipertansiyon; podosit

Çeviri Bildirimi

Otofajinin gelişimindeki önemli rolü göz önüne alındığında,böbrekhastalıklar, farmakolojik modülasyonotofajibirkaçının önlenmesi ve tedavisi için umut verici bir strateji olabilir.böbrekhastalıklar. Paralel olarak, podositlerdeki kalpain aktivitesinin aşırı aktivasyonunun podosit fonksiyonu üzerinde zararlı etkiler oynadığı bulundu, ancak zararlı etki mekanizmaları tanımlanmadı. Burada kalpainin, anjiyotensin II'nin zararlı etkisini, kalp hastalığının zararlı blokajına bağladığına dair kanıt sunuyoruz.otofajipodositlerde ve kalpain inhibisyonunun, kısmen podosit otofajisinin korunması yoluyla podosit hastalıkları için umut verici bir terapötik hedef olabileceğini düşündürmektedir.

Tıklakronik böbrek hastalığı tedavisinde Cistanche Deserticola ma

Hipertansiyon, ilerleyici kronik hastalığın önde gelen nedeni olarak yalnızca diyabetten sonra ikinci sıradadır.böbrekhastalık1–3 ve hatta kan basıncında orta derecede yükselme, son dönem böbrek hastalığı için bağımsız bir risk faktörüdür.4 Artan sayıda deneysel çalışma, podositlerin böbrek hastalığının gelişimindeki önemini vurgulamıştır.böbrekincinme. Progresif podosit kaybı ve mikrovasküler değişiklikler, deneysel hipertansif nefropatide fonksiyonel böbrek azalması ile erken ortaya çıkar.5 Hastalarda, canlı podositlerin idrarla atılımının preeklampsi için duyarlı ve spesifik bir belirteç olduğu gösterilmiştir,6,7 ve nefrosklerozlu hastalarda anlamlı bir daha düşük glomerüler podosit yoğunluğuböbrekdonörler.8,9 Ayrıca, glomerüler hastalığın ilerlemesini destekleyen anjiyotensin II'nin (AngII) patojenik rolü, yalnızca hipertansif koşullarda değil, aynı zamanda çeşitli glomerüler hastalıklarda da iyi bilinmektedir.10-21

Glomerüler hipertansiyon, glomerüler kapiller gerilmeye, endotel hasarına ve glomerüler kollapsa ve glomerüloskleroza neden olan yüksek glomerüler protein filtrasyonuna neden olur. Aynı zamanda, glomerüler yapılar üzerinde doğrudan bir etki uygulayarak, telafi etmeyi amaçlayan sinyal düzenleyici yanıtlara neden olur. Aktive sistemik ve lokal renin-anjiyotensin-aldosteron sistemi (RAAS), mezangial hiperplaziyi ve vasküler geçirgenlik faktörlerinin sentezini teşvik eder. Aynı zamanda, podositler kalsiyum sinyali 22,23 sergilerler ve AngII tip 1 reseptörüne (AT1) bağımlı stimülasyon üzerine şekillerini değiştirirler.24-28 Bu adaptif mekanizmalar uzun vadede uyumsuz hale gelir ve sonunda glomerüloskleroza yol açar. AT1, kan basıncı ve tuz ve su homeostazı için belirgin RAAS katılımına aracılık eder. Anjiyotensin dönüştürücü enzim inhibitörleri ve AT1 blokerleri, hastalarda hipertansiyon ve kalp yetmezliğinin tedavisi için klinik olarak kullanılmaktadır. İlginç bir şekilde, her iki engelleyici de üzerinde koruyucu bir etki gösterir.böbrekişlev.

Otofajinin, özellikle postmitotik hücrelerde29,30 ve özellikle podositlerde, hücresel homeostazın sürdürülmesi için gerekli olduğu gösterildi.31-34otofajiuzun ömürlü sitoplazmik proteinler ve işlevsiz organeller35,36 için lizozomla ilişkili bir bozunma sistemidir ve otofagozomlarda proteinlerin ve organellerin sekestrasyonunu içerir. Otofagozomların oluşumu, Map1lc3a/b, Beclin 1 ve Tags dahil olmak üzere birçok genin indüklenmesine bağlıdır. 37 Otofajik yolun düzensizliğinin böbrek yaşlanmasının patogenezinde rol oynadığına dair artan kanıtlar vardır ve birkaçböbrekakut böbrek hasarı, polikistik böbrek hastalığı, yaşlanma ve diyabetik nefropati gibi hastalıklar.31,32,38-41

Düzenlenmesiotofajipodositlerde, fizyolojik ve hepsinden önemlisi patolojik bağlamda iyi bilinmemektedir. Yakın zamanda, podosit otofajisinin fizyolojik koşullarda rapamisin (mTOR) düzenlemesinin mekanik hedefinden bağımsız olduğunu gösterdik ve bu hücre tipini bir istisna haline getirdik.42 AT1 aktivasyonu, hücrelerde protein sentezini ve protein dönüşümünü uyarır. Bu nedenle, RAAS'ın aktivasyonunun, protein ciro stimülasyonunu ve proteostazını da etkileyebileceğini düşündük.

Bu çalışmada, podositte AngIIsignaling'in rolüne odaklandık.otofajidüzenleme. AngII'nin podosit üzerindeki kronik bloke edici etkisine aracılık eden kalsiyumla aktive olan proteaz kalpainlerini belirledik.otofaji. Ayrıca, endojen kalpain inhibitörününkalpastatinhipertansiyon sırasında AngII'ye bağlı otofaji inhibisyonunu ve podosit hasarını önleyebildi.

Bu bulgular, AngII aracılı hipertansiyonun inhibe ettiği orijinal bir mekanizmayı ortaya çıkarır.otofajikalpastatin aktivitesi ile dengesizlik durumunda patojenik sonuçları olan kalsiyum kaynaklı kalpain alımı yoluyla.

YÖNTEMLER

Hayvanlar

kalpastatintransgenik (CSTTg) fareler, Dr. E. Letavernier tarafından nazikçe sağlandı.43 Atg5 geninin (Nphs2.cre Atg5lox/lox) podosit spesifik bozulmasına sahip fareler, Nphs2.cre farelerini44 Atg5lox/lox ile çaprazlayarak daha önce tarif edildiği gibi31 üretildi. Mouse45, C57BL6/J arka planında. Nphs2.cre Atg5lox/lox fareleri ve 10 ila 12 haftalık kontrol yavruları erkekleri bu çalışmada kullanıldı. Hipertansif model, ozmotik mini pompalar aracılığıyla 4 ila 6 hafta boyunca 1 mg/kg/dk'lık bir dozda AngII'nin (Sigma-Aldrich, A9525) sc infüzyonu ile indüklendi (Alzet Corp, model 2006). Pompalar, omuz bıçakları ve kalçalar arasına sırt üzerine sc implante edildi. Fareler, yiyeceklerde tuz takviyesi (yüzde 3 NaCl) aldı. Tüm çalışmalarda kontrol olarak Atg5lox/lox (yabani tip [WT]) fareler kullanıldı. Nefron indirgeme modeline sahip deoksikortikosteron asetat (DOCA) tuzu için yetişkin erkek farelere tek taraflı sol nefrektomi uygulandı. Nefrektomiden iki hafta sonra, 21-gün salımı (Amerika'nın Yenilikçi Araştırması) implante edilen DOC peletleri aldılar. İlk implanttan 3 hafta sonra ikinci bir pelet implante edildi. Tüm fareler, içme suyunda ad libitum olarak yüzde 0,9 NaCl aldı ve 6 haftalık DOC uygulamasından sonra öldürüldü.46 Deneyler, Fransız veterinerlik yönergelerine ve Avrupa Topluluğu tarafından deneysel hayvan kullanımı için formüle edilenlere göre yapıldı (L358-86/ 609EEC) ve Fransız Araştırma Bakanlığı ve yerel üniversite araştırma etik komitesi (APAFIS-7646 ve -22373) tarafından onaylanmıştır.

Birincil podosit kültürü deneyi

Farklılaştırılmış primer podositler daha önce tarif edildiği gibi kültürlendi.47,48 Kısaca, taze izole edilmiş renal korteks karıştırıldı ve Roswell Park Memorial Institute 1640'de kollajenaz I (Gibco, 17100-017) tarafından sindirildi (Life Technologies, 61870-044). Dokular daha sonra 70 mm ve 40 mm hücre süzgeçlerinden (BD Falcon, 352340 ve 352350) geçirildi. 40 mm hücre süzgecine yapışan glomerüller, basınç altında enjekte edilen fosfat tamponlu salin (PBS; Life Technologies, 10010023) + yüzde 0,5 bovin serum albümini (Eurobio, HALALB07-65) ile çıkarıldı ve daha sonra iki kez yıkandı. PBS'de. Taze izole edilmiş glomerüller, podositlerin glomerüllerden çıkmasına izin vermek için yüzde 10 cenin buzağı serumu ve yüzde 1 penisilin/streptomisin (Life Technologies, 15140122) ile desteklenen Roswell Park Memorial Institute 1640'ta (Gibco, 61870036) kuyu kaplarına kaplandı. ve büyümek. Podosit zenginleştirmesi, daha önce tarif edildiği gibi Western blot analizi ile doğrulandı31,48,49 (Ek Şekil S1). Podositler, bafilomisin A1 (100 nmol/l, Sigma-Aldrich, B1793) yokluğunda veya varlığında 4 saat boyunca kültürlendi. İmmünofloresan deneyleri için, birincil podositler 4 tabak etiketi (Dutcher, 055071) üzerine kaplanmıştır. Podositler daha sonra 10 dakika boyunca yüzde 4 paraformaldehit içinde sabitlendi ve immünofloresan için işlendi.

Kalpain aktivite tahlili

Hücre içi kalpain aktivitesi, daha önce tarif edildiği gibi, birincil podositlerde belirlendi.50-52 Roswell Park Memorial Institute 1640'taki 24-kuyu doku kültürü tabaklarında yüzde 10 fetal eklenmiş toplam 100,{3}} hücre kültürlendi. buzağı serumu ve yüzde 1 penisilin/streptomisin. Belirtilen kültür periyodundan sonra ortam, 10 mM kalpain inhibitörü-1 ile veya onsuz 4 mM CaCl2 içeren Krebs-Ringer HEPES bikarbonat (KRH) çözeltisi (pH 7.4) ile değiştirildi ve eklemeden önce 10 dakika inkübe edildi. 50 mM kalpain substratı N-süksinil-Leu-Leu-Val-Tyr-7-amino-4-metil kumarin (Sigma-Aldrich, S6510). 90-dakikalık bir inkübasyon periyodundan sonra kalpain aktivitesi, kalpain inhibitörü olan ve olmayan FL floresan (360 nm eksitasyon ve 430 nm emisyonda ölçülen) arasındaki fark olarak belirlendi-1.

