Cistanche Musalais'teki Aroma Bileşenlerinin ve Diferansiyel Metabolitlerin GC-MS ve Metabolomiklere Dayalı Analizi
Nov 28, 2025
Soyut:Bu çalışma, Sincan Hetian kırmızı üzümleri ve çeşitli Cistanche ilaveleri ile geleneksel teknikler kullanılarak Cistanche Musalais'i hazırladı. Optimum işleme koşulları tek yönlü ANOVA ile belirlendi. Aroma bileşenlerini ve diferansiyel metabolitleri analiz etmek için GC-MS ve hedeflenmemiş metabolomikler kullanıldı ve toplam flavonoidler ve toplam polifenoller gibi aktif bileşenler ölçüldü. Optimum koşullar şunlardı: 32 derece Bx başlangıç şeker içeriği, 25 derece fermantasyon sıcaklığı ve %7 Cistanche Deserticola ilavesi. Bu koşullar altında alkol içeriği, toplam asitlik, toplam flavonoidler ve toplam polifenoller sırasıyla %(12,6 ± 0,6) hacim, (3,82 ± 0,19) g/L, (0,80 ± 0,01) g/L ve (0,60 ± 0,00) g/L'ye ulaştı. GC-MS 38 aroma bileşiği tespit etti; en bol bulunan sınıf esterler (24 bileşik), ardından 6 alkol, 2 keton ve 2 aldehit geldi. Yalnızca üzüm suyundan yapılan Musalais'lerle karşılaştırıldığında, Cistanche Deserticola Musalais, etil asetat (%6,42'ye karşı %{. 2.42) ve etil palmitat (%3,75'e karşı %{. 1.18}) dahil olmak üzere önemli ölçüde daha yüksek seviyelerde anahtar esterler sergilerken, izobutanol gibi yüksek alkoller önemli ölçüde azaldı (%2,11'e karşı %{. 3.98). Metabolomikler, ABC taşıyıcıları ve amino asit biyosentezi ile ilgili yollarda zenginleştirilmiş 230 diferansiyel metabolit (VIP 1'den büyük veya ona eşit, P < 0.05) tanımladı. Trigonelin ve krosin gibi bileşenler önemli ölçüde arttı. Amino asit metabolizması karakteristik lezzet profilinin oluşumuna katkıda bulunmuştur. Bu çalışma, Cistanche Musalais'in geliştirilmesi ve kalitesinin iyileştirilmesi için teorik ve teknik bir temel sağlamaktadır. Gelecekteki araştırmalar, genel lezzet profilinden sorumlu anahtar aktif bileşikleri daha iyi tanımlamak için GC-O gibi moleküler duyusal teknikleri içermelidir.
Anahtar Kelimeler: Cistanche;Musalailer; GC-MS; metabolomik
CistancheMusalailer
Cistanche Musalais Liste Detayları
Musalais (Msalais)Awati kırmızı üzümlerinden veya Hetian (Hotan) kırmızı üzümlerinden üretilen, Sincan'a özgü geleneksel fermente bir içecektir. Meyve suyu sıkma, konsantre etme ve kendiliğinden fermantasyon yoluyla yapılır ve ilkel, doğal ve yeşil olarak nitelendirilir. Benzersiz bir Çin doğal fermente alkollü içeceği olan Musalais, duyusal özellikler, besin değeri ve fonksiyonel aktiviteler açısından farklı bölgesel özellikler sergiliyor. Fermantasyon sırasında oluşan alkoller, esterler, aldehitler, asitler, fenolikler ve terpenler sadece benzersiz bir tat vermekle kalmaz, aynı zamanda kan dolaşımını teşvik etmek, kan lipitlerini düşürmek, böbreği tonlamak ve vücudu güçlendirmek, kolesterolü düzenlemek ve kardiyovasküler ve serebrovasküler sağlığı korumak gibi faydalarla da ilişkilidir ve bu da onu farklı yaşlardaki tüketiciler için uygun hale getirir.
