Cistanche Deserticola Özü Osteoblastlarda Kemik Oluşumunu Artırıyor--Bölüm I

İletişim:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Te Mao Li^ave bir

Soyut
Amaçların etkisini araştırdık.cistancheçöl çiçeğianne. (CD) açıkkemikoluşumkültürlü osteoblastlar tarafından Yöntemler CD'nin in vitro etkilerini incelemek için mineralize nodül oluşumu testi kullanıldı.(cistancheçölikola)üzerindekemikoluşum. Alkalin fosfataz (ALP), kemik morfogenetik proteinleri (BMP)-2 ve osteopontin (OPN) mRNA ifadesi, nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ile analiz edildi. CD'nin etki mekanizması(cistancheçölikola)Ekstrakt Western blot kullanılarak araştırıldı. CD'nin in vivo anti-osteoporotik etkisi(cistancheçölikola)özü, yumurtalıkları alınmış farelerde değerlendirildi.
Önemli bulgular

CD(cistancheçölikola)özütün, kültürlenmiş osteoblastların proliferasyonu, göçü veya yara iyileşmesi üzerinde hiçbir etkisi olmadı, ancak ALP, BMP-2 ve OPN mRNA ve kemik mineralizasyonunu arttırdı. Mitojenle aktive olan protein kinaz (MAPK) veya nükleer faktör (NF)-kB inhibitörleri CD'yi azalttı(cistancheçölikola)ekstrakt kaynaklıkemik oluşumuve ALP, BMP-2 ve OPN ifadesi. Bununla birlikte, CD(cistancheçölikola)ekstrakt osteoklastogenezi etkilemedi. Ek olarak, CD(cistancheçölikola)özü, in vivo olarak ovariektominin neden olduğu kemik kaybını önledi.
Sonuçlar

CD(cistancheçölikola)roman olabilirkemik oluşumuosteoporoz tedavisi için ajan.

anahtar kelimelerkemik oluşumu; cistancheçöl çiçeği; Çin otu; osteoblastlar

cistanche çöl çiçeğiiçin ..... iyidirkemik oluşumu

giriiş

Kemik, 'kemiğin yeniden şekillenmesi' olarak adlandırılan sürekli bir yenilenme ve onarım sürecinden geçen çeşitli hücre tiplerinden oluşan karmaşık bir dokudur. Kemiğin yeniden şekillenmesinden sorumlu iki ana hücre tipi, kemiği rezorbe eden osteoklastlar ve yeni kemiği oluşturan osteoblastlardır. Kemik yeniden şekillenmesi çeşitli sistemik hormonlar (örn. paratiroid hormonu, 1, 25-dihidroksi vitamin D3, seks hormonları ve kalsitonin) ve lokal faktörler (örn. nitrik oksit, prostaglandinler, büyüme faktörleri ve sitokinler) tarafından düzenlenir.[1] Osteoporoz, kemik rezorpsiyonu ve oluşumu koordine edilmediğinde ve aşırı kemik yıkımı kemik oluşumunu aştığında ortaya çıkar.[2] Osteoporoz için mevcut tedaviler, osteoklast aktivitesini inhibe ederek kemik kütlesini koruyan kemik rezorpsiyon inhibitörleri olan bifosfonatlar, kalsitonin ve östrojeni içerir.[3] Bununla birlikte, bu ilaçların kemik kütlesini artırma veya iyileştirmedeki etkisi nispeten küçüktür, kesinlikle yılda yüzde 2'den fazla değildir.[3] Bu nedenle teriparatid gibi kemik yapıcı ajanlara ihtiyaç vardır.kemikoluşumve yerleşik osteoporozun özelliği olan trabeküler mikromimarideki değişikliği düzeltin.[4,5] Çünkü yenikemikoluşumesas olarak osteoblastın bir fonksiyonudur, ya osteoblastik soy hücrelerinin proliferasyonunu artırarak ya da osteoblastların farklılaşmasını indükleyerek hareket eden ajanlar kemik oluşumunu artırabilir.[5,6]
Osteoporozun mekanizmaları belirsizliğini korusa da, bunlar muhtemelen kemik morfogenetik proteinleri (BMP'ler) gibi kemik büyüme faktörlerinin azalan bulunabilirliği veya etkileri ile ilgilidir.[7] Dönüştürücü büyüme faktörü-b süper ailesi ile yapısal olarak ilişkili olan BMP'ler, başlangıçta ektopik indükleme kapasiteleri ile tanımlandı.kemik oluşumkemirgenlerde.[8] BMP'ler önemli bir rol oynamaktadırkemikoluşumve alkalin fosfataz (ALP) aktivitesinin yanı sıra proteoglikan, kollajen ve osteopontin (OPN) sentezini uyararak kemik hücresi farklılaşması.[9] Yakın tarihli bir çalışma, osteoporoz ile BMP-2, ALP ve OPN genlerindeki spesifik polimorfizmler arasında bir bağlantı buldu ve bunların osteoporoz gelişimi ile ilişkili olduğunu düşündürdü.[10]