Batı lekesi

Birincil podositler, fosfataz ve proteaz inhibitörü içeren 80 ml radyoimmünopresipitasyon deney tamponu ile çizildi. Protein konsantrasyonu, BCA Protein Test Kiti (Merck Biochemistry, 71285) ile ölçüldü. Yirmi mikrogram protein, Criterion XT prekast jeli (yüzde 12 Bis-Tris, Bio-Rad, 3450124) üzerinde elektroforeze tabi tutuldu. Proteinler, poliviniliden diflorür membranına aktarıldı (Thermo Fischer Scientific, 88518). Tris Tampon Salin yüzde 0.1 Tween (TBS-T) içinde yüzde 5 sütte bloke edildikten sonra, membranlar tavşan poliklonal anti-LC3 (1:1000, Cell Signaling Technology, 2575), tavşan poliklonal anti-ATG5 ile inkübe edildi. (1:2000, Cell Signaling Technology, 2630), kobay poliklonal anti-Sequestosome 1 (SQSTM1)/P62 (1:10,000, PROGEN, GP62), tavşan poliklonal anti-kalpain 1 alan IV (1:1000, Abcam, ab39170 ), tavşan poliklonal anti-kalpain 2 alan I'in amino-terminal ucu (1:1000, Abcam, ab39165), fare monoklonal IgG1 anti-kalpain 4 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, sc-32325), tavşan anti podocin (1:1000, Abcam, ab50339), kobay anti-nefrin (1:500, PROGEN, GP-N2) ve sıçan monoklonal anti-tubulin (1:5000, Abcam,ab6160) antikoru. Yıkandıktan sonra, membranlar yaban turpu peroksidaz bağlantılı antikor (1:2000, Cell Signaling Technology, 7074, 7076, 7077) ile inkübe edildi. Spesifik sinyallerin tespiti, LAS 4000 cihazında (Fuji) ECL Chemiluminescent Kit (Bio-Rad, 170-5070) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Kantifikasyon için ImageJ yazılımı (Ulusal Sağlık Enstitüleri) ile dansitometri analizi kullanıldı.

Kan basıncı ölçümleri ve fizyolojik değerlendirmeler

Farelerin sistolik kan basıncı, tail-cuff yöntemi (Visitech Systems Inc., BP-2000) kullanılarak kaydedildi. Her fareden on ölçüm alındı ​​ve ardından bir ortalama değer belirlendi. Sistolik kan basıncı başlangıçta (12 haftalıkken) ve ardından tedavi süresinin sonuna kadar haftalık olarak ölçüldü. Tüm fareler, 6-saatlik idrar toplama için suya serbest erişimi olan metabolik kafeslere yerleştirildi. İdrar kreatinin ve plazma üre konsantrasyonları, kolorimetrik bir yöntem (Olympus, AU400) kullanılarak spektrofotometrik olarak analiz edildi. İdrar albümin atılımı, fare idrarında albüminin kantitatif tespiti için spesifik bir enzime bağlı immünosorbent tahlili kullanılarak ölçüldü (Crystal Chem, 80630).

histoloji

böbreklerhasat edildi ve yüzde 4 PBS tamponlu formalinde sabitlendi. Parafine gömülü kesitler (3-mm kalınlığında) böbrek morfolojisini değerlendirmek için Masson'strichrome ile boyandı. Böbreklerdeki anormallikler, glomerüloskleroz, mezanjiyal genişleme, tübüler atrofi veya atmalar ve fibrozis dahil olmak üzere bileşen anormalliklerinin varlığı ve ciddiyetine göre derecelendirildi. Sklerotik glomerül oranı, her hastada en az 50 glomerülün kör muayenesi ile değerlendirildi.böbrekbölüm.

Böbrek bölümlerinin ve birincil podositlerin immünofloresan boyaması

Sabit primer podositler, TBS-T yüzde 3 bovin serum albümini içinde bloke edildi ve gece boyunca 4 derecede birincil antikorlar kobay anti-SQSTM1/P62 (1:1000, PROGEN, GP-62C) ve tavşan anti ile inkübe edildi. -yeşil FL floresan proteini (GFP; 1:500, Abcam, ab290). TBS-T ile durulandıktan sonra, FL florofor konjuge ikincil antikorlar eşek anti-kobay IgG AF594-konjuge antikor (JacksonImmunoResearch, 706-585-148) ve eşek anti-tavşan IgG AF488-konjuge antikor ( Invitrogen, A21206) uygulandı. Görüntüler bir Zeiss 2 ft floresan mikroskobu, bir AxioCam HRccamera ve Axiovision 4.3 yazılımı kullanılarak alındı.

Formalinle sabitlenmiş parafine gömülü (FFPE) içinböbrekler, kesitler (3 mm) deparafinize edildi ve hidratlandı ve ısıtılmış sitrat tamponunda (pH 6) antijen alımı yapıldı. Kesitler daha sonra Triton 0.1 (Euromedex) ile geçirgenleştirildi ve 4°C'de gece boyunca antikor inkübasyonundan önce TBS-T yüzde 3 bovin serum albümini içinde bloke edildi. Keçi anti-nefrin (1:100, PROGEN, GP) kullandık -N2), kobay anti-SQSTM1/P62 (1:1000, PROGEN, GP-62C), tavşan anti-GFP(1:1000, Abcam, ab290), keçi anti-Podokaliksin (PODXL; 1: 1000, Bio-Techne, AF-1556) ve tavşan anti-Wilmʼs Tumor 1 (WT1;1:100, Abcam, ab192) antikoru. İkincil antikorlar, Invitrogen'den Alexa488- ve Alexa 568-konjuge antikorlarıydı. Çekirdekler Hoechst kullanılarak mavi boyandı. Slaytlar, bir floresan yerleştirme ortamı (Dako, S3023) kullanılarak monte edildi. Fotomikrograflar bir Zeiss Axiophot fotomikroskop ve Axiovision yazılımı ile çekildi. Fare başına en az 30 glomerülde glomerüler bölüm başına nefrin pozitif ve PODXL+ alanlarının nicelenmesi için Fiji'de yarı otomatik nicelemeler kullanıldı. Podosit sayısı, fare başına en az 30 glomerülde glomerüler bölüm başına WT1+ çekirdek sayısı olarak sayıldı.

Transmisyon elektron mikroskobu prosedürü

Renal korteksin küçük parçaları (1 mm3), 1 ila 30 gün boyunca yüzde 3 glutaraldehit derecesinde (Electron Microscopy Sciences) sabitlendi ve üç kez PBS içinde yıkandı. Örnekler, 0.1 M PBS (pH 7.4) içinde yüzde 1 osmiyum tetroksit 0.1 M (Elektron Mikroskopisi Bilimi) içinde sonradan sabitlendi ve su içinde yıkandı. Numuneler alkol derecelerinde ve yüzde 100 propilen oksitte (Electron Microscopy Science) kurutuldu. Reçine infiltrasyonu şu şekilde gerçekleştirildi: Epikote 812 ve propilen oksidi 1:1 oranında 30 dakika karıştırın, ardından Epikote 812 ve propilen oksidi gece boyunca oda sıcaklığında 1:2 oranında karıştırın. Örnekler, yüzde 100 Epikote 812 içinde 4 mm jelatin kapsüllere gömüldü ve 60°C'ye ısıtılmış bir fırında polimerize edildi. Ultra ince kesitler, bir UFC7 ultramikrotom (Leica MicrosystemsGmbH) ile kesildi ve Gilder Grids 200 ağ gözü (Electron Microscopy Science) üzerine bırakıldı. Yüzde 7 uranil asetat (LFG Distribution) ve Reynold'un kurşun sitratı (LFG) ile zıt boyama yapıldı. Örnekler, JEM1011 transmisyon elektron mikroskobunda (JEOL) Orius SC1000 CCD kamera (Gatan) ile, Dijital Mikrograf yazılımı (Gatan) ile çalıştırılarak elde edildi.

Cistanche-böbrek hastalığı

Kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu dizisi

Taze izole edilmiş glomerüller, QIAzol Lysis reaktifinde (Qiagen) -80 derecede donduruldu. Fenol bazlı yöntem kullanılarak toplam RNA ekstraksiyonu, üreticinin tavsiyelerine göre işlendi. cDNA'lar RT2 First Strand Kit (Qiagen, 330401) kullanılarak sentezlendi ve gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), RT2 SYBR Green qPCR Mastermix (Qiagen, 330502) ile bir Özel RT2 Profiler PCR Dizisi (Qiagen, CLAM36771C) kullanılarak yapıldı. . Kantitatif PCR plakaları, Applied Biosystems StepOnePlus döngüleyici üzerinde çalıştırıldı. Her dizi, ters transkripsiyon verimliliği ve genomik DNA kontaminasyonu için kalite kontrolü içerir. GeneGlobe Veri Analiz Merkezi (www. Qiagen.com/shop/genes-and-pathways/data-analysis-center-overview-page) yardımıyla 2-DDCT yöntemi kullanılarak nicel PCR analizi yapıldı ve ifade edildi. Gen ifadesinde Log2 kat değişikliği olarak.

Siliko proteomik analizinde

Kalpain bölünme bölgesinin in silico tahmini, DeepCalpain (//deepcalpain.cancerbio.info/help.php), GPS-CCD (/ccd.biocuckoo.org) ve CaMPDB (////) ile yapıldı. calpain.org/) çevrimiçi araçlar. Fare proteini amino asit dizisi, Uniprot'tan (https://www.uniprot.org) elde edildi. Sonuçlar, Ek Tablolar S1 ve S2'de devam ettirilmektedir.

istatistiksel analizler

Tüm grafikler bireysel değerleri ve ortalama±SEM'i temsil eder. İstatistiksel analizler GraphPad Prism yazılımı sürüm 9 kullanılarak yapıldı. Örnekler Anderson-Darling ve D'Agostino normallik testlerini ve varyans eşitliği için F testini geçtiğinde 2 grup arasındaki karşılaştırma bir parametricStudent t-testi kullanılarak yapıldı. Aksi takdirde parametrik olmayan Mann-Whitney testi kullanıldı. Çoklu gruplar arasında karşılaştırma, 1-yollu veya 2-yollu varyans analizi ve ardından Simak'ın düzeltmesiyle çoklu karşılaştırma testi kullanılarak yapıldı. P < 0.05="" değerleri="" anlamlı="" kabul="" edildi.*p="">< 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p=""><>

Şekil 1|Anjiyotensin II (AngII) D yüksek tuzlu diyet (HSD) kaynaklı hipertansiyon, glomerülerotofaji. (a–c) Vahşi tip (WT) farelerden glomerüllerde (a,a0 ) Podocalyxin (PODXL; kırmızı) ve P62 (yeşil) immünofloresansı, (b,b{3}} ) 6 haftalık AngII + HSD'den sonra WT fareleri ve Nphs2.cre Atg5lox/lox farelerinden (c,c0 ), hipertansiyon sırasında podositlerde ve podosit spesifik ATG'de P62 birikimini gösterir{{1{{12 ) }}}}eksik fareler. Ok uçları, (a0 ) içinde WT'deki P62+ noktalarını gösterir. Çekirdekler Hoechst (mavi) ile zıt boyandı. Asal olan şekil alt bölümleri daha yüksek büyütmeyi gösterir. Çubuklar=50 mm. (d) Glomerüler alanın yüzdesi olarak ifade edilen P62+ alanının ilişkili niceliği. n=4 WT fareleri ve AngII + HSD'li n=5 WT ve Nphs2.cre Atg5lox/lox fareleri. Değerler, ayrı grafikler ve ortalama±SEM olarak sunulur. Mann-Whitney testi: *P=0.0159. Bu resmin görüntülenmesini optimize etmek için lütfen bu makalenin çevrimiçi versiyonuna bakın: www.böbrek-international.org.

