Dendrimer-tesaglitazar Konjugatı, Mikroglia'da Fenotip Değişimini İndükler ve -amiloid Fagositozunu† Geliştirir Bölüm 1

Mikroglia'yı hastalığı alevlendiren 'proinflamatuar' bir durumdan nöroprotektif, 'antiinflamatuar' bir fenotipe dönüştürmek, birçok nörodejeneratif hastalığı ele almak için umut verici bir stratejidir.

Mikroglia, merkezi sinir sisteminde bulunan ve öncelikle nöronların sağlığının ve fonksiyonunun korunmasından sorumlu olan bir hücre türüdür. Çeşitli büyüme faktörleri ve nörotrofik faktörler salgılayabilirler ve nöronların etrafındaki atık maddeleri temizleyerek nöronların normal metabolik aktivitesini koruyabilirler. Son yıllarda yapılan çalışmalar mikrogliaların hafızayla yakından ilişkili olduğunu göstermiştir. Gelin hep birlikte bir göz atalım.

Birincisi, mikroglia nöronları uyarabilir ve nöronların aktivasyonunu destekleyerek hafızayı güçlendirebilir. Mikroglia, glutamat ve alanin gibi bir dizi nörotransmitteri serbest bırakarak, nöronlar arasındaki sinyal iletimini destekleyebilir ve presinaptik membranlar arasındaki glial-nöron sinyal rezonansını geliştirebilir, nöronal uyarılabilirliği ve hafıza oluşumunu daha da teşvik edebilir.

İkincisi, mikroglia ayrıca nöronların etrafındaki atıkları temizleyebilir, nöronların normal metabolik aktivitesini koruyabilir ve nöron ölümlerini azaltabilir, böylece hafızanın iyileşmesini teşvik edebilir. Nöronların etrafında çok fazla çöp biriktiğinde, bu durum nöronların normal metabolik aktivitesini etkileyerek nöron ölümüne ve fonksiyonun zayıflamasına yol açarak hafıza performansını azaltır. Mikroglia, nöronların normal metabolik ortamını koruyabilir ve çevredeki atıkları yutup ayrıştırarak nöron ölümlerini azaltabilir, böylece hafızayı geliştirebilir.

Özetle mikroglialar hafızayla yakından ilişkilidir. Mikroglia, nöronların uyarılmasını teşvik ederek ve çevredeki atıkları temizleyerek hafızayı daha da geliştirebilir ve beynimizi sağlıklı ve aktif tutabilir. Daha iyi bir hafızaya sahip olmak için mikrogliaların sağlığını korumaya dikkat etmeliyiz. Hafızayı geliştirmemiz gerektiği görülebilir ve Cistanche hafızayı önemli ölçüde geliştirebilir çünkü Cistanche birçok benzersiz etkiye sahip geleneksel bir Çin tıbbi malzemesidir ve bunlardan biri hafızayı geliştirmektir. Cistanche'nin etkinliği, tanik asit, polisakkaritler, flavonoid glikozitler vb. dahil olmak üzere içerdiği çeşitli aktif bileşenlerden gelir. Bu bileşenler beyin sağlığını çeşitli şekillerde geliştirebilir.

Belleği geliştirmenin 10 yolunu bilin'e tıklayın

Proinflamatuar mikroglia, nörotoksik maddeleri serbest bırakarak ve patojenik protein birikimini hızlandırarak hastalığın ilerlemesine katkıda bulunur. PPAR ve PPAR agonistlerinin her ikisinin de mikroglia'yı proinflamatuar ("M1-benzeri") fenotipten alternatif olarak aktifleştirilmiş ("M2-benzeri") fenotipe değiştirdiği gösterilmiştir. Bu tür stratejiler, Alzheimer ve Parkinson hastalığı gibi nörolojik hastalıklar için yapılan klinik çalışmalarda araştırılmış, ancak kan-beyin bariyerinin (BBB) ​​zayıf penetrasyonu nedeniyle muhtemelen başarısız olmuştur.

Hidroksil ile sonlanan poliamidoamin dendrimerlerin (herhangi bir hedefleme ligandına bağlanmadan), nöroenflamasyon bölgesinde bozulmuş BBB'yi geçtiği ve aktif mikrogliada biriktiği gösterilmiştir.

Bu nedenle, bir PPAR/dual agonistin dendrimer konjugasyonu, aktifleştirilmiş mikrogliaların hedeflenen fenotip değişimini mümkün kılabilir. Burada yeni bir dendrimer-PPAR/dual agonist konjugatının (D-tesaglitazar) sentezini ve karakterizasyonunu sunuyoruz.

İn vitro olarak D-tesaglitazar, 'M1'den M2'ye' fenotip değişimini indükler, reaktif oksijen türlerinin salgılanmasını azaltır, fagositoz için genlerin ekspresyonunu ve patojenik proteinlerin (örn. -amiloid, -sinüklein) enzimatik parçalanmasını arttırır ve -amiloid fagositozunu arttırır.

Bu sonuçlar, D-tesaglitazar'ın başta Alzheimer ve Parkinson Hastalığı olmak üzere birçok nörodejeneratif hastalığın çevirisine yönelik daha da geliştirilmesini desteklemektedir.

giriiş

Yalnızca Amerika Birleşik Devletleri'nde şu anda 5,3 milyondan fazla Alzheimer hastalığı (AH) ve 1 milyondan fazla Parkinson hastalığı (PD) bulunmaktadır.1 Artan yaş birçok nörodejeneratif hastalık için en büyük risk faktörü olduğundan, bu hastalıkların yaygınlığı ve tedavi maliyeti nüfus yaşlanmaya devam ettikçe artmaya devam edecektir.

Dahası, bu hastalıkları tedavi etmek için yeni ilaçlar geliştirmede yakın zamanda elde edilen başarının eksikliği, yenilikçi tedavilerin geliştirilmesine olan ihtiyacın altını çizdi.2,3 Bu klinik başarısızlıklar, bir ilacın geliştirilmesindeki zorlukların altını çiziyor; buna, ilacın etkili olması için beyne yeterli yüksek konsantrasyonda verilmesi de dahil. olumsuz yan etkilere neden olur.

Alzheimer ve Parkinson hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıklar üç ana nöropatolojik bileşeni paylaşır: nöroinflamasyon, patojenik protein birikimi ve nöron ölümü.4-7 Sağlıklı insanlarda, beynin doğuştan gelen bağışıklık hücresi (temikroglia) yanlış katlanmış proteinleri (örn. -amiloid, -sinüklein) sürekli olarak fagositoz eder. ) üretildikçe nöron ölümüne neden olur ve bu da ayırt edici kümelerin oluşmasını engeller.

Bununla birlikte, sonunda nörodejeneratif hastalıklar geliştiren insanlarda, mikroglia artık bu proteinleri etkili bir şekilde uzaklaştıramaz ve hastalığı alevlendiren, proