Cistanche Tubulosa Feniletanoid Glikozitler H22 Hepatosellüler Karsinom Hücrelerinde Hem Dışsal hem de İçsel Sinyal Yolları Yoluyla Apoptozu İndükler

İletişim: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-posta:audrey.hu@wecistanche.com

Pengfei Yuan, Jinyu Li, Adila Aipire, Yi Yang, Lijie Xia, Xinhui Wang, Yijie Li ve Jinyao Li

Soyut

Arka fon:Cistanche tübüloza(Schenk) R. Wight, Tamarix bitkisinin köklerini parazitleştiren ve erkek iktidarsızlığı, kısırlık, vücut zayıflığı tedavisinde ve tonik olarak kullanılan geleneksel bir Çin tıbbıdır. Bununla birlikte, hepatosellüler karsinom üzerindeki antitümör etkisi hala belirsizdir. Burada antitümör etkisini araştırdık.C. tubulosa feniletanoid glikozitler(CTPG) H22 hepatoselüler karsinom hücreleri üzerinde hem in vitro hem de in vivo ve mekanizmaları. Yöntemler: H22 hücrelerinin morfolojisi, canlılığı, apoptoz, hücre döngüsü ve mitokondriyal membran potansiyeli (Δψm) sırasıyla ters çevrilmiş mikroskopi, MTT tahlili ve akış sitometrisi ile analiz edildi. Apoptoz yolundaki proteinlerin ekspresyonu ve aktivasyonu Western blot ile tespit edildi. İn vivo antitümör etkisi, erkek Kunming fareleri kullanılarak oluşturulan bir tümör fare modelinde değerlendirildi. Sonuçlar: CTPG tedavisi, artan apoptoz ve G0/G1 ve G2/M fazlarında hücre döngüsü durması ile ilişkili olan, doza ve zamana bağlı bir şekilde H22 hücre büyümesini önemli ölçüde bastırdı. Ayrıca, CTPG ile tedavi edilen H22 hücrelerinde kromozomal yoğunlaşma gözlendi. CTPG tedavisi Bax/ Bcl-2 oranını önemli ölçüde arttırdı, Δψm'yi azalttı ve sitokrom c salınımını arttırdı. Hem dışsal hem de içsel sinyal yollarındaki bölünmüş kaspaz-8 ve kaspaz-9 seviyeleri, PARP'ı parçalamak için sıralı olarak aktive edilen kaspaz-7 ve -3 önemli ölçüde arttı. Son olarak, CTPG (cistanchetübülozafeniletanoid glikozitler) farelerde H22 hücrelerinin büyümesini inhibe etti ve tümör farelerinin hayatta kalma oranını iyileştirdi. Sonuçlar: Bu sonuçlar, CTPG'nin hem dışsal hem de içsel apoptoz yolları yoluyla H22 hücre büyümesini baskıladığını ileri sürdü.

Arka fon

Karaciğer kanseri, dünya çapında kanser insidansı için altıncı ve kanser ölümleri için dördüncü sırada yer aldı. Ayrıca, düşük sosyodemografik indeksi olan ülkelerde kanser insidansı için dördüncü ve kanser mortalitesi için ilk sırada yer aldı [1]. Çin'de karaciğer kanseri, 2015 yılında kansere bağlı ölümlerin üçüncü önde gelen nedenidir [2]. Dünyadaki primer karaciğer kanserlerinin yüzde 90'ından fazlası hepatosellüler karsinomdur (HCC). Şu anda, HCC tedavisi için ana seçenek hepatik rezeksiyondur. Bununla birlikte, HCC'li hastaların yüzde 30'undan azı küratif karaciğer rezeksiyonu kriterlerini karşıladı ve yüksek nüks oranı nedeniyle toplam 5-yıllık sağkalım oranı hala yüzde 35-50 kadar düşük [4, 5 ]. Orta ila ileri HCC'li hastalar için tedavi seçeneklerinin mevcudiyeti çok sınırlıdır. Moleküler olarak hedeflenen bir ilaç olan Sorafenib, FDA tarafından ileri HCC için birinci basamak tedavi olarak onaylanmıştır. Bununla birlikte, sorafenib sadece yaklaşık 3 aylık sağkalımı uzatır ve yanıt oranı yüzde 4'ten azdır [6, 7]. HCC'ye karşı yeni ilaçlar veya stratejiler geliştirmek acildir. Geleneksel Çin tıbbı (TCM) tek başına veya diğer stratejilerle birlikte HCC'yi tedavi etmek için kullanılmış ve uzun sağkalım süresi, iyileştirilmiş yaşam kalitesi, azaltılmış advers reaksiyonlar vb. dahil olmak üzere klinik faydalar göstermiştir [8, 9].cistanche, bir tür TCM, çeşitli biyolojik işlevlere sahiptir, örneğinanti-oksidasyon, anti-inflamatuar, anti-aging,ve nöroproteksiyon [10, 11]. Feniletanoid glikozitler, ana aktif bileşenler olarak kabul edilmiştir.cistancheanti-oksidasyon, anti-inflamasyon, hepatoproteksiyon ve nöroproteksiyon dahil olmak üzere çeşitli aktivitelere sahip olan [12-15]. Grubumuz bildirdiCistanche tubulosa feniletanoid glikozitler(CTPG), melanom B16-F10 hücrelerinde apoptozu indükleyebilir ve farelerde tümörlerin büyümesini inhibe edebilir [16]. Bu çalışmada, CTPG'nin hem in vitro hem de in vivo HCC H22 hücreleri üzerindeki antitümör etkisini ölçtük ve mekanizmalarını araştırdık. CTPG'nin hem dışsal hem de içsel sinyal yolları yoluyla H22 hücrelerinde apoptozu indüklediğini ve farelerde H22 tümörlerinin büyümesini bastırdığını bulduk.