SONUÇLAR

AngII D yüksek tuzlu diyete bağlı hipertansiyon, podosit otofajisini inhibe etti

Podositler yüksek düzeyde sunarotofajiin vivo olarak, otofajinin önemli bir belirteci olan LC3'e (GFP-LC3 fareleri) GFP füzyonu olan transgenik farelerde güçlü GFP ekspresyonu ile gösterildiği gibi (Ek Şekil S2A). Otofaji, sürekli otofagozom oluşumu ve otofagolizozomların bozulması ile dinamik bir süreçtir. Klorokin ile otofagosomal bozulmanın bloke edilmesi, podositlerde yüksek otofajik akışa işaret eden GFPþ noktalarının birikmesine neden oldu (Ek Şekiller S2A ve B). GFP+ noktalarının otofagozomlar olduğunun teyidi, GFP ve SQSTM1/P62 için çift immüno-FL floresansı ile gösterilmiştir.otofaji(Ek Şekil S2C ve D). Yine, klorokin tedavisi GFP+ P62+ noktalarının birikmesini indükleyerek, podositlerde önemli otofajik akış olduğunu gösterdi. Son olarak, GFP-LC3 farelerinden izole edilen primer podositlerde GFP ve P62 ekspresyonu ve bafilomisin A1 tedavisi altında güçlü GFPþ ve P62+ noktalarının birikmesi ile gösterildiği gibi yüksek otofajik akış in vitro olarak korunmuştur, başka bir otofagosomal bozulma blokeri (Ek Şekil S2E-H) .

Hipertansiyonun podosit otofajik tepkilerini modüle etme kapasitesi daha sonra 6 hafta boyunca yüksek tuzlu diyet (HSD) ile AngII ile aşılanmış farelerde ve hipertansif olmayan kontrollerde değerlendirildi. Şekil 1'de gösterildiği gibi, AngII + HSD, podositlerde güçlü birikim ile glomerüllerde P62 birikimini indükler, bu da AngII + HSD'nin podositten sorumlu olduğunu düşündürür.otofajiabluka (Şekil 1a–d). İlginç bir şekilde, podositlerdeki P62 birikimi, podosit otofajisi eksik farelerde (Nphs2.cre Atg5lox/lox fareleri) gözlemlenene benzerdi. Başka bir hipertansiyon modelinde, DOC-tuz modelinde, hastalığın zaman süreci boyunca podositlerde ilerleyici P62 birikimini de gözlemledik (Ek Şekil S3).

Atg5'in özellikle podositlerde silinmesi, AngII D HSD modelinde artmış albüminüri, podosit kaybı ve glomerüler hasar ile sonuçlanır.

Daha sonra olup olmadığını inceledikotofajisadece podositlerde blokaj (Nphs2.cre Atg5lox/lox fareleri) AngII + HSD modelinde glomerüler hasarı etkiler. İlk önce Nphs2'yi doğruladık. cre Atg5lox/lox farelerinde normal kan basıncı vardı, normalböbrekfonksiyon ve daha önce bildirildiği gibi 10 aylık olana kadar glomerüler histolojik lezyon yok (Ek Şekil S4).32 Ardından, Atg5lox/lox (WT) ve Nphs2. cre Atg5lox/lox fareleri, 6 hafta boyunca HSD ile AngII ile aşılandı. Daha da önemlisi, çalışma süresince AngII infüzyonundan sonra 2 grupta sistolik kan basıncı benzerdi (Şekil 2a), ancak kan basıncını ölçmek için kullanılan kuyruk manşet yöntemi küçük kan basıncı farklılıklarını çözme yeteneğine sahip olmayabilir. HSD ile AngII infüzyonu, WT farelerinde idrar albümin-kreatinin oranını belirgin şekilde arttırdı ve bu etki, Nphs2.cre Atg5lox/lox farelerinde daha da önemli ölçüde arttı (Şekil 2b). Hipertansif Nphs2.cre Atg5lox/lox fareleri ayrıca WT yavruları ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde artmış glomerüler skleroz sergilemiştir (Şekil 2c-e). Ölçülen proteinüri ile uyumlu olarak, ATG5'te podosit eksikliği olan farelerde proteinli döküntüler ve tübüler dilatasyon önemli ölçüde daha yaygındı (Şekil 2f-h).

Şekil 2|Atg5'in özellikle podositlerde silinmesi, albüminüride önemli bir artışa neden olur,böbrek6 haftalık anjiyotensin II (AngII) infüzyonu D yüksek tuzlu diyet (HSD) sonrasında yaralanma ve podosit kaybı. (a) 36 günlük AngII + HSD sırasında Atg5lox/lox ve Nphs2.cre Atg5lox/lox farelerinde sistolik kan basıncı. genotip başına n=9 fare. Değerler ortalama±SEM olarak sunulmuştur. İki yönlü varyans analizi (ANOVA): ns. (b–m)'de, genotip başına n=10 fare. (b,g,h,k)'de değerler ayrı grafikler ve ortalama±SEM olarak sunulur. (b) AngII ş HSD (devamı)

Şekil 2|(devamı) Nphs2'de albüminüride dramatik bir artışa neden oldu. Cre Atg5lox/lox fareleri, Atg5lox/lox kontrol fareleri ile karşılaştırıldığında. İki yönlü ANOVA: genotip, P=0.013; zaman, P=00,0018. (c–f) 6 haftalık AngII + HSD sonrasında Atg5lox/lox kontrolünden ve Nphs2.cre Atg5lox/lox farelerinden Masson'un trikrom lekeli glomerül bölümlerinin temsili görüntüleri. Çubuklar=50 mm in (c,d). Çubuklar=100 mm (e,f). (g,h) Sklerotik glomerül oranının karşılaştırması (g) ve mikroskobik alan başına tübüler döküm sayısının (h) sayısı. Mann-Whitney testi: **P=0.0026 (h), ***P=0.0003 (g). (i,j) 6 hafta boyunca AngII ş HSD'den sonra Atg5lox/lox kontrolü ve Nphs2.cre Atg5lox/lox farelerinden glomerüllerde Wilmʼs Tümörü 1 (WT1; kırmızı) ve Podocalyxin (PODXL; yeşil) ifadesinin temsili immünofloresan görüntüleri. Çekirdekler Hoechst (mavi) ile boyandı. Çubuklar=50 mm. (k) Glomerüler bölüm başına WT1+ hücrelerinin sayısının niceliği. Mann-Whitney testi: **P=0.0029 in (l,m). 6 hafta boyunca AngII + HSD'den sonra Atg5lox/lox kontrolünden ve Nphs2.cre Atg5lox/lox farelerinden glomerüllerde CD44 (yeşil) ifadesinin temsili immünofloresan görüntüleri. Çekirdekler Hoechst (mavi) ile boyandı. Çubuklar=50 mm. (n,o) 6 hafta boyunca AngII + HSD'den sonra Atg5lox/lox kontrolünden ve Nphs2.cre Atg5lox/lox farelerinden glomerül bölümlerinin temsili transmisyon elektron mikroskobu fotomikrografları, hipertansif Nphs2'de podosit ayak işlemi silinmesini (ok başları) gösterir. cre Atg5lox/lox fareleri. Çubuklar=1 mm. genotip başına n=3 fare. Bu resmin görüntülenmesini optimize etmek için lütfen bu makalenin çevrimiçi versiyonuna www.kidney-international.org adresinden bakın.

Şekil 3|Podositlerde kalpain ekspresyonu ve aktivitesi. (a) Birincil podositlerde kalpain-1, kalpain-2 ve kalpain-4 ifadesinin Western blot analizi. Tubulin ifadesi normalizasyon işlevi görür. (b) Kalpain aktivitesi, kalpeptin (10 mM) ile veya onsuz 24 saat boyunca anjiyotensin II (AngII; 100 nM) ile tedavi edilen veya edilmeyen primer podositlerde ölçüldü. n=5 bağımsız deney. Değerler, ayrı grafikler ve ortalama±SEM olarak sunulur. Tek yönlü varyans analizi (ANOVA): tedavi, P=0.0035. Sidak'ın çoklu karşılaştırma testi: *P=0.0128 için AngII için taban çizgisi, ##P=0.0056 için AngII ş kalpeptin ve AngII için. (c) Kalpain aktivitesi, vahşi tipten (WT) birincil podositlerde ölçüldü veyakalpastatin24 saat boyunca AngII (100 nM) ile tedavi edilen veya edilmeyen transgenik (CSTTg) fareler. n=7 bağımsız deney. Değerler, ayrı grafikler ve ortalama±SEM olarak sunulur. Tedavi için eşleştirilmiş iki yönlü ANOVA: genotip, P=0.0483. Sidak'ın çoklu karşılaştırma testi: ***P=0.0009 WT AngII için taban çizgisine karşı, *P=0.0420 CSTTg AngII için taban çizgisine karşı, #P=0.0424 WT'ye karşı CSTTg için İngilizce Bu resmin görüntülenmesini optimize etmek için lütfen bu makalenin çevrimiçi versiyonuna bakın: www.böbrek-international.org.

Nphs2'de glomerül başına podosit sayısı önemli ölçüde azaldı. AngII + HSD ile tedavi edilen cre Atg5lox/lox fareleri (Şekil 2i-k). AngII infüzyonu + HSD bulunan Nphs2.cre Atg5lox/lox farelerinde podosit hasarı, glomerüllerde parietal epitelyal hücre (PEC) aktivasyon markörü CD44'ün ekspresyonu ile gösterildiği gibi fokal ve segmental glomerüloskleroza bile ilerlemiştir (Şekil 2l ve m). Elektron mikroskopi analizi, hipertansif Nphs2'de ayak sürecinin silinmesi dahil, HSD ile kronik AngII infüzyonu üzerine ATG5 eksikliği ile ilişkili önemli değişiklikleri tanımladı. cre Atg5lox/lox fareleri. Buna karşılık, HSD ile 10 haftalık AngII infüzyonundan sonra bile WT farelerinden alınan podositlerde birkaç ultrastrüktürel kusur bulundu (Şekil 2n ve o), podositlerin otofajik aktivitesinin AngII + HSD kaynaklı hasara dirençleri için gerekli olduğunu gösterir. Toplamda, sonuçlarımız AngII + HSD modelinde,otofajiinhibisyon, podosit hasarını ve kaybını şiddetlendirir ve müteakip fokal ve segmental glomerülosklerozu indükler.

