Cistanche Deserticola'nın Toplam Glikozitleri, Nörovasküler Rejenerasyonu İndükleyerek Nörolojik Fonksiyon İyileşmesini Destekler

İletişim:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Fujiang Wang1, Ruiyan Li 2, Pengfei Tu1, Jianping Chen3, Kewu Zeng1* ve Yong Jiang1*

Arka fon:Geleneksel Çin tıbbı Cistanche Deserticola'nın kardiyovasküler ve serebrovasküler hastalıklar için geçerli olduğu bildirilmiştir. Bununla birlikte, iskemik inmenin korunması için aktif bileşenleri net değildir. C. Deserticola'nın iskemik inmeye karşı aktif bileşenlerini ve potansiyel mekanizmalarını araştırmayı amaçladık.

Yöntemler:C. Deserticola, toplam glikozitler (TG'ler), polisakaritler (PS'ler) ve oligosakkaritler (OS'ler) özlerinin beyin koruyucu etkilerini, bir orta serebral arter tıkanıklık-reperfüzyon (MCAO/R) sıçan modelinde araştırdık. 2, 3, 5-Trifenil tetrazolyum klorür (TTC) boyaması serebral enfarktüs hacmini değerlendirmek için kullanıldı ve kan-beyin bariyeri (BBB) ​​geçirgenliğini değerlendirmek için Evansblue testi kabul edildi. Ardından, CD31, a-SMA, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, ZO-1, claudin-5, occludin,Keap-1 ve Nrf{{13 ifadeleri }} western blot veya immünofloresan kullanılarak analiz edildi ve MDA, SOD, CAT ve GSH-Px aktiviteleri kitler kullanılarak analiz edildi.

Sonuçlar:TG tedavisi, nörolojik defisit skorlarını ve enfarktüs hacimlerini önemli ölçüde azalttı, anjiyogenezi ve nöral yeniden şekillenmeyi destekledi ve model grubuyla karşılaştırıldığında kan-beyin-bariyer bütünlüğünü etkili bir şekilde korudu. Ayrıca, TGs, beyinlerde MDA seviyelerini önemli ölçüde azalttı ve antioksidan aktiviteleri (SOD, CAT ve GSH-Px) arttırdı. Bu arada, TG'ler Keep-1 ifadesini dikkate değer ölçüde azalttı ve Nrf-2 nükleer yer değiştirmesini kolaylaştırdı. Aksine, PS'ler ve OS'ler grupları için herhangi bir koruyucu etki gözlenmedi.

Çözüm:TG'ler, MCAO/R'nin neden olduğu beyin hasarına karşı C. Deserticola'nın ana aktif bileşenleridir ve koruma esas olarak Nrf-2/Keap-1 yolu aracılığıyladır.

Anahtar Kelimeler:cistanche çöl çiçeği,beyin hasarı, toplam glikozitler, polisakaritler, oligosakkaritler, Nrf-2/Keap-1 yolu

cistanche amazon çölü

GİRİİŞ

İnme, dünyada önemli bir ölüm ve sakatlık nedeni olarak kabul edilmektedir (Donnan ve ark., 2008). Tüm inme vakalarının yaklaşık yüzde 87'si iskemik inme tarafından tetiklenir (Ovbiagele ve Nguyen-Huynh, 2011). Şu anda iskemik inme tedavisi için kullanılan en etkili ajan ve FDA onaylı tek ilaç rekombinant doku plazminojen aktivatörüdür. Ancak, dar terapötik zaman penceresi ve ciddi bir hemorajik komplikasyon riski nedeniyle çok sayıda inmeli hasta bu ilaca yanıt vermemektedir (Lee ve ark., 2012; Schellinger ve Kohrmann, 2014). Trombolitik tedavinin önemli bir zorluğu, beyin hasarı ve fonksiyon yıkımının ana nedeni olarak kabul edilen iskemi/reperfüzyon (I/R) hasarıdır. Serebral iskemi sonrası reperfüzyon, beyin kanaması riskini artırırken, nörovasküler hasara yol açar ve kan-beyin bariyerine zarar veren aşırı reaktif oksijen türleri (ROS) üretir (Alluri ve ark., 2015). Bir dizi çalışma, KBB'nin bozulmasının iskemik inme patogenezinin ana nedeni olduğunu doğrulamıştır (Cao ve ark., 2016b).

BBB esas olarak endotelyal hücreler, perisitler, astrositler, nöronlar ve bazal membranlardan oluşur. BBB'nin çekirdek bileşenleri, sıkı bağlantılarla birleştirilen serebral mikrovasküler endotel hücreleridir, böylece eksojen molekülleri beyne sınırlar. Sıkı bağlantıların patolojik değişiklikleri – özellikle okludin, claudin-5 ve zonulaoccludens-1 (ZO-1)- iskemik inme sırasında KBB fonksiyonunu, özellikle bariyer geçirgenliğini önemli ölçüde etkiler (Liuet al., 2014). ; Hu ve diğerleri, 2018; Liu ve diğerleri, 2019). I/R dönemlerinde aşırı ROS, beyin nöronlarının doğrudan hasar görmesine neden olan ana faktörlerden biridir (Ding ve ark., 2014). Aşırı ROS üretimi, belirli bağlantıların bozulmasına ve BBB bozulmasına yol açar, bu da eksojen moleküllerin BBB yoluyla beyne girmesine neden olarak beyin hasarının şiddetlenmesine yol açar (Cheon ve diğerleri, 2016; Zhang QY ve diğerleri, 2017). Bu nedenle, BBB'nin antioksidanlar tarafından korunması, reperfüzyon hasarını önlemenin potansiyel bir yolu olarak kabul edilmiştir.

BBB'nin parçalanmasının yanı sıra, I/R, innörovasküler hasar ve nöronal ölümle sonuçlanabilir (Jung ve ark., 2010). İnme sırasında artan nöronal hücre ölümü, oksidatif stresten kaynaklanabilir (Chi ve ark., 2018) ve çok sayıda çalışma ROS'un felç şiddetini ve nörolojik hasarı arttırdığını göstermiştir (Kondo ve diğerleri, 1997; Crack ve diğerleri, 2001; Crack ve diğerleri, 2006). Klinik çalışmalarda tatmin edici sonuçlar olmamasına rağmen, akut iskemik inme tedavisi için nöroproteksiyon hala umut verici bir stratejidir (Moretti ve ark., 2015). Bu nedenle, felçleri tedavi etmek için etkili nöroproteksiyon ilaçları bulmak, felçli hastalar için bir faydadır.

Geleneksel Çin tıbbı (TCM), vücudun iç dengesizliğine müdahale etmek için önlemler alır (Gaire, 2018). İskemik inmelerin karmaşık patogenezi nedeniyle, TCM'nin ve aktif bileşenlerinin çok faktörlü etkisi, felç tedavisinde kritik rol oynar. Moğolistan ve Kuzeybatı Çin genelinde kurak veya yarı kurak bölgelerde yaygın olan Cistanche Deserticola YC Ma, Çin'de 1,000 yıldan fazla bir süredir unutkanlık ve depresyon gibi çeşitli hastalıkların tedavisinde yaygın olarak kullanılan bir TCMherb olmuştur. Modern farmakolojik çalışmalar, C'den elde edilen ham özlerin olduğunu göstermiştir. Deserticola, öğrenme ve hafıza fonksiyonunu geliştirme, nöroproteksiyon, bağışıklığı arttırma, antioksidan, yaşlanma karşıtı ve yorgunluk önleyici etkiler gibi çoklu farmakolojik aktiviteler gösterdi (Ko ve Leung, 2007; Wang ve diğerleri, 2012; Li ve diğerleri, 2015).Kimyasal analiz of C. Deserticola, ana bileşenlerinin feniletanoid glikozitler, iridoid glikozitler, polisakaritler ve oligosakkaritler içerdiğini göstermiştir (Jiang ve Tu, 2009). Bununla birlikte, C. Deserticola'nın beyin koruması için aktif bileşenleri çok net değildir.

C. Deserticola'nın nöroprotektif özelliği, Alzheimer hastalığının yanı sıra felç ve depresyon gibi bilişsel ilişkili hastalıklardaki terapötik potansiyelini ima eder (Wang ve diğerleri, 2017). Bununla birlikte, aktif bileşenleri ve etki mekanizmaları dahil olmak üzere C. Deserticola'nın felç üzerindeki etkisine ilişkin araştırmalar çok sınırlıdır. Mevcut çalışmada, C. Deserticola, toplam glikozitler (TG'ler, feniletanoid glikozitler ve diğer glikozitler), polisakaritler (PS'ler) ve oligosakkaritler (OS'ler) kaynaklı üç özütün serebral I/R yaralanmaları üzerindeki koruyucu etkisini araştırdık. Bulgularımız C. Deserticola'nın doğru klinik uygulamasına katkıda bulunabilir ve iskemik inme tedavisi için aday bir ajan sağlayabilir.

Cistanche'ın t'si varterapötik potansiyelinme ve depresyon gibi bilişsel ilişkili hastalıklarda,yanı sıra Alzheimer hastalığı.

MALZEMELER VE YÖNTEMLER

Kimyasallar ve tepkimeler

Cistanche Deserticola'nın gövdeleri Alashan, İç Moğolistan'dan satın alındı ​​ve yazarlardan biri tarafından tanımlandı (P.-F. Tu). TG'ler, PS'ler ve OS'ler daha önce bildirdiğimiz yöntemimize göre hazırlandı (Gao ve diğerleri, 2015) . TGs'nin kantitatif analizi, daha önce açıklandığı gibi (Li ve diğerleri, 2019) yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile yapıldı ve kromatogramı Şekil 1'de gösterilmektedir. asetillakteosit; içerikleri sırasıyla 163.05 mg/g, 4.125 mg/g, 41.66 mg/g, 22.655 mg/g ve 12.045 mg/g'dir. PS'lerin ve OS'lerin içerikleri sırasıyla HPLC ve fenol-sülfürik asit analizi ile belirlendiği üzere sırasıyla yüzde 69.42 ve yüzde 65.24'tür (Zhang A. ve diğerleri, 2018; Shi ve diğerleri, 2019).

Ekinakozid (A0282), tubulosideA (A0942), acteoside (A0280), izoacteoside (A0281) ve 2'-acetylacteoside (A0943) standart referansları Chengdu MustBiotechnology'den (Sichuan, Çin) satın alındı. Tüm standartların saflıkları yüzde 98'den fazladır. Nissl leke H&E kitleri Boster'dan (Wuhan, Çin) satın alındı. Edaravone (T0407-1), TargetMol'den (Şanghay, Çin) satın alındı. Tavşan anti-sıçan MAP-2 (ab32454), Nrf-2(ab31163), PDGFRb (ab32570), Keap-1 (ab66620) ve fareanti-sıçan CD31 (ab24590) şuradan satın alındı: Abcam Inc (Cambridge, MA, ABD). Tavşan anti-sıçan Claudin5 (BS1069), ZO-1 (BS9802M) ve Occludin (BS72035) Bioworld Technology'den (Nanjing, Çin) satın alındı. Cell SignalingTechnology Inc. (Boston, MA, ABD), tavşananti-sıçan Synapsin-1 (SYN,5297T), PSD95 (3450T), a-SmoothMuscle Actin (a-SMA,19245T) kaynağıydı. GAPDH (HRP-60004), Proteintech Group, Inc.'den (Chicago, ABD) satın alındı. İkincil antikorlar, Zhongshan GoldenBridge Biotechnology (Pekin, Çin) tarafından sağlandı. Hoechst 33258, Beyotime'dan (Jiangsu, Çin) elde edildi.

