Cistanche Deserticola Polisakkarit Melanositlerde Melanogenezi İndükler, Oksidatif Stresi Azaltır ve Beyazlamayı Teşvik Eder
Mar 24, 2022
İletişim:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Yibo Hu1|Jinhua Huang1|Yixiao Li2|Ling Jiang1|Yujie Ouyang1|Lun Yang1|Xiaojiao Zhao1|Lihua Huang3|Hong Xiang3|Jing Chen1 Qinghai Zeng1
Soyut
Pigmentasyon bozukluklarının ana parçası olan vitiligo ve akromik nevüs gibi cilt depigmentasyon hastalıkları çok yaygındır ve artık daha fazla ilgi görmektedir. Depigmentasyonun patogenezi, muhtemelen kalıtım, otoimmünite veoksidatif stress. Bunlar arasında oksidatif stres önemli bir rol oynar; bununla birlikte, birkaç klinik tedavi oksidatif stresle başa çıkabilir. Bildirdiği gibi,Cistanche Deserticola polisakkarit(CDP) etkili bir antioksidandır; buna dayanarak, melanositlerdeki rolünü değerlendirdik ve mekanizmaları daha da ortaya çıkardık. Bu çalışmada, CDP'nin teşvik edebileceğini bulduk.melanogenezinsan epidermal melanositlerinde (HEM'ler) ve fare melanom B16F10 hücrelerinde, ayrıca zebra balıklarında pigmentasyona neden oldu. Üstelik,CDPmitojenle aktive olan protein kinaz (MAPK) sinyal yolunu aktive edebilir, ardından mikroftalmi ile ilişkili transkripsiyon faktörü (MITF) ve aşağı akış genleri TYR, TRP1, TRP2 ve RAB27A'nın ekspresyonunu yukarı regüle edebilir. Aksi takdirde, CDP'nin melanositlerde H2O2-uyarılmış sitotoksisiteyi ve apoptozu azaltabileceğini bulduk. Daha fazla kanıt, CDP'nin NRF2/HO-1 antioksidan yolunu geliştirebileceğini ve hücre içi ROS'u temizleyebileceğini ortaya koydu. Özetle, CDP teşvik edebilirmelanogenezve melanositleri önlemekoksitleyicistresCDP'nin melanositlerin normal durumunu korumaya yardımcı olduğunu düşündürür. Böylece,CDPdepigmentasyon hastalıklarının tedavisi için yeni bir ilaç olabilir.
ANAHTAR KELİMELER
Cistanche Deserticola polisakkarit, depigmentasyon hastalığı, melanosit, melanogenez, NRF2, oksidatif stres
tazecistanche
1|GİRİİŞ
Vitiligo ve akromik nevus gibi deri depigmentasyon hastalıkları, yamalı veya yaygın deri depigmentasyonu ile karakterizedir.1 Deri lezyonları nadiren ciddi fiziksel yaralanmaya neden olsa da, hastanın görünümünü etkiler ve ciddi bir psikolojik yük, hatta zihinsel sağlık bozuklukları yaratır.2 depigmentasyondaki başlıca patolojik değişiklikler, melanin sentezini ve taşınmasını büyük ölçüde etkileyen melanosit disfonksiyonu ve kaybını içerir3, bu nedenle ciltte yetersiz melanin birikimine yol açar.
Depigmentasyonla ilgili mekanizmalar şu anda bilinmemektedir, ancak çalışmalar bazı ilgili faktörleri tanımlamıştır. Bir yandan, melanosit işlevi kısmen, mikroftalmi ile ilişkili transkripsiyon faktörüne (MITF) bağlıdır.melanogeneztirozinaz (TYR), tirozinaz ile ilgili protein 1 (TRP1), tirozinaz ile ilgili protein 2 (TRP2), ras ile ilgili protein Rab-27a (RAB27A) ve fascin aktin-demetleyici protein 1 (FSCN1) dahil olmak üzere ilgili genler .4 Bu genler arasında, TYR, l-dopa'yı dopakinona oksitleyerek melanin sentezinde anahtar bir rol oynar.5 Öte yandan, çalışmalar, kalıtım, çevre, otoimmünite dahil olmak üzere melanosit kaybından sorumlu olabilecek çeşitli faktörlerin bir kombinasyonunu önermektedir. , veoksidatif stres.6-9 Bu faktörler arasında oksidatif stres en önemlisi olarak kabul edilir.