AngII D HSD, otofaji blokajına katkıda bulunan podositlerde kalpain aktivitesini aktive eder

Kalpain aktivitesinin (i) birkaç hücre tipinde AngII tarafından aktive edildiği ve (ii) birkaç hücreyi parçaladığı bulundu.otofajiAngII + HSD aracılı otofaji blokajının artan AngII ile indüklenen kalpain aktivitesine bağlanıp bağlanamayacağını merak ettik. İlk olarak, birincil podositlerin her yerde bulunan 3 kalpain formunu ifade ettiğini bulduk (Şekil 3a). Daha sonra AngII'nin birincil podositlerde kalpain aktivitesini uyardığını gösterdik. Kalpain aktivitesindeki bu artış, seçici bir kalpain inhibitörü tarafından bloke edildi (Şekil 3b). Ekli bir tak-çıkar fare kullandıkkalpastatinAngII + HSD aracılı hastalıkta kalpainlerin rolünü değerlendirmek için transgen ekspresyonu (azalmış kalpain aktivitesindeböbrekyaralanma ve otofaji blokajı. CSTTg farelerinden elde edilen birincil podositler, kontrol farelerinden alınan podositlerle karşılaştırıldığında AngII'ye yanıt olarak kalpain aktivitesinin azaldığını gösterdi (Şekil 3c). Böylece,kalpastatinpodositlerde aşırı ekspresyon, AngII aracılı kalpain aktivasyonunu azalttı.

Daha sonra değerlendirdikotofajiCSTTg farelerinden alınan podositlerdeki seviyeler. GFP-LC3 transgeni ile CSTTg fareleri ürettik. LC3-GFP muhabiri, otofagozomların GFPþ/P62þ noktaları olarak sayılmasına izin verdi. P62, otofajik akış bloke edildiğinde hücrelerdeki agregalarda birikecektir. Bazal durumda, normal GFP-LC3 farelerinin podositlerine kıyasla CSTTg GFP-LC3 farelerinin podositlerinde daha az GFPþ P62+ noktası (Şekil 4a, b ve e) ve daha az P62 birikimi (Şekil 4c, d ve f) saydık. , yüksek kalpastatin bolluğuna sahip farelerin podositlerinde otofajik akışın arttığını düşündürür.

Şekil 4|podositlerinde otofajik akışın değerlendirilmesikalpastatintransgenik (CSTTg) fareler. (a,b) 12-haftalık GFP-LC3 ve CSTTg GFP-LC3 farelerinden glomerüllerde yeşil FL floresan proteini (GFP) (yeşil) ve P62 (kırmızı) ifadesinin temsili immünofloresan görüntüleri. Ok uçları GFPþ P62þ otofagozomlarını göstermektedir. (c,d) 12-haftalık GFP-LC3 ve CSTTg GFP-LC3 farelerinden glomerüllerde P62 (yeşil) ve Podocalyxin (PODXL; kırmızı) ifadesinin temsili immünofloresan görüntüleri. Asal olan şekil alt bölümleri daha yüksek büyütmeyi gösterir. Çekirdekler Hoechst (mavi) ile boyandı. Çubuklar=50 mm. (e) Podosit başına LC3+ P62+ nokta sayısının niceliği. Mann-Whitney testi: **P= 0.0065. (f) Glomerüler bölüm başına P62+ alanının miktar tayini. Mann-Whitney testi: *P=0.0420. (e,f), n=5 GFP-LC3 fareleri ve n=8 CSTTg GFP-LC3 fareleri. Değerler, ayrı grafikler ve ortalama±SEM olarak sunulur. Bu resmin görüntülenmesini optimize etmek için lütfen bu makalenin çevrimiçi versiyonuna bakın: www.böbrek-international.org.

Otofajik akış, Western blot üzerinde LC3'ün sitoplazmik formunun, LC3-I'nin otofagosomal parçalanmış ve fosfatidiletanolamin-bağlı LC3, LC3-II formuna dönüşümünün ölçülmesiyle izlenebilir. . CSTTg farelerinden alınan podositler, bafilomisin A1 varlığında ve yokluğunda artan LC3-I'den LC3-II'ye dönüşüm ve azalmış P62 ekspresyonu gösterdi (Şekil 5a ve b), kalpastatin aşırı ekspresyonu olan podositler. Son olarak, klorokin uygulamasından sonra podositlerde GFP+ P62+ noktalarının birikmesi, CSTTg GFP-LC3 farelerinde GFP-LC3 farelerine göre daha önemliydi, dolayısıyla şunu doğruladı:kalpastatinaşırı ekspresyon, in vivo olarak podositlerde otofajik dışa akışı indükler (Şekil 5c-e). Toplamda, verilerimiz AngII'nin podositlerde kalpain aktivitesini uyardığını, yaniotofajipodositlerde kalpain tarafından inhibe edilir ve kalpastatin aşırı ekspresyonu ile endojen kalpain aktivitesinin inhibisyonu, podositlerde otofajik akışı uyarmak için yeterlidir.

CSTTg fareleri, AngII D HSD kaynaklı podosit hasarından korunur

CSTTg fareleri herhangi bir şey göstermediböbreken az 12 aylık olana kadar değişiklik (Ek Şekil S5). AngII + HSD tedavisi sırasında CSTTg farelerinde podosit hasarını analiz ettik. WT fareleri, podokaliksin ve nefrinin anormal ekspresyonu ile gösterildiği gibi, 4 haftalık hipertansiyondan sonra hafif glomerüloskleroz ve podosit hasarı geliştirmesine rağmen, CSTTg fareleri daha az sklerotik glomerüler lezyon (Şekil 6a ve b) ve korunmuş podokaliksin ve nefrin ekspresyonu (Şekil 6c-h) gösterdi. . Podosit fenotipindeki bu tür farklılıklar, podosit çekirdek yoğunluğunun WT ve hipertansif CSTTg fareleri arasında farklı olmadığı bir aşamada gözlendi (Şekil 6i-k).

Şekil 5|Otofagosomal bozulmayı engellemek, podosit otofajik akışının arttığını doğruladı.kalpastatintransgenik (CSTTg) fareler. (a) Yabani tip (WT) veya CSTTg farelerden alınan birincil podositlerde LC3, Sequestosome 1 (SQSTM1)/P62 ve ATG5 ekspresyonunun Western blot analizi. Tubulin ifadesi normalizasyon işlevi görür. Podositler, kültür durmasından 4 saat önce bafilomisin A1 (BafA1; 100 nM) ile tedavi edildi veya edilmedi. (b) LC{{10}}II/tubulin ve P62/tubulin oranlarının miktar tayini. n=10 WT fareleri ve n=8 CSTTg fareleri. Değerler, ayrı grafikler ve ortalama±SEM olarak sunulur. Tedavi için eşleştirilmiş iki yönlü varyans analizi: LC3-II/tubulin için: genotip, P=0.{{30}}008; tedavi, P < 0.0001;="" p62/tubulin="" için:="" genotip,="" p="0.0884;" tedavi,="" p="">< 0.0001.="" sidak'ın="" çoklu="" karşılaştırma="" testi:="" lc3-ii/tubulin="" için:="" ***wt="" artı="" bafa1="" için="" p="">< 0.0001="" ve="" wt="" ×="" bafa1,="" ***csttg="" artı="" bafa1="" için="" p="">< 0.0001="" ve="" csttg="" ×="" bafa1,="" ##p{="" {34}}.0028="" wt="" +="" bafa1="" için="" csttg="" +="" bafa1="" için;="" p62/tubulin="" için:="" ***wt="" artı="" bafa1'e="" karşı="" wt="" +="" bafa1,="" için="" p="">< 0.0001="" csttg="" artı="" bafa1'e="" karşı="" csttg="" +="" bafa1="" için="" p="">< 0.0001.="" (c,d)="" 12-="" haftalık="" gfp-lc3="" ve="" csttg="" gfp-lc3="" farelerinden="" glomerüllerde="" yeşil="" fl="" floresan="" proteini="" (gfp;="" yeşil)="" ve="" p62="" (kırmızı)="" ifadesinin="" temsili="" immünofloresan="" görüntüleri.="" asal="" olan="" şekil="" alt="" bölümleri="" daha="" yüksek="" büyütmeyi="" gösterir.="" çekirdekler="" hoechst="" (mavi)="" ile="" boyandı.="" çubuklar="50" mm.="" fareler,="" öldürülmeden="" 4="" saat="" önce="" klorokin="" (cq;="" 80="" mg/kg)="" ile="" tedavi="" edildi.="" ok="" uçları="" gfpþ="" p62þ="" otofagozomlarını="" göstermektedir.="" (e)="" podosit="" başına="" lc3+="" p62+="" nokta="" sayısının="" niceliği.="" genotip="" başına="" n="5" fare.="" değerler="" ayrı="" grafikler="" ve="" ortalamalar="" olarak="">±SEM. Eşit SD ile eşleştirilmemiş t testi: *P=0.0302. Bu resmin görüntülenmesini optimize etmek için lütfen bu makalenin çevrimiçi versiyonuna bakın: www.böbrek-international.org.

Şekil 6 |kalpastatinaşırı ekspresyon, anjiyotensin II (AngII) D yüksek tuzlu diyet (HSD) aracılı podosit hasarını önler. (a,b) 6 haftalık AngII + HSD'den sonra vahşi tip (WT) ve kalpastatin transgenik (CSTTg) farelerinden Masson'un trikrom lekeli glomerül bölümlerinin temsili görüntüleri. Çubuklar=50 mm. (c,d,f,g) WT ve CSTTg farelerde (c,d) Podocalyxin (PODXL) ve (f,g) nefrin (NPHS1) ekspresyonunun temsili immünofloresan görüntüleri 6 haftalık AngII + HSD ve (e ,h) ilgili nicelemeler. Çubuklar=50 mm. (i,j) Wilmʼs Tümörü 1 (WT1; yeşil) ve PODXL (kırmızı) ekspresyonunun WT ve CSTTg farelerinden 6 haftalık AngII + HSD sonrası glomerüllerde temsili immünofloresan görüntüleri ve (k) WT1+ sayısının ilişkili nicelemesi glomerüler bölüm başına hücreler. Çekirdekler Hoechst (mavi) ile boyandı. Çubuklar=50 mm. (e,h,k)'de değerler ayrı grafikler ve ortalama±SEM olarak sunulur. n=9 WT fareleri ve n=7 CSTTg fareleri. Eşit SD ile eşleştirilmemiş t testi: **P=0.0095 (e), *P=0.0249 (h), P=0.7891 (k). Bu resmin görüntülenmesini optimize etmek için lütfen bu makalenin çevrimiçi versiyonuna bakın: www.böbrek-international.org.

Benzer şekilde, 6 haftalık hipertansiyondan sonra, GFP-LC3 ve CSTTg GFP-LC3 fareleri podosit hasarı gösterdi, ancak lezyonlar GFP-LC3 farelerinde daha belirgindi (Şekil 7). İdrar albümin-kreatinin oranı, 4 haftalık AngII + HSD'den sonra GFP-LC3 farelerinde daha yüksekti (Şekil 7a). Podosit sayısı 2 genotip arasında farklı değildi, ancak nefrin ekspresyonu GFP-LC3 (kontrol) farelerinde önemli ölçüde daha fazla azaldı (Şekil 7b-e). ile ilgilikalpastatinaracılı koruma, ultrastrüktürel analiz, AngII + HSD ile tedavi edilen GFP-LC3 farelerinde hafif ve fokal podosit ayak işlemi silinmesi gösterdi ve CSTTg farelerde ayak işlemi silinmesinin daha iyi korunması, her ne kadar glomerüler taban başına ayak işlemi sayısının global nicelemesi membran (GBM) uzunluğu istatistiksel olarak farklı değildi, büyük olasılıkla modelimizde podosit hasarı fokal ve segmental olduğundan (Şekil 7f–h). Not olarak, makrofajlar ve T-lenfosit infiltrasyonuböbreklergruplar arasında farklı değildi (Ek Şekil S6). Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar göstermiştir ki,kalpastatinAngII + HSD kaynaklı podosit hasarını önledi.