ŞEKİL 1|TG'lerin (A) ve standart referansların (B) HPLC kromatogramları.

Hayvanlar

Sprague-Dawley sıçanları (erkek, 250-300 g ağırlığında) Vital River Laboratory Animal Technology'den (Pekin, Çin) elde edildi ve 12 saat aydınlık/karanlık döngüsünde tutulan klimalı bir odaya yerleştirildi. Tüm hayvan deneyleri, hayvan araştırması ARRIVE yönergelerine (Kilkenny ve diğerleri, 2010; McGrath ve diğerleri, 2010) uygun olarak yapıldı ve Pekin Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (LA2019123) tarafından onaylandı.

Hayvan Deneysel Protokolleri

Sıçanlar, daha önce tarif edildiği gibi MCAO/R'ye tabi tutuldu (Wang ve diğerleri, 2018). Kısaca, sol ana karotid arter (CCA), dış karotid arter (ECA) ve iç karotidarter (ICA) açığa çıkarıldı ve ECA'dan orta serebral artere ulaşana kadar ICA'ya 3-0 naylon monofilament sütür yerleştirildi ( MCA). 1.5 saatlik MCA oklüzyonundan sonra, filaman çıkarılarak reperfüzyon simüle edildi. Cerrahi işlem sırasında tüm sıçanların vücut ısısı 37.0 derecede tutuldu.

İlaç İdaresi

Sıçanlar, tarif edildiği gibi (Jiang ve diğerleri, 2014): normal grup (NOR); model grubu (MOD); edaeavone grubu (pozitif ilaç, 6 mL/kg, EDI); TGs grubu (280 mg/kg, TGs); PSs grubu (280 mg/kg, PSs) ve OSs grubu (280 mg/kg, OSs). TG'ler, PS'ler ve OS'ler, 14 gün boyunca MCAO/R'den sonra günde bir kez ig uygulandı. NOR ve MOD grupları normal salin ile tedavi edildi. Hayvan numaraları Tablo 1'de gösterilmiştir.

TABLO 1|Uygulamadan 14 gün sonra farklı deney grupları ve çeşitli parametreler için hayvan sayısı.

Ağırlık Ölçümü ve Modifiye Nörolojik Eksiklik Skorları (mNSS)

Vücut ağırlığı 14. günde ADVENTURE™ Dijital Skala (OHAUS, New Jersey, ABD) kullanılarak izlendi. NSS, küçük revizyonlarla FJ Wang (Wang ve diğerleri, 2018) tarafından açıklanan yönteme göre değerlendirildi.

2, 3, 5-Trifeniltetrazolyum Klorür (TTC) Boyama

Enfarktüs hacmi daha önce tarif edildiği gibi ölçüldü (Wanget ark., 2015). Kısaca, beyinler eşit aralıklı yedi koronal bloğa (2 mm) bölündü. Bu kesitler yüzde 2 TTC (Coolaber, Beijing, China) ile 37 derecede 15 dakika boyandı. Enfarktüs hacmi ( yüzde )=(aynı taraf iskemik hemisfer hacmi−kontralateral iskemik hemisfer hacmi)/kontralateraliskemik hemisfer hacmi × 100.

Nissl ve H&E Boyama

Sıçanlara derin anestezi uygulandı ve daha sonra tüm beyin kafatasından hızla çıkarıldı ve yüzde 4 paraformaldehit kullanılarak sabitlendi ve parafin mumu içine gömüldü ve 7 um kalınlığında dilimler halinde kesildi. Kesitler Nissl ve H&E ile boyandı. Bu çalışmada, bir ışık mikroskobu ile her doku örneğinde altı rastgele 200 × 200 µm alan yakalandı. Nissl'ın ceset sayısı, IPPsoftware sürüm 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, ABD) ile sayıldı.

Evans Mavi Testi

Sıçanlara MCAO/R'den sonra yüzde 2 EB (Coolaber Science & TechnologyCo., LTD) enjekte edildi. İki saat sonra, sıçanlara anestezi uygulandı ve tüm beyin daha sonra hızla çıkarıldı ve aseton içinde homojenleştirildi. Süpernatanlar, 800 TS absorbans okuyucu (BioTek, ABD) ile 620 nm'de analiz edildi.

Katalaz(CAT), Süperoksit Dismutaz (SOD),Malondialdehit (MDA) ve GlutatyonPeroksidaz (GSH-Px) Aktivitelerinin Ölçümü

Tüm serum numuneleri, 4 derecede 15 dakika boyunca 4,000 × rpm'de santrifüjlendi ve daha sonra üreticinin talimatlarına göre MDA, CAT, SOD ve GSH-Px aktivitelerini saptamak için analiz edildi (Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd). , Çin).

Western Blot Analizi

Her sıçandan toplanan beyin dokuları (100 mg) homojenleştirildi ve RIPA lizis tamponunda lize edildi ve daha sonra bir BCA kiti (Beijing TransGenBiotech Co., Ltd.) kullanılarak protein konsantrasyonunu saptamak için analiz edildi. Doku toplam proteinleri yüzde 10'luk SDS-PAGE jellerine yüklendi ve bir nitroselüloz zara aktarıldı. Zar yüzde 5 yağsız süt kullanılarak bloke edildi, daha sonra bir gece boyunca 4 derecede birincil antikorlarla inkübe edildi. Membran daha sonra ikincil bir antikor ile inkübe edildi. Western blot analizi, Kodak Digital Imaging System (5200 Multi, Tanon, Çin) kullanılarak analiz edildi.

İmmünofloresan Analizi

CD31, a-SMA, ZO-1,claudin5, occludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, Nrf-2 ve Keap-1 için immünofloresan boyama yapıldı. Nrf-2,CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, occludin, PDGFRb, SYN,PSD95, MAP-2 ve Keap-1'e karşı birincil antikorlar seyreltildi 1:200 ve 1:100,sırasıyla. Alexa Flur 488 fareanti-tavşan IgG ve rodamin (TRITC) keçi anti-tavşan IgG'nin ikincil antikorlarının her ikisi de 1:200'e seyreltildi. Çekirdekler Hoechst 33258 ile boyandı. Görüntüler, Vectra® Polaris™ Otomatik Kantitatif Patoloji Görüntüleme Sistemi (PerkinElmer, ABD) kullanılarak yakalandı. Protein ifadesi, IPP yazılımı sürüm 6.0 kullanılarak analiz edildi.

İstatistiksel analiz

Tüm veriler ortalama ± SD olarak tanımlandı. İstatistiksel analiz için SPSS yazılım versiyonu 22.0kullanıldı. Farklı grupları karşılaştırırken tek yönlü ANOVA kullanıldı. P < 0.05="" istatistiksel="" fark="" olarak="" kabul="">

cistanche vücut geliştirme sinir koruması

SONUÇLAR

TG'ler, MCAO/R Sıçanlarında Vücut Ağırlığını Artırır ve Beyin Hasarlarını Azaltır

TG'ler, PS'ler, Oss ve EDI ile 14 günlük kürden sonra, vücut ağırlıkları, nörolojik defisitler ve I/R sıçanlarının enfarktüs hacimleri değerlendirildi. Sonuçlar, MOD grubundaki vücut ağırlıklarının büyük ölçüde azaldığını, TG'ler, PS'ler ve EDI gruplarındaki azalan ağırlıkların belirgin şekilde arttığını gösterdi (Şekil 2A). Nörolojik eksiklik skorları, EDI ve TG'ler tarafından önemli ölçüde düşürüldü (Şekil 2B). NOR grubu sıçanlarda beyin dilimleri koyu kırmızıydı ve enfarktüs yoktu, MOD grubu sıçanlarında ise büyük bir ipsilateral serebral enfarktüs görüldü. TG tedavisinden sonra, enfarktüs hacimleri önemli ölçüde azaldı(Şekil 2C, D). PS'ler ve OS'ler tedavisi, yukarıdaki endeksler üzerinde belirgin bir etki göstermedi. Yukarıdaki veriler, TG'nin I/R'nin neden olduğu beyin hasarını belirgin şekilde hafifletebileceğini, ancak PSs ve OS'lerin yapamadığını gösterdi.

ŞEKİL 2|TG'ler, geçici fokal serebral iskeminin neden olduğu beyin hasarını azaltır.

TG'ler, MCAO/R Sıçanlarında Histopatolojik Hasarı İyileştiriyor

TG'ler, PS'ler ve OSs tedavisinin histopatolojik hasarlar üzerindeki bazı etkilerini belirlemek için patolojik hasarı ortaya çıkarmak için H&E boyaması yapıldı. NOR grubundaki beyinlerin histomorfolojik yapıları düzenli olarak düzenlenmiştir. TGs gruplarındaki morfoloji değişiklikleri MOD grubuna göre daha hafif olmuştur. Bununla birlikte, PS'ler ve OS'ler tedavi grupları, morfoloji değişikliklerinde önemli bir iyileşme göstermedi (Şekil 3).

TG'ler, I/R ile İndüklenen Sıçanlardan Sonra Nöronal Yaralanmayı Azaltıyor

Nissl boyaması, iskemik alanın yarı gölgesindeki nöronların histopatolojik değişikliklerini gösterdi. Şekil 4'te gösterildiği gibi, normal nöronlar açık bir nükleolusa ve sağlam bir yapıya sahipti. MOD grubunda, nöronlar hücreler arası boşlukları genişletti. Nisslbody'ler kayboldu, küçüldü ve derin lekelendi. Bununla birlikte, bu değişiklikler EDI, TG'ler ve PSs gruplarında nadiren gözlendi. Bu sonuçlar, TG'lerin ve PS'lerin iskemi/reperfüzyonun neden olduğu nöronal hasarı önemli ölçüde azaltabileceğini gösterdi.

TG'ler, I/R ile Tedavi Edilen Sıçanlardan Sonra BBB Bozulmasını Azaltır

Evans mavi testi, BBB geçirgenliğinin değişimini araştırmak için klasik bir yöntemdir. Deney sonuçları, MOD grubunda artan Evans mavisinin gözlemlendiğini, TG'ler ve EDI ile tedavi edilen sıçanlarda ise önemli ölçüde azalmış bir Evans mavisi olduğunu gösterdi. Ayrıca, PS'ler ve OS'ler tedavi grupları arasında anlamlı bir fark yoktu (Şekil 5). Bu sonuçlar, TG'lerin BBB kesintisini önemli ölçüde azaltabileceğini gösterdi.

ŞEKİL 3|TG'ler, MCAO/R sıçanlarında histopatolojik hasarı iyileştirir.

