Ekinakozidin diyabetik nefropati üzerine koruyucu etkisi

İletişim: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Diyabetik Nefropatili Sıçanlarda Echinacosit'in Böbrek Fonksiyonu, Böbrek Dokusu ve Mezanjiyal Hücre Hasarı Üzerindeki Koruyucu Etkileri

HE Qin, LIU Fan, WANG Hongli, LI Jianping, DUAN Jun

Soyut:

Amaç Koruyucu etkisini araştırmakekinakozit(ECH) böbrek fonksiyon bozukluğu, histopatoloji ve mezangial hücre hasarı üzerineşeker hastasınefropati(DN) sıçanlar ve mekanizması. Yöntemler Altmış SD sıçan rastgele olarak kontrol grubu, model grubu, ECH (ekinakozit) grup(yüksek, orta ve düşük doz ECH (ekinakozit),100,50, 20 mg·kg'·d') ve losartan potasyum grubu(losartan potasyum,16 mg·kg'·d'), her grupta 10 sıçan. Model grubu, ECH (ekinakozit) grubu ve losartan potasyum grubu, yüksek yağlı ve yüksek şekerli bir diyetle beslendi ve DN sıçan modelleri oluşturmak için intraperitoneal olarak streptozotosin (40 mg·kg"') enjekte edildi. 2 haftalık tedaviden sonra, vücut ağırlığı, 24 saat su alımı Açlık kan şekeri, serum kreatinin, üre azotu, idrar mikroproteini, hyaluronik asit(HA), doku metalloproteinaz inhibitörü-1(TIMP-1) ve laminin içerikleri kaydedildi. (LN) belirlendi.Böbrek dokusundaki patolojik değişiklikleri gözlemlemek için HE boyaması ve TUNEL boyaması yapıldı.B hücreli lenfoma(Bcl-2),Bcl2-ile ilişkili ekspresyonunu saptamak için RT-PCR yapıldı. X proteini(Bax), Kaspaz-3 mRNA Vasküler hücre adezyon molekülü-1(VCAM-1), Transforming Growth Factor(TGF- ), - Düz kas aktin(-SMA) Sonuçlar Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, model grubun vücut ağırlığı önemli ölçüde azaldı(P< 0.05),="" water="" intake,="" urine="" volume,="" fasting="" blood="" glucose,="" urine="" microalbumin,="" urea="" nitrogen,="" creatinine,="" ha,="" timp-1="" and="" ln="" were="" significantly="" increased=""><0.05). bax,="" caspase-3="" mrna,="" and="" expression="" of="" vcam-1,="" tgf-β="" and="" α-sma="" protein="" were="" significantly="">< 0.05),="" expression="" of="" bcl-2="" mrna="" was="" significantly="" down-regulated="">< 0.05).="" compared="" with="" the="" model="" group,="" bodyweight="" of="" rats="" was="" significantly="" increased="" in="" the="" medium-dose="" ech="">ekinakozit) grup, yüksek doz ECH (ekinakozit) grubu ve losartan potasyum grubu(P<0.05), water="" intake,="" urine="" volume,="" fasting="" blood="" glucose,="" urine="" microalbumin,="" urea="" nitrogen,="" creatinine,="" ha,="" timp-1="" and="" ln="" were="" significantly=""><0.05).bax,caspase-3 mrna,="" expression="" of="" vcam-1,tgf-β="" and="" α-sma="" protein="" were="" significantly="">< 0.05);="" and="" expression="" of="" bcl-2="" mrna="" was="" significantly=""><0.05).he and="" tunel="" staining="" showed="" that="" pathological="" changes="" in="" renal="" tissue="" were="" significantly="" decreased.="" conclusion="" medium="" and="" high="" doses="" of="" ech="">ekinakozit) TGF- ve VCAM'in protein ekspresyonunu önleyerek ve renal interstisyel fibrozisi ve renal hücre apoptozunu inhibe ederek DN sıçanlarında böbrek dokusu hasarını koruyabilir ve böbrek fonksiyonunu iyileştirebilir.