cistancheçöl çiçeğianne. (Orobanchaceae; CD olarak kısaltılır)(cistancheçölikola)Çin'de yerli bir bitkidir ve yatıştırıcı, analjezik ve immün sistemi uyarıcı özelliklerinden dolayı geleneksel tıpta terapötik bir ajan olarak yaygın olarak kullanılmaktadır.[11] Modern farmakolojik çalışmalar göstermiştir ki CD(cistancheçölikola)ekstraktlar bağışıklığı uyarabilir,[12] serbest radikalleri temizleyebilir[13] ve süperoksit dismutazın aktivitesini artırabilir.[14] Anti-inflamatuar ve antioksidan ajanlar, osteoporozu artırarak tedavi etme potansiyeline sahiptir.kemik oluşumve/veya kemik rezorpsiyonunun baskılanması.[15,16] Bununla birlikte, CD'nin etkisi(cistancheçölikola)kemik hücre fonksiyonu üzerinde henüz belirlenmemiştir. Burada, o CD'yi rapor ediyoruz(cistancheçölikola)özü, kültürlenmiş osteoblastların proliferasyonunu, göçünü veya yara iyileştirme aktivitesini etkilemedi, ancak ALP, BMP-2 ve OPN ekspresyonunu ve kemik mineralizasyonunu arttırdı. Ek olarak, mitojenle aktive olan protein kinaz (MAPK) ve nükleer faktör (NF)-kB sinyal yollarının, gen ekspresyonu ve kemik mineralizasyonunda CD aracılı artışta rol oynayabileceğini gösterdik. Buna karşılık, CD(cistancheçölikola)ekstrakt, in vitro olarak osteoklastogenezi baskılamadı. Özellikle, farelerin CD ile tedavisi(cistancheçölikola)özü, in vivo olarak ovariektominin neden olduğu kemik kaybını önledi. Bu nedenle verilerimiz, CD'nin(cistancheçölikola)uyarmak için kullanılabilirkemikoluşumosteoporoz tedavisi için.

cistanche çöl çiçeğibağışıklığı artırmak

Malzemeler ve yöntemler

Cistanche Deserticola özü ve malzemeleri

CD(cistancheçölikola)özü, Chuang Song-Zong Pharmaceutical Company'den (Kaohsiung, Tayvan) satın alındı. CD'nin çıkarılması ve izolasyonu(cistancheçölikola)daha önce tarif edildiği gibi takip edildi (spektral verilere dayanarak, beta-sitosterol, daukosterol, süksinik asit, triacontanol, asteosit, betain ve polisakarit içeren kimyasal bileşimi tanımladılar).[17] p-hücre dışı sinyalle düzenlenen kinazlar (ERK), ERK, p-p38, p38, pc-Jun N-terminal kinazlar (JNK), JNK, p-p65 ve p65 için spesifik tavşan poliklonal antikorları Santa Cruz Biotechnology'den satın alındı ​​( Santa Cruz, ABD). Osteokalsin ELISA kiti Biosource Technology'den (Nivelles, Belçika) satın alındı. Tip I kollajen ELISA kitinin C-terminal telopeptidleri Cross Laps'ten (Herlev, Danimarka) elde edildi. p38 baskın-negatif mutant, Dr. J. Han (Güney-Batı Tıp Merkezi, Dallas, ABD) tarafından sağlandı. JNK baskın-negatif mutant, Dr. M. Karin (Kaliforniya Üniversitesi, San Diego, ABD) tarafından sağlandı. ERK2 baskın-negatif mutantı, Dr. M. Cobb (Güney-Batı Tıp Merkezi) tarafından sağlandı. Diğer tüm reaktifler Sigma-Aldrich'ten (St Louis, ABD) elde edildi.