Son yıllarda sağlıklı içeceklere yönelik tüketici talebinin artmasıyla birlikte fonksiyonel likör pazarı da hızla genişledi. Geleneksel bira yapımına dayanarak, fonksiyonel likörler sağlıklı yaşam, sağlık bakımı veya spesifik fizyolojik düzenleme ihtiyaçlarını karşılamak için belirli fonksiyonel bileşenleri içerir. Kaliteleri ham maddelerden, proseslerden, mikrobiyal topluluklardan ve fonksiyonel bileşenlerin stabilitesinden etkilenir [2]. Güney Sincan halk pratiğinde, Musalai'nin hazırlanması sırasında sağlık yararlarını arttırmak ve lezzet çeşitliliğini zenginleştirmek için goji meyvesi, aspir, Cistanche ve safran gibi yerel yardımcı maddeler sıklıkla eklenir [3]. Bunlar arasında polisakkaritler, amino asitler, feniletanoid glikozitler, iridoid glikozitler ve alkaloidler açısından zengin olan Cistanche, böbrek yang'ı üzerinde tonik etkilere sahiptir, nöroendokrin fonksiyonu modüle eder ve yorgunlukla mücadele eder ve "çölün ginseng'i" adını alır [4-5].
Bununla birlikte, Cistanche Musalais'in sanayileşmesi şu anda üretim standartlarının eksikliği, eksik işleme teknolojisi ve aroma maddeleri üzerine yetersiz araştırma gibi, pazar tanıtımını ve kalite iyileştirmeyi kısıtlayan zorluklarla karşı karşıyadır. Bu çalışmada Musalais fermantasyon sürecini optimize etmek için Cistanche yardımcı madde olarak kullanıldı. Aroma bileşenlerini ve diferansiyel metabolitleri sistematik olarak çözmek için GC-MS ve hedeflenmemiş metabolomikler kullanılmış olup, Cistanche Musalais'in standartlaştırılmış üretimi, lezzet modülasyonu ve fonksiyonel gelişimi için teorik bir temel ve teknik destek sağlamayı ve böylece bu geleneksel içeceğin modernizasyonunu ve değer gelişimini desteklemeyi amaçlamaktadır.
1 Malzemeler ve yöntemler
1.1 Malzemeler ve reaktifler
Cistanche tubulosa (borulu Cistanche): Hetian (Hotan), Sincan'dan temin edilen, dolgun dokulu, küf ve yabancı maddeler içermeyen birinci sınıf ticari örnekler.
Hetian kırmızı üzümleri: Hetian, Sincan'dan temin edilen, bozulmamış görünüme ve güçlü aromaya sahip ticari meyve.
Metanol ve asetonitril: Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd.
Formik asit: TCI (Shanghai) Development Co., Ltd.
L-2-klorofenilalanin: Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.
1.2 Aletler ve ekipmanlar
08-2T sabit sıcaklıkta manyetik karıştırıcı, Shanghai Meiyingpu Instrument Co., Ltd.
57330-U SPME cihazı ve 57348-U 50/30 μm DVB/CAR/PDMS SPME fiber, Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd.
6890N-5973 GC–MS sistemi, Agilent Technologies (Çin) Co., Ltd.
5430R soğutmalı santrifüj, Eppendorf (Shanghai) International Trading Co., Ltd.
TL-48R yüksek verimli doku öğütücü, Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.
SCIENTZ-1LS vakum yoğunlaştırıcı, Ningbo Scientz Bioteknoloji Co., Ltd.
Vanquish Flex UHPLC, Thermo Fisher Scientific (Çin) Co., Ltd.
SDAJ-0.5 Çin tarzı şarap üretim hattı, Shandong Anji Bio-Fermentation Equipment Technology Co., Ltd.
1.3 Deneysel yöntemler
1.3.1 Süreç akışı
Cistanche daha sonra kullanılmak üzere buharda pişirildi. Hetian kırmızı üzümleri yıkanıp seçildi, sapları ayıklandı ve ezildi. Üzüm suyu bir presle ekstrakte edildi, ardından ısıtıldı ve meyve suyu konsantrasyon göstergelerini ayarlamak için konsantre edildi. Son olarak buharda pişirilen Cistanche ürünü konsantre üzüm suyuyla karıştırılarak kontrollü sıcaklık ve zaman parametreleri altında fermente edildi. Fermantasyonun ardından ürün, Cistanche Musalais'i elde etmek için arıtıldı.