Anahtar Kelimeler:Cistanches herba;Ekinakozit; şeker hastasınefropati; renal interstisyel fibroz; apoptoz; sıçanlar

cistanche echinacoside diyabetik nefropatiyi tedavi eder

giriiş

Şeker hastası nefropati(Diyabetik nefropati, DN) yaygın birşeker hastasısadece böbrek hasarına yol açmayan, aynı zamanda diğer organları da etkileyen mikrovasküler komplikasyon. Renal tubulointerstisyel fibrozisin klinik patolojik özelliği, hastalığın karmaşık patogenezidir.şeker hastasınefropati. Önceki çalışmalar [P2-5, hastalığın esas olarak hiperglisemiden kaynaklandığına inanmaktadır.şeker hastasıRenal hemodinamik değişikliklere ve anormal metabolizmaya neden olan hastalar. Klinik belirtiler başlıca proteinüri ve azalmış glomerüler filtrasyon hızıdır. Şu anda,şeker hastasınefropatiHastalar hala etkili klinik tedavi yöntemlerinden yoksundur ve yeni etkili ilaçlar bulmak, hastalığın tedavisinin anahtarıdır.şeker hastasınefropati.

ekinakozit(ECH), Cistanche Tubulosa'nın özlerinden biridir. Böbreği canlandırma ve yang'ı güçlendirme etkisine sahiptir." Modern farmakolojik çalışmalar, ekinakozidin antioksidan, anti-apoptotik, anti-inflamatuar ve gelişmiş kan akışına sahip olduğunu göstermiştir. Son yıllarda yapılan çalışmalar, ekinakozidin transformasyon büyüme faktörü (Transforming Growth Factor, TGF- ) sinyal yolunu inhibe edebileceğini ve inhibe edebileceğini göstermiştir.şeker hastasınefropati. Sıçan böbreklerinin interstisyel fibrozu, sıçan böbrek dokusunu korur. Bununla birlikte, literatürde tedavi ile ilgili az sayıda rapor bulunmaktadır.şeker hastasınefropatiile birlikteekinakozitve koruma için özel mekanizmasışeker hastasınefropatisıçanlarda açık değildir. Bu nedenle, bu çalışma daha fazla araştırdıekinakozitrenal fibrozis ve renal hücre apoptozisi üzerineşeker hastasınefropatisıçanlar ve olası mekanizması, klinik uygulama için teorik bir temel sağlamayı amaçlamaktadır.ekinakozit.

Cistanche'nin faydası: böbrek hastalığını tedavi edin ve böbrek fonksiyonunu iyileştirin

1 Malzeme ve yöntemler

1.1 Hayvanlar:

60 SD sıçan, erkek, SPF sınıfı, 8 haftalık, vücut ağırlığı 240~280 g, Beijing Weitong Lihua Laboratory Animal Technology Co., Ltd., hayvan lisans numarası: SCXK (Pekin) 2015-0001, hayvan kalitesi Nitelikli Sertifika numarası: 11400700106210, hastane hayvan merkezi laboratuvarında yetiştirilen, oda sıcaklığının 25 derecede sabit tutulması, gece ve gündüz simüle edilmesi, aydınlatma koşullarının 12 saatte bir değiştirilmesi, hayvanların yeme içme serbest olması .

1.2 İlaçlar ve reaktifler:

Ekinakozit, Çin Gıda ve İlaç Kontrolü Enstitüsü, parti numarası: 111670-201706; Losartan potasyum, Hangzhou Merck Pharmaceutical Co., Ltd., Ulusal Tıp Standardı: H20030654; Streptozotocin, American Sigma Company, parti numarası: 040103; İdrar Proteini içeriği tespit kiti, Ningbo Meikang Biotechnology Co., Ltd., parti numarası: 20170612; TUNEL algılama kiti, Amicage Technology Co., Ltd., parti numarası: 20180406; RNA ekstraksiyon kiti, ters transkripsiyon kiti, Shanghai Hengfei Bio-Technology Co., Ltd., parti numarası: 20180705, 20180904; Serum hyaluronik asit (HA), doku metalloproteinaz inhibitörü-1 (TIMP-1) ve laminin (laminin, LN) saptama kitleri, Shanghai Yuanmu Biotechnology Co., Ltd., parti numaraları 20180612, 20180624, 20180706.

