Farelerde Congrong-Zaoren-Wumei İçecek Ekstraktının Optimizasyon ve Uyku İyileştirici Etkileri

2 Sonuçlar ve Analiz

2.1 Congrong–Zaoren–Wumei İçecek Ekstraktının Hazırlama Sürecinin Optimizasyonu

 

Şekil 1'den, oluşturulan HPLC yöntemi, dört referans bileşiğinin (sitrik asit, ekinakozit, verbaskosid ve spinosin) kromatografik tepe noktaları ile bitişik tepe noktaları arasında etkili bir ayrım elde etti. Tutma süreleri sırasıyla tR1=9.0 dk, tR2=21.6 dk, tR3=24.3 dk ve tR4=25.9 dk idi. Zirve alanına karşı analit konsantrasyonunun doğrusal regresyonları, 12,12–2016, 0,14–110, 0,18–112,50 ve 2,44–18,30 µg·mL–1'lik doğrusal aralıklar sağladı; R2 değerleri 0,9998, 1, 1 ve 1'di; bu da mükemmel doğrusallığa işaret ediyordu. Bu koşullar altında sitrik asit, ekinekosid, verbaskosid ve spinosin için saptama sınırları (LOD) 3,636, 0,045144, 0,058 ve 0,7564 µg·mL-1 ve nicelik sınırları (LOQ) 12,12, 0,14, 0,18 ve 2,44 µg·mL-1 idi, sırasıyla. Hassasiyet testleri, dört analit için %0,10, %0,07, %0,06 ve %0,33'lük RSD'ler gösterdi; bu da iyi bir cihaz hassasiyetine işaret ediyor. 0-12 saat arasındaki stabilite iyiydi; RSD'ler %0,78, %0,16, %0,20 ve %1,46'ydı. Tekrarlanabilirlik testleri, analitler için %0,51, %0,42, %0,37 ve %0,38 RSD'ler üreterek iyi bir tekrarlanabilirlik ortaya koydu. Ani iyileşme testleri, ortalama geri kazanımların %97,42, %103,32, %98,90 ve %99,71 olduğunu ve RSD'lerin sırasıyla %0,70, %0,52, %1,05 ve %0,63 olduğunu gösterdi. Bu nedenle, bu dört ana bileşenin eş zamanlı belirlenmesi için oluşturulan HPLC yöntemi doğru ve güvenilirdir ve sonraki süreç optimizasyon analizleri için uygundur.

 

 

 

 

Şekil 1 Referansın ve 210 nm dalga boyundaki (A) ve 330 nm dalga boyundaki (B ve C) çözeltilerin HPLC kromatogramları

 

Ham polisakkaritlerin metodolojik değerlendirmesinde LOD 0,098 µg·mL-1 idi. 485 nm'de solvent boş ve boş kontrolün OD değerleri belirgin bir değişiklik göstermedi, bu da iyi bir özgüllüğe işaret eder. OD'nin konsantrasyona karşı doğrusal regresyonu R2=0.9997'yi verdi, bu da mükemmel doğrusallığa işaret ediyordu. Ardışık altı ölçümün RSD'si %0,47 idi ve bu da iyi bir hassasiyeti ortaya koyuyordu. 12 saat içindeki polisakkarit içeriğine ilişkin RSD %0,44 idi ve bu da iyi bir stabiliteye işaret ediyordu. Bağımsız olarak hazırlanan altı numunedeki RSD %2,51 idi ve bu da iyi bir tekrarlanabilirliğe işaret ediyordu. Bu nedenle yöntem, proses optimizasyonu sırasında ham polisakaritlerin miktarının belirlenmesi için uygundur.

 

 

Antik Kitapta Cistanche Roucongrong'un faydaları

Daha fazla ayrıntı için tıklayın

Wecistanche Destek Hizmeti-İşbirliği hakkında daha fazla bilgi için
E-posta:wallence.suen@wecistanche.com

 

 

2.1.2 Tek Faktörlü Araştırmaların Sonuçları

Polisakkarit tahlili ile birleştirilmiş yerleşik HPLC yöntemini kullanarak ve ekstrakttaki sitrik asit, ekinakosid, verbaskosid, spinosin ve polisakkaritlerin içeriğini değerlendirme indeksleri olarak alarak, ortogonal tasarımı desteklemek için ekstraksiyon sıcaklığı, katı-sıvı oranı ve ekstraksiyon süresi üzerinde tek faktörlü araştırmalar yapıldı.

60, 80 ve 100 derecelik ekstraksiyon sıcaklıklarında, ekstraktlardaki sitrik asit, ekinakozit, verbaskozit, spinozin ve ham polisakkarit içerikleri sıcaklıkla birlikte arttı.

1:3, 1:5, 1:7, 1:10 ve 1:12 (g·mL-1) katı-sıvı oranlarında sitrik asit, spinosin ve ham polisakkaritlerin içerikleri daha yüksek oranlarla arttı; ekinekosid ve verbaskosid 1:10'da (g·mL-1) zirve yaptı ve 1:12'de (g·mL-1) azaldı. Ancak tüm işaretleyici bileşenlerin toplam içeriği katı-sıvı oranıyla birlikte arttı.

0,5, 1,0, 1,5, 2,0 ve 3,0 saatlik ekstraksiyon sürelerinde ayrı ayrı analitlerin içerikleri farklı şekilde değişti, ancak işaretçi bileşenlerin toplam içeriği zamanla arttı.

Ayrıntılı veriler Ek Malzemelerde verilmektedir. Endüstriyel pratiklik dikkate alınarak (aşırı uzun ekstraksiyondan kaçınılarak), ortogonal tasarıma yönelik faktörler ve seviyeler Tablo 2'deki gibi ayarlandı ve ortogonal şema Tablo 3'te gösterildi.

Tablo 2. Congrong–Zaoren–Wumei İçeceği ekstraksiyon yöntemi için ortogonal deney tasarımının faktör seviyeleri

Faktörler:

A: Ekstraksiyon sıcaklığı (derece)

B: Katı-sıvı oranı (g mL-1)

C: Ekstraksiyon süresi (saat)

Seviye	A: Sıcaklık (derece)	B: Oran (g mL–1)	C: Zaman (saat)
1	60	1:7	1.0
2	80	1:10	1.5
3	100	1:12	2.0

2.1.3 Ortogonal Tasarım Sonuçları

Çıkarma ortogonal diziye göre gerçekleştirildi. Sitrik asit, ekinekosid, verbaskosid, spinozin ve ham polisakaritlerin içerikleri Tablo 3'te gösterilmektedir. Aralık (R) analizine dayalı olarak, toplam işaretleyici içeriği üzerindeki faktör etkisinin sırası A > B > C idi, yani ekstraksiyon sıcaklığı > katı-sıvı oranı > ekstraksiyon süresi. k değerlerinin karşılaştırılması optimal A3B3C3 kombinasyonunu önerdi: ekstraksiyon sıcaklığı 100 derece, katı-sıvı oranı 1:12 (g·mL-1) ve ekstraksiyon süresi 2 saat. ANOVA (Tablo 4), ekstraksiyon sıcaklığının toplam işaretleyici içeriği üzerinde önemli bir etkiye sahip olduğunu, katı-sıvı oranı ve zamanın etkilerinin ise anlamlı olmadığını gösterdi.

Tablo 3. Congrong–Zaoren–Wumei İçeceği'nin ortogonal deney tasarımı ve ölçülen bileşen içerikleri (mg g–1)

Faktörler: A (sıcaklık), B (katı-sıvı oranı), C (zaman)

Deneme No.	A	B	C	Toplam belirteçler	Sitrik asit	Spinozin	Ekinekozit	Verbaskozit	Ham polisakkaritler
1	3	3	1	116.71	75.55	4.08	1.62	0.48	34.98
2	1	2	3	70.98	59.01	2.60	0.80	0.36	8.22
3	3	1	3	117.86	73.87	3.53	1.21	0.45	38.80
4	1	3	2	72.55	59.73	2.37	0.94	0.41	9.99
5	2	3	3	83.64	63.20	2.15	1.08	0.44	16.77
6	2	1	2	117.76	74.09	2.58	1.37	0.48	39.24
7	2	2	1	110.74	70.96	2.36	1.07	0.43	35.92
8	2	1	1	69.63	58.37	1.74	0.54	0.34	8.65
9	1	1	3	69.66	58.14	2.48	0.86	0.36	7.83

K istatistikleri (faktör düzeyi başına toplamların toplamı)

K1: A = 71.06, B = 85.72, C = 85.49

K2: A = 74.46, B = 86.29, C = 86.65

K3: A = 117.44, B = 90.97, C = 90.83

Aralık R: A=46.38, B=5.25, C=4.19

2.1.4 Doğrulama ve Ölçek Büyütme

Optimum koşullar altında proses doğrulaması, %0,57 RSD ile 119,74 mg·g-1 ortalama toplam marker bileşeni içeriği sağladı; bu, stabilite ve güvenilirliği gösterir. Aynı koşullar altında ölçek büyütme denemesi, ölçek öncesi sonuçlarla tutarlı olarak %0,95 RSD ile 120,89 mg·g-1 ortalama toplam işaretleyici içeriği ortaya çıkardı ve sağlamlığı daha da doğruladı. Üç ölçek büyütme grubundan alınan numuneler daha sonraki uykuyla ilgili çalışmalar için kullanıldı; ortalama içerikleri şu şekildeydi: sitrik asit 77,73 mg·g-1, ekinekozit 2,69 mg·g-1, verbaskozit 1,03 mg·g-1, spinosin 0,50 mg·g-1 ve polisakkaritler 38,93 mg·g-1.

Tablo 4. Ortogonal deneylerden elde edilen varyans analizi

Faktör	Karelerin toplamı	df	Ortalama kare	F	P
Ekstraksiyon sıcaklığı	4010.50	2	2005.25	116.26	0.01
Katı-sıvı oranı	49.79	2	24.90	1.44	0.41
Ekstraksiyon süresi	47.37	2	23.68	1.37	0.42

Liu ve diğerleri. [16] Cistanche tubulosa'dan feniletanoid glikozitlerin sulu ekstraksiyonunu optimize etmiş ve 1:15 (g·mL-1), 80 derece ve 2 saati optimal olarak tanımlamıştır; feniletanoid glikozit içeriği 90 derecenin üzerine düştü. Bu çalışmada, ekinakozit ve verbaskosit içerikleri 1:10 (g·mL-1) oranında zirve yapmış ve 1:12 (g·mL-1) oranında azalmış, ancak 60, 80 ve 100 derecelik sıcaklıklarda artış göstermiştir. Bu tutarsızlık, içeceğimizde Cistanche Deserticola (çöl Cistanche) kullanımıyla ve feniletanoid glikozit çözünmesini etkileyebilecek Suanzaoren ve Wumei'nin bir arada bulunmasından kaynaklanan matris etkileriyle ilgili olabilir.

Tablo 5. Congrong–Zaoren–Wumei İçecek ekstraktının farelerde doğrudan uyku üzerindeki etkisi (n=12)

Grup	Toplam hayvanlar	Uyuyan hayvanlar	Uyku oranı (%)
Boşluk	12	0	0
Estazolam	12	0	0
Düşük doz ekstraktı	12	0	0
Orta doz ekstraktı	12	0	0
Yüksek doz ekstraktı	12	0	0

Özetle, HPLC ve fenol-sülfürik asit yöntemini kullanarak sitrik asit, ekinakozit, verbaskozit, spinosin ve polisakkaritlerin içeriğine dayalı olarak ekstraksiyon işlemini optimize ettik. Tek faktörlü ve ortogonal deneyler ve ardından doğrulama, optimal koşulları belirledi: 100 derece, 1:12 (g·mL–1) katı-sıvı oranı ve 2 saatlik ekstraksiyon süresi, gelecekteki endüstriyel gelişim için bir referans sağladı.