1.3.2 Cistanche'nin Hazırlanması
Gong ve ark.'da küçük değişikliklerle. [6], yüksek kaliteli, bozulmamış kurutulmuş Cistanche soyuldu, dilimlendi, gazlı bezle sarıldı ve daha sonra kullanılmak üzere 20 dakika buharda pişirildi.
1.3.3 Üzüm suyunun hazırlanması
Başlangıç çözünür katıları (şekeri) 18 derece Bx olan Hetian kırmızı üzümleri kullanıldı. Çürümüş, bozulmuş ve dengesiz olgunlaşmış üzümler çıkarıldı. Üzümler yıkanıp soyulduktan sonra preslenir. Meyve suyu yüksek sıcaklıkta kaynatıldı (konsantre edildi) ve şeker 26, 29 veya 32 derece Bx'e ulaştığında konsantrasyon durduruldu. Meyve suyu daha sonra kullanılmak üzere oda sıcaklığına soğutuldu.
1.3.4 Cistanche Musalais'in fermantasyon süreci
Buharda pişirilmiş Cistanche, bir fermentörde 600 mL konsantre üzüm suyuna belirli oranlarda (%3, %5, %7) ilave edildi. İlerlemeyi izlemek için fermantasyon sırasında her 24 saatte bir artık şeker ölçüldü. Artık şeker 4 g/L'ye düştüğünde fermantasyon sonlandırıldı. Süpernatan toplandı ve Cistanche Musalais'i elde etmek için 85 derecede 30 dakika boyunca pastörize edildi.
1.3.5 Cistanche Musalais için tek faktörlü deneysel tasarım
Cistanche ilavesinin (%3, %5, %7), başlangıç şeker içeriğinin (26, 29, 32 derece Bx) ve fermantasyon sıcaklığının (22, 25, 28 derece) fizikokimyasal özellikler ve biyoaktivite üzerindeki etkileri araştırıldı.
1.3.6 Analizler ve ölçümler
Alkol içeriği, çözünür katılar ve toplam asitlik: GB/T 15038-2006 "Şarap ve meyve şarabı için genel analitik yöntemler"e göre belirlenmiştir.
Toplam flavonoidler: Xu ve ark.'na referansla belirlenmiştir. [7]. Absis olarak rutin konsantrasyonu (X) ve ordinat olarak 510 nm'de absorbans (Y) ile bir kalibrasyon eğrisi hazırlandı, bu da iyi doğrusallığa işaret eden Y=0.8043X − 0,0278, R2=0.9999 sonucunu verdi.
Toplam polifenoller: Folin-Ciocalteu yöntemi kullanılarak belirlenir [8]. Absis olarak gallik asit içeriği (X) ve ordinat olarak 760 nm'de absorbans (Y) ile bir kalibrasyon eğrisi hazırlandı, bu da iyi bir doğrusallığa işaret eden Y=0.4177X + 0.1048, R2=0.9975 sonucunu verdi.
1.3.7 GC-MS analizi
Deneysel (32 derece Bx, 25 derece, %7 Cistanche) ve Cistanche'siz kontrol olmak üzere iki gruptan alınan numuneler GC-MS'ye tabi tutuldu.
Numune ön işlemi: Numune 20 mL'lik bir ekstraksiyon şişesine yerleştirildi; 100 uL 50 ug/mL izoamil fenilasetat dahili standart olarak eklenmiştir. Şişe kapatıldı ve 20 dakika boyunca 250 devir/dakikada manyetik karıştırma ile 60 derecelik bir su banyosunda dengelendi. Daha sonra SPME fiberi 30 dakikalık ekstraksiyon için yerleştirildi. Kullanmadan önce, SPME fiberi GC girişinde 250 derecede 20 dakika süreyle şartlandırıldı.
GC–MS koşulları: HP-INNOWax kolonu (60 m × 250 μm × 0,25 μm); giriş 250 derece; transfer hattı 250 derece; taşıyıcı gaz akışı 1,5 mL/dak; 4:1 oranında bölünür. Fırın programı: 40 derece (5 dakika), 5 derece/dakika ila 250 derece arasında rampa, 10 dakika bekletin. İyon kaynağı 230 derece; dört kutuplu 150 derece; EI 70 eV; tam tarama 35–550 Da.