Hücre kültürü

Murin osteoblast hücre dizisi MC3T3-E1, American Type Culture Collection'dan (ATCC; Rockville, ABD) satın alındı. Hücreler, 20 mm HEPES ve yüzde 10 ısıyla inaktive edilmiş fetal buzağı serumu, 2 mm-glutamin, penisilin (100 U/ml) ve streptomisin (100 mg) ile desteklenmiş a-MEM ile yüzde 95 havada, yüzde 5 CO2'de kültürlendi. /ml).

Mineralize nodül oluşumunun ölçümü

Mineralize nodül oluşumu tarif edildiği gibi değerlendirildi.[18] Özetle, osteoblastlar iki hafta boyunca C vitamini (50 mg/ml) ve b-gliserofosfat (10 mm) içeren bir ortamda kültürlendi ve ortam her üç günde bir değiştirildi. CD ile inkübasyondan sonra(cistancheçölikola)12 gün boyunca özüt, hücreler iki kez 0.15 m NaCl (pH 7.4) içeren 20 mm Tris-tamponlu tuzlu su ile yıkandı, 30 dakika boyunca buz gibi soğuk yüzde 75 (h/h) etanol içinde sabitlendi ve hava- kurutulmuş. Kalsiyum birikimi, alizarin red-S boyaması kullanılarak belirlendi. Kısaca, etanolle sabitlenmiş hücreler ve matris 1 saat boyunca 40 mm alizarin kırmızısı-S (pH 4.2) ile boyandı ve suyla iyice durulandı. Bağlı leke, yüzde 10 (a/h) setilpiridinyum klorür ile ayrıştırıldı ve numunelerdeki alizarin kırmızısı-S, 550 nm'de absorbans ölçülerek ölçüldü ve standart bir eğri ile karşılaştırıldı. Bir mol alizarin red-S seçici olarak yaklaşık iki mol kalsiyumu bağlar.

cistanche çöl çiçeğiiçin ..... iyidirkemik oluşumu

Kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu

Toplam RNA, bir TRIzol kiti (MDBio Inc., Taipei, Tayvan) kullanılarak osteoblastlardan ekstre edildi. 2 mg toplam RNA ve bir oligo(dT) primeri kullanılarak ters transkripsiyon yapıldı.[19,20] Kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), TaqMan® one-step PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, AMERİKA BİRLEŞİK DEVLETLERİ). Toplam cDNA (25-ml reaksiyon başına 100 ng) diziye özgü primerler ve Taqman® probları ile eklenmiştir. Tüm hedef gen primerleri ve probları, dahili kontrol olarak b-aktin (Applied Biosystems) dahil olmak üzere ticari olarak satın alındı. qPCR tahlilleri, bir StepOnePlus dizi saptama sistemi (Applied Biosystems) üzerinde üç kopya halinde gerçekleştirildi. Döngü koşulları, 95 derecede 10-dak polimeraz aktivasyonu, ardından 15 s için 95 derecelik 40 döngü ve 60 s için 60 derece idi. Eşik, transkriptin saptandığı (CT ile gösterilir) döngü numarasını hesaplamak için şablon olmayan kontrol arka planının üzerinde ve hedef gen amplifikasyonunun lineer fazı içinde ayarlandı.

Western blot analizi

Hücre lizatları daha önce tarif edildiği gibi hazırlandı.[21,22] Proteinler SDS-PAGE ile çözüldü ve Immobilon polivinil diflorür membranlarına (Millipore, Billerica, ABD) aktarıldı. Lekeler, oda sıcaklığında 1 saat süreyle yüzde 4 sığır serum albümini ile bloke edildi ve ardından oda sıcaklığında 1 saat boyunca p-65 veya p-p65 (1:1000)'e karşı tavşan anti-insan antikorları ile problandı. Üç yıkamadan sonra, lekeler, oda sıcaklığında 1 saat süreyle peroksidaz konjuge eşek anti-tavşan ikincil antikoru (1: 1000) ile inkübe edildi. Lekeler, X-OMAT LS filmi (Eastman Kodak, Rochester, ABD) kullanılarak geliştirilmiş kemilüminesans ile görselleştirildi.