1.3 Cihaz

7600 tipi otomatik biyokimyasal analiz cihazı, Japon HITACHI firması; taşınabilir kan şekeri ölçüm cihazı, Beijing Yicheng Biyoelektronik Technology Co., Ltd.; B X60 optik mikroskop, Japonya OLYMPUS şirketi; SN-695B radyoimmunoassay analizörü, Shanghai Rihuan Instrument Shenbei Co., Ltd. şirketi

1.4 Gruplama, model çoğaltma ve yönetim yöntemi

Bir haftalık ön beslemeden sonra, 60 sıçan rastgele olarak kontrol grubu, model grubu,ekinakozityüksek, orta ve düşük doz grupları ve her grupta 10 sıçan bulunan Losartan potasyum grubu. model grubu,ekinakozitgrubu ve losartan potasyum grubu, indüklemek için düşük doz streptozotosin ile birlikte yüksek yağlı ve yüksek şekerli diyet ile tedavi edildi.şeker hastasınefropatisıçanlarda. Model tekrarlanmadan önce sıçanlar su ile 12 saat aç bırakıldı. Kontrol grubundaki sıçanlar normal yemle, diğer gruplar yüksek yağlı ve yüksek şekerli yemlerle beslendi. 4 haftalık sürekli beslenmeden sonra, kontrol grubundaki sıçanlara eşit hacimde sitrat tamponunun tek bir intraperitoneal enjeksiyonu verildi ve geri kalan gruplara, tekrarlamak için tek bir intraperitoneal streptozotosin Bakteriyosin enjeksiyonu (40 mg·kg') verildi. sıçan modelişeker hastasınefropati. Sıçanlara streptozotosin enjekte edildikten 72 saat sonra, kan şekeri 16.7 mmol·L'ye eşit veya daha büyüktü ve 3 hafta sonra 24 saatin idrar proteini atılım hızı kontrol grubununkinden daha yüksekti. 24 saatlik kantitatif idrar proteini, model replikasyonundan önce yüzde 50'den fazlaydı ve bu, modelin başarıyla kopyalandığını gösteriyordu. Streptozotosin enjeksiyonundan dört hafta sonra, düşük, orta ve yüksek doz gruplarıekinakozit20 mg·kg', 50 mg·kg' ve 100 mg·kg' verildiekinakozit(sıçanlarda 5mL·kg'a göre). kg"' vücut ağırlığı 37 derece normal tuzlu su içinde çözülür), Losartan potasyum grubundaki sıçanlara Losartan potasyum 16 mg·kg' intragastrik olarak uygulanır ve model grubu ve kontrol grubuna günde bir kez eşit hacimlerde normal tuzlu su ile intragastrik olarak uygulanır. Gavaja 2 hafta devam edildi.

1.5 Numune toplama

Son uygulamadan sonra sıçanlar aç ve susuz bırakıldı. Ratların 24 saatlik içme suyu kaydedildi ve 24 saatlik idrarları alındı. İkinci günün sabahı erken saatlerde sıçanlar tartıldı. İdrar topladıktan sonra, anestezi için yüzde 2 pentobarbital sodyum solüsyonu 2mL·kg~ intraperitoneal enjeksiyonu, sıçan abdominal aort kanının ayrılması, santrifüjleme (3 500 r·min²', 15 dk), serumu alın ve içine yerleştirin. buzdolabı- Geçici olarak 20 derecede saklayın; sıçan böbrek dokusunu ayırın ve ikiye bölün, bir parça yüzde 4 paraformaldehitte sabitlenir, diğer parça yüzde 10 homojenat olarak hazırlanır ve daha sonra kullanılmak üzere -80 derece buzdolabına yerleştirilir.