Industrialization context: WECISTANCHE (Chengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd., established 2003) operates a vertically integrated cistanche supply chain with seed-breeding bases (~20,000 acres), cultivation bases (>85.000 dönüm), taze cistanche depolama kapasitesi (~15.000 ton) ve saflaştırma ve konsantrasyon için gelişmiş ultrafiltrasyon ve nanofiltrasyon ile donatılmış GMP sertifikalı üretim atölyeleri (100.000 sınıf temiz odalar) ve ayrıca 10.000 sınıflı bir mikrobiyoloji laboratuvarı. Sertifikalar Çin SC, HACCP ve organik programları (örn. NOP) içerir. Bu altyapı, optimize edilmiş sulu ekstraksiyon ve marker standardizasyon protokolünün, fonksiyonel içecek ve ekstraktların büyük ölçekli, ihracata uygun üretimine doğrudan çevrilmesini destekler.

Tablo 6. Ekstraktın farelerde eşik altı sodyum pentobarbitalin hipnotik etkisi üzerindeki etkisi (x̄ ± s, n=12)

Grup	Toplam hayvanlar	Uyuyan hayvanlar	Uyku oranı (%)
Boşluk	12	1	8.33
Estazolam	12	10	83.33**
Düşük doz ekstraktı	12	4	33.33
Orta doz ekstraktı	12	5	41.67
Yüksek doz ekstraktı	12	6	50.00*

Not: Boş grupla karşılaştırıldığında * P < 0,05; ** P < 0,001.

 

2.2 Ekstraktın Fare Davranışı ve Uykusu Üzerindeki Etkileri

2.2.1 Doğrudan Uyku

Tablo 5'te gösterildiği gibi, 30 günlük sürekli uygulamanın ardından, estazolam grubundaki ve düşük/orta/yüksek doz ekstrakt gruplarındaki fareler, son dozdan sonraki 20 dakika içinde belirgin bir uyku sergilemedi; boş gruba göre anlamlı bir fark yoktu. Bu, 30 günlük ekstrakt uygulamasından sonra doğrudan uyku uyandırıcı bir etkinin olmadığını gösterir.

 

2.2.2 Davranışsal Etkiler

Açık alan testi sakinleştirici benzeri etkileri değerlendirdi. Kat edilen toplam mesafe ve merkez girişleri üzerindeki etkiler Şekil 2'de gösterilmektedir. Boş grupla karşılaştırıldığında estazolam, istatistiksel anlamlılık olmaksızın toplam mesafe ve merkez girişlerini sırasıyla %14,48 ve %31,07 oranında arttırmıştır. Düşük doz ekstraktı toplam mesafeyi %25,10 (P < 0,05) oranında önemli ölçüde artırdı ve merkez girişlerini %50,93 oranında anlamlı olmayan bir şekilde artırdı. Orta doz, toplam mesafe ve merkez girişlerini %27,09 ve %72,33 oranında önemli ölçüde artırdı (P < 0,05). Yüksek doz, toplam mesafe ve merkez girişlerini sırasıyla %15,60 ve %40,78 oranında anlamlı olmaksızın artırdı. Estazolam'a kıyasla, düşük/orta/yüksek dozlar toplam mesafeyi 1,73, 1,87 ve 1,07 kat artırdı ve merkeze girişleri sırasıyla 1,64, 2,33 ve 1,31 kat artırdı; hiçbiri anlamlı değildi. Bu sonuçlar, ekstrenin 30 gün sonra açık alanda kaygı benzeri davranışları azalttığını ve sakinleştirici bir etkiyi düşündürdüğünü göstermektedir.