Ovariektomiye bağlı osteoporoz

Bu çalışma için dört haftalık, 22~28 g dişi ICR fareleri kullanıldı. Fareler, trikloroasetaldehit (100 mg/kg) anestezisi altında iki taraflı olarak yumurtalıkları alındı ​​ve kontrol fareleri, karşılaştırma için sahte ameliyat edildi (Sham). Çeşitli CD konsantrasyonlarının oral yoldan verilmesinden sonra kemik mineral yoğunluğu ve kemik mineral içeriği ölçülmüştür.(cistancheçölikola)dört hafta boyunca her iki günde bir çıkarın. Toplam vücut kemik mineral yoğunluğu ve kemik mineral içeriği, daha önce tarif edildiği gibi küçük denekler için bir mod kullanılarak çift enerjili bir X-ışını absorpsiyometresi (DEXA; XR-26; Norland, Fort Atkinson, ABD) ile belirlendi.[18, 23] Tüm protokoller kurumsal yönergelere uygundur ve Çin Tıp Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanmıştır.

istatistiksel analiz

İstatistiksel analiz, Prism 4.01 yazılımı kullanılarak yapıldı. (GraphPad Software Inc., San Diego, ABD). Verilen değerler ortalama SEM'dir. İki numune arasındaki istatistiksel analiz, Student t-testi kullanılarak yapıldı. İkiden fazla grubun istatistiksel karşılaştırmaları, Bonferroni'nin posthoc testi ile tek yönlü bir varyans analizi kullanılarak yapıldı. Tüm durumlarda, P < 0.05="" anlamlı="" kabul="">

cistanche çöl çiçeğiiçin ..... iyidirkemik oluşumu

Sonuçlar

cistanche çöl çiçeğiözü, osteoblastlar tarafından kemik mineralizasyonunu arttırır CD'nin eklenmesi(cistancheçölikola)24 veya 48 saatlik ekstrakt, bir MTT tahlilinde fare osteoblast MC3T3-E1 hücrelerinin proliferasyonunu etkilemedi (veriler gösterilmemiştir). Osteoblast farklılaşması, hücre proliferasyonu ve göçünü içeren karmaşık bir süreç olduğundan, CD ile tedaviden sonra MC3T3-E1 hücrelerinin göç kabiliyetini de test ettik.(cistancheçölikola)Ayıkla. Transwell ve yara iyileştirme deneylerini kullanarak, CD'nin(cistancheçölikola)özü, osteoblast göçünü etkilemedi (veriler gösterilmemiştir). Mineralize nodüllerin oluşumu, osteoblast olgunlaşmasının belirteçlerinden biridir. Alizarin kırmızısı S boyaması, osteoblastların C vitamini (50 ug/ml) ve -gliserofosfat (10 mm) içeren bir ortamda iki hafta boyunca kültürlendiğinde, CD'nin eklenmesiyle konsantrasyona bağlı bir şekilde mineralize nodüllerin oluştuğunu gösterdi.(cistancheçölikola)(Şekil 1a). Bu nedenle, CD(cistancheçölikola)kültürlenmiş osteoblastlar tarafından indüklenen kemik nodülü oluşumunu çıkarın, ancak proliferasyonlarını veya migrasyonlarını değil. CD'nin rolünü de inceledik.(cistancheçölikola)RANKL ile indüklenen osteoklastogenezde ekstrakte edildi, ancak hiçbir etki bulunamadı (veriler gösterilmemiştir).