Calpastatin aşırı ekspresyonu, AngII D HSD tedavisinden sonra farelerden podositlerde otofajik akışı geri yükler

Sonunda merak ettikkalpastatinAngII + HSD modelinde -aracılı glomerüler koruma, podositlerde otofaji bakımını içeriyordu. İlginç bir şekilde, CSTTg ve GFP-LC3 CSTTg farelerinde podositlerde AngII + HSD kaynaklı P62 birikimi önlendi (Şekil 8a-d), bu da kalpastatinin podosit blokajını önlediğini gösterir.otofaji. Dikkat çekici bir şekilde, otofagozomların GFP+ P62+ noktalarının sayısı hipertansif GFP-LC3 ve GFP-LC3 CSTTg farelerinden alınan podositlerde benzerdi, bu nedenle AngII+ HSD'nin tam bir tutuklama yerine podosit otofajik akışında bir yavaşlamaya neden olduğunu düşündürdü (Şekil 8e– g).

Podosit proteinlerinde kalpain bölünme bölgesinin silico tahmininde

Podositlerdeki potansiyel kalpain hedeflerini tahmin etmek için birkaç in silico aracı kullandık (Ek Tablolar S1 ve S2). Üç çevrimiçi veri tabanı karşılaştırıldı: GPS-CCD,54 CaMPDB,55 ve DeepCalpain.56 In silico analizi, kalpainler tarafından parçalanabilen, aralarında nefrin ve podosin olmak üzere birkaç podosit proteini tanımladı. Böylece,kalpastatinaracılı glomerüler koruma, kalpain enzimatik aktivitesinin azalmasıyla bağlantılı olabilir, bu da bazı podosit proteinlerinin indirgenmiş bozulmasına yol açar.

Ayrıca, en az 3otofajiilgili proteinler kalpainlerin doğrudan hedefleridir. ATG5 kalpainler tarafından parçalanır, bu da ATG12-ATG5 kompleksi oluşumunda bir bozukluğa yol açar.57,58 Kalpain inhibitörlerinin in vivo uygulanması ayrıca otofaji proteini Beclin'in bölünmesini de önlemiştir-1.59 In silico analizinde otofaji ile ilgili proteinlerdeki varsayılan bölünme bölgesi, kalpainin otofaji proteinlerinin enzimatik bölünmesi yoluyla otofajiyi düzenleyebileceği hipotezini desteklemektedir.

Cistanche-böbrek fonksiyonu

AngII artı HSD ile tedavi edilen farelerden alınan glomerüllerde endoplazmik retikulum (ER) ve oksidatif stres belirteçlerinin mRNA ifadesi

AngII + HSD tedavisi sırasında glomerüllerde kantitatif PCR ile endoplazmik retikulum (ER) stresi ve oksidatif stresi değerlendirdik (Tablo 1). Başlangıçta, WT ve Nphs2.cre Atg5lox/lox farelerinden glomerüllerde analiz edilen genlerin mRNA ekspresyonunda herhangi bir değişiklik gözlemlemedik (Ek Şekil S7). 6 haftalık hipertansiyondan sonra, Nphs2'den glomerüller. cre Atg5lox/lox fareleri, WT glomerülleri ile karşılaştırıldığında Sod1, Prdx1, Atf4, Gpx1 ve Hsp90b1'in artan ekspresyonu ile ER stres ve oksidatif stres yollarının genlerinin farklı mRNA profilini gösterdi;otofajipodositlerdeki tükenme, AngII + HSD kaynaklı ER stresini ve oksidatif stresi destekledi. Tersine, CSTTg farelerinden elde edilen glomerüller, bazı proapoptotik genlerin ekspresyonunun azalmasının yanı sıra ER stresinin ve oksidatif stres yollarının birkaç geninin aşağı regülasyonunu sundu (Şekil 9).

Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar şunu göstermektedir:kalpastatinaşırı ekspresyon, AngII + HSD kaynaklı ER ve oksidatif stresi azaltarak glomerüler hasarı önleyebilir.

TARTIŞMA

Bu çalışmada, AngII + HSD kaynaklı hipertansiyonda, podosit otofajisinin belirgin şekilde aşağı regüle edildiğini gösterdik. Ayrıca, podosit-spesifik Atg5 delesyonu olan fareler, AngII + HSD ile indüklenen glomerüloskleroz ve podosit kaybına daha yatkındı;otofajipodositlerde hipertansif nefropati gelişimini engeller, otofajinin AngII + HSD ile indüklenen podosit hasarındaki kritik rolünü vurgular. Hücresel otofajiyi düzenleyen hücre dışı uyaranlar hakkında çok az şey bilinmektedir ve bu sonuçlar AngII tarafından podosit otofajisinin patofizyolojik düzenlenmesine ışık tutmaktadır.

Çoğu insan glomerülopatisinde, podosit ayak prosesinin silinmesi, proteinüriye yol açan glomerüler hasarın ayırt edici özelliğidir. Otofajinin podosit fonksiyonunun sürdürülmesinde önemli bir rol oynaması muhtemeldir çünkü bu terminal olarak farklılaşmış hücreler yüksek orandaotofajistres yokluğunda bile. Önceki bir çalışma, AngII'nin, şartlı olarak ölümsüzleştirilmiş bir murin podosit hücre hattında reaktif oksijen türlerinin üretilmesi yoluyla otofajiyi desteklediğini göstermiştir.60 Reaktif oksijen türlerinin üretimi, gerçekten de birçok hücre tipinde genel bir otofaji indükleyicisidir ve bizim bulgularımız ile bu tür tutarsızlığın nedenleri şunlardır: belirsiz. Bu son çalışmanın aksine, biz sıçangil hücre dizilerini değil, podosin ve nefrin ekspresyonunu ve in vivo yaklaşımları koruyan murin primer kültürlü podositleri kullandık. Postmitotik podositlerin alışılmadık derecede yüksek düzeyde yapısalotofaji. Lizozomal inhibitörlerin varlığında veya yokluğunda AngII stimülasyonundan sonra artan LC3-II miktarının ölçümü, otofajik akışın arttığını veya bloke edildiğini belirlemek için gereklidir. Önceki çalışmalar bu fenomeni ihmal etmiştir.60

Şekil 7 |kalpastatinaşırı ekspresyon, yeşil FL floresan proteini (GFP)-LC3 farelerinde anjiyotensin II (AngII) D yüksek tuzlu diyet (HSD) aracılı podosit hasarını önler. (a) AngII + HSD, CSTTg (kalpastatin transgenik) GFP-LC3 farelerine kıyasla GFP-LC3 farelerinde albüminüride dramatik bir artışla sonuçlandı. n=8 genotip başına 13 fare. Değerler, ayrı grafikler ve ortalama±SEM olarak sunulur. İki yönlü varyans analizi: genotip, P=0.0429; zaman, P=0.0165. Sidak'ın çoklu karşılaştırma testi: 28. günde CSTTg GFP-LC3 farelerine karşı GFP-LC3 için P=0.0453. (b,c) Wilmʼs Tümörü 1 (WT1; yeşil) ve nefrin ekspresyonunun temsili immünofloresan görüntüleri (NPHS1) (kırmızı), 6 haftalık AngII infüzyonundan sonra 18-haftalık GFP-LC3 ve CSTTg GFP-LC3 farelerinden glomerüllerde + HSD. Çekirdekler Hoechst (mavi) ile boyandı. Çubuklar=50 mm. (d) Glomerüler bölüm başına NPHS1+ alanının ve (e) 6 haftalık AngII infüzyonundan sonra 18-haftalık GFP-LC3 ve CSTTg GFP-LC3 farelerinde glomerüler bölüm başına WT1+ hücre sayısı + HSD. n=19 GFP-LC3 faresi ve n=25 CSTTg GFP-LC3 faresi. Değerler, ayrı grafikler ve ortalama±SEM olarak sunulur. Eşit SD ile eşleştirilmemiş t testi: **P=0.0010 (d), P= 0.1158 (e). (f,g) 6 haftalık AngII + HSD sonrasında GFP-LC3 ve CSTTg GFP-LC3 farelerinden glomerüllerin transmisyon elektron mikroskobu görüntüleri. Ok uçları, ayak işleminin silinmesini gösterir. Çubuklar=1 mm. (h) Glomerüler bazal membranın (GBM) mikrometresi başına ayak proseslerinin sayısının niceliği. genotip başına n=3 fare. Değerler, ayrı grafikler ve ortalama SEM olarak sunulur. Her çizim, 1 sürekli GBM uzunluğunda GBM'nin mikrometresi başına ortalama podosit sayısını temsil eder. Eşit SD ile eşleştirilmemiş t testi: P=0.7512. Bu resmin görüntülenmesini optimize etmek için lütfen bu makalenin çevrimiçi versiyonuna bakın: www.böbrek-international.org.

Burada, AngII perfüzyon ve HSD'ye dayalı bir hipertansif model kullandık. Podositler AT1 reseptörleri sergiler ve AngII.13,16,26,61-65 gibi serbestçe filtrelenmiş peptitlere maruz kalırlar. özel RAAS. Benzer şekilde, in vivo çalışmalar, AngII'nin podosit hasarı üzerindeki etkisini ve AT1'in podosit spesifik gen hedeflemesini doğruladı, deneysel lupus nefritinde glomerüldeki AT1 reseptörlerinin aktivasyonunun hızlandırmak için yeterli olduğunu gösterdi.böbrekhipertansiyon yokluğunda yaralanma.66,67 Kalpain aracılıotofajimodelimizdeki düzensizlik, podositler üzerindeki doğrudan AngII-AT1 sinyaliyle bağlantılı olabilir veya hipertansiyonun bir sonucu olabilir. Bu soruya erken bir cevap verebiliriz. Gerçekten de, DOC-tuz modelinde, hipertansif farelerden podositlerde P62 birikimi de bulduk (Ek Şekil S3). Bu, AngII'den bağımsız olduğu varsayılan bu modeldeki podositlerde otofaji blokajının meydana geldiğini göstermektedir.68 Podositlerde AT1 eksikliği olan farelerde kalpain aktivitesine ve otofajik dışa akıma ilişkin podosit hasarını değerlendiren ileri çalışmalar, böyle bir düzenlemenin olup olmadığını belirlemek için gerekli olacaktır. podosit otofajisi, AngII'nin doğrudan veya dolaylı etkilerine bağlıdır.