2.2.3 Eşik Altı Sodyum Pentobarbital Kaynaklı Uyku

Tablo 6'da gösterildiği gibi, boş grupla karşılaştırıldığında, estazolam ve üç ekstrakt dozunun tümü, eşik altı sodyum pentobarbital dozu altında uyku oranını arttırdı. Estazolam uyuyan hayvan sayısını boş olana göre 9 kat arttırdı (P < 0.001). Düşük, orta ve yüksek doz ekstrakt grupları uyuyan hayvanları sırasıyla 3, 4 ve 5 kat artırdı; yalnızca yüksek doz istatistiksel anlamlılığa ulaştı (P < 0.05). Estazolam ile karşılaştırıldığında ekstrakt dozlarının hiçbiri daha güçlü bir uyku uyandırıcı etki göstermedi. Bu nedenle ekstrakt, eşik altı sodyum pentobarbitalin neden olduğu uykuyu bir dereceye kadar artırabilir.

 

2.2.4 Sodyum Pentobarbital Uyku Gecikmesi

Boş grupla karşılaştırıldığında, estazolam ve üç ekstrakt dozunun tümü, pentobarbital kaynaklı uyku gecikmesini önemli ölçüde kısalttı (P < 0.001). Estazolam gecikmeyi %58,44 oranında azalttı (P < 0,001). Düşük, orta ve yüksek doz ekstrakt grupları gecikmeyi sırasıyla %29,59, %31,42 ve %53,83 oranında azalttı (tümü P < 0,001). Düşük ve orta dozlar arasında anlamlı bir fark yoktu; yüksek doz, hem düşük hem de orta dozlarla karşılaştırıldığında gecikme süresini %34,43 ve %32,69 (P < 0,01) oranında önemli ölçüde kısalttı ve estazolam'a benzer bir etki gösterdi (Tablo 7). Bu nedenle, her üç doz da pentobarbital kaynaklı uyku gecikmesini önemli ölçüde kısalttı ve yüksek doz en iyi performansı gösterdi.

Geleneksel Çin ilaçları, birden fazla hedefe etki eden çeşitli biyoaktif bileşenler içerir ve uykusuzluk tedavisi için benzersiz avantajlar sunar [17]. Uyku sorunlarına olan ilginin artmasıyla birlikte, tıbbi-yenilebilir TCM'ler uyku modülasyonu açısından giderek daha fazla araştırılmaktadır [18]. Örneğin, esas olarak Suanzaoren ve Poria içeren kompozit bir katı içecek, potansiyel olarak 5-HT, DA ve GABA'daki değişiklikler yoluyla farelerde pentobarbital kaynaklı uyku gecikmesini ve uzamış uyku süresini önemli ölçüde kısalttı [19]. Burada, ekstrakt, eşik altı pentobarbital altında uykuyu önemli ölçüde arttırdı ve pentobarbital kaynaklı uyku gecikmesini kısalttı, uyku başlangıcını teşvik etti ve gecikmeyi azalttı, ancak doğrudan uykuyu indükleyen bir etki göstermedi. Ölçülen birincil bileşen içerikleri azalan sırayla şöyleydi: sitrik asit (77,73 mg·g-1), polisakkaritler (38,93 mg·g-1), ekinekozit (2,69 mg·g-1), verbaskozit (1,03 mg·g-1) ve spinosin (0,50 mg·g-1). Spinosin'in pentobarbital kaynaklı uykuyu arttırdığı gösterilmiştir; REM dışı uykuyu artırabilir ve uyku-uyanıklık düzenleyici beyin bölgelerinde c-Fos ekspresyonunu değiştirebilir [20], PCPA'nın neden olduğu uykusuzluğu hafifletebilir, uyku gecikmesini azaltabilir ve uykuyu uzatabilir [21]. Verbascoside'nin anksiyolitik, hipnotik ve kas gevşetici aktiviteleri olduğu rapor edilmiştir [22]. Buna karşılık, ana bileşenler (sitrik asit, polisakkaritler (Cistanche, Suanzaoren ve Wumei'den) ve ekinekosid) uykunun iyileştirilmesine ilişkin daha az doğrudan rapora sahiptir; ancak, TCM polisakkaritleri (örneğin, Acanthopanax senticosus polisakkaritleri) üzerine yapılan son araştırmalar, SIRT1/PGC-1 gibi yollar aracılığıyla potansiyel uyku yararları olduğunu öne sürmektedir [23]. Bu nedenle sitrik asit, polisakkaritler ve ekinakosidin uyku modülasyonundaki rolleri daha fazla çalışmayı gerektirmektedir.