yöntemler

Hücre çizgisi

Fare H22 hepatoselüler karsinoma hücreleri, Xinjiang Biyolojik Kaynaklar ve Genetik Mühendisliği, Xinjiang Üniversitesi (Urumqi, Xinjiang, Çin) Xinjiang Key Laboratory'den elde edildi ve 100 U/ml penisilin ve 100 ug/ml ile takviye edilmiş RPMI 1640 ortamında (Gibco) kültürlendi. streptomisin ve yüzde 10 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (Gibco) 37 derecede, yüzde 5 CO2'lik nemli bir atmosferde.

MTT tahlili

CTPG, Hetian Dichen Biotech Co., Ltd.'den (Hetian, Xinjiang, Çin) satın alındı ​​ve CTPG'nin ana bileşikleri, yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile nitelendi ve nicelendirildi [16]. Hücre canlılığı 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2, 5-difeniltetrazolyum bromür (MTT) (Sigma, St. Louis, MO) ile değerlendirildi. , ABD) tahlil. H22 hücreleri, kuyu başına 100 ul ortam içinde 2 x 104 hücre yoğunluğunda 96-kuyucuklu plakalara aşılandı ve 37 derecede kültürlendi. 24 saat sonra hücreler, sırasıyla 24, 48 ve 72 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda CTPG (0, 100, 200, 300 ve 400 ug/ml) veya yüzde 0,3 DMSO (400 ug/ml CTPG'dekine eşit) ile işlendi. . 7 dakika 1000 rpm'de santrifüj edildikten sonra süpernatan atıldı ve her bir oyuğa 100 ul MTT solüsyonu (PBS içinde 5 mg/ml) ilave edildi. Plakalar 4 saat 37 derecede inkübe edildi ve oluşan formazan kristallerini çözmek için 100 ul DMSO eklendi. OD490 değerleri, bir 96- kuyulu mikroplaka okuyucu (Bio-Rad Laboratories, CA, ABD) tarafından tespit edildi. Hücre canlılığı şu formüle göre hesaplandı: Hücre canlılığı (yüzde)=(ODtedavi edilmiş/ODtedavi edilmemiş) x yüzde 100.

Apoptoz tespiti

H22 hücreleri, 24 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda CTPG (0, 100, 200, 300 ve 400 ug/ml) veya yüzde 0.3 DMSO ile işlendi ve sonra Annexin V FITC/ ile boyandı. Üreticinin talimatlarına göre propidium iyodür (PI) Apoptoz Tespit Kiti (YEASEN, Çin). Örnekler akış sitometrisi (BD FACSCalibur, ABD) ile analiz edildi.

Mitokondriyal membran potansiyelinin tespiti

H22 hücreleri, 24 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda CTPG (0, 200 ve 400 ug/ml) ile işleme tabi tutuldu ve ardından 20 saat boyunca membran geçirgen JC-1 boyası (Beyotime, Çin) ile boyandı. 37 derecede min. JC-1 tamponu ile iki kez yıkandıktan sonra, numuneler 300 ul JC-1 tamponu ile yeniden süspanse edildi ve akış sitometrisi (BD FACSCalibur, ABD) ile analiz edildi.