mekanizmalarıoksidatif stresdepigmentasyona neden olan kısmen ortaya çıkarılmıştır; reaktif oksijen türlerinin (ROS) aşırı yüklenmesi önemli bir faktördür.10 Depigmentasyondaki ROS aşırı yüklenmesi, pro- ve antioksidan sistemler arasındaki bir dengesizliği içerir.11 Bu dengesizliğe katılan unsurlardan biri nükleer faktör eritroid 2-ile ilgilidir. faktör 2/antioksidan yanıt elemanı (NRF2/ARE) antioksidan yol bozukluğu.12 Yol, NRF2 ve heme oksijenaz-1 (HMOX-1, HO-1) gibi antioksidan enzimlerden oluşur. , katalaz (CAT), glutatyon peroksidaz 1 (GPX1) ve NAD(P)H kinon dehidrojenaz 1 (NQO1).13 Melanositler aşırı ROS'a maruz kaldığında, NRF2 çekirdeğe yer değiştirebilir ve korunmuş ARE'ye bağlanabilir, ardından antioksidan enzimlerin ekspresyonu. Bununla birlikte, vitiligo gibi bazı depigmentasyon hastalıklarında, bozulmuş bir NRF2/ARE antioksidan yolu, ROS'u etkili bir şekilde temizleyemez.14
Depigmentasyonda yaygın olarak kullanılan klinik tedaviler arasında topikal veya sistemik kortikosteroidler, kalsinörin inhibitörleri, dar bantlı ultraviyole B (NBUVB; 311 nm), 308-nm excimer light, otolog epidermal transplantasyon ve geleneksel Çin tıbbı (TCM) tedavisi yer alır. Kortikosteroidler ve kalsinörin inhibitörleri anormal bağışıklık aktivasyonunu azaltabilir15, fototerapiler ise birinci basamak tedavi olarak kullanılır; özellikle, NBUVB melanosit proliferasyonunu ve T-hücre yıkımını uyarır,16 308-nm eksimer ışığı ise T hücrelerinin apoptozunu indükler.17 Ayrıca, TCM terapilerinin etkileri teşvik ile ilgilidir.melanogenez.18 Bir dereceye kadar, bu yöntemler depigmentasyonu iyileştirmek için faydalıdır, ancak hastalığın ilerlemesini kontrol etmek zor olmaya devam etmektedir. Özellikle yeni tedavilerin geliştirilmesi gerekmektedir.oksidatif stres, daha önce ihmal edilmişti.
Cistanche Deserticola 'çöl ginsengi' olarak bilinir.19 Bileşenleri etanolün neden olduğu karaciğer hasarı ve bağırsak inflamatuar hiperplazisinde faydalıdır; aynı zamanda yorgunluk önleyici, iltihap önleyici ve tümör önleyici reaktif olarak da kullanılabilir.20-22 Son zamanlarda, Guo ve ark.Cistanche Deserticola polisakkarit(CDP), ana bileşenlerinden biri olan antioksidan ve hepatoprotektif aktiviteye sahiptir20; diğer iki çalışma, hücrelerin bir virüsten korunmasındaki rolünü tanımladı.oksidatif stresoksijen-glikoz yoksunluğu/reperfüzyon ve osteoporoz koşullarında yaralanma.23,24 Bununla birlikte, CDP'nin depigmentasyon hastalıklarındaki rolü açıklanmamıştır. olup olmadığını doğrulamayı amaçladık.CDPetkileyebilirmelanogenezve melanositleri oksidatif stresten korur.
2|ARAÇ VE YÖNTEMLER
2.1|Kimyasallar ve antikorlar
Cistanche Deserticola polisakkarit(CDP) ve l-dopa, Yuanye Biotec'ten satın alındı (saflık yüzde 98'e eşit veya daha büyük; Şanghay, Çin). Hidrojen peroksit (H2O2), dimetil sülfoksit (DMSO), NaOH, Triton X-100, 4,5-dimetiltiazol-2-il-2,5-difeniltetrazolyum bromür ( MTT) ve bir Annexin V-FITC Apoptoz Tespit Kiti Sigma-Aldrich'ten satın alındı. Yüzde 4 nötr paraformaldehit Biosharp'tan (Hefei, Çin) satın alındı; ve bir İmmünofloresan Boyama Kiti (Alexa Fluor 488) ve 2,7-diklorofloresan-diasetat (DCFH-DA) Beyotime Biotec'ten (Şangay, Çin) satın alındı. Bir Fontana-Masson Leke Kiti ve bir Nucleoplasmic Protein Extraction Kit, Sloarbio'dan (Pekin, Çin) satın alındı. İnsan melanosit büyüme takviyesi (HMGS), Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamı (DMEM) ve ortam 254, Gibco'dan satın alındı. Fetal sığır serumu (FBS), BI'dan (Kibbutz Beit-Haemek, İsrail) satın alındı. -aktin, TYR, TRP2, RAB27A, FSCN1, ERK, p-ERK, JNK, p-JNK, p38, p-p38, NRF2 ve HO-1 için birincil antikorlar Cell Signaling Technology'den satın alındı. MITF antikoru St John's Laboratory'den, p-MITF için birincil antikor Affinity Biosciences'dan, GAPDH için birincil antikor Bioworld'den ve TRP1 için birincil antikor EMD Millipore'dan satın alındı.
2.2|Hücre kültürü ve tedavisi
Fare melanom B16F10 hücreleri, yüzde 10 FBS ve yüzde 1 penisilin-streptomisin antibiyotik karışımı ile takviye edilmiş DMEM ortamında kültürlendi. İnsan epidermal melanositleri (HEM'ler) insan sünnet derisinden ayrıldı (önceki çalışmamıza25 bakın) ve HMGS, yüzde 5 FBS ve yüzde 1 penisilin-streptomisin antibiyotik karışımı ile desteklenmiş ortam 254'te kültürlendi. Tüm hücreler, yüzde 5 CO2 ile 37 derecede ıslak bir inkübatörde kültürlendi. CDP, DMSO içinde çözündürüldü ve kullanımdan önce ortam ile seyreltildi, DMSO'nun nihai konsantrasyonu yüzde 0.1'den düşüktü. H2O2, kullanımdan önce ortam ile seyreltildi.
2.3|Zebra balığı yetiştiriciliği ve tedavisi
Zebra balığı embriyoları ve ortamı, EzeRinka Biotech'ten satın alındı. Deney protokolü, Central South Üniversitesi Etik Kurulu tarafından onaylandı. Zebra balığı, ışıktan 37 derece uzakta 12-kuyucuklu plakalarda kültürlendi ve farklı konsantrasyonlarda CDP ile işleme tabi tutuldu. Zebra balıklarının baş ve kuyruklarındaki melaninleri günlük olarak gözlemlemek ve kaydetmek için ters bir mikroskop kullanıldı. Gözlemden sonra ortamı değiştirdik ve yeniden ekledik.CDP. Zebra balığı kuyruklarındaki melanin yoğunluğu Image J ile ölçüldü ve değerler entegre optik yoğunluklar (IOD) olarak sunuldu.