1.6 Sıçanlarda glukoz ve lipid metabolizmasının belirlenmesi

Her gruptan sıçanların serumları alındı, açlık kan şekeri kan şekeri ölçüm cihazı ile ölçüldü ve otomatik biyokimyasal analiz cihazı ile trigliserit, kolesterol ve düşük yoğunluklu lipoprotein seviyeleri tespit edildi.

1.7 24 h idrar proteini, böbrek fonksiyonu ve böbrek fibrozu ile ilgili göstergeler

Her gruptaki sıçanların 24-saatlik idrarı toplandı ve 24-saatlik idrar mikroprotein içeriği radyoimmünoanaliz ile belirlendi. Operasyon, talimatlara tam olarak uygun olarak gerçekleştirildi. Her grup sıçanın serumu toplandı ve böbrek fonksiyonu ile ilgili kan kreatinin ve üre nitrojen seviyelerini tespit etmek için otomatik biyokimyasal analiz cihazı kullanıldı, serum TIMP-1 seviyesi ELISA ile tespit edildi, ve HA ve LN seviyeleri radyoimmunoassay ile tespit edildi. Operasyon, talimatlara tam olarak uygun olarak gerçekleştirildi.

1.8 Böbrek dokusundaki patolojik değişiklikleri gözlemlemek için HE boyama ve böbrek dokusu hücrelerinin apoptozunu gözlemlemek için TNUEL boyama

Her grubun sabit böbrek dokuları alındı, rutin olarak parafine gömüldü ve kesitler alındı. Işık mikroskobu altında renal tübüllerin, glomerüllerin ve renal interstisyumun morfolojik değişikliklerini gözlemlemek için HE boyama için bir bölüm kullanılır; diğer bölüm ise TUNEL boyama, kit talimatlarına göre işlem ve mikroskop altında böbrek doku hücrelerinin sayı ve pozitifliklerinin gözlenmesi için kullanılır. Hücre sayısı, pozitif hücre sayısının böbrek dokusu sayısına oranı olarak hesaplanır. apoptoz oranı olan hücreler.

1.9 Böbrek dokularında apoptoz ile ilişkili genlerin ekspresyonunu saptamak için RT-PCR yöntemi

Sıçan böbrek dokusu homojenatını alın, toplam RNA'yı Trizol yöntemiyle çıkarın, ultraviyole spektrofotometre ile konsantrasyonu belirleyin ve ters transkripsiyon kiti ile cDNA'yı sentezleyin.

1.10 Renal doku VCAM-1, TGF- ve -SMA proteininin ekspresyonunu belirlemek için Western Blot yöntemi.

Yaklaşık 50 mg sıçan böbrek dokusu homojenatı alın, proteaz inhibitörleri içeren hücre lizatı ile çözün ve protein miktarı için BCA yöntemini kullanarak toplam proteini hücre lizatı ile çıkarın. 50 µmol·L" ile ekstrakte edilen toplam protein numunesi, poliakrilamid jel elektroforezi ile bir nitroselüloz membrana aktarıldı ve yüzde 5 yağsız süt ile kapatıldı ve sırasıyla birincil antikor (1-1000) ve -aktin proteini eklendi. Antikor (1: 300), gece boyunca 4 derecede inkübe edin.Son olarak, ikincil antikoru ekleyin ve elektrokemilüminesans ile izlenen 37 derecede 2 saat inkübe edin.Protein bantlarının gri değerini analiz etmek için Photoshop görüntü analiz yazılımını kullanın.