Hücre döngüsü analizi

H22 hücreleri 60 mm kültür kaplarına aşılandı ve farklı konsantrasyonlarda CTPG (0, 100, 200, 300 ve 400 ug/ml) veya yüzde 0,3 DMSO ile işleme tabi tutuldu. 24 saat Tüm hücreler toplandı ve iki kez PBS ile yıkandı. Hücreler, 2 saat boyunca -20 derecede yüzde 70 buz gibi soğuk etanol içinde sabitlendi ve iki kez PBS ile yıkandı, ardından 300 ul Propidium iodide/RNase boyama tamponunda (BD Biosciences) yeniden süspanse edildi. Oda sıcaklığında 10 dakika sonra, akış sitometrisi (BD FACSCalibur, ABD) ile örnekler toplandı ve hücre döngüsü dağılımı ModFit LT 3.0 yazılımı ile analiz edildi.

Hoechst 33.258 boyama

H22 hücre çekirdeklerinin morfolojik değişiklikleri, zar geçirgen DNA bağlayıcı boya Hoechst 33.258 boyaması ile analiz edildi. H22 hücreleri, 2 ml'lik bir ortam içinde 1 x 105 hücre/kuyu konsantrasyonunda bir 6-yuvalı plakaya ekildi. Yüzde 60 ila yüzde 70 birleşmeden sonra hücreler, 24 saat boyunca CTPG (0, 100, 200, 300 ve 400 ug/ml) ile işlendi. Hücreler toplandı ve yüzde 4 buz gibi soğuk Paraformaldehit ile 4 derecede 10 dakika sabitlendi. PBS ile yıkandıktan sonra hücreler Hoechst 33.258 (Beyotime, Çin) ile 4 derecede 10 dakika boyandı. Örnekler, ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu (Nikon Eclipse Ti-E, Japonya) ile gözlemlendi.

Batı lekesi

Anti-kaspaz-3, anti-parçalanmış kaspaz-3, Anti-Bcl-2 ve anti-Bax, Beyotime Biotech Co., Ltd.'den (Shanghai, Çin) satın alınmıştır. Anti-kaspaz-7, anti-parçalanmış-kaspaz-7, anti-kaspaz-8, anti-yarılmış-kaspaz-8, anti-kaspaz-9, anti -cleaved-caspase-9, anti-PARP, anti-cleved PARP, anti-fare IgG-HRP ve anti-rabbit IgG-HRP, Cell Signaling Technology'den satın alındı. Anti- -aktin, Beijing ComWin Biotech Co., Ltd.'den (Pekin, Çin) satın alındı.

H22 hücreleri, 24 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda CTPG (0, 100, 200, 300 ve 400 ug/ml) veya yüzde 0.3 DMSO ile işlendi. Hücreler toplandı ve Cell Lysis Solution RIPA (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd) ile buz üzerinde 30 dakika boyunca parçalandı. Süpernatanları toplamak için numuneler döndürüldü (12,000 g, 4 derecede 15 dakika) ve protein konsantrasyonları BCA kiti (Thermo Fisher Scientific, ABD) ile ölçüldü. Her numunede eşit miktarda protein yüzde 12 SDS-PAGE ile izole edildi ve PVDF membranlarına (Biosharp, Çin) aktarıldı. Yüzde 5 yağsız süt içeren TBST tamponu ile bloke edildikten sonra, membranlar sırasıyla ilgili birincil antikorlar ve yaban turpu peroksidaza (HRP) konjuge edilmiş ikincil antikorlar ile inkübe edildi. TBST ile yıkandıktan sonra, hedef proteinler ECL tahlil kiti (Beyotime, Çin) ile saptandı.

Hayvanlar ve etik beyanı

6-8 haftalık erkek Kunming fareleri, Xinjiang Tıp Üniversitesi (Urumqi, Xinjiang, Çin) Hayvan Laboratuvarı Merkezi'nden satın alındı. Fareler, Xinjiang Üniversitesi'nin standart sıcaklık kontrollü, hafif döngülü bir hayvan tesisinde tutuldu. Tüm hayvan çalışmaları, Xinjiang Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin yönergelerine göre yapıldı. Protokol, Sincan Üniversitesi, Sincan Biyolojik Kaynaklar ve Genetik Mühendisliğinin (BRGE-AE001) Temel Laboratuvarı Hayvan Deneyleri Etiği Komitesi tarafından onaylandı.