2.4|Hücre canlılığı
Hücre canlılığı, bir MTT tahlili kullanılarak ölçüldü. sitotoksisitesini araştırmak içinCDP, HEM'ler ve B16F10 hücreleri, 96-yuvalı plakalara 2 x 103 hücre/kuyu yoğunluğunda implante edildi ve hücreler plakalara bağlanana kadar kültürlendi. Hücreler daha sonra farklı konsantrasyonlarda (0, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 ve 320 ug/mL) muamele edildi.CDP24, 48 veya 72 saat boyunca. Ölçümden önce her kuyuya 20 µL MTT eklendi ve plaklar 37 derecede 4 saat inkübe edildi. Bundan sonra, süpernatantı attık ve formazan kristallerini çözmek için her kuyuya 160 μL DMSO ekledik. 490 nm'deki absorbans değeri, çok modlu bir plaka okuyucu (PerkinElmer) ile ölçülmüştür. H2O2- ile indüklenen sitotoksisite koşulunda CDP'nin etkisini araştırmak için, HEM'ler ve B16F10 hücreleri, 96-kuyu plakalarına 4 x 103 hücre/kuyu yoğunluğunda kaplandı. Hücreler, farklı konsantrasyonlardaCDP({0}}, 20, 40 veya 80 ug/mL) 24 saat boyunca, bu noktada her kuyuya H2O2 (nihai konsantrasyonlar: HEM'ler için 500 μm ve B16F10 hücreleri için 1.0 mm) ekledik ve hücreleri 24 saat daha inkübe etti. CDP ile tedavi edilen ve negatif kontrol (NC) grupları kurduk. Tespit adımları daha önce tarif edilenle aynıydı.
2.5|Melanin içeriğinin NaOH tahlili
Hücreler 100-mm petri kaplarında kültürlendi veCDP48 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda (0, 20, 40 ve 80 ug/mL), ardından tripsin ile sindirildi ve 1.5-mL'lik tüplerde toplandı. Hücreleri iki kez damıtılmış suyla yıkadık, 1 mL etanol içinde yeniden süspanse ettik ve melanini serbest bırakmak için vorteksledik. Daha sonra karışımı santrifüjledik (200 g, 5 dakika) ve süpernatantı attık, her tüpe 1 mL yüzde 10 DMSO (1 mm NaOH solüsyonu ile seyreltilmiş) ilave ettik ve tortuyu süspanse ettik. Süspansiyonu melanini çözmek için 80 derecede 1 saat su banyosunda inkübe ettik. Son olarak, 200 μL sıvıyı bir 96-kuyu plakasına aktardık ve 470 nm'de absorbans değerini ölçmek için çok modlu bir plaka okuyucu kullandık.
cistancheyorumlar: engellermelaninüretme.
2.6|Tirozinaz aktivite ölçümleri
Hücreler 100-mm Petri kaplarında kültürlendi veCDPölçümden önce tripsin ile sindirildi ve 1.5-mL'lik tüplerde toplandı ve iki kez fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkandı. Her numuneden 106 hücreyi yeni bir tüpe taşıdık ve santrifüjden sonra süpernatantı attık, ardından hücre peletine 1 ml 0%5 Triton X-100 ekledik ve 15 dakika 0 derecede karıştırın. Daha sonra, substrat olarak 1 mL l-dopa (1 mm, 0.1 M fosfat tamponu ile seyreltilmiş) ekledik ve çözeltiyi karıştırdık, karışımın 200 μL'sini bir { {16}}kuyu plakası hemen ve çok modlu plaka okuyucu kullanarak 475 nm'de absorbans değerini (A0) ölçtü, ölçümü 10 dakikada tekrarladı (A10). Tirozinaz aktivitesi (A10-A0)/105 ile hesaplandı ve sonuçlar, negatif kontrole karşı yüzde (yüzde) olarak ifade edildi.
2.7|Fontana-Masson melanin boyama
Hücreler, yüzde 50 yoğunluğa ulaşana kadar 12-kuyulu plakalarda kültürlendi. İşlemden sonra hücreler yüzde 4 nötr paraformaldehit ile 30 dakika sabitlendi ve damıtılmış su ile yıkandı. Daha sonra her kuyuya 500 μL Fontana amonyak-gümüş solüsyonu ekledik ve melanini boyamak için plakaları 16 saat karanlıkta sakladık. Daha sonra hücreleri beş kez (her seferinde 1 dakika) damıtılmış suyla yıkadık ve 5 dakika boyunca 500 μL hiposülfit içinde ıslattık; son olarak hiposülfiti uzaklaştırdık ve hücreleri tekrar distile su ile 1 dakika boyunca duruladık. Daha sonra melaninleri gözlemlemek ve kaydetmek için ters çevrilmiş bir mikroskop kullandık.