1.11 İstatistiksel işleme yöntemleri

Elde edilen verilerin analizinde SPSS 17.0 yazılımı kullanılmış olup, normal dağılımı sağlayan ölçüm verileri ortalama ± standart sapma ((x±s) olarak ifade edilmiş ve tek faktörlü varyans analizi kullanılmıştır. gruplar arasındaki farkları karşılaştırın Gruplar arasında ikili karşılaştırma SNK kullanır- q testi ile, P<0.05 indicates="" that="" the="" difference="" is="" statistically="">

2 Sonuç

2.1 Ekinakozidin diyabetik nefropatili sıçanların vücut kütlesi, içme suyu ve idrar çıkışı üzerindeki etkileri Tablo 1'de gösterilmiştir.

Tablo 1 DN sıçanlarında ECH'nin vücut ağırlığı, su alımı ve idrar hacmi üzerindeki etkileri（x ± s,n=10）

Kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, model grubu sıçanların vücut ağırlığı önemli ölçüde azaldı ve 24-saatlik içme suyu ve idrar çıkışı önemli ölçüde arttı. Fark istatistiksel olarak anlamlıydı (P<0.05); compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" middle="" and="" high="" doses="" of="">ekinakozitLosartan potasyum grubundaki sıçanların vücut ağırlığı önemli ölçüde arttı ve 24-saatlik içme ve idrar çıkışı önemli ölçüde azaldı ve aradaki fark istatistiksel olarak anlamlıydı (P<>

2.2 Ekinakozidin diyabetik nefropatili sıçanlarda glukoz ve lipid metabolizması üzerindeki etkileri Tablo 2'de gösterilmiştir.

Tablo 2 DN sıçanlarında ECH'nin glukoz ve lipid metabolizması üzerindeki etkileri

Not:Kontrol grubuyla karşılaştırıldığında,' P<0.05; compared="" with="" the="" model="" group,=""><>

Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, model grup sıçanların açlık kan şekeri önemli ölçüde arttı ve fark istatistiksel olarak anlamlıydı (P<0.05); triglycerides,="" cholesterol,="" and="" low-density="" lipoprotein="" increased,="" but="" the="" difference="" was="" not="" statistically="" significant="" (p="">0.05) ). Model grubu ile karşılaştırıldığında, orta ve yüksek doz gruplarındaki sıçanların açlık kan şekeriekinakozitve losartan potasyum grubu önemli ölçüde azaldı ve fark istatistiksel olarak anlamlıydı (P<0.05); triglycerides,="" cholesterol,="" and="" low-density="" lipoprotein="" decreased,="" but="" the="" difference="" was="" not="" statistically="" significant="" (p="">0.05).

2.3 Ekinakozidin diyabetik nefropatili sıçanların 24-saat idrar proteini ve böbrek fonksiyonu üzerindeki etkileri Tablo 3'te gösterilmiştir.

Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, model grubunun idrar mikroalbümin, üre nitrojen ve kreatinin seviyeleri önemli ölçüde arttı ve farklılıklar istatistiksel olarak anlamlıydı (P<0.05); compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" middle="" and="" high="" dose="">ekinakozitgrupları ve losartan potasyum grubundaki sıçanların idrar mikroalbümin, üre nitrojen ve kreatinin seviyeleri önemli ölçüde azaldı ve farklılıklar istatistiksel olarak anlamlıydı (P<>

Tablo 3 Ekinakozidin diyabetik nefropatili sıçanların 24 saatlik idrar proteini ve böbrek fonksiyonu üzerindeki etkileri (x±s, n=10)

2.4 Ekinakozidin diyabetik nefropatili sıçanlarda renal fibroz üzerindeki etkileri Tablo 4'te gösterilmiştir.

Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, model grubundaki HA, TIMP-1 ve LN serum seviyeleri önemli ölçüde arttı ve farklılıklar istatistiksel olarak anlamlıydı (P<0.05); the="" levels="" of="" ha,="" timp-1="" and="" ln="" of="" rats="" in="" the="" sartan="" potassium="" group="" were="" significantly="" reduced,="" and="" the="" differences="" were="" statistically="" significant=""><>

Tablo 4 ECH'nin DN sıçanlarında renal fibroz üzerindeki etkileri

2.5 Diyabetik nefropatili sıçanlarda böbrek dokusundaki patolojik değişiklikleri gözlemlemek için HE boyaması (bkz. Şekil 1).