Tümör fare çalışması

Tümör fare modelinin uyarılması için, erkek Kunming farelerine 1 x 106 H22 hücresi, 100 ul PBS içinde sağ yan tarafa deri altından enjekte edildi. 3 gün sonra fareler rastgele 3 gruba ayrıldı (7 fare/grup). Kontrol grubuna tümör çevresine deri altından 0.1 ml DMSO enjekte edildi. CTPG-200 ve CTPG- 400 gruplarına tümör çevresine 0.1 ml DMSO içinde 200 veya 400 mg/kg CTPG deri altından enjekte edildi. Fareler 21 güne kadar 2 günde bir tedavi edildi. Tümör boyutları 25 güne kadar kumpaslar kullanılarak ölçüldü ve tümör hacmi şu formüle göre hesaplandı: tümör hacmi (mm3 )=(uzunluk x genişlik2)/2. 25 gün sonra, tümör farelerinin hayatta kalması, bu çalışmanın sonuna kadar her gün izlendi.

istatistiksel analiz

İstatistiksel anlamlılık, tedavi ve kontrol grupları arasında tek yönlü varyans analizi ile hesaplandı. Tüm veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak ifade edildi. p < 0.05="" istatistiksel="" olarak="" anlamlı="" kabul="">

Sonuçlar

CTPG, H22 hücrelerinin canlılığını in vitro olarak azalttı

CTPG'nin HCC üzerindeki antitümör etkisini araştırmak için H22 hücreleri, in vitro olarak farklı konsantrasyonlarda CTPG (0, 100, 200, 300 ve 400 ug/ml) ile tedavi edildi. 24 saat sonra, ters bir mikroskop kullanılarak H22 hücrelerinin morfolojisi gözlendi. H22 hücrelerinin morfolojisinin CTPG tedavisi ile çarpıcı biçimde değiştiğini bulduk. Artan CTPG konsantrasyonu ile hücreler küçüldü ve yuvarlaklaştı ve hücre sayısı da büyük ölçüde azaldı (Şekil 1a). Sırasıyla 24, 48 ve 72 saat boyunca CTPG işleminden sonra H22 hücrelerinin canlılığını analiz etmek için MTT tahlili kullanıldı. CTPG, doza bağlı ve zamana bağlı bir şekilde H22 hücre canlılığını önemli ölçüde azalttı (Şekil 1b). 300 ug/ml'deki CTPG, en iyi inhibitör orana ulaştı (Şekil 1c). H22 hücreleri için CTPG'nin IC50 değerleri 24 saatte 236 ug/ml ve 48 saatte 169.8 ug/ml'dir.

H22 hücrelerinde CTPG kaynaklı apoptoz

H22 hücrelerinin azalan canlılığının apoptoz indüksiyonunun aracılık edip etmediğini araştırmak için H22 hücreleri, 24 saat boyunca farklı CTPG konsantrasyonları (0, 100, 200, 300 ve 400 ug/ml) ile işlendi ve boyandı. PI ve Annexin V ile. Akış sitometrisi sonuçları, CTPG'nin H22 hücrelerinin apoptozunu (erken ve geç apoptoz dahil) doza bağlı bir şekilde önemli ölçüde indüklediğini gösterdi (Şekil 2a). Yüksek dozda CTPG, H22 hücrelerinin nekrozunu da önemli ölçüde artırsa da, nekroz, apoptoza kıyasla (%52,6) daha düşük oranı (yüzde 8,3) nedeniyle H22 hücre büyümesinin inhibisyonunda küçük bir rol oynar. Ayrıca, CTPG tedavisinden sonra H22 hücrelerinin toplam proteinleri izole edildi ve anti-apoptotik B hücreli lenfoma 2 (Bcl-2) ve pro-apoptotik BCL-2-ilişkili X proteini (Bax) tarafından tespit edildi. Batı lekesi. Gri tonlamalı tarama verileri, Bax ve Bcl-2 ekspresyon seviyelerinin sırasıyla arttığını ve azaldığını gösterdi. Bax/Bcl-2 oranı önemli ölçüde arttı (Şekil 2b). Bu sonuçlar, CTPG'nin H22 hücrelerinde apoptozu indüklediğini göstermektedir.