2.8|RNA ekstraksiyonu ve kantitatif ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu
Hücreler 6-kuyulu plakalarda kültürlendi. Tedaviden sonra hücreler tripsin ile sindirildi ve 1.5-mL'lik tüplerde toplandı. Hücreleri iki kez PBS ile yıkadık, sonra 1 mL lizis tamponu ekledik, karışımı vorteksledik ve hücreleri tamamen parçalamak için tüpleri 5 dakika buz üzerinde yerleştirdik. RNA, bir Total RNA Kiti (Omega Bio-Tek) kullanılarak özütlendi ve ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (TOYOBO) kullanılarak ters kopyalandı (RT). Kantitatif ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), KODSYBR qPCR Mix (TOYOBO) kullanılarak gerçekleştirildi. RT karışımının reaksiyon hacmi 20 μL iken PCR karışımının reaksiyon hacmi 20 μL (cDNA 1-8 μL, MIX 10 μL, primer F 1 μL, primer R 1 μL, 20 μL'ye DEPC H2O ekleyin) ). Deneyler protokollere göre yapıldı. Primerlerin dizileri Tablo S1'de listelenmiştir.
2.9|Protein ekstraksiyonu ve Western blot/immünofloresan
Hücreler 100-mm Petri kaplarında kültürlendi. Tedaviden sonra hücreler tripsin ile sindirildi ve 1.5-mL'lik tüplerde toplandı. Hücreleri iki kez PBS ile yıkadık, ardından 1 mm fenilmetilsülfonil florür (Thermo Fisher) ve 1:100 seyreltilmiş fosfataz inhibitör kokteyli (Roche) ile takviye edilmiş 500 μL RIPA lizis tamponu (Thermo Fisher) içine ekledik. Nükleer ve sitoplazma proteini, üreticinin protokolüne göre Nükleoplazmik Protein Ekstraksiyon Kiti kullanılarak ekstre edildi. Tüpleri 30 dakika buz üzerine yerleştirdik ve hücreleri tamamen parçalamak için her 5 dakikada bir vorteksledik. Hücreleri santrifüjledik (200 g, 4 derece, 15 dakika), süpernatantı yeni bir tüpe taşıdık ve bir BCA protein tahlil kiti (KeyGEN Biotec) kullanarak toplam protein konsantrasyonunu ölçtük. Proteinleri 5× yükleme tamponu (Beyotime Biotec, Çin) ile 100 derecede 10 dakika kaynattık, sonra -80 derecede sakladık. Western blotlamada poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) yöntemi kullanıldı ve her gruptan 20 ug protein ayrıldı ve bir poliviniliden florür membranına aktarıldı. Antijen bloke edildikten sonra, zarı 1:1000 oranında seyreltilmiş bir birincil antikor içinde 16 saat süreyle 4 derecede inkübe ettik, ardından zarı PBST ile yıkadık ve 1:10 000 seyreltilmiş floresan ikincil antikor içinde 37 derecede 1 saat süreyle inkübe ettik. . Floresan yoğunluğu, bir Odyssey CLx Görüntüleme Sistemi (LI-COR) kullanılarak tespit edildi. İmmünofloresan, birincil antikorun 1:100 dilüsyonu ile İmmünofloresan Boyama Kiti (Alexa Fluor 488) kullanılarak yapıldı.
cistanche reddit
2.10|Hücre apoptoz ölçümü
Hücreler {{0}}mm Petri kaplarında kültürlendi ve farklı konsantrasyonlarda (0, 20, 40 ve 80 ug/mL) işleme tabi tutuldu.CDPve H2O2 eklendi (nihai konsantrasyonlar: HEM'ler için 500 um, B16F10 hücreleri için 1.0 mm) ve 24 saat daha inkübe edildi. Ayrıca CDP ile tedavi edilen ve NC grupları kurduk. Tedaviden sonra hücreleri EDTA içermeyen tripsin ile sindirdik ve tüplerde topladık, ardından hücreleri iki kez PBS ile yıkadık ve 100 μL PBS içinde yeniden süspanse ettik. Hücreler protokole göre Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit ile boyandı ve akış sitometrisi (FCM) ile tespit edildi. Apoptoz oranını analiz etmek için FlowJo yazılımı kullanıldı.
2.11|Hücre içi ROS ölçümü
Hücreler {{0}}kuyulu plakalarda kültürlendi ve farklı konsantrasyonlarda (0, 20, 40 ve 80 ug/mL) işleme tabi tutuldu.CDP24 saat boyunca her bir kuyucuğa H2O2 (nihai konsantrasyonlar: HEM'ler için 500 μm, B16F10 hücreleri için 1.0 mm) ekledik, onları 24 saat daha inkübe ettik ve CDP ile muamele edilmiş ve NC grupları oluşturduk. Tedaviden sonra, tüm ortamı ve FBS'yi çıkarmak için hücreleri iki kez PBS ile yıkadık, ardından DCFH-DA probunu ortamla 1:1000'e kadar seyreltdik ve her bir oyuğa ekledik. Hücreleri 37 derecede 30 dakika inkübe ettik ve üç kez serumsuz ortam ile yıkadık. biz kullandıkfloresansı gözlemlemek ve kaydetmek için ters floresan mikroskobu, ardından floresan yoğunluğunu ölçmek için ImageJ kullandı.