TG'ler, I/R Yaralı Sıçanlarda Anjiyogenezi Destekliyor

Daha yeni çalışmalar, anjiyogenezin, akut iskemik inme sonrası nörolojik fonksiyonel iyileşme ve prognostik sonuç açısından kritik bir rol oynadığını göstermektedir (Yuen ve ark., 2015). TG'lerin, PS'lerin ve OS'lerin anjiyogenez üzerindeki etkilerini değerlendirmek için, kapiler sayıları ölçmek için CD31 ve a-SMA kullanıldı. İmmünofloresan boyama, MOD grubunun, normal sıçanlarla karşılaştırıldığında, I/Rrats'ın iskemik alanlarının yarı gölgesinde CD31 (Şekil 6A, B) ve a-SMA (Şekil 6C, D) ekspresyonlarında dikkate değer bir azalmaya neden olduğunu gösterdi. Bu sonuç, I/R'nin iskemik hemisferlerin korteks penumbrasında vasküler hasara neden olabileceğini gösterdi. Bununla birlikte, TG'ler ve EDI tedavisi, artan CD31 ve a-SMA ekspresyonları ile gösterildiği gibi kapiler yoğunluğu, anjiyogenezi ve arteriyojenezi önemli ölçüde arttırdı. Bu sonuçlar, TG'lerin, I/R sıçanlarının iskemik yarı gölgesinde anjiyogenezi destekleyebileceğini, ancak PSs ve OS'lerin yapamayacağını göstermektedir.

TG'ler, I/R Yaralı Sıçanlarda Sıkı Bağlantı Proteinlerinin Ekspresyonunu Artırıyor

KBB bozulması beyin su içeriğini ve doku şişmesini yükselterek beyin hasarına yol açabilir. Sıkı bağlantı proteinleri, BBB'nin önemli yapısal bileşenleridir (Tenreiro ve diğerleri, 2016; Jiang ve diğerleri, 2018). İnme sonrası TG'ler, PS'ler ve OS tedavisinin KBB bütünlüğünü etkileyip etkilemediğini test etmek için ZO-1, claudin-5 ve okludin ekspresyonları immünofloresan analizi ile gerçekleştirilmiştir. Sonuçlar, MOD grubunda claudin-5, okludin ve ZO-1 ekspresyonlarının gözle görülür şekilde azaldığını gösterdi. Bununla birlikte, 14 günlük TG uygulamasından sonra önemli ölçüde arttılar. PS'ler ve OS grupları, bu protein ifadelerinde önemli bir değişiklik göstermedi (Şekil 7). Bu veriler, TG'lerin sıkı bağlantı protein ekspresyonlarını düzenleyebildiğini ve muhtemelen I/R yaralanmasından sonra BBB bütünlüğünü koruduğunu gösterdi.

TG'ler İ/R Yaralı Sıçanlarda Kılcal Damarlardaki Perisit Kapsamını Artırıyor

Kılcal damarlardaki perisit kapsamı, KBB bütünlüğünün korunmasında kritik bir rol oynar (Armulik ve diğerleri, 2010; Daneman ve diğerleri, 2010). Böylece, perisit kapsamının TG'ler, PS'ler ve OS'ler tedavisi ile artırılıp artırılamayacağını test ettik. İmmünofloresan yoğunluk analizi sonuçları, MOD grubunda hem PDGFRb hem de CD31 ekspresyonlarının önemli ölçüde azaldığını gösterdi. TG'lerin I/R sıçanlarına uygulanması, PDGFRb ve CD31'in ekspresyon yoğunluklarını önemli ölçüde iyileştirdi veya hatta arttırdı, ancak PS'ler ve OS'ler tedavi gruplarında hiçbir fark gözlenmedi (Şekil 8). Böylece, TG'lerin tedavisi, perisit kapsamını önemli ölçüde artırabilir. Bu bulgular ayrıca TG'lerin I/R'den sonra BBB'nin bütünlüğünü koruyabildiğini doğruladı.

TG'ler I/RIYaralı Sıçanlarda Sinirsel Yeniden Şekillenmeyi Destekliyor

Çok sayıda araştırmaya göre, inme sonrası nörojenezfonksiyonel iyileşmeyi önemli ölçüde iyileştirebilir (Grefkes veWard, 2014; Zhang ve diğerleri, 2019). Sinaptofizin (SYN), sinaptik sonrası yoğunluk 95 (PSD-95) proteinleri ve mikrotübül ilişkili protein 2 (MAP-2), korteksin iskemik yarı gölgesindeki nöronal plastisiteyi incelemek için belirteçler olarak kullanıldı. TG'ler, PS'ler ve OS tedavisinin I/R ile yaralanmış sıçanlarda nörogenez üzerindeki etkilerini değerlendirmek için SYN, PSD95 ve MAP-2 ifadeleri için immünofloresan ve western blot uygulandı. Şekil 9 ve 10'da gösterildiği gibi, 14 günlük reperfüzyondan sonra I/Rrats'taki SYN, PSD95 ve MAP-2 ekspresyon seviyeleri NOR sıçanlarına kıyasla azalırken, TG'ler ve PS'ler kürü, ekspresyon seviyelerini önemli ölçüde yukarı regüle edebilir. . OS grubu, MOD grubu ile karşılaştırıldığında önemli bir değişiklik göstermedi. Veriler, TG'lerin ve PS'lerin tedavisinin, I/R yaralanmasından sonra nöral yeniden şekillenmeyi çarpıcı biçimde destekleyebildiğini gösterdi.