CTPG, H22 hücrelerinde kromozomal yoğunlaşmayı ve hücre döngüsü durmasını indükler

İlaçların neden olduğu DNA hasarının ve hücre döngüsü durmasının tümör hücresi büyümesini engelleyebileceği ve tümör hücrelerinde apoptoza neden olabileceği bildirilmiştir [17, 18]. 24 saat CTPG işleminden sonra H22 hücrelerindeki çekirdeklerin morfolojisini saptamak için H22 hücreleri Hoechst 33.342 ile boyandı ve ters çevrilmiş floresan mikroskopisi kullanılarak gözlemlendi. CTPG ile tedavi edilen hücreler, parlak bir şekilde yoğunlaştırılmış çekirdek kromatininde doza bağlı bir artış gösterirken, tedavi edilmeyen hücreler homojen olarak boyanmış çekirdekler gösterdi (Şekil 3a). H22 hücrelerinde hücre döngüsü dağılımı, 24 saat boyunca CTPG işleminden sonra PI boyama ile ayrıca analiz edildi. Şekil 3b'de gösterildiği gibi, CTPG tedavisi G0/G1- ve G2/M-faz hücrelerinin oranını önemli ölçüde arttırdı ve S-faz hücrelerinin oranını önemli ölçüde azalttı, bu da CTPG'nin G'yi indüklediğini düşündürür. H22 hücrelerinde 0/G1 ve G2/M fazı durması. Yüksek dozda CTPG, alt G1 hücrelerinin oranını da önemli ölçüde arttırdı.

CTPG mitokondriyal membran potansiyelini azalttı ve sitokrom c salınımını artırdı

Mitokondriyal bağımlı yol, apoptozun indüklenmesinde önemli bir rol oynar [19, 20]. Mitokondriyal membran potansiyelindeki (Δψm) değişiklikler, JC-1 boyaması ile izlenebilir, çünkü JC-1 agregası (kırmızı floresan) Δψm'nin azalmasıyla monomere (yeşil floresan) bozunabilir [21]. 24 saat CTPG işleminden sonra H22 hücreleri JC- 1 boyası ile boyandı. Akış sitometrisi verileri, FL-2 kanalındaki kırmızı flüoresansın ve FL-1 kanalındaki yeşil flüoresansın CTPG tedavisi üzerine önemli ölçüde azaldığını ve arttığını gösterdi. PE− FITC artı hücrelerinin oranı önemli ölçüde arttı (Şekil 4a), bu da CTPG'nin H22 hücrelerinde Δψm'yi azalttığını gösteriyor. Bu, artan Bax/Bcl-2 oranıyla tutarlıdır. Sonuç olarak, CTPG tedavisi üzerine sitokrom c salınımının önemli ölçüde arttığını gözlemledik (Şekil 4b). Bu sonuçlar, CTPG'nin, mitokondriyal bağımlı (içsel) bir yol yoluyla H22 hücrelerinde apoptozu kısmen indükleyebileceğini gösterdi.

CTPG kaspaz yolunu aktive etti ve DNA onarımını engelledi

Daha sonra, hem dışsal hem de içsel sinyal yolları yoluyla CTPG tarafından indüklenen kaspaz aktivasyonu analiz edildi. 24 saatlik CTPG işleminden sonra, H22 hücrelerinden toplam proteinler izole edildi ve pro- ve bölünmüş kaspazların seviyeleri Western blot ile tespit edildi. Tedavi edilmeyen veya DMSO kontrolü ile karşılaştırıldığında, CTPG tedavisi sadece bölünmüş kaspaz -8 (dış yol) seviyesini değil, aynı zamanda bölünmüş kaspaz-9 (iç yol) seviyesini de önemli ölçüde yukarı regüle etti (Şek. 5). Sırayla, aktive edilmiş kaspaz-8 ve -9, Şekil 5'te gözlemlenen aşağı akış pro-kaspazını-3 ve -7 böldü. Aktive edilmiş kaspaz-3 DNA'yı parçaladı. Şekil 3a'da görüldüğü gibi DNA onarımını önlemek ve DNA hasarını biriktirmek için poli (ADP-riboz) polimerazın (PARP) onarım enzimi.

Bu sonuçlar, CTPG'nin H22 hücrelerinde hem dışsal hem de içsel sinyal yolları yoluyla apoptozu indüklediğini gösterdi.