2.12|İstatistik ve analiz
Bu çalışmadaki veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunulmuştur ve istatistiksel analiz GraphPad Prism (sürüm 7.0) veya SPSS (sürüm 22.0) ve Student's kullanılarak yapılmıştır. Çoklu grup karşılaştırmaları için t testi veya tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanıldı. WB protein bantlarının gri değeri, GAPDH veya -aktin ile standardize edilmiştir. P < .05="" değerleri="" anlamlı="" kabul="" edildi.="" tüm="" deneyler="" en="" az="" üç="" kez="" tekrar="">
3|SONUÇLAR
3.1|HEM'lerde ve B16F10 hücrelerinde CDP kaynaklı melanogenez
Başlamadan önce, CDP'nin HEM'ler ve fare melanom B16F10 hücreleri üzerindeki potansiyel sitotoksisitesini araştırmak için MTT tahlilini kullandık. Hücreler tedavi edildiCDP24, 48 veya 72 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda. HEM canlılık testi, konsantrasyonlar 320 ug/mL'den düşük olduğunda, CDP'nin hücre canlılığı üzerinde hiçbir etkisi olmadığını göstermiştir; bununla birlikte, konsantrasyon 24, 48 ve 72 saatte 320 ug/mL'ye ulaştığında canlılık önemli ölçüde azaldı (P < .05;="" şekil="" 1a).="" b16f10="" hücrelerinin="" canlılığı="" da="" 48="" ve="" 72.="" saatlerde="">CDP320 ug/mL'ye (P < .01)="" ulaştı,="" ancak="" daha="" düşük="" konsantrasyonlarda="" herhangi="" bir="" değişiklik="" görülmedi="" (şekil="" 1b).="" daha="" sonra="" ön="" olarak="" cdp'nin="" rolünü="">melanogenezve etkilerini HEM'lerdeki -melanosit uyarıcı hormon ( -MSH; konsantrasyonlar: 20, 100 ve 400 nm) ve DMSO'nun (yüzde 0.1) etkileriyle karşılaştırdı. Melanin boyama, tirozinaz aktivitesi ve melanin içeriği tahlillerinin sonuçları, CDP'nin melanogenezi teşvik etmek için -MSH ile karşılaştırılabilir olduğunu, yüzde 0.1 DMSO tedavisinin hiçbir fark yaratmadığını gösterdi (Şekil S1).
Keşifimizi buna göre daha da geliştirdik. HEM'ler ile tedavi edildiCDP48 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda (20, 40 ve 80 ug/mL); melanin boyama, melanin içeriği ve tirozinaz aktivite deneyleri yapıldı ve hepsi, 80 ug/mL grubunda zirve yapan konsantrasyona bağlı bir şekilde CDP tedavisinden sonra önemli artışlar gösterdi (P < .05,="" şekil="" 2a-c).="" daha="" sonra="" mrna="" ve="" protein="" seviyelerini="">melanogenezilgili genler (MITF, TYR, TRP1, TRP2, RAB27A ve FSCN1). CDP, HEM'lerdeki bu genlerin mRNA seviyelerini önemli ölçüde arttırdı (P < .05;="" şekil="" s2a).="" ayrıca,="" fosforile="" edilmiş="" mitf'nin="" toplam="" mitf'ye="" oranı="" (p="">< .05)="" gibi="" mitf,="" tyr,="" trp1="" ve="" rab27a="" proteinlerinin="" seviyeleri="" artarken,="" trp2="" ve="" fscn1="" hiçbir="" fark="" göstermedi="" (şekil="" 2d,e).="" sonuçlar,="" cdp'nin="" melanogenezi="" teşvik="" edebileceğini="" ve="" insan="" melanositlerinde="" melanogenez="" ile="" ilgili="" genlerin="" ekspresyonunu="" yukarı="" doğru="" düzenleyebileceğini="">
Ayrıca, etkilerini yeniden doğruladıkCDPtekrar B16F10 hücreleri ile ve B16F10 hücrelerinin melanin içeriğinin önemli ölçüde arttığını buldu (P < .01;="" şekil="" s2b).="" ayrıca,="" cdp,="" mrna="" seviyelerini="" önemli="" ölçüde="">melanogenezilişkili genler (P < .05; Şekil S2C) ve MITF, TYR, TRP1, TRP2 ve RAB27A'nın protein seviyeleri de CDP tedavisinden sonra arttı (P < .05; Şekil S2D-E).
ŞEKİL 1 HEM'lerde ve B16F10 hücrelerinde CDP'nin sitotoksisitesi.
3.2|CDP, zebra balıklarında melanogenezi teşvik etti
olup olmadığını araştırmak içinCDPteşvik edebilirmelanogenezin vivo, zebra balığı embriyoları kullandık. Zebra balığı embriyoları dört gruba ayrıldı ve sürekli olarak tek başına ortam (NC) veya farklı konsantrasyonlarda (20, 40 ve 80 ug/mL) CDP ile tedavi edildi; melanin granüllerinin yoğunluğu ve dağılımı her gün gözlemlendi ve kaydedildi. Zebra balığı embriyoları büyüdükçe, baş ve kuyruklarda melanin yoğunluğunun kademeli olarak arttığını bulduk. 3. günde, gruplar arası farklılıklar ayırt edilebilirdi ve 6. günde deneyi sonlandırana kadar fark artmaya devam etti (Şekil 3A). Zebra balığı kuyruklarındaki melanin yoğunluğunu ölçmek için Image J'yi kullandık; CDP ile tedavi edilen gruplardaki melanin yoğunluğu, kontrol grubundakinden önemli ölçüde daha yüksekti (P < .05;="" şekil="">
3.3|HEM'lerde ve B16F10 hücrelerinde CDP aktive MAPK sinyal yolu
mekanizmalarını ortaya çıkarmak içinCDPterfimelanogenez, HEM'leri 48 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda (20, 40 ve 80 ug/mL) CDP ile tedavi ettik ve ardından MAPK sinyal yolundaki ERK, JNK ve p38 proteinlerinin fosforile ve toplam seviyelerini araştırdık. Western blot ile ölçüldüğü gibi, p-ERK, p-JNK ve p-p38 seviyeleri CDP tedavisinden sonra artarken (P < .05),="" bunların="" toplam="" seviyeleri="" değişmedi="" (şekil="" 4a,="" b).="" deneyler="" b16f10="" hücreleri="" ile="" tekrarlandı="" ve="" erk,="" jnk="" ve="" p38="" proteinlerinin="" fosforile="" seviyeleri="" artırıldı="" (p="">< .05),="" ancak="" toplam="" mapk="" seviyeleri="" değişmedi="" (şekil="" 4c,="" d),="" sonuçlarla="" tutarlı="" olarak="">
3.4|CDP zayıflatılmış H2O2-HEM'lerde ve B16F10 hücrelerinde sitotoksisite ve apoptozu indükledi
Oksidatif stres ortamını simüle etmek için H2O2 kullandık ve oksidatif stres altındaki melanositlerde CDP'nin rolünü daha da araştırdık. HEM'lerde kullanılan nihai H2O2 konsantrasyonu 500 µm iken, B16F10 hücrelerindeki bu 1,0 mm idi. CDP'nin H2O2- ile indüklenen sitotoksisite üzerindeki etkisini araştırmak için HEM'leri ve B16F10 hücrelerini ön işleme tabi tuttuk.CDP24 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda (20, 40 ve 80 ug/mL), ardından H2O2 ilave edildi ve gözlem ve MTT tahlilini gerçekleştirmeden önce 24 saat boyunca bunları işlemeye devam etti.