TG'ler I/R Yaralı Sıçanlarda Nrf-2 ve Keap-1 İfadelerini Değiştiriyor

Oksidatif stres, İ/R yaralanmasında ana patojenik mekanizmadır (Ya ve diğerleri, 2018; Yu ve diğerleri, 2018). Çalışmalar, Nrf-2'nin antioksidan tepkilerin ana düzenleyicisi olduğunu doğruladı (Thompson ve diğerleri, 2015). I/R yaralanmasından sonra Nrf-2 ve Keap-1 aracılı oksidatif yanıtları araştırmak için, Keap-1'ın nükleer translokasyonunun yanı sıra sitoplazmik ekspresyonu da değerlendirdik. Bu arada, Nrf{{7'nin ifadesi }} I/R'de yaralı sıçanın beyin dokuları da test edildi (Şekil 10 ve 11). İmmünofloresan analizine göre, Nrf-2'nin NOR grubunda esas olarak sitoplazmada yer aldığı bulundu. TGs grubunda, sitoplazmik lokalizasyonda Nrf-2 ekspresyonu aşağı regüle edildi, ancak çekirdekte yukarı regüle edildi ve Keap-1 ekspresyonunda azalma da gözlendi. Veriler, TG'lerin beyin korumasının Nrf-2 ve Keap-1 modülasyonu ile ilişkili olabileceğini gösterdi.

ŞEKİL 4|TG'ler, I/R ile tedavi edilen sıçanlardan sonra nöronal hasarı hafifletir.

TG'ler, İ/R Yaralı Sıçanlarda Beyin Dokusu Oksidatif Stresini Azaltır

TG'lerin antioksidatif etkilerini doğrulamak için SOD, CAT, GSH-Px ve MDA'nın aktiviteleri I/R yaralı sıçanlarda değerlendirildi. Şekil 12'de MOD grubunda MDA içeriği belirgin olarak artmış ve aynı zamanda normal sıçanlara göre SOD,CAT ve GSH-Px aktiviteleri azalmıştır.Tersine, TGs tedavisi önemli bir azalmaya yol açmıştır. MDA içeriğinde ve SOD, CAT ve GSH-Px aktivitelerinde artış. Bu sonuçlar ayrıca TG'lerin antioksidasyon aktivitesini doğruladı.

TARTIŞMA

Birçok çalışma, TCM C. Deserticola'nın, örneğin öğrenme, hafıza ve bağışıklığı geliştirme gibi kapsamlı biyolojik aktivitelere sahip olduğunu göstermektedir (Dong ve diğerleri, 2007; Jiang ve Tu, 2009; Wanget diğerleri., 2017; Xia ve diğerleri., 2018). ). Bununla birlikte, C'nin aktif bileşenleri. Nöroproteksiyon için çölikola belirsizliğini koruyor. Mevcut çalışma, MCAO/R modelinde iskemik inmeye karşı C. Deserticola'nın aktif bileşenlerini taramayı amaçlamaktadır. C. Deserticola'dan (TG'ler, PS'ler ve OS'ler) üç ekstre, bunların MCAO/R sıçanları üzerindeki etkilerini ve ayrıca olası mekanizmaları değerlendirmek için kullanıldı.

İnme sık görülen bir akut serebrovasküler hastalıktır. Epidemiyolojik çalışmalar inmenin erkeklerde kadınlara göre daha sık görüldüğünü göstermektedir (Sealy-Jefferson ve ark., 2012; Guzik ve Bushnell, 2017). Bu nedenle, deneyimizde testler için erkek sıçanlar kabul edildi. Sonuçlarımız, I/R indüksiyonunun oksidatif stresi ve enfarktüs hacmini hızlandırdığını, BBB'yi kırdığını ve sinir ve serebrovasküler hasara yol açtığını kanıtladı. Taramadan sonra, TG'lerin enfarktüs hacmini azalttığı ve nöral yeniden şekillenmeyi ve anjiyogenezi desteklediği bulundu. Ayrıca, TG'lerin I/R yaralanmasından sonra BBB bütünlüğünü koruduğu gözlemlendi. Aksine, PS'ler ve OS'ler, I/R yaralanmasında önemli bir azalma sağlamaz. Bu nedenle, TG'ler, potansiyel olarak Nrf-2/Keap-1 yolunu aktive ederek nöral yeniden modelleme, anjiyogenez ve BBB bütünlüğünü teşvik ederek, C. Deserticola fornöroproteksiyonunun ana aktif fraksiyonu olarak kabul edilir.

ŞEKİL 5|TG'ler, I/R yaralanmasından sonra BBB bozulmasını hafifletir.

Artan kanıtlar, etkili kollateral dolaşımın kurulmasının enfarktüs ve iskemik yarı gölge oluşumundan kaçınmak için önemli ölçüde önemli olduğunu ve iskemik inmenin erken evresinde kritik bir tedavi olduğunu göstermektedir (ElAli, 2016; Iwasawa ve ark., 2016). İskemik enfarktüs sonrası vasküler endotel hücrelerinin ve düz kas hücrelerinin proliferasyonu, kollateral dolaşımın kurulmasını belirler. Bununla birlikte, iskemi modellerinin ortak bir fenomeni vardır - yani, beyin mikrovaskülatüründe yaygın olarak bulunan oksidatif stres. Çalışma verileri, çok sayıda antioksidanın BBB'nin işlevini ve anjiyogenezin özelliklerini bozabileceğini göstermiştir (Mentor ve Fisher, 2017). CD31 ve a-SMA, sırasıyla vasküler endotel hücrelerinin ve düz kas hücrelerinin belirteçleridir (Saboor ve ark., 2016). C.deserticola'dan elde edilen ekstraktların yukarıda bahsedilen hücre proliferasyonu üzerindeki etkisini araştırmak için, serebral iskemik yarı gölge homojenatında CD31 ve a-SMA ekspresyonlarını inceledik. Verilerimiz, TG'lerin CD31 ve a-SMA ifadelerini çarpıcı bir şekilde geliştirdiğini gösterdi. Ancak, PS'ler ve OS'ler grupları için anlamlı bir fark yoktu. Bu nedenle, TG'lerin, CD31 ve a-SMA ekspresyonlarını artırarak anjiyogenezi teşvik ederek beyin hasarını azaltabileceği sonucuna vardık, oysa PS'ler ve OS'ler beyin hasarından böyle bir koruma sağlamadı. Bu sonuçlar ayrıca sadece TG'nin serebral I/R hasarını önleyebileceğini doğruladı.