CTPG, H22 HCC'nin in vivo büyümesini baskılar ve tümör farelerinin hayatta kalma oranını artırır

Son olarak, CTPG'nin HCC üzerindeki antitümör etkisi, H22 hücrelerinin deri altına enjeksiyonu ile oluşturulan bir tümör fare modelinde değerlendirildi. 3 günlük H22 hücre enjeksiyonundan sonra, tümör fareleri 8 kez CTPG ile tedavi edildi. Farelerin vücut ağırlığı ve tümör boyutları belirtilen zaman noktalarında izlendi. Şekil 6a'da gösterildiği gibi, her gruptaki farelerin vücut ağırlığı önemli bir fark göstermez, bu da seçilen CTPG dozlarının belirgin bir yan etkisi olmadığını gösterir. İlginç bir şekilde, hem 200 mg/kg hem de 400 mg/kg CTPG ile tedavi edilen farelerde tümör büyümesi önemli ölçüde inhibe edildi (Şekil 6b). Ayrıca, iki doz CTPG tedavisi, deneyin sonunda kontrol grubu (0/7) ile karşılaştırıldığında tümör farelerinin (3/7, 3/7) hayatta kalmasını büyük ölçüde iyileştirdi (Şekil 6b). Ayrıca, CTPG'nin, erkek Kunming farelerinden izole edilen splenositlerin proliferasyonunu doza bağımlı bir şekilde önemli ölçüde arttırdığını bulduk (Şekil 6c), bu da CTPG'nin immün sistemi uyarıcı bir etkiye sahip olduğunu düşündürür.

Tartışma

TCM, uzun bir tarih boyunca kanserler de dahil olmak üzere çeşitli hastalıkları tedavi etmek için kullanılmıştır. TCM'nin, antitümör etkileri uygulamak için hem dışsal (ölüm reseptörü aracılı) hem de içsel (mitokondriye bağımlı) sinyal yolları yoluyla farklı tipteki tümör hücrelerinde apoptozu indükleyebildiği bildirilmiştir [22-25]. İki yol sırasıyla kaspaz-8 ve -9'yi aktive edebilir [24, 26]. Burada, CTPG'nin apoptoz indüksiyonu ve hücre döngüsü durması yoluyla H22 hücre büyümesini önemli ölçüde baskıladığını bulduk. Bölünmüş kaspaz -8 ve -9 seviyeleri, CTPG tedavisi ile önemli ölçüde yukarı regüle edildi, bu da hem dışsal hem de içsel sinyal yollarının apoptozun indüklenmesinde rol oynadığını düşündürdü. Önceki çalışmamız, CTPG'nin melanom B16-F10 hücrelerinde mitokondriye bağımlı yolla apoptozu indüklediğini, bu da bölünmüş kaspaz-9 seviyesini arttırdığını, ancak kaspaz değil-8 [16] gösterdi. CTPG, farklı tümör hücrelerinde farklı sinyal yollarını aktive edebilir.

Mitokondriyal membran bütünlüğü, Bax ve Bcl-2 dahil olmak üzere BCL-2 protein ailesinin üyeleri tarafından sıkı bir şekilde düzenlenir [27, 28]. Bax'ın Bcl'ye oranı-2 mitokondriye bağımlı apoptoz yolunda kritik bir rol oynar [29]. CTPG ile tedavi edilen H22 hücrelerinde, Bax/Bcl-2 oranı önemli ölçüde yukarı regüle edildi, bu da bu çalışmada gözlemlenen Δψm azalmasına ve sitokrom c salınımına neden olabilir. Sonuç olarak, pro-kaspaz-9 parçalandı ve aktive edildi. Son olarak, aktif kaspaz-8 ve -9 başlatıcıları, DNA onarımını önlemek için PARP'ı parçalamak üzere kaspaz-3 cellatını aktive etti. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar CTPG'nin H22 hücrelerinde hem dışsal hem de içsel sinyal yolları yoluyla apoptozu indüklediğini ileri sürdü.

Tümör fare modelinde, CTPG, H22 HCC'nin büyümesini önemli ölçüde bastırdı ve tümör farelerinin hayatta kalmasını büyük ölçüde geliştirdi. İlginç bir şekilde, CTPG, önceki çalışmamızla tutarlı olarak Kunming farelerinden splenositlerin proliferasyonunu doza bağımlı olarak destekledi [16].

Bu sonuçlar, CTPG'nin farelerde hem doğrudan antitümör etkisi hem de dolaylı bağışıklık geliştirme yoluyla H22 HCC'nin büyümesini baskılayabileceğini ileri sürdü.

Sonuçlar

CTPG, H22 hücrelerinin hem in vitro hem de in vivo büyümesini baskıladı ve hem dışsal hem de içsel sinyal yolları yoluyla H22 hücrelerinde apoptozu indükledi. Bu veriler, CTPG'nin HCC tedavisi için potansiyel bir aday olabileceğini gösterdi.