H2O2, HEM'lerde belirgin membran kabarmasına ve hücre büzülmesine neden oldu, CDP ile ön işleme tabi tutulmuş gruplarda durum hafifletildi. Tek başına CDP ile tedavinin hiçbir etkisi olmadı (Şekil 5A). MTT tahlili, H2O2 tedavisinin HEM canlılığını azalttığı, buna karşın CDP'nin bu zararlı etkiyi önemli ölçüde iyileştirdiği konusunda benzer bir sonuç gösterdi (P < .01);="" ile="">CDPtek başına hiçbir fark yaratmadı (Şekil 5C). Daha sonra koruyucu etkiyi B16F10 hücrelerinde tekrar doğruladık. H2O2 tedavisi, belirgin zar kabarmasına ve hücre büzülmesine neden olurken, olumsuz durum da B16F10 hücrelerinde CDP tarafından iyileştirildi (Şekil 5B). Bu arada, MTT tahlili, H2O2 işleminden sonra B16F10 hücre canlılığının azaldığını, ancak CDP ile ön işleme tabi tutulmuş gruplarda durumun önemli ölçüde iyileştiğini gösterdi (P < .05;="" şekil="">
Ayrıca, HEM'lerin ve B16F10 hücrelerinin H2O2- ile indüklenen apoptozunu ölçmek için FCM'yi kullandık. Sonuçlar, H2O2'nin HEM'lerde ve B16F10 hücrelerinde önemli apoptoza neden olduğunu, ancakCDPfarklı konsantrasyonlarda apoptozu önemli ölçüde azaltabilir; aksi takdirde, tek başına CDP tedavisi hiçbir fark yaratmadı (Şekil 5E, F). Apoptoz oranı H2O2 tedavisinden sonra arttı ancak CDP ile ön işleme tabi tutulmuş gruplarda azaldı, değişiklik hem HEM'lerde hem de B16F10 hücrelerinde önemliydi (P < .05,="" şekil="" 5g,="">
ŞEKİL 2 CDP, HEM'lerde melanogenezi destekler.
3.5|CDP, HEM'lerde ve B16F10 hücrelerinde H2O2-indüklediği hücre içi ROS'u temizledi
mekanizmalarını araştırmak içinCDPH2O2-uyarılmış sitotoksisiteyi ve apoptozu azaltmak için, ayrıca bir DCFH-DA floresan probu kullanarak HEM'lerde ve B16F10 hücrelerinde hücre içi ROS'u tespit ettik. Tedaviler yukarıda tarif edilenlerle aynıydı, ROS seviyesini temsil etmek için floresan yoğunluğu ölçüldü. HEM'lerde gözlemlediğimiz gibi, H2O2 tedavisi ROS'u yükseltmede etkiliydi, ancak CDP, H2O2- ile tedavi edilen gruplarda hücre içi ROS'u önemli ölçüde temizledi (P < .01;="" şekil="" 6a,="" c);="" ayrıca,="" tek="" başına="" cdp="" kullanımı="" hiçbir="" fark="" yaratmadı.="" sonuçları="" b16f10="" hücrelerinde="" yeniden="" doğruladık.="" b16f10="" hücrelerinde,="" sadece="" cdp="" ile="" tedavi="" ros="" seviyesini="" etkilemezken,="" h2o2="" tedavisi="" ros="" seviyesini="" açıkça="" arttırdı,="" ancak="" bu="" değişiklik="" cdp="" ön="" tedavisi="" ile="" de="" önemli="" ölçüde="" azaldı="" (p="">< .05;="" şekil="" 6b,="">
3.6|Melanositlerde CDP yukarı regüleli NRF2/HO-1 antioksidan yolu
CDP'nin ROS'u temizleme mekanizmalarını daha fazla ortaya çıkarmak için ilk olarak B16F10 hücrelerinde NRF2/HO-1 antioksidan yol yolunun protein seviyelerini ölçtük. Sadece CDP ile tedavinin NRF2 ve HO-1 proteinlerini önemli ölçüde etkilemediğini, ancak H2O2- ile tedavi edilen gruplarda bu iki proteinin seviyesinin önemli ölçüde arttığını bulduk veCDPön işlem yüksekliği daha da arttırdı (p<.05; figure="" s3).="" moreover,="" we="" investigated="" the="" protein="" levels="" of="" nrf2="" and="" ho-1="" in="" hems="" after="" h2o2="" and/or="" cdp="" treatment.="" the="" results="" showed="" that="" ho-1="" level="" was="" elevated="" in="" h2o2-treated="" groups,="" and="" further="" increased="" in="" cdp="" pretreatment="" groups=""><.05; figure="" 7a,="" b).="" to="" know="" the="" distribution="" of="" nrf2,="" we="" compared="" the="" level="" of="" nuclear="" and="" cytoplasmic="" nrf2="" with="" the="" total="" level="" of="" β-actin="" in="" hems.