Cistanche Deserticola özü, kültürlenmiş osteoblastlarda alkalin fosfataz, kemik morfogenetik proteini-2 ve osteopontin ekspresyonunu arttırır

Farklılaşmış osteoblastlar, yüksek düzeyde enzim ekspresyonu ile ilişkili olan yüksek ALP aktivitesi sergiler.[18] CD ile tedaviyi bulduk(cistancheçölikola)72 saat boyunca özüt, osteoblast ALP aktivitesini önemli ölçüde arttırdı (Şekil 1b). BMP-2, ALP ve OPN'nin osteoblast farklılaşmasındaki önemli rolü göz önüne alındığında, CD'nin(cistancheçölikola)özü, BMP-2, ALP ve OPN ifadesini düzenleyerek osteoblast farklılaşması üzerindeki etkisini gösterir. CD ile hücrelerin tedavisi(cistancheçölikola)ALP, BMP-2 ve OPN'nin artan mRNA ekspresyonunu konsantrasyona bağlı bir şekilde çıkarır (Şekil 1c), bu CD'yi gösterir.(cistancheçölikola)ALP, BMP-2 ve OPN ifadesini yukarı doğru düzenleyerek osteoblastların indüklenmiş farklılaşmasını çıkarın.

Cistanche Deserticola özü, mitojenle aktive olan protein kinaz yolu yoluyla kemik nodülü oluşumunu arttırır

MAPK'nın önemli bir rol oynadığı bildirildi.kemikoluşum[24,25] bu yüzden daha sonra bu sinyal yolunun CD'ye dahil olup olmadığını inceledik.(cistancheçölikola)ekstrakt kaynaklı kemik mineralizasyonu. Hücrelerin ERK inhibitörü U0126, p38 inhibitörü SB203580 veya JNK inhibitörü SP600125 ile ön tedavisi CD'yi azalttı(cistancheçölikola)ekstraktla artan kemik mineralizasyonu (Şekil 2a, 3a ve 4a). Ayrıca, inhibitörler ayrıca CD'yi bloke etti(cistancheçölikola)özüt kaynaklı ALP, BMP-2 ve OPN ifadesi (Şekil 2b–4c). ERK2, p38 veya JNK mutantı azaltılmış CD ile hücrelerin transfeksiyonu(cistancheçölikola)ALP, BMP-2 ve OPN mRNA ifadesinde ekstrakt artışı (Şekil 2c, 3c ve 4c). Daha sonra, CD'den sonra ERK, p38 ve JNK aktivasyonunu doğrudan inceledik.(cistancheçölikola)ekstrakt tedavisi. CD ile hücrelerin inkübasyonu(cistancheçölikola)indüklenen ERK, p38 ve JNK fosforilasyonunu özütleyin (Şekil 2d, 3d ve 4d). Bu nedenle, ERK, p38 ve JNK, artışa aracılık eder.kemikoluşumCD tarafından indüklenen(cistancheçölikola)Osteoblastların tedavisi.

Cistanche Deserticola özü, nükleer faktör-kB yolu yoluyla kemik nodülü oluşumunu arttırır

Daha önce belirtildiği gibi, NF-kB aktivasyonu için gereklidirkemikoluşum[26,27] Daha sonra osteoblastları NF-kB inhibitörleri pirolidin ditiyokarbamat (PDTC) ve N-tosil-L-fenilalanin klorometil keton (TPCK) ile Calbiochem'den (Darmstadt, Almanya) satın alarak tedavi ettik. CD'ye dahil(cistancheçölikola)ekstrakt kaynaklı kemik mineralizasyonu. Şekil 5a, osteoblastların PDTC veya TPCK ile ön tedavisinin CD'yi inhibe ettiğini gösterir.(cistancheçölikola)ekstrakt ile indüklenen kemik nodülü oluşumunu ve ayrıca ALP, BMP-2 ve OPN ekspresyonundaki artışı azalttı (Şekil 5b ve 5c). NF-kB p65 alt biriminin fosforilasyonu, NF-kB aktivasyonunun bir göstergesidir;[28] bununla tutarlı olarak, CD'nin(cistancheçölikola)osteoblastlarda artan p65 fosforilasyonunu çıkarın (Şekil 5d). Bu sonuçlar, NF-kB aktivasyonunun, CD ekstraktı ile indüklenen ALP, BMP-2 ve OPN ekspresyonu ve kemik nodülü oluşumu için önemli olduğunu göstermiştir.