İskemik inme, nöronal plastisitedeki bozulma veya beyin bölgelerinin yeniden şekillenmesinin neden olduğu serebral iskeminin bir sonucu olarak düşünülebilir. İnme hastalarının çoğu nörolojik defisitlerden muzdariptir. Nörojenezi aktive etmek, inme hastalarının nörolojik fonksiyonlarını iyileştirmeleri için umut verici bir stratejidir (Cramer ve Chopp, 2000). Nörojenez, beyin I/Rinjury'den sonra nörolojik fonksiyonun iyileşmesine doğrudan katılır (Zhang ve diğerleri, 2019). Önceki araştırmalar, TG'lerin hipokampal piramidal hücrelerin hayatta kalma oranını iyileştirebileceğini ve nörojenezi indükleyebileceğini gösteriyor (Lian ve diğerleri, 2017). Oksidatif stres, Parkinson, felç ve benzeri birçok hastalık sırasında nöronların kaybına neden olur (Duan ve Si, 2019; Singh ve diğerleri, 2019). Nrf-2başlıca SOD, MDA, CAT ve g glutamil sistein ligazları, vb. dahil olmak üzere promotör bölgelerinde nöro-koruma ile ilgili birçok geni kopyalar (Satoh ve diğerleri, 2006). Sinaptik oluşum ve nörotransmisyon ile yakından ilişkili olan SYN, PSD-95 ve MAP-2 proteinleri, iskemik penumbra bölgesindeki araştırma nöronal plastisitesinin belirteçleri olarak kabul edilebilir. TG'ler, PSD95, SYN ve MAP-2 ifadelerini önemli ölçüde artırabilir, bu da TG'lerin beyin korumasının, I/R sırasında artan nöronal plastisite ile ilişkili olduğunu gösterir. Bununla birlikte, PSsa'lar için bariz bir fark olmaması üzücü. OS grupları olarak. Bu sonuçlar, TG'lerin serebral I/R hasarından sonra nöroplastisiteyi artırabileceğini gösterdi.

İnme hastalarında yapılan görüntüleme araştırmaları, KBB disfonksiyonunun peri iskemik beynin çarpıcı bir özelliği olarak düşünülebileceğini göstermiştir (Bang ve ark., 2007). Sitoplazmik proteinler, transmembran proteinler ve kılcal endotel hücreleri arasındaki bağlantı yapışma moleküllerinden oluşan TJ'ler, BBB bütünlüğünü korumada çok önemlidir (Ye ve diğerleri, 2019). Bunlar arasında ZO-1, claudin-5 ve okludin TJ'lerdeki en önemli proteinlerdir. Artan kanıtlar, iskemi tarafından indüklenen BBB'nin artan geçirgenliğinin genel olarak ZO-1, claudin-5 ve okludin değişiklikleriyle ilişkili olduğunu göstermektedir (Cao ve diğerleri, 2016a; Page ve diğerleri, 2016; Yu ve diğerleri). ., 2017; Liu ve diğerleri, 2018). Bu çalışmada, sonuçlar, TG'lerin MCAO'nun neden olduğu beyin dokularında ZO-1, claudin-5 ve okludin proteinlerinin ekspresyonlarını önemli ölçüde artırabilmesine rağmen, PSsnor OS'lerin de yapmadığını göstermiştir. BBB, serebral endotelyal hücrelerden oluşur ve perisitlerle yakından ilişkilidir (Nyul-Toth ve diğerleri, 2016). Perisitler, BBB bütünlüğü için hayati öneme sahiptir (Bell ve diğerleri, 2010). İskemik inme, akut fazda perisit ölümünü ve beyin endotel hücrelerinden ayrılmayı tetikler, böylece mikrovaskülatürde istikrarı bozar ve BBB özelliklerini değiştirir (Zechariahet ark., 2013). Verilerimiz TG'lerin kılcal damarlardaki perisit kapsamını artırabileceğini ve ZO-1, claudin-5 ve okludin ekspresyon seviyelerini artırabileceğini gösterdi. Bu fenomenler, TG'lerin serebral I/R yaralanmasından sonra BBB bütünlüğünü etkili bir şekilde koruyabildiğini kanıtladı. Özetle, TG'ler, anjiyogenezi teşvik etmek, nöronal plastisiteyi geliştirmek ve BBB'nin bütünlüğünü korumak gibi birçok yolla beyin hasarını hafifletebilir.

Ardından, TG'lerin beyin korumasının altında yatan mekanizmayı keşfetmek için sinyal yolunu araştırdık. I/R hasarı süreci çok faktörlüdür ve bu nedenle patogenezde çok sayıda mekanizma rol oynar. Oksidatif stres, BBB yapı hasarı, vasküler endotelyal disfonksiyon ve iskemik nöronal hasarın alevlenmesi gibi I/R kaynaklı beyin hasarına (Suda ve diğerleri, 2013) katkıda bulunan temel bir risk faktörüdür (Xiong ve diğerleri, 2015; Çağlayan ve diğerleri). diğerleri, 2019; Priestley ve diğerleri, 2019). Böylece, oksidatif stres, I/R kaynaklı beyin hasarında çekici bir terapötik hedef haline gelmiştir. Nükleer faktör E2-ilişkili faktör-2 (Nrf-2) tarafından aracılık edilen Faz 2 enzimleri, nöronların kendilerini oksidatif strese karşı korudukları önemli bir araç olarak kabul edilmektedir (Suzukiand Yamamoto, 2015; Ya ve ark., 2018). Artan kanıtlar, I/R sırasında Nrf-2 aktivasyonunun nöroproteksiyon için potansiyel bir terapötik hedef olduğunu göstermektedir (Ding ve diğerleri, 2015; Zhang R. ve diğerleri, 2017). Endojen antioksidan savunmanın önemli bir düzenleyicisi olan Nrf-2, hem oksijenaz 1 (HO-1) düzeyine hem de NAD(P)H kinon oksidoredüktaz1 (NQO1), SOD gibi diğer antioksidan enzimlere aracılık eder. CAT, GSH ve MDA (Siow ve diğerleri, 2007; Dinget diğerleri, 2014). Ayrıca, Nrf-2, anjiogenezde önemli bir düzenleyici rol oynar. Mevcut çalışma, Nrf-2'nin vasküler gelişim sürecinde önemli ölçüde arttırılabileceğini ve aktive edilebileceğini göstermektedir (Wei ve ark., 2013).