="" similarly,="" we="" found="" that="" both="" nuclear="" and="" cytoplasmic="" nrf2="" were="" elevated="" under="" h2o2="" treatment;="" their="" levels="" further="" increased="" in="" the="" cdp="" pretreated="" groups.="" based="" on="" that,="" we="" calculated="" the="" ratio="" of="" nuclear="" nrf2="" to="" cytoplasmic="" nrf2.="" the="" result="" suggested="" that="" cdp="" increased="" the="" ratio="" significantly="" at="" concentrations="" of="" 40="" and="" 80="" μg/ml=""><.05; figure="" 7a,="" b).="" using="" immunofluorescence,="" we="" observed="" the="" fluorescence="" of="" nrf2="" in="" hems="" and="" knew="" that,="" under="" h2o2="" treatment,="" the="" nucleus="" seemed="" to="" have="" expanded="" and="" the="" levels="" of="" nrf2="" in="" the="" nucleus="" and="" cytoplasm="" were="" enhanced.="" among="" them,="" the="" cells="" pretreated="" with="">CDPçekirdekteki floresansın sitoplazmadakinden daha güçlü olduğunu ve dağılımın üç CDP konsantrasyonunda yakın olduğunu görebildiğimiz için bazı farklılıklar gösterdi (Şekil 7C).
ŞEKİL 3 CDP, zebra balıklarında melanogenezi destekler.
4|TARTIŞMA VE SONUÇLAR
Bu çalışmada, rolünü araştırdık.CDPHEM'lerde ve B16F10 hücrelerinde. İlk kez, CDP'nin melanositlerde melanogenezi teşvik edebileceğini ve zebra balıklarında pigmentasyonu teşvik edebileceğini bulduk. Sonraki bir deney, MAPK sinyal yolunun CDP tedavisi altında aktive edildiğini gösterdi. rolünü daha da araştırdık.oksidatif stresve CDP'nin melanositlerde H2O2- ile indüklenen sitotoksisiteyi ve apoptozu azaltabildiğini buldu; bu arada, CDP, NRF2/HO-1 antioksidan yolunu aktive edebilir ve oksidatif stres koşulları altında hücre içi ROS'u temizleyebilir.
Mitojenle aktive olan protein kinaz, ekspresyonunu destekleyen önemli bir transkripsiyon faktörü olan MITF'nin düzenlenmesinde rol oynayan hayati bir yoldur.melanogenezmelanin sentezini ve taşınmasını etkiler.26,27 Çalışmamızda, CDP tedavisinden sonra melanositlerde ERK, JNK ve p38 aktivasyonu önemli ölçüde artmıştır; bu arada, MITF/p-MITF ve MITF güdümlü TYR, TRP1, TRP2 ve RAB27A ifadeleri buna göre yukarı regüle edildi. Bu nedenle, CDP'nin teşvik edebileceğini öneriyoruz.melanogenezMAPK yolunu etkinleştirerek, ancak nasılCDPMAPK'ları etkinleştirdiği bilinmiyor. Son çalışmalara göre, ücretli benzeri reseptör 4 (TLR4) melanositlerde yüksek oranda eksprese edilir vemelanogenez.28,29 TLR4, lipopolisakarit (LPS)30'u spesifik olarak bağlayabilen önemli bir transmembran proteinidir; çalışmalar, LPS'nin melanogenezi indükleyebileceğini bildirdi.29 İlginç bir şekilde, bitkilerden veya mantarlardan ekstrakte edilen birkaç polisakkaritin TLR'leri ve MAPK ve nükleer faktör kappa beta (NF-κB) gibi aşağı akış sinyal yollarını aktive ettiği bildirildi.31,32 Bu nedenle,CDPTLR'ler tarafından tanınabilir ve bağlanabilir, ardından aşağı akış MAPK sinyal yolunu aktive eder ve teşvik edermelanogenez. Ayrıca, nükleotid bağlayıcı oligomerizasyon alanı benzeri reseptörlerin (NLR'ler) hücre içi ligandları tanıdığı ve MAPK ve NF-κB sinyal yollarının aktivasyonunu yönlendirdiği bilinmektedir.33,34 Bildirildiği gibi, Ganoderma lucidum ve Astragalus'tan ekstrakte edilen polisakkaritler hücrelere girebilir ve NLR'leri etkiler.35,36 Böylece, CDP'nin melanositlere girmesi ve NLR'ler aracılığıyla MAPK sinyal yolunu düzenlemesi mümkündür. Ancak, bu hipotezi doğrulamak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.