Şekil 8 |kalpastatinaşırı ekspresyon, anjiyotensin II (AngII) D yüksek tuzlu diyet (HSD) ile indüklenenotofajipodositlerde aşağı regülasyon. (a,b) Yeşil FL floresan proteini (GFP)–LC3 ve CSTTg'den glomerüllerde P62 (yeşil) ve Podocalyxin (PODXL; kırmızı) ifadesinin temsili immünofloresan görüntüleri (kalpastatintransgenik) 6 haftalık AngII + HSD'den sonra GFP-LC3 fareleri. Asal olan şekil alt bölümleri daha yüksek büyütmeyi gösterir. Çekirdekler Hoechst (mavi) ile boyandı. Çubuklar=50 mm. (c,d) Glomerüler bölüm başına P62+ alanının niceliği. (c)'de n=9 vahşi tip (WT) fare ve n=7 CSTTg fare ve n=16 GFP-LC3 fare ve n=16 CSTTg GFP-LC3 fare (d) içinde. Değerler, ayrı grafikler ve ortalama±SEM olarak sunulur. Mann-Whitney testi: (c)'de **P=0.0033, (d)'de **P=0.0011. (e,f) 6 haftalık AngII + HSD'den sonra GFP-LC3 ve CSTTg GFP-LC3 farelerinden glomerüllerde GFP (yeşil) ve P62 (kırmızı) ifadesinin temsili immünofloresan görüntüleri. Asal olan şekil alt bölümleri daha yüksek büyütmeyi gösterir. Ok uçları GFPþ P62þ otofagozomlarını göstermektedir. (g) Podosit başına LC3+ P62+ nokta sayısının niceliği. n=11 GFP-LC3 fareleri ve n=16 CSTTg GFP-LC3 fareleri. Değerler, ayrı grafikler ve ortalama±SEM olarak sunulur. Eşit SD ile eşleştirilmemiş t testi: P=0.1014. Bu resmin görüntülenmesini optimize etmek için lütfen bu makalenin çevrimiçi versiyonuna bakın: www.böbrek-international.org.

Tablo 1|Özel RT2 Profiler PCR Dizisi

Kalpain-1 ve kalpain-2, aktivitesi aşağıdakiler tarafından kontrol edilen her yerde bulunan proinflamatuar proteazlardır.kalpastatin, onların spesifik inhibitörü. Gerçekten de kalpastatin, kalpainleri seçici olarak inhibe eder ve bugüne kadar başka hiçbir proteazı inhibe etmez. Kalpain aktivasyonu yakın zamandaböbrekçeşitli patolojik bağlamlarda yaralanma.69,70 Kalsiyum kanalı taşıyıcı geçici reseptör potansiyel kanalı C6'nın, Ca2+/kalsinörin aktivasyonu yoluyla podositlerde kalpaini-1 aktive ettiği bulundu. Fokal ve segmental glomerülosklerozlu hastaların böbreklerinde geçici reseptör potansiyel kanal C6 ekspresyonu artmış, kalpain ve kalsinörin aktivitesinde artış ve podosit hücre iskeleti stabilitesi için kritik olan kalpain hedef talinin-1 ekspresyonu azalmıştır.71 Geçici reseptör potansiyel kanalı C6 ayrıca kalpain-1 ve kalpain-2'e doğrudan bağlanır. Bu etkileşim, talin-1 bölünmesinin düzenlenmesi ve podositlerin hareketliliğinin kontrol edilmesi için çok önemlidir.72

Aşırı ifade eden transgenik farelerkalpastatinvasküler yeniden şekillenmeye ve AngII'ye bağlı inflamasyona karşı korunur73; glomerülonefrit,43 sepsis,74 veya allogreft reddi75 modellerinde iltihaplanmaya karşı; ve yaşa bağlı iltihaplanmaya karşı.76 Bu farelerde podosit hasarı araştırılmamıştır. Peltier et al. fazla ifade edildiğini göstermiştir.kalpastatinböbreklerde AngII'ye bağlı perivasküler inflamasyonu önledi.43 Bu nedenle, CSTTg farelerinde böbrek korumasına, en azından kısmen, bir anti-inflamatuar mekanizma aracılık edebilir. Modelimizde makrofajları ve lenfosit infiltrasyonunu değerlendirdik veböbrekküresel analiz edilirken CSTTg ve kontrol fareleri arasındaki iltihaplanmaböbreklökosit infiltrasyonu (Ek Şekil S6).

Kalpain yakın zamanda otofaji düzenlemesinde yer aldı (son zamanlarda Weber ve ark.53'te gözden geçirildi), kalpain inhibisyonunun diyabetik bağlamda ilginç ve biyo-koruyucu özellikleri ile restorasyonu yoluyla.otofaji.77 Burada kalpain inhibisyonununkalpastatinaşırı ekspresyon (i) hipertansiyon sırasında podosit hasarını önledi ve (ii) podositlerde otofajiyi restore etti, böylece hipertansiyon sırasında kalpain aktivasyonunun yeni bir zararlı rolünü vurguladı.otofaji.

Neredeyse tüm ATG proteinlerinin kalpainler tarafından in vitro olarak parçalandığı gösterilmiştir. 78 Burada şunu varsaydık:otofajihipertansif CSTTg farelerinde idame kalpain inhibisyonu aracılık etti. Hipotezimizi desteklemek için, CSTTg'den gelen podositlerin in vitro AngII ile tehdit edildiğinde kalpain aktivitesinin azaldığını gösterdik (Şekil 3c). CSTTg farelerinden alınan podositlerde ATG5 protein seviyesinin arttığını bulduk, bu da kalpastatin aşırı ekspresyonunun bu bağlamda kalpain aracılı ATG5 bölünmesini önlediğini gösterir (Şekil 5a). Buna karşılık, gösterildi kikalpastatin-aracılı kalpain inhibisyonu, proteaz aktivitelerinin inhibisyonundan bağımsız olabilir79; bu nedenle, kalpain enzimatik aktivitesinden bağımsız olarak otofajinin kalpastatin tarafından düzenlenmesini dışlayamadık.

Özetle, bu bulgular daha önce tanınmayan bir rolü ortaya çıkardı.kalpastatinpodosit düzenlenmesindeotofajive hipertansif nefropatiler sırasında podosit sağkalımını artırmak için yeni terapötik stratejilerin araştırılması için bir yol sağladı.

AÇIKLAMA

Tüm yazarlar rakip çıkarlar beyan etmemiştir.

TEŞEKKÜRLER

Bu çalışma Institut National de la Santé Et de la recherche Médicale (Inserm) ve Université de Paris tarafından desteklenmiştir. IB, Ministère de l'EducationNationale, de la Recherche et de la Technologie'den bir yüksek lisans bursu ile desteklenmiştir. OL, Avrupa Diyabet Araştırmaları için EFSD/Novo Nordisk Programı tarafından desteklenen bir Avrupa Diyabet Araştırmaları Vakfı (EFSD) ödülü ve Société Francophone duDiabète (SFD) tarafından finanse edilmiştir. BR ve CH, Avrupa Araştırma Konseyi ve Avrupa Birliği'nden (P-LT) 107037 Başlangıç ​​Hibesi ile finanse edildi. YS, Fondation de France'dan bir yüksek lisans bursu ile desteklenmiştir.

Elizabeth Huc, Nicolas Perez, Corina Suldac ve ERIU970 ekibine (Université de Paris, PARCC, Inserm, Paris, Fransa) hayvan bakımı ve muamelesi konusundaki yardımlarına, Nicolas Sorhaindo'ya biyokimyasal ölçümler için (ICB-IFR2, Laboratoire de Biochimie, Hôpital Bichat) teşekkür ederiz. , Paris, Fransa) ve Alain Schmitt ve Jean-Marc Masse transmisyon elektron mikroskobu için (Institut Cochin, Paris, Fransa). Siliko analizindeki yardımları için Morgane Le Gall'e (Cochin proteomik tesisi 3P5, Paris,Fransa) teşekkür ederiz. Véronique Oberweis, Bruno Pillard ve Cyrille Mahieux'den (Université de Paris, PARCC, Inserm, Paris, Fransa) idari desteği kabul ediyoruz.

EK MATERYAL

Ek Dosya (PDF)

Şekil S1. Birincil podosit kültürü, podosit belirteçlerini ifade eder. WT ve CSTTg farelerinden birincil podosit kültüründe podosit belirteçleri NPHS1 ve NPHS2 ekspresyonunun Western blot analizi. Tubulin (TUBA) bir yükleme kontrolü görevi görür. Genotip başına n=4 farenin temsilcisi.

Şekil S2. Yüksek bazal podosit seviyesiotofaji. (A, B) Öldürmeden 4 saat önce CQ (80mg/kg) ile tedavi edilen veya edilmeyen GFP-LC3 farelerinden alınan glomerüllerde GFP (yeşil) ve NPHS1 (kırmızı) ifadesinin temsili immünofloresan görüntüleri. Ok uçları GFPþ otofagozomlarını göstermektedir. (C,D) Öldürmeden 4 saat önce CQ (80mg/kg) ile tedavi edilen veya edilmeyen GFP-LC3 farelerinden alınan glomerüllerde GFP (yeşil) ve P62 (kırmızı) ifadesinin temsili immünofloresan görüntüleri. Ok uçları GFPþ P62þ otofagozomlarını göstermektedir. (A–D) (0 ) daha yüksek büyütmeyi temsil eder. Çekirdekler Hoechst (mavi) ile boyandı. çubuk=50 mm. Koşul başına N=4 fare (E–H) Tedavi edilen (F, H) veya uygulanmayan (E, G) GFP-LC3 farelerinden alınan birincil podositlerde GFP (yeşil) ve P62 (kırmızı) ifadesinin temsili immünofloresan görüntüleri ) 4 saat boyunca Bafifilomycin A1 (100 nM) ile. Koşul başına N=5 fare.

Şekil S3. P62, hipertansiyonun DOC-tuz modelinde podositlerde birikir. (A–C) 2 ila 6 haftalık DOC-tuz modelinden sonra WT farelerinden glomerüllerde P62 (yeşil) ve PODXL (kırmızı) ifadesinin temsili immünofloresan görüntüleri. (0 ) daha yüksek büyütmeyi temsil eder. Çekirdekler Hoechst (mavi) ile boyandı. Çubuk ¼ 50 mm. (D) Podosit alanı başına P62 alanının miktarı (yüzde). Koşul başına N=5–6 fare. Tek yönlü varyans analizi: zaman P=0.0059, Sidak'ın çoklu karşılaştırma testi: D42 ile D14 **P=0.0055, D28 ile D14 P=0.8590.

Şekil S4. podositotofajipodosit gelişimi için vazgeçilmezdir. (A) Sistolik kan basıncı, (B) idrar albümin-kreatinin oranı ve (C) Atg5lox/lox ve Nphs2.cre Atg5lox/lox farelerinde kan üre nitrojen seviyeleri. Genotip başına N=5–6 fare. Değerler ayrı grafikler ve ortalamalar olarak sunulur±SEM. Mann-Whitney testi: P=0.7273 (A), P=0.4286 (B) ve P=0.6623 (C). (D–E) Atg5lox/lox ve Nphs2.cre Atg5lox/lox farelerinden Masson'un trikrom lekeli glomerül bölümlerinin temsili görüntüleri. (F–G) Atg5lox/lox ve Nphs2.cre Atg5lox/lox farelerinde PODXL (yeşil) ve WT1 (kırmızı) ifadesinin temsili immünofloresan görüntüleri. Çekirdekler Hoechst (mavi) ile boyandı. (D–G) Çubuk=50 mm. Genotip başına N=6 fare. (H–I) Atg5lox/lox ve Nphs2.cre Atg5lox/lox farelerinden glomerüllerin transmisyon elektron mikroskobu bölümlerinin temsili fotomikrografları. çubuk=1 mm. Genotip başına N=3 fare.