Daha önce açıklandığı gibi (Jiang ve Tu, 2009), TG'ler, örneğin, ekinakozit, tübülosit A, akteosid, izoakteozit ve 2'-asetillakteozit gibi birçok biyoaktif bileşik içerir ve bunlardan bazıları, serebral I/R hasarından sonra nöroprotektif işlevler göstermiştir (Penget al. ., 2016). Ekinakozidin antioksidasyon, yaşlanma karşıtı, nöroproteksiyon, anti-inflamasyon, sikatrizasyonun teşviki, hepatoproteksiyon, kemik oluşumunun teşviki ve anti-tümör aktiviteleri gibi birçok farmakolojik etkisi vardır (Yu ve ark., 2016; Li ve ark., 2018; Zhang Y. ve diğerleri, 2018; Ji ve diğerleri, 2019; Xu ve diğerleri, 2019). Son zamanlarda, ekinakozit, merkezi sinir sisteminde güçlü bir antioksidan olarak tanımlanmıştır (Lu ve ark., 2016). Ekinakozit, iskemi beyin hasarında MDA içeriğini azaltabilir ve SOD ve GSH Px'nin aktivitelerini iyileştirebilir ve moleküler yerleştirme analizi, ekinakozitin Keap-1'e bağlanarak Nrf-2 nükleer translokasyonuna yol açabileceğini göstermiştir (Li ve ark. , 2018). Xia'nın çalışması, ateositin, oksidatif stresi azaltarak MCAO/R sıçanlarında nörolojik defisitleri iyileştirmek için enfarktüs hacmini ve beyin su içeriğini azaltabileceğini gösterdi (Xia ve ark., 2018). Diğer çalışmalar, izoakteozidin H2O2-tedavi edilmiş V79-4 hücrelerinde hücresel antioksidan enzimler, SOD ve CAT aktivitelerini artırabileceğini göstermiştir (Chae ve diğerleri, 2005). TG'lerde bulunan aktif bileşiklerin yukarıdaki raporlarına dayanarak, TG'lerin antioksidasyon yolları yoluyla iskemik inmeye karşı koruma sağlayabildiği sonucunu çıkarmak mümkündür.

Li, feniletanoidglikozitlerin (PhG'ler) Nrf2/ARE yolu yoluyla PC12 hücreleri üzerinde H2O2- ile indüklenen apoptoz üzerindeki nöroprotektif etkileri hakkında rapor verdi (Li ve diğerleri, 2018). Bu PhG'ler, Nrf2 nükleer translokasyonunu tetikleyerek ve HO-1, NQO1, glutamat-sistein ligaz katalitik alt birimi (GCLC) ve glutamat-sistein ligaz değiştirici alt birimi (GCLM) ekspresyonlarını artırarak önemli ölçüde bastırıldı (Li ve diğerleri, 2018; Gong ve diğerleri). al., 2019). Bu nedenle, bu bulgular, Nrf-2/ARE yolunun, nöronal hücreler üzerinde PhG'lerin aracılık ettiği koruyucu etkilerde çok önemli bir rol oynadığını göstermektedir. Benzer şekilde, bu çalışmada, TG'lerin I/R sıçanlarında MDA seviyesini azaltabildiğini ve SOD, CAT ve GSH-Px seviyelerini artırabildiğini bulduk. sitoplazma ve Keap-1 ifadesini önemli ölçüde azaltır. Bu nedenle, Nrf-2/Keap-1 yolu, TG'lerin aracılık ettiği nöroprotektif etkilerde rol oynayabilir. Bu yolun daha fazla doğrulaması, gelecekte oksijen-glukoz yoksunluğu/reoksijenasyon yaralanma modelleri ile in vitro hücre kültürü ile gerçekleştirilecektir. Ayrıca, C. Çalışmamızda sürekli olarak 14 gün boyunca çölikola ekstreleri uygulandı. Yetişkin nörojenezi, 14 günlük reperfüzyon sırasında nöroprotektif etkilerin yorumlanmasını etkileyeceğinden, CT'lerin nöroprotektif etkisini keşfetmeye yönelik mevcut deney tasarımımızda nörojenez göz ardı edilemez. Bu, araştırmamızın sınırlamasıdır.

Sonuç olarak, anjiyogenez ve nörojenezi artırabilen ve aynı zamanda İ/R yaralanmalı sıçanlarda BBB'nin bütünlüğünü koruyabilen, C. çölicola'dan elde edilen TG'lerdir, ancak PS'ler ve OS'ler değil. Etkilere, Nrf-2/Keap-1 yolunun aktivasyonu aracılık edebilir.

c. çöl çiçeğigeliştirebiliranjiyogenez ve nörogenez.

Daha fazla bilgi için lütfen buraya tıklayın.