Bugüne kadar yapılan bazı çalışmalar, melanin üretimini inhibe etmek için melanogenezde bitkisel polisakkaritlerin uygulandığını bildirmiştir.37,38 Ancak bu çalışmada,CDPterfimelanogenezmelanositlerde ve bu etki, -MSH ile karşılaştırmadan sonra daha da doğrulandı. CDP aynı zamanda bitkilerden elde edilen bir tür polisakkarittir, CDP'nin zıt etkisinin CDP ve diğer polisakkaritler arasındaki yapısal farklılıklarla ilgili olabileceğinden şüpheleniyoruz. Polisakaritler, monosakaritlerin polimerizasyonu ile oluşturulur, ancak monosakarit tipi, mono-sakarit bileşimi, glikozidik bağ, yan zincir yapısı ve moleküler ağırlık bakımından değişkendir39,40; bu faktörlerin biyolojik işlevlerini belirlediği düşünülmektedir.41 Mevcut çalışmalar,CDPve CDP yapısının sonradan onun işlevini etkilediğini öne sürdü.42 Bu nedenle, CDP'yi tam olarak anlamak ve hipotezimizi doğrulamak için daha fazla kanıta ihtiyaç var.
melanogenezultraviyole hasarına direnmenin ve vücut homeostazını sürdürmenin önemli bir koruyucu mekanizmasıdır43; aynı zamanda, melanositler, ROS aşırı yüklenmesi gibi olumsuz ortamlara kolayca maruz kalırlar.11 ROS'un melanogenezi teşvik etmeye katıldığı bilinmektedir, mekanizmalardan biri MAPK'ları aktive etmektir.44 Ancak çalışmalar, bu etkinin sadece belirli bir ROS içinde var olduğunu da ortaya koymuştur. seviye, ROS aşırı yükü bozulurkenmelanogenezönemli ölçüde.45ROS, MAPK ve melanogenez arasındaki ilişki farklı koşullar altında değişkendir, bu nedenle pro- ve antioksidan sistemler arasındaki denge açıkça önemlidir. Vitiligo gibi depigmentasyon hastalıklarında, dengesiz bir antioksidan sistem ve kontrol edilemeyen ROS aşırı yüklenmesi, melanositlere zarar verir ve hücre canlılığını azaltır.11,46 Bu çalışmada, hücrelerdeki aşırı ROS yükünü simüle etmek için farklı H2O2 konsantrasyonları kullandık ve HEM'ler daha zayıf tolerans gösterdi. B16F10 hücrelerinden daha H2O2. Melanositler H2O2 tedavisine tabi tutulduğunda, canlılıkları ve apoptoz oranları daha da kötüleşti, ancak CDP ön tedavisi bu eğilimi kısmen tersine çevirebilirdi. Aynı zamanda, ROS temizlendi. Bildirildiği gibi, NRF2/ARE antioksidasyon yolu aktivasyonu, deri hücrelerinde ROS süpürme için başlıca bir yöntemdir.14 Deneylerimizde, melanositlerdeki NRF2 ve HO-1 protein seviyeleri, CDP'siz H2O2 tedavisinden sonra yukarı regüle edildi; bu, H2O2-'nın indüklediği anlamına geliroksidatif stresNRF2/HO-1 yolunu aktive edebilir, ancak redoks dengesini korumak ve hücreyi hasardan korumak için yetersizdir. Bununla birlikte, CDP ön işlemi NRF2/HO-1 antioksidasyon yolunu iyileştirdi ve dengeyi yeniden sağladı. Bu nedenle, CDP'nin NRF2/HO-1 antioksidasyon yolunu aktive ederek ve ROS'u temizleyerek melanositleri oksidatif stres hasarından koruyabileceğini öneriyoruz.
Daha fazla bilgi için lütfen buraya tıklayın.
Onu buldukCDPtek başına tedavinin melanositlerdeki ROS veya NRF2/HO-1 üzerinde hiçbir etkisi yoktur. Bu sonuç, CDP'nin aşağıdaki koşullarda redoks dengesini etkileyebileceğini göstermektedir.oksidatif stres, ama normal şartlar değil. Ayrıca, NRF2/HO-1 antioksidasyon yolunun PI3K, NF-κB ve MAPK sinyal yolları tarafından düzenlendiği bildirilmektedir.47,48 Çalışmamızda CDP, MAPK sinyal yolunu aktive edebilmiştir. CDP'nin, MAPK'ları yukarı doğru düzenleyen yoluyla NRF2/HO-1 yolunu etkinleştirmesi mümkündür. Slominski'nin bildirdiği gibi, melanositler düzenleyici bir ağda yer alan stres sensörleridir ve işlevleri çevreye tepki olarak hızla değişebilir.49 Biz CDP'nin rolünün melanositlerin durumundan etkilendiğini öneriyoruz.melanogeneznormal koşullar altında antioksidan sistemi etkilemeden ancak oksidatif stres koşulları altında redoks dengesini geri yükler. Bu nedenle, melanosit fonksiyonu ve hayatta kalması CDP ile iki farklı şekilde sağlanabilir. CDP, melanositlerin aynı zamanda önemli bir işlevi olan homeostaziyi sürdürmesine yardımcı olur.melanogenez.50,51
Sonuç olarak,CDPMAPK sinyal yolunu aktive ederek melanositlerin melanogenezini teşvik edebilir. CDP, NRF2/HO-1 antioksidan yolunu aktive ederek ve hücre içi ROS'u aşağıdaki koşullarda temizleyerek melanosit sağkalımını iyileştirebilir.oksidatif streskoşullar. Bulgularımız anlamlı çünkü CDP'nin hemmelanogenezve melanositleri, muhtemelen melanosit disfonksiyonu ve kaybından sorumlu olan oksidatif stres hasarından korur. Bu çalışmanın bulguları, CDP'nin depigmentasyon hastalıklarının tedavisinde yeni bir ilaç olabileceğini göstermektedir.