1.3.8 Hedeflenmemiş metabolomikler
1.3.8.1 Numune hazırlama
İki grup test edildi: deneysel (32 derece Bx, 25 derece, %7 Cistanche) ve Cistanche'siz kontrol; Grup başına n=3 biyolojik kopya, toplam 6 örnek. Çözdürme ve vorteksleme işleminden sonra her numuneden 300 μL, 1,5 mL'lik bir tüpe aktarıldı ve 12.000 r/dk, 4 derecede 15 dakika santrifüj edildi. Daha sonra, 100 μL süpernatan 2 mL'lik bir tüpe taşındı, sıvı nitrojende anında donduruldu ve liyofilize edildi. 1 mL önceden soğutulmuş metanol:asetonitril (1:1, v/v) ekleyin, 30 saniye vorteksleyin; 30 dakika boyunca -20 derecede dondurun; 12.000 dev/dk'da, 4 derecede 10 dakika süreyle santrifüjleyin; 850 μL süpernatantı toplayın ve tamamlanana kadar vakumla kurutun; 150 μL %50 metanol (5 ppm 2-klorofenilalanin ile) içinde yeniden oluşturun, 30 saniye vorteksleyin; 12.000 dev/dak santrifüj, 10 dakika boyunca 4 derece; 0,22 μm membrandan filtreleyin ve filtratı şişelere aktarın. Cihaz stabilitesini ve veri güvenilirliğini değerlendirmek üzere bir QC numunesi oluşturmak için her numuneden 10–20 μL'yi birleştirin; 5'ten az örnek dahil edilirse QC atlanır.
1.3.8.2 Analitik koşullar
Kromatografi: ACQUITY UPLC HSS T3 kolonu (100 Å, 1,8 μm, 2,1 mm × 100 mm); akış 0,4 mL/dak; sütun 40 derece; otomatik örnekleyici 8 derece; enjeksiyon 2 μL. Mobil faz A: %0,1 (h/h) formik asit içeren su; mobil faz B: %0,1 (h/h) formik asit içeren asetonitril.
Kütle spektrometresi: püskürtme voltajı +3.5 kV/−3,0 kV; kılıf gazı 40 arb; yardımcı gaz 10 arb; kılcal 320 derece; yardımcı gaz sıcaklığı 300 derece; MS1 çözünürlüğü 60.000; tarama aralığı m/z 70–1.000; AGC Hedef Standardı; Maksimum BT 100 ms; 4 saniyelik dinamik dışlama ile ilk 4 iyondaki veriye bağlı MS/MS; MS2 çözünürlüğü 15.000; HCD çarpışma enerjisi %30.
1.3.8.3 Metabolit tanımlama
Metabolit tanımlaması, kurum içi standartlar kütüphanesi, mzCloud (https://www.mzcloud.org/), LIPID MAPS (https://www.lipidmaps.org/), HMDB (https://hmdb.ca/), MoNA (https://mona.fiehnlab.ucdavis.edu/), içeren PSNGM'ye (PerSonalbio Yeni Nesil Metabolomik Veri Tabanı) dayanıyordu. NIST_2020_MSMS ve yapay zeka tarafından tahmin edilen bir MS/MS spektral kitaplığı.
Ek açıklamalarda kullanılan harici veritabanlarına ilişkin not:
HMDB: KEGG, PubChem, MetaCyc, ChEBI, PDB, UniProt ve GenBank ile kapsamlı çapraz bağlantılara sahip ve gelişmiş metin/dizi/yapı ve MS/NMR spektral aramalarını destekleyen, 220.945 metabolit için ayrıntılı kimyasal, klinik ve biyokimyasal bilgiler içeren kapsamlı bir insan metabolom veritabanı (Sürüm 5.0). Ayrıca DrugBank, T3DB, SMPDB ve FooDB ile de ilişkilidir.
LIPID MAPS: An open-access lipidomics resource providing databases (e.g., LMSD with >50.000 seçilmiş lipit yapısı), spektrumlar, yollar, MS analizi için araçlar, yapı çizimi ve isimlendirme/sınıflandırma kaynakları.
mzCloud: Firefox/Chrome masaüstü erişimi için optimize edilmiş, 32.330 bileşik, 51.002 spektral ağaç ve 16.531.567 spektrum (2024'te önemli eklemelerle birlikte) içeren, spektrum, yapı, altyapı, ağaç ve m/z tabanlı aramaları destekleyen gelişmiş bir kütle spektral kitaplığı.