Şekil 4 c-Jun N-terminal kinazların (JNK)cistancheçöl çiçeği(CD) osteoblastlarda ekstrakt kaynaklı kemik mineralizasyonu. (a) Hücreler 24-yuvalı plakalara kaplandı ve iki hafta boyunca C vitamini (50 mg/ml) ve b-gliserofosfat (10 mM) içeren bir ortamda kültürlendi. Hücreler eşzamanlı olarak CD ile tedavi edildi.(cistancheçölikola)ekstrakt (26 mg/ml) artı SP600125 (3 mM). Mineralize nodül oluşumu alizarin red-S boyaması ile değerlendirildi (n=5). (b, c) Hücreler, 30 dakika boyunca SP600125 ile ön işleme tabi tutuldu veya JNK mutantı ile veya 24 saat transfekte edildi, ardından CD özütü ve alkalin fosfataz (ALP) aktivitesi ve ALP, kemik morfogenetik proteini (BMP)-2 ve osteopontin (OPN) mRNA ekspresyonu, ALP kiti ve nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ile ölçülmüştür. (d) Hücreler, belirtilen zaman aralıkları için CD özü ile işlendi ve p-JNK ifadesi Western blot ile incelendi. *P< 0.05,="" compared="" with="" control="" group;="">< 0.05,="" compared="" with="" cd="">(cistancheçölikola)ekstrakt ile tedavi edilen grup.

Yumurtalıkları alınmış farelerde Cistanche Deserticola özü ile kemik kaybının inhibisyonu

CD'nin etkisini incelemek için(cistancheçölikola)Kemik kaybı üzerine ekstrakt, dişi farelerde ovariektomi ile osteoporoz indüklendi. Beklendiği gibi, yumurtalıkları alınmış farelerde toplam vücut kemik mineral yoğunluğu ve kemik mineral içeriği azalmıştır (Şekil 6a ve 6b). CD ile tedavi(cistancheçölikola)dört hafta boyunca ekstrakt, doza bağlı bir şekilde kemik mineral yoğunluğu ve kemik mineral içeriği kaybını engelledi (Şekil 6a ve 6b). ALP'nin kan konsantrasyonları osteoblastik aktiviteyi yansıtabilir.[29] Şekil 6c'de gösterildiği gibi, CD(cistancheçölikola)özü, ovariektominin neden olduğu serum ALP aktivitesinde azalmayı inhibe etti. Ek olarak, CD(cistancheçölikola)özü aynı zamanda bir belirteç olan osteokalsin seviyesini de arttırdı.kemikoluşumve kemik erimesinin bir belirteci olan tip I kollajenin C-terminal telopeptidlerinin seviyesini azalttı (Şekil 6d ve 6e). Bu bulgular böylece CD'nin gücünü ve etkinliğini desteklemektedir.(cistancheçölikola)in vivo olarak kemik kaybını önlemede ekstrakt.

Şekil 6 Ovariektominin indüklediği kemik mineral yoğunluğu ve kemik mineral içeriğindeki azalmanın inhibisyonucistancheçöl çiçeği(CD) özü. Dişi ICR farelerine sahte bir operasyon uygulandı veya yumurtalıkları alındı. Yumurtalıkları alınmış fareler, belirtilen CD konsantrasyonları ile tedavi edildi.(cistancheçölikola)oral besleme ile ekstrakte edin. Toplam vücut kemik mineral yoğunluğu (a), kemik mineral içeriği (b), serum alkalin fosfataz (ALP) aktivitesi (c), serum osteokalsin (d) ve tip I kollajen (e) serum C-terminal telopeptidleri, dört olarak belirlendi. ameliyattan haftalar sonra. Veriler ortalama SE, n=8–10 fare/grup olarak sunulur. *P < 0.05,="" sahte="" ile="" karşılaştırıldığında;="" #p="">< 0.05,="" yumurtalıkları="" alınmış="" grupla="">

TARTIŞMA

Bu makalenin II. Bölümü (Tartışma ve Sonuç) hakkında bilgi almak için buraya tıklayın.

İtibaren: 'cistancheçöl çiçeğiekstrakt artarkemikoluşumtarafından osteoblastlardaTe Mao Li^ave diğerleri

---© 2012 Yazarlar. JPP © 2012 Kraliyet Eczacılık Derneği 2012Eczacılık ve Farmakoloji Dergisi, 64, s. 897–907