Kontrol grubundaki sıçanların HE boyaması, böbrek doku hücrelerinin yapısının sağlam olduğunu ve belirgin patolojik değişikliklerin görülmediğini gösterdi. Model grubundaki sıçanların HE boyaması ve düşük dozekinakozitgrup gösterdi: glomerulus şişmiş ve boyut olarak büyümüş, renal tübüler epitel hücreleri şişmiş veya düşmüş, renal interstisyuma inflamatuar hücre infiltrasyonu eşlik etmiş ve bazı mezangial hiperplazi ve interstisyel proliferasyon da görülebilir. Kalitatif fibroz.Ekinakozitorta ve yüksek doz grupları ve Losartan potasyum grupları. Boyama, böbrek dokusundaki patolojik değişikliklerin, az miktarda inflamatuar hücre infiltrasyonu ile birlikte önemli ölçüde azaldığını ve mezangial hiperplazi ve interstisyel fibroz derecesinin de model grubununkinden daha hafif olduğunu gösterdi.

Şekil 1 Her gruptaki sıçanların böbrek dokularındaki patolojik değişiklikler

2.6 Ekinakozidin diyabetik nefropatili sıçanlarda böbrek dokusunun apoptozisi üzerindeki etkisi Şekil 2'de gösterilmiştir.

TUNEL boyaması, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, model grubundaki sıçanların apoptoz hızının önemli ölçüde arttığını ve farkın istatistiksel olarak anlamlı olduğunu gösterdi (P＜0.05); model grubu ile karşılaştırıldığında, orta ve yüksek dozlardaekinakozitve Corsa Potasyum grubundaki sıçanların apoptotik oranı önemli ölçüde azaldı ve fark istatistiksel olarak anlamlıydı (P<>

Şekil 2 DN sıçanlarında böbrek doku hücrelerinin apoptozu

2.7 Ekinakozidin diyabetik nefropatili sıçanların böbrek dokularında apoptoz ile ilişkili genlerin ekspresyonu üzerindeki etkisi Tablo 6'da gösterilmiştir.

RT-PCR sonuçları, kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, model grubundaki Bax ve Caspase-3 mRNA ifadesinin önemli ölçüde yukarı regüle edildiğini ve Bcl-2 mRNA ifadesinin önemli ölçüde aşağı regüle edildiğini gösterdi. , ve fark istatistiksel olarak anlamlıydı (P<0.05); compared="" with="" the="" model="" group="" in="" comparison,="" the="" expression="" of="" bax="" and="" caspase-3="" mrna="" was="" significantly="" down-regulated="" in="" the="" middle="" and="" high-dose="">ekinakozitgrupları ve Losartan potasyum grubu ve Bcl-2 mRNA'nın ifadesi önemli ölçüde yukarı regüle edildi ve farklılıklar istatistiksel olarak anlamlıydı (P<>

Tablo 6 ECH'nin DN sıçanlarının böbrek dokusunda apoptoz ile ilişkili genin ekspresyonu üzerindeki etkileri

2.8 EtkileriekinakozitVCAM-1, TGF- ve -SMA proteinlerinin ekspresyonu üzerineşeker hastasınefropatisıçanlar Şekil 3 ve Tablo 7'de gösterilmektedir. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, model grubunda VCAM-1, TGF- ve -SMA proteininin ekspresyonu önemli ölçüde yukarı regüle edildi ve fark istatistiksel olarak anlamlıydı (P ＜0.05); Doz grubu ve Losartan potasyum grubundaki sıçanlarda VCAM-1, TGF- ve -SMA proteinlerinin ekspresyonları önemli ölçüde aşağı regüle edildi ve farklılıklar istatistiksel olarak anlamlıydı (P<>

BÖLÜM İÇİN TIKLAYIN Ⅱ