1.3.8.4 Çok değişkenli istatistiksel analiz
PCA gerçekleştirmek için 6 numuneden alınan metabolit verilerine çok değişkenli analizler uygulandı ve Cistanche Musalais ve Musalais arasındaki metabolik farklılıklar aydınlatıldı. Gruplar arasındaki farklı metabolitler, projeksiyonda OPLS-DA değişken önemi (VIP), kat değişimi ve P değerleri (VIP eşiği ve yukarıdaki gibi anlamlılık) ve ardından KEGG yolu zenginleştirmesini içeren biyolojik yorumlama kullanılarak tarandı [9].
Referanslar
[1] Zhu LX, Wang LL, Song HZ, ve diğerleri. Sincan Çin'deki geleneksel Musalais işlemeyle ilişkili ana aroma bileşiklerinin kalitatif analizi. Bira Üretim Enstitüsü Dergisi. 2012;118(2):236–242.
[2] Zhao B, Li DD, Yuan Y, ve diğerleri. Fermente fonksiyonel likör üzerine modern araştırma ilerlemesi. İçki Yapımı. 2025;52(2):43–49.
[3] Zhu LX, Hou XJ, Xu Q. Xinjiang Msalais üzüm şarabının geliştirme stratejileri üzerine tartışma. İçki Yapımı Bilimi ve Teknolojisi. 2008(7):111–113.
[4] Song ZH, Lei L, Tu PF. Cistanche Hoffing bitkilerinde farmakolojik aktivite araştırmalarındaki gelişmeler. ve Bağlantı. Geleneksel Çin ve Bitkisel İlaçlar. 2003;34(9):U018.
[5] Shi TT, Ge WH. Cistanche Hoffmg'un araştırma geliştirmesi. Et Bağlantısı. Çin Etnotıp ve Etnofarmasi Dergisi. 2009;18(9):7–9.
[6] Gong X, Zhong T, Zhou JY, ve diğerleri. Yeni fermente Cistanche şarabı teknolojisi üzerine çalışma. Modern Yiyecek. 2019(5):64–68;79.
[7] Xu HT, Li H, Zhao YZ, ve diğerleri. Nervilia fordii'den elde edilen toplam flavonoidlerin antioksidan ve antibakteriyel aktiviteleri. Kuzey Bahçıvanlık. 2017(16):161–165.
[8] Yu H, Xu X, Hao JX, ve diğerleri. Turunçgil kabuğu posasının Trichoderma koningii, Aspergillus oryzae ve Lactobacillus casei ile karışık fermantasyonu: süreç optimizasyonu, antioksidan aktiviteler ve hedeflenmemiş metabolomik analiz. Gıda Biyobilimi. 2025;66:106180.
[9] Zhou JN, Hou DH, Zou WQ, ve diğerleri. Yabani Ophiocordyceps sinensis'in geniş çapta hedeflenen metabolomiklerinin ve hedeflenmemiş metabolomiklerinin karşılaştırılması. Moleküller. 2022;27(11):3645.
[10] Li XH. Rosa kwangsiensis var. teknolojisi üzerine araştırma. sterilis fermente şarap [Yüksek Lisans tezi]. Chongqing: Güneybatı Üniversitesi; 2017.
[11] Li ZJ, Zhang XD, Long BX, ve diğerleri. Msalais armutunun ürün geliştirme ve tepki yüzeyi optimizasyonu üzerine araştırma. Tarımsal Ürün İşleme. 2025;3:1–10.
[12] Zhang L, Jiang XF. GB/T15038-2006 şarap ve meyve şarabı genel analiz yönteminde bakır belirleme yönteminin uyarlanabilirliğinin doğrulanması. İçki Yapımı. 2020;47(5):104–107.
[13] Zhong DL, Yang H, Wang Z, ve diğerleri. Malolaktik fermantasyon sıcaklığının Cabernet Sauvignon şarabının kalitesine etkisi. Zhejiang Tarım Bilimleri. 2025;66(7):1724–1732.