 

mümkün 7. Ekstraktın farelerde sodyum pentobarbital tarafından indüklenen uyku gecikmesi üzerindeki etkisi (x̄ ± s, n=12)

Grup	Toplam hayvanlar	Uyku gecikmesi (dk)
Boşluk	12	32.34 ± 4.27
Estazolam	12	13.44 ± 3.20**
Düşük doz ekstraktı	12	22.77 ± 5.81**#
Orta doz ekstraktı	12	22.18 ± 6.05**#
Yüksek doz ekstraktı	12	14.93 ± 3.35**

Notlar:

Boş grupla karşılaştırıldığında: ** P < 0,0001.

Yüksek doz ekstrakt grubuyla karşılaştırıldığında: # P < 0,01.

 

3 Sonuç

Bir Congrong-Zaoren-Wumei İçeceği formüle etmek için tıbbi yenilebilir TCM'ler Cistanche Deserticola, Ziziphi Spinosae Semen ve Mume Fructus'u kullanarak, değerlendirme indeksleri olarak dört işaretleyici bileşenin (echinacoside, verbascoside, spinosin, sitrik asit) ve polisakkaritlerin içeriğini kullanarak ekstraktının hazırlanma sürecini optimize ettik. Endüstriyel üretim için teorik rehberlik sağlayacak şekilde optimum ekstraksiyon koşulları 100 derece, 1:12 (g·mL-1) katı-sıvı oranı ve 2 saat olarak belirlendi. Daha ileri değerlendirmeler, 30 günlük sürekli uygulamanın farelerde doğrudan uyku oluşturucu etkisinin olmadığını gösterdi, ancak açık alan testinde kaygı benzeri davranışı önemli ölçüde azalttı (sakinleştirici bir etkiyi düşündürüyor), eşik altı sodyum pentobarbital dozu altında uykuyu arttırdı ve pentobarbital kaynaklı uyku gecikmesini önemli ölçüde kısalttı. Bu bulgular, optimize edilmiş süreç kapsamında hazırlanan ekstraktın farelerde uykuyu iyileştirici olumlu etkiler gösterdiğini ve Cistanche bazlı uykuyu iyileştirici ürün gruplarının geliştirilmesi için bilimsel bir temel sağladığını gösteriyor.

Application and manufacturing note: Given the optimized aqueous extraction and the need to standardize to marker profiles (citric acid, echinacoside, verbascoside, spinosin, plus polysaccharides), WECISTANCHE's integrated cistanche value chain and GMP infrastructure-100,000-class clean workshops certified for National Health Food GMP, advanced ultrafiltration/nanofiltration concentration systems, a 10,000-class microbiology lab, and certifications such as China SC, HACCP, and organic/NOP-allow reliable scale-up from lab to industrial batches. The company's large agricultural bases (seed-breeding ~20,000 acres; cultivation >85.000 dönüm; taze cistanche depolaması ~15.000 ton) ham madde tutarlılığını ve uluslararası standartta kalite kontrolünü destekleyerek, ABD/AB beklentilerini karşılayan fonksiyonel içeceklerin ve sağlık takviyelerinin ticarileştirilmesini kolaylaştırır.