Cistanche Deserticola Formül Granüllerinin Karakteristik HPLC-MS Profili
Oct 13, 2025
Yazarlar: Mao Dan; Yu Hong; Mao Xiuhong; Hu Qing; Ji Shen*
Üyelik: Şanghay Gıda ve İlaç Kontrol Enstitüsü; Geleneksel Çin İlaçlarının Kalite Kontrolüne Yönelik NMPA Anahtar Laboratuvarı, Şanghay 201203, Çin
Soyut
Cistanche Deserticola formül granülleri için karakteristik bir kromatografik profil oluşturma yöntemi, HPLC-MS'ye dayalı olarak oluşturulmuştur. Referans olarak doğrulanmış Cistanche Deserticola kaynatma parçaları ve bir ekinekosid referans maddesi kullanılarak, on parti numune doğrudan %50 metanol ile ekstre edildi ve HPLC ile analiz edildi. Ayırma, 1,0 mL/dak, 30 derecede asetonitril-%0,1 formik asit gradyanı ve 330 nm'de UV tespiti ile bir Phenomenex Luna C18 kolonu (4,6 mm x 250 mm, 5 μm) üzerinde gerçekleştirildi. Dokuz ortak tepe noktasına sahip bir referans karakteristik kromatogram oluşturuldu; bunların arasında beş tepe noktası LC/Q‑TOF‑MS ile tanımlandı. On grup, 0,981'den büyük veya ona eşit benzerlik gösterdi. Karakteristik profilin kesinlik, stabilite ve tekrarlanabilirlik ölçümleri tatmin ediciydi. Yöntem basittir, Cistanche Deserticola formülü granüllerini etkili bir şekilde tanımlar ve kalite değerlendirmesi için kullanılabilir.
Anahtar Kelimeler: Cistanche Deserticola; formül granülleri; karakteristik kromatogram; ekinakozid; verbascoside (acteoside); HPLC; LC–Q‑TOF‑MS; cistanche'nin faydaları; satılık en iyi cistanche
Cistanche'nin Tanıtımı
Cistanche (Rou Cong Rong)böbrek tonlayıcı, öz besleyici ve müshil etkileri olan ünlü bir geleneksel Çin tıbbı (TCM) toniktir. İlk olarak Shennong'un Materia Medica Klasik'inde kaydedildi ve üstün dereceli bir ilaç olarak listelendi. Çin Halk Cumhuriyeti Farmakopesi'nin 2020 baskısı (Bölüm I), orijinal kaynakları Cistanche Deserticola YC Ma veya Cistanche tubulosa (Schenk) Wight'ın kurutulmuş, pullu, etli sapları olarak tanımlar ve ham ürün ve şarapla işlenmiş ürünü içeren işleme yöntemlerine sahiptir. Başlıca kimyasal bileşenler arasında nöroproteksiyon, yaşlanma karşıtı, hepatoproteksiyon ve laksasyon gibi farmakolojik aktiviteleri destekleyen feniletanoid glikozitler (PhG'ler), iridoidler, lignanlar ve şekerler; klinik uygulama umutları geniştir. Bunlar arasında PhG'ler en aktif bileşenlerdir.
Cistanche Deserticola formülü granülleri, klinik reçetelerde kullanılmak üzere modern üretim teknikleri kullanılarak işlenmiş C. Deserticola'dan hazırlanan tek bitki granülleridir. Şu anda kalite kontrollerine yönelik ulusal bir standart bulunmamaktadır. Önceki çalışmalarda C. tubulosa formül granülleri için içerik belirleme yöntemleri veya parmak izi rapor edilmişti, ancak özellikle C. Deserticola formül granülleri için karakteristik kromatogramlara ilişkin literatür yoktu. Bu çalışmada, ilk kez C. Deserticola formül granülleri için bir HPLC karakteristik profili oluşturmak üzere on parti toplandı ve LC-MS ile beş tepe noktası belirlendi. Bu profil, C. Deserticola formül granüllerinin sıkı kalite kontrolü için etkili ve bilimsel bir temel sağlar.
Deneysel cistanche
1.1 Cihazlar ve reaktifler
UV–Vis dedektörlü ve ChemStation'lı Agilent 1100 HPLC (Agilent, ABD)
ESI kaynağına sahip Agilent 1290 Infinity HPLC ve Agilent 6530 Q‑TOF MS (Agilent, ABD)
Sartorius elektronik terazisi (Sartorius Scientific Instruments, Pekin, Çin)
Elmasonic P ultrasonik temizleyici (Elma, Almanya)
Cistanche Deserticola'nın referans kaynatma parçaları ve ekinakosid ve verbaskosidin (acteoside) referans maddeleri, Ulusal Gıda ve İlaç Kontrolü Enstitüleri'nden satın alınmıştır (seri numaraları. 121101‑201603, 111670‑201907, 111530‑201914). Cistanoside A, tubulosid A ve isoverbascoside, Shanghai Tauto Biotech'ten elde edildi (parti No'ları. 21040621, 20061231, 21040824). Asetonitril (HPLC sınıfı) Merck'tendi; diğer reaktifler analitik saflıktaydı (Şanghay Lingfeng Kimyasal Reaktifleri). On parti C. Deserticola formül granülü (PFKL1-PFKL10), üç parti C. Deserticola kaynatma parçası (YP1-YP3) ve üç parti C. Deserticola standart kaynatma (BZTJ1-BZTJ3) Shanghai Wanshicheng Pharmaceutical Co., Ltd. tarafından sağlandı.
1.2 Çözümlerin hazırlanması
1.2.1 Referans çözümleri
Referans bitki çözeltisi: 1 g kimliği doğrulanmış C. Deserticola kaynatma parçasını tıpalı konik bir şişeye tartın, 25 mL %50 metanol ekleyin, 30 dakika boyunca sonikasyona tabi tutun (250 W, 35 kHz), soğutun, karıştırın ve santrifüjleyin. Süpernatantı referans bitki çözeltisi olarak kullanın.
Referans madde çözeltisi: Ekinekozidi %50 metanolde 0,2 mg/mL'de hazırlayın.
1.2.2 Test çözümü
Numuneyi öğütün; Yaklaşık 1 g'ı 100 mL'lik amber renkli bir ölçülü şişeye doğru bir şekilde tartın. 50 mL %50 metanol ekleyin, durdurucuyla çalkalayın, tartın, 30 dakika bekletin ve 40 dakika (250 W, 35 kHz) sonikasyon uygulayın. Soğumaya bırakın, yeniden tartın ve kaybedilen ağırlığı %50 metanolle telafi edin. Analiz için sonraki süzüntüyü karıştırın, bekletin, filtreleyin ve toplayın.
1.3 Enstrümantal koşullar
Kromatografik koşullar: Phenomenex Luna C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm); mobil faz A: asetonitril; mobil faz B: suda %0,1 formik asit; gradyan elüsyonu: 0–5 dakika, %12 A; 5–15 dakika, %12→%20 A; 15–30 dakika, %20→%30 A. Akış hızı 1,0 mL/dak; algılama dalga boyu 330 nm; sütun sıcaklığı 30 derece; enjeksiyon hacmi 10 μL. Ekinekozit zirvesi üzerinden hesaplanan teorik plakalar 5000'den büyük veya ona eşit olmalıdır.
Not: Orijinal metinde "15–30 dk, %20→%30 A" iki kez listelenir; bu tek bir adım olarak yorumlanır.
Kütle spektrometrik koşullar: Pozitif iyon modunda ESI; tarama aralığı m/z 50–1200. Kaynak ayarları: nebülizör (N2) 35 psi; kurutma gazı (N2) 200 derecede 15 L/dak; kılıf gazı (N2) 350 derecede 12 L/dak; kılcal 3,5 kV; parçalayıcı 125 V; 10, 20 ve 40 eV'de MS/MS çarpışma enerjileri (CID).
Sonuçlar ve tartışma
2.1 Numune ön işlemi ve tespit dalga boyu
Ekstraksiyon solventleri (metanol, %75 metanol, %50 metanol, %25 metanol), ekstraksiyon modları (ultrasonikasyon, geri akış) ve süreleri (10, 20, 40, 60 dakika) karşılaştırıldı. Optimum ön işlem, 40 dakikalık ultrasonikasyonla %50 metanoldü. C. Deserticola'daki PhG'ler 330 nm'de maksimum UV emilimi gösterdiğinden, tespit için 330 nm seçildi.
2.2 Kromatografik koşulların seçimi
2.2.1 Sütunlar
Zorbax SB‑C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm), Kromasil 100‑5‑C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm) ve Phenomenex Luna C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm) yeterli ayırma sağladı ve sistem uygunluğunu karşıladı; karakteristik zirvelerin bağıl alıkonma süreleri (RRT'ler) belirtilen değerlerin ±%10'u dahilindeydi. Laboratuvarlar bunlar arasından seçim yapabilir.
2.2.2 Mobil faz
Metanol-%0,1 formik asit, ekinekosid hariç çoğu pik için zayıf ayırma sağladı; bu nedenle asetonitril-%0,1 formik asit benimsendi ve Bölüm 1.3'teki gradyana göre optimize edildi; böylece optimum çözünürlük, plaka sayıları ve stabil bir taban çizgisi sağlandı. 30 dakika sonra başka pikler ellenmediğinden, başlangıç kompozisyonunda yeniden dengeleme başlatıldı.
2.3 Hassasiyet, tekrarlanabilirlik ve kararlılık
PFKL1 serisi kullanılarak Bölüm 1.2.2'ye göre hazırlanan test çözeltisi Bölüm 1.3 koşulları altında altı kez enjekte edildi. RRT'lerin RSD'leri ve dokuz karakteristik zirve için göreceli zirve alanlarının tümü<1%, indicating good instrumental precision. Six independently prepared test solutions of PFKL1 yielded RSDs <1% for both RRTs and relative peak areas, demonstrating repeatability. Stability testing at 0, 3, 9, 14, 21, and 28 h showed RSDs <1% for RRTs and relative peak areas, indicating the test solution was stable within 0–28 h.
2.4 Karakteristik kromatogramın ve teknik parametrelerin oluşturulması
2.4.1 Referans karakteristik kromatogramı
On grup C. Deserticola formülü granülü, referans bitki çözeltisindeki alıkonma süresi açısından dokuz zirveye karşılık gelen dokuz karakteristik zirveyi tutarlı bir şekilde sergiledi (Şekil 1-2). Standartlara göre ekinekozit, cistanosid A, tubulozit A, verbaskosit (akteozit) ve izoverbaskozit olarak beş pik belirlendi. Ekinakozit piki, toplam pik alanının büyük ve stabil bir oranına katkıda bulundu ve referans madde olarak seçildi. On partideki kromatografik davranış esasen tutarlıydı.
A.Blanksolution;B.Echinacoside;C.Testsolution;D.Cistanchedeserticola;E.Referans karakteristik kromatogram.
Cistanche Tubulosa Teknik Özellikler Listesi
2.4.2 Pik tanımlama
Test çözümleri (Bölüm 1.2.2) LC-MS ile hem pozitif hem de negatif ESI modlarında analiz edildi; pozitif mod daha zengin tepe bilgisi sağladı ve kullanıldı (Şekil 3). Toplamda dokuz bileşik tanımlandı; beşi standartlar kullanılarak kesin kütle, alıkonma süresi ve MS/MS fragmanları ile doğrulandı (Tablo 1). PhG'lerin C. Deserticola'daki ana aktif maddeler olduğu ve formül granüllerinin sulu ekstraksiyonla hazırlandığı göz önüne alındığında, LC/Q‑TOF‑MS, PhG'lerin ana bileşenler olduğunu doğruladı. Buna göre dokuz karakteristik tepe noktası kataloglandı ve nispeten güçlü tepkilere sahip beş tepe noktası referans kromatogramında açıklandı.
Şekil 2 HPLCreferanskarakteristikkromatogram 3(S):Echinacoside;4:CistanosideA;5:TubulosideA; 6:Akteozit;7:İzoakteozit.
Şekil 3 Test çözeltisinin ekstraksiyon akım kromatogramı 3(S):Echinacoside;4:CistanosideA;5:TubulosideA;6:Akteosid;7:İzoakteosid.
2.4.3 Belirtilen göreceli saklama süreleri
On seriye dayalı olarak, ortalama RRT'ler (S zirvesine, yani ekinekoside göre) şu şekildeydi: 0,77 (Zirve 1), 0,86 (Zirve 2), 1,00 (Zirve 3, S), 1,17 (Zirve 4), 1,27 (Zirve 5), 1,32 (Zirve 6), 1,44 (Zirve 7), 1,67 (Zirve) 8) ve 1,81 (Zirve 9). Her pikin RRT'si belirtilen değerin ±%10'u dahilinde olmalıdır.
Tablo 1. Kromatografik Tepe Kütle Spektrometresi Parametreleri ile İlgiliCistanche DeserticolaFormül Granülleri
| Doruğa ulaşmak | İsim | Moleküler Formül | m/z | Saklama Süresi (dk) |
|---|---|---|---|---|
| 1 | Bilinmiyor | C₅₁H₃₆O₁₁ | 824.2258 | 6.123 |
| 2 | Bilinmiyor | C₃₆H₃₀O₈ | 590.1941 | 6.876 |
| 3 | Ekinekozit | C₃₅H₄₆O₂₀ | 809.2467 | 13.646 |
| 4 | Cistanosid A | C₃₆H₄₈O₂₀ | 823.2642 | 16.285 |
| 5 | Tubulosid A | C₃₇H₄₈O₂₁ | 851.2570 | 17.947 |
| 6 | Akteozit | C₂₉H₃₆O₁₅ | 647.1931 | 18.464 |
| 7 | İzoakteozit | C₂₉H₃₆O₁₅ | 647.1956 | 20.083 |
| 8 | Bilinmiyor | C₃₁H₃₈O₁₆ | 689.2044 | 23.446 |
| 9 | Bilinmiyor | C₃₁H₃₈O₁₆ | 689.2041 | 25.883 |
2.5 Benzerlik değerlendirmesi
On gruptan alınan kromatogramlar "TCM Kromatografik Parmak İzi için Benzerlik Değerlendirme Sistemine (2012A)" aktarıldı. Referans olarak S1 örneğini kullanarak, medyan yöntemi, 0,5 dakikalık bir zaman penceresi, çok noktalı kalibrasyon ve veri eşleştirme, dokuz ortak zirveye sahip bir referans parmak izi (Şekil 4) oluşturdu. On grubun tamamı için benzerlik değerleri 0,981'den büyük veya ona eşitti (0,981-0,999), bu da gruplar arası benzerliğin yüksek olduğunu gösteriyor.
2.6 Kaynatma parçalarından standart kaynatma ve formül granüllerine miktar ve kalitenin aktarılması
Zirve eşleştirmesi, C. Deserticola kaynatma parçalarının, standart kaynatmanın ve formül granüllerinin, atanan beş tepe noktası (ekinakozit, cistanosit A, tubulozit A, verbaskosit ve izoverbaskosit) dahil olmak üzere dokuz karakteristik zirveyi paylaştığını gösterdi (Şekil 5). Karakteristik profiller oldukça ilişkiliydi ve kaynatma parçalarından → standart kaynatma → formül granüllerinden transfer kuralları açıktı. Kaynatma parçalarından standart kaynatmaya kadar, Tepe 6'nın (verbascoside) alanı, verbascoside'nin ısıya dayanıksızlığıyla tutarlı olarak belirgin şekilde azaldı.
Şekil 4 Cistanche Deserticola Formülügranüllerinin HPLC Karakteristik Kromatogramının Kaplaması
2.7 C. Deserticola ve C. Tubulosa formül granülleri arasındaki karakteristik kromatogramların karşılaştırılması
Hem C. Deserticola hem de C. Tubulosa, ekinakozit, cistanosid A, verbaskosit, izoverbaskozit ve tubulozit A içerir. Bununla birlikte, iki tür, ekinakozit içeriği açısından önemli ölçüde farklılık gösterir ve cistanosid A, C. tubulosa'da yalnızca eser düzeylerde mevcuttur. Bu nedenle, ekinakozit ve cistanosid A, botanik kökenin (C. Deserticola'ya karşı C. Tubulosa) ayırt edilmesinde ayırt edici belirteçler olarak görev yapabilir.
Şekil 5 Cistanched çöltikola kaynatma parçaları (A), standart kaynatma (B) ve formül granüllerinin (C) karakteristik kromatogramlarının karşılaştırılması 3(S): Ekinakozit; 4: Sistanosit A; 5: Tubulosid A; 6: Akteosid; 7: İzoakteosid.
Sonuç (talep edildiği gibi değiştirildi: hangi tür "daha iyi" içeriğe sahip)
Yerleşik HPLC-MS karakteristik profili çerçevesindeCistanche Deserticolaformül granülleri ve türler arası karşılaştırma dikkate alındığında,C. Deserticoladaha zengin ve daha dengeli bir feniletanoid glikozit profili sergiler: cistanoside A, C. Deserticola'da kolaylıkla tespit edilir ancak yalnızca eser miktarda bulunur.C. tubulosa, sırasındaekinekozittürler arası belirgin farklılıklar gösterir. Bu nedenle, temel PhG'lerin daha yüksek toplam düzeylerini ve daha güçlü genel cistanche faydalarını hedefleyen formülasyonlar için, içerik açısından daha iyi tür olarak Cistanche Deserticola önerilir. Bir ürün özellikle hedefliyorsamaksimum ekinakozit, seçilen C. tubulosa partileriTedarik ve parti testine bağlı olarak değerlendirilecektir. Uygulamada, "satılık en iyi cistanche", burada açıklanan valide edilmiş yöntem kapsamında ekinekosid, verbaskosid (akteosid) ve cistanosid A'nın seriye özel kantitatif testiyle belirlenmelidir.
Referanslar
[1] Tang SW. Sınıflandırılmış Materia Medica. Pekin: Huaxia Yayınevi, 1993:192.
[2] Çin Farmakopesi Komisyonu. Çin Halk Cumhuriyeti Farmakopesi (Cilt. 1). Pekin: Çin Tıp Bilimi ve Teknolojisi Basını, 2020:140.
[3] Zhi YJ, Zhen YQ, Tian W, ve diğerleri. Çin Geleneksel ve Bitkisel İlaçları, 2021, 52(9):2758.
[4] Zhen YQ, Tian W, Wang XG, ve diğerleri. Modern Geleneksel Çin Tıbbı, 2019, 39(1):83.
[5] Jing H, Zuo JF, Li JS. Lishizhen Medicine ve Materia Medica, 2006, 17(3):440.
[6] Han GQ, Li CF, Wang XQ, ve diğerleri. Çin Çin Materia Medica Dergisi, 2015, 40(21):4218.
[7] Lei L, Jiang Y, Liu X ve diğerleri. Helv Chim Acta, 2010, 90(1):79.
[8] Liu XM, Li J, Jiang Y, ve diğerleri. Biochem Syst Ecol, 2013, 47(8):21.
[9] Gong HM, Hu H, Liu YC. Batı Çin Farmasötik Bilimler Dergisi, 2018, 33(6):623.
[10] Gao Y, Guo LN, Ma SC, ve diğerleri. Çin Çin Materia Medica Dergisi, 2019, 44(17):3749.
[11] Lu YH, Pi WM, Zhang Y, ve diğerleri. Modern Çin Tıbbı, 2019, 21(8):999.
[12] Wang LW, Cao R, Fang YY, ve diğerleri. Çin Tıbbi Malzemeleri Dergisi, 2017, 40(2):295.
Notlar
Bileşiklerin adları: ekinekozit; cistanosid A; tubulosit A; verbascoside (acteoside); izoverbaskozit.
Kaynakta "hindistan cevizi"nden söz eden bariz tipografik kaymalar, bağlama göre çeviride "Cistanche" olarak çevrildi.