Şekil S5.kalpastatinaşırı ifade etkilemezböbrekbaşlangıçta işlev. 12-haftalık GFP-LC3 ve CSTTg GFP-LC3 farelerinde (A) kan üre nitrojeni ve (B) plazma albümin seviyeleri. N=5 GFP-LC3 ve N=6 CSTTg GFP-LC3. Değerler ayrı grafikler ve ortalamalar olarak sunulur±SEM. Mann-Whitney testi: P=0.6623 (A) ve P=0.9307 (B). (C,D) GFP-LC3 ve CSTTg GFP-LC3 farelerinden Masson'un trikrom lekeli glomerül bölümlerinin temsili görüntüleri. (E–H) GFP-LC3 ve CSTTg GFP-LC3 farelerinde PODXL (E, F) ve NPHS1 (G, H) ifadesinin temsili immünofloresan görüntüleri. (C–H) Çubuk=50 mm. (I, J) Glomerüler bölüm başına PODXL ve NPHS1 alanının ilişkili kantifikasyonu. N=5 GFP-LC3 ve N=6 CSTTg GFP-LC3. Değerler ayrı grafikler ve ortalamalar olarak sunulur±SEM. Mann-Whitney testi: P=0.1898 (A) ve P=0.8413 (B).

Cistanche-böbrek fonksiyonu

Şekil S6.kalpastatinaşırı ekspresyon, global böbrek iltihabını etkilemez. 6 haftalık Anjiyotensin II +HSD'den sonra GFP-LC3 ve CSTTg GFP-LC3 farelerinde F4/80 (A, B) ve CD3 (D–E) ifadesinin temsili immünohistokimyası. çubuk=200 mm. (C, F) F4/80 ve CD3 alanının ilişkili kantifikasyonuböbrekbölüm. N=7 CSTTg GFP-LC3 ve N=8 GFP-LC3 fareleri. Değerler ayrı grafikler olarak sunulur ve SEM anlamına gelir. Mann-Whitney testi: P=0.3969 (C) P= 0.3357 (F).

Şekil S7. podositotofajideficiency does not induce ER stress or oxidative stress in young adults at baseline. qPCR analysis of the mRNA expression of genes of the ER stress, oxidative stress, and apoptosis pathway by Qiagen qPCR array in glomeruli from WT and Nphs2.cre Atg5lox/lox mice (A) and WT and CSTTg mice (B). N=4 mice per genotype. For Nox3, Ct >33.

Tablo S1. Kalpain bölünme bölgelerinin silico olarak öngörülmesi. Kalpain bölünme bölgeleri, GPS-CCD (//ccd.biocuckoo.org), CaMPDB (HTTP:// calpain.org) ve DeepCalpain Predict (//deepcalpain. kanserbiyo. info/help.php). Ek Dosya (Excel)

Ek Tablo S2. Kalpain bölünme sitelerinin in silico prevision tam dosyası. Kalpain bölünme bölgeleri, podositle ilişkili veotofajiGPS-CCD (http://ccd. biocuckoo.org), CaMPDB (http://calpain.org) ve DeepCalpain Predict (http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php) ile ilişkili proteinler. GPS-CCD ve DeepCalpain Predict için her protein için tahmin bölünme bölgeleri yeniden başlatılır.

REFERANSLAR

1. Coresh J, Selvin E, Stevens LA, et al. Kronik prevalansıböbrekAmerika Birleşik Devletleri'nde hastalık. JAMA. 2007;298:2038–2047.

2. Collins AJ, Vassalotti JA, Wang C, et al. KBH taraması için kimler hedeflenmelidir? Diyabet, hipertansiyon ve kardiyovasküler hastalıkların etkisi. J Böbrek Dis. 2009;53:S71–S77.

3. Chang TI, Li S, Chen SC, et al. Albüminürisi olan ve olmayan korunmuş tahmini GFR'si olan bireylerde ESRD için risk faktörleri: Böbrek Erken Değerlendirme Programının (KEEP) sonuçları. J Böbrek Dis. 2013;61:S4–S11.

4. Hsu CY, McCulloch CE, Darbinian J, et al. Başlangıç ​​böbrek hastalığı olmayan kişilerde yüksek kan basıncı ve son dönem böbrek hastalığı riski. Arch Stajyer Med. 2005;165:923–928.

5. Nagase M, Shibata S, Yoshida S, et al. Dahl tuzu-hipertansif sıçanların glomerülopatisinin altında podosit hasarı yatar ve aldosteron bloker tarafından tersine çevrilir. Hipertansiyon. 2006;47:1084-1093.

6. Garovic VD, Wagner SJ, Turner ST, et al. Preeklampsi için bir belirteç olarak idrar podosit atılımı. J Obstet Gynecol'um. 2007;196, 320.e321–e327.

7. Craici IM, Wagner SJ, Bailey KR, et al. Podositüri, proteinüri ve preeklampsinin klinik özelliklerinden önce gelir: uzunlamasına prospektif bir çalışma. Hipertansiyon. 2013;61:1289–1296.

8. Wang G, Lai FM, Kwan BC, et al. İnsan hipertansif nefrosklerozunda podosit kaybı. J Hipertens miyim? 2009;22:300–306.

9. Wang G, Kwan BC, Lai FM, et al. Hipertansif nefrosklerozlu hastalarda miRNA'ların intrarenal ekspresyonu. J Hipertens miyim? 2010;23:78–84.

10. Ruggenenti P, Perna A, Gherardi G, et al. Kronik proteinürik nefropatiler: farklı böbrek hasarı paternleri olan 352 hastadan oluşan prospektif bir kohortta tedaviye yanıt ve sonuçlar. J Böbrek Dis. 2000;35:1155–1165.

11. Fukuda A, Wickman LT, Venkatareddy MP, et al. Kararsızlaştırılmış glomerüllerden anjiyotensin II'ye bağlı kalıcı podosit kaybı, son aşamanın ilerlemesine neden olurböbrekhastalık. Böbrek İnt. 2012;81:40–55.

12. Tunçdemir M, Öztürk M. Deneysel streptozotosin ile indüklenen diyabetik nefropati sıçan modelinde anjiyotensin-II reseptör blokerlerinin podosit hasarı ve glomerüler apoptoz üzerindeki etkileri. Acta Histochem. 2011;113:826-832.

13. Nijenhuis T, Sloan AJ, Hoenderop JG, et al. Anjiyotensin II, NFAT aracılı bir pozitif geri besleme sinyal yolu aracılığıyla TRPC6 ekspresyonunu artırarak podosit hasarına katkıda bulunur. J Pathol'um. 2011;179:1719–1732.

14. EUCLID Çalışma Grubu. İnsüline bağımlı diyabet ve normoalbuminüri veya mikroalbuminüri olan normotansif hastalarda lisinoprilin randomize plasebo kontrollü denemesi. Lancet. 1997;349:1787-1792.

15. de Zeeuw D, Remuzzi G, Parving HH, et al. Tip 2 diyabetik nefropatili hastalarda renoproteksiyon hedefi olan proteinüri: RENTAL'den dersler. Böbrek İnt. 2004;65:2309-2320.

16. Benigni A, Gagliardini E, Remuzzi G. Anjiyotensin II tarafından indüklenen glomerüler perm seçiciliğindeki değişiklikler, podosit disfonksiyonu ve yarık diyafram proteininin yeniden düzenlenmesi anlamına gelir. Semin Nefrol. 2004;24:131–140.

17. Wang L, Flannery PJ, Spurney RF. Podositlerde anjiyotensin II reseptör alt tiplerinin karakterizasyonu. J Lab Clin Med. 2003;142:313–321.

18. Langham RG, Kelly DJ, Cox AJ, et al. Diyabetik nefropatide proteinüri ve podosit yarık diyafram proteini, nefrin ifadesi: anjiyotensin dönüştürücü enzim inhibisyonunun etkileri. diyabetoloji. 2002;45:1572–1576.

19. Nakamura T, Ushiyama C, Suzuki S, et al. IgA nefropatisi olan hastalarda anjiyotensin dönüştürücü enzim inhibitörü, anjiyotensin II reseptör antagonisti ve kalsiyum antagonistinin idrar podositleri üzerindeki etkileri. J Nephrol'um. 2000;20:373–379.

20. Henger A, Huber T, Fischer KG, et al. Anjiyotensin II, kültürde sıçan podositlerinde sitozolik kalsiyum aktivitesini arttırır. Böbrek İnt. 1997;52: 687-693.

21. Praga M, Hernandez E, Montoyo C, et al. Nefrotik proteinürili hastalarda anjiyotensin dönüştürücü enzim inhibisyonunun uzun vadeli faydalı etkileri. J Böbrek Dis. 1992;20:240–248.

22. Nitschke R, Henger A, Ricken S, et al. Anjiyotensin II, sağlam glomerulusun podositlerinde hücre içi kalsiyum aktivitesini arttırır.BöbrekInt. 2000;57:41–49.

23. Gloy J, Henger A, Fischer KG, et al. Anjiyotensin II, podositlerin hücresel fonksiyonlarını modüle eder. Böbrek Int Suppl. 1998;67:S168–S170.

24. Miceli I, Burt D, Taraba E, et al. Stretch, insan podositlerinde anjiyotensin II-AT (1)'e bağlı bir mekanizma yoluyla nefrin ekspresyonunu azaltır: rosiglitazon etkisi. J Physiol Renal Physiol Am. 2010;298:F381–F390.

25. Endlich N, Endlich K. Gerilme, gerilim ve yapışma—podositlerdeki aktin hücre iskeletinin adaptif mekanizmaları. Eur J Hücre Biol. 2006;85:229–234.

26. Durvasula RV, Petermann AT, Hiromura K, et al. Mekanik bir suş ile podositlerde lokal doku anjiyotensin sisteminin aktivasyonu. Böbrek İnt. 2004;65:30–39.

27. Yükseltici BL, Cortes P, Heilig C, et al. Döngüsel gerdirme kuvveti, kültürlenmiş sıçan mezangial hücrelerinde dönüştürücü büyüme faktörü-beta izoformlarını seçici olarak yukarı düzenler. J Pathol'um. 1996;148:1915–1923.

28. Kretzler M, Koeppen-Hagemann I, Kriz W. Podosit hasarı, tek nefrektomize-desoksikortikosteron hipertansif sıçanda glomerüloskleroz gelişiminde kritik bir adımdır. Virchows Arşivi. 1994;425:181–193.

29. Jung HS, Chung KW, Won Kim J, et al. Otofaji kaybı, pankreas beta hücre kütlesini azaltır ve sonuçta ortaya çıkan hiperglisemi ile işlev görür. Hücre Metab. 2008;8:318–324.

30. Ebato C, Uchida T, Arakawa M, et al.otofajiadacık homeostazında ve yüksek yağlı bir diyete yanıt olarak beta hücre kütlesinin telafi edici artışında önemlidir. Hücre Metab. 2008;8:325–332.

31. Lenoir O, Jasiek M, Henique C, et al. Endotel hücresi ve podosit otofajisi, diyabetin neden olduğu glomerülosklerozdan sinerjistik olarak korur. Otofaji. 2015;11:1130–1145.

32. Hartleben B, Gödel M, Meyer-Schwesinger C, et al. Otofaji, glomerüler hastalık duyarlılığını etkiler ve yaşlanan farelerde podosit homeostazını korur J Clin Invest. 2010;120:1084–1096.

33. Sato S, Kitamura H, Adachi A, et al. Renal biyopsi örneklerinde podositlerde iki tip otofaji: ultrastrüktürel bir çalışma. J Submicrosc Cytol Pathol. 2006;38:167-174.

34. Asanuma K, Tanida I, Shirato I, et al. Umut verici bir otofagosomal belirteç olan MAP-LC3, podositlerin PAN nefrozundan farklılaşması ve geri kazanılması sırasında işlenir. FASEB J. 2003;17:1165–1167.

35. Mizushima N, Levine B, Cuervo AM, et al.otofajiHücresel kendi kendine sindirim yoluyla hastalıklarla savaşır. Doğa. 2008;451:1069–1075.

36. Yang L, Li P, Fu S, et al. Obezitede kusurlu hepatik otofaji, ER stresini arttırır ve insülin direncine neden olur. Hücre Metab. 2010;11:467–478.

37. Xie Z, Klionsky DJ. Otofagozom oluşumu: çekirdek makineler ve uyarlamalar. Nat Cell Biol. 2007;9:1102–1109.

38. Kume S, Thomas MC, Koya D. Besin algılama, otofaji ve diyabetik nefropati. Diyabet. 2012;61:23–29.

39. Kume S, Uzu T, Maegawa H, et al. Otofaji: için yeni bir terapötik hedefböbrekhastalıklar. Clin Exp Nefrol. 2012;16:827-832.

40. Huber TB, Edelstein CL, Hartleben B, et al. ortaya çıkan rolüotofajiböbrek fonksiyonunda, hastalıklarda ve yaşlanmada. Otofaji. 2012;8:1009–1031.

41. Weide T, Huber TB. Glomerüler yaşlanma ve hastalık için otofajinin etkileri. Hücre Dokusu Arş. 2011;343:467-473.

42. Bork T, Liang W, Yamahara K, et al. Podositler, mtor sinyallemesinden bağımsız olarak yüksek bazal otofaji seviyelerini korur. Otofaji. 2020;16:1932– 1948.

43. Peltier J, Bellocq A, Perez J, et al. Kalpain aktivasyonu ve salgılanması, deneysel glomerülonefritte glomerüler hasarı teşvik eder: kanıtkalpastatin-transgenik fareler. J Am Soc Nephrol. 2006;17:3415–3423.

44. Moeller MJ, Sanden SK, Soofifi A, et al. Transgenik farelerde Cre rekombinazın podosit spesifik ekspresyonu. Yaratılış. 2003;35:39–42.

45. Hara T, Nakamura K, Matsui M, et al. Nöral hücrelerde bazal otofajinin baskılanması, farelerde nörodejeneratif hastalığa neden olur. Doğa. 2006;441: 885-889.

46. ​​Lazareth H, Henique C, Lenoir O, et al. Tetraspanin CD9, parietal epitel hücrelerinin göçünü ve çoğalmasını ve glomerüler hastalık ilerlemesini kontrol eder. Nat Komün. 2019;10:3303.

47. Bollee G, Flamant M, Schordan S, et al. Epidermal büyüme faktörü reseptörü, hızla ilerleyen kresentik glomerülonefritte glomerüler hasarı ve böbrek yetmezliğini destekler. Nat Med. 2011;17:1242–1250.

48. Lenoir O, Milon M, Virsolvy A, et al. Endotelinin-1 podositler üzerindeki doğrudan etkisi, diyabetik glomerülosklerozu teşvik eder. J Am Soc Nephrol. 2014;25:1050-1062.

49. Henique C, Bollee G, Lenoir O, et al. Nükleer faktör eritroid 2-ilgili faktör 2, kresentik GN'ye direnç için gerekli olan peroksizom proliferatörü ile aktive edilen reseptör g'nin podosit spesifik ekspresyonunu yönlendirir. J Am Soc Nephrol. 2016;27:172–188.

50. Perez J, Dansou B, Herve R, et al. T lenfositleri tarafından salınan kalpainler, IL-17 ifadesini kontrol etmek için TLR2'yi parçalar. J İmmünol. 2016;196:168–181.

51. Raimbourg Q, Perez J, Vandermeersch S, et al. kalpa/kalpastatinsistem, melanomun büyümesinde ve metastatik yayılımında zıt rollere sahiptir. PLoS Bir. 2013;8:e60469.

52. Letavernier B, Zafrani L, Nassar D, et al. Kalpainler, hızla ilerleyen glomerülonefrit formunda vasküler onarıma katkıda bulunur: dışsallaştırmalarının potansiyel rolü. Arterioscler Tromb Vasc Biol. 2012;32:335–342.

53. Weber JJ, Pereira Sena P, Singer E, et al. Bir taşla iki kızgın kuş vurmak:otofajinörodejeneratif hastalıklarda ve ötesinde kalpainleri inhibe ederek aktivasyon. Biomed Arş. 2019;2019:4741252.

54. Liu Z, Cao J, Gao X, et al. GPS-CCD: kalpain bölünme bölgelerinin tahmini için yeni bir hesaplama programı. PLoS Bir. 2011;6:e19001.

55. duVerle D, Takigawa I, Ono Y, et al. CaMPDB: kalpain ve modülatör proteoliz için bir kaynak. Genom Bilgi. 2010;22:202–213.

56. Liu ZX, Yu K, Dong J, et al. Kalpain bölünme bölgelerinin ve kanserdeki mutasyonların neden olduğu anormalliklerinin kesin tahmini. Ön Genet. 2019;10: 715.

57. Yousefifi S, Perozzo R, Schmid I, et al. Atg5'in kalpain aracılı bölünmesi, otofajiyi apoptoza çevirir Nat Cell Biol. 2006;8:1124-1132.

58. Xia HG, Zhang L, Chen G, et al. ATG5'in kalpain1 aracılı bölünmesi ile bazal otofajinin kontrolü.otofaji. 2010;6:61–66.

59. Russo R, Berliocchi L, Adornetto A, et al. Kalpain aracılı Beclin-1 bölünmesi ve in vivo retina iskemik yaralanmasının ardından otofaji deregülasyonu. Hücre Ölümü Dis. 2011;2:e144.

60. Yadav A, Vallabu S, Arora S, et al. ANG II teşvik ederotofajipodositlerde. J Physiol Cell Physiol Am. 2010;299:C488–C496.

61. Flannery PJ, Spurney RF. Glomerüler podositlerde anjiyotensin II tarafından epidermal büyüme faktörü reseptörünün transaktivasyonu. Nefron Exp Nefrol. 2006;103:e109–e118.

62. Harrison-Bernard LM, Navar LG, Ho MM, et al. Yetişkin sıçanda ANG II AT1 reseptörünün immünohistokimyasal lokalizasyonuböbrekbir monoklonal antikor kullanarak. J Physiol'um. 1997;273:F170–F177.

63. Liebau MC, Lang D, Bohm J, et al. İnsan podositlerinde renin anjiyotensin sisteminin fonksiyonel ifadesi. J Physiol Renal Physiol Am. 2006;290:F710–F719.

64. Pavenstadt H. Franz Volhard Ödülü 2000: podositte anjiyotensin II sinyali. Böbrek Kan Basıncı Arş. 2000;23:156–158.

65. Wennmann DO, Hsu HH, Pavenstadt H. Podositlerde renin-anjiyotensin aldosteron sistemi. Semin Nefrol. 2012;32:377–384.

66. Jia J, Ding G, Zhu J, et al. Anjiyotensin II infüzyonu, nefrin ekspresyonu değişikliklerini ve podosit apoptozunu indükler. J Nephrol'um. 2008;28:500– 507.

67. Crowley SD, Vasievich MP, Ruiz P, et al. Glomerüler tip 1 anjiyotensin reseptörleri, murin otoimmün nefritinde böbrek hasarını ve iltihabı arttırır. J Clin Invest. 2009;119:943–953.

68. Song K, Stuart D, Abraham N, et al. Kanal renininin toplanması, DOCA-tuz hipertansiyonuna veya böbrek hasarına aracılık etmez. PLoS Bir. 2016;11: e0159872.

69. Liu Z, Ji J, Zheng D, et al. Lipopolisakkarit kaynaklı akut dönemde endotel kalpain nakavtının koruyucu rolüböbrekp38-iNOS yolunun zayıflaması ve NO/ROS üretimi yoluyla yaralanma. Exp Mol Med. 2020;52:702– 712.

70. Seremwe M, Schnellmann RG, Bollag WB. Bir adrenal glom rulosa hücre modelinde anjiyotensin II ile indüklenen aldosteron üretiminin altında kalpain-10 aktivitesi yatar. Endokrinoloji. 2015;156:2138–2149.

71. Verheijden KAT, Sonneveld R, Bakker-van Bebber M, et al. Kalsiyum bağımlı proteaz kalpain-1 TRPC6 aktivitesini podosit hasarına bağlar. J Am Soc Nephrol. 2018;29:2099–2109.

72. Farmer LK, Rollason R, Whitcomb DJ, et al. TRPC6, kanal aktivitesinden bağımsız olarak kalpaine bağlanır ve onu aktive eder ve podosit hücre iskeletini, hücre yapışmasını ve hareketliliğini düzenler. J Am Soc Nephrol. 2019;30: 1910–1924.

73. Letavernier E, Perez J, Bellocq A, et al. Anjiyotensin II'nin neden olduğu hipertansiyonda kardiyovasküler yeniden şekillenmeyi önlemek için yeni bir strateji olarak kalpain/kalpastatin sistemini hedeflemek. Çevre Res. 2008;102:720–728.

74. Zafrani L, Gerotziafas G, Byrnes C, et al.kalpastatinprokoagülan mikropartikül salınımını sınırlayarak polimikrobiyal sepsisi kontrol eder. J Respir Crit Care Med. 2012;185:744–755.

75. Letavernier E, Dansou B, Lochner M, et al. Akut allogreft reddinde kalpain/kalpastatin dengesinin kritik rolü. Eur J İmmünol. 2011;41: 473–484.

76. Hanouna G, Mesnard L, Vandermeersch S, et al. Spesifik kalpain inhibisyonu,böbrekiltihaplanmaya karşı. Bilim Temsilcisi 2017;7:8016.

77. Ong SB, Lee WH, Shao NY, et al. Kalpain inhibisyonu geri yüklerotofajive diyabetik endo the liopatinin bir insan iPSC modelinde mitokondriyal parçalanmayı önler. Kök Hücre Temsilcisi 2019;12:597–610.

78. Norman JM, Cohen GM, Bampton ET. Yüksek proteinlerin hücre ölümü proteazları tarafından in vitro bölünmesi. Otofaji. 2010;6:1042–1056.

79. De Tullio R, Averna M, Pedrazzi M, et al. Kalpain-kalpastatin kompleksinin L-domeni tarafından diferansiyel düzenlenmesikalpastatin. Biochim Biophys Acta. 2014;1843:2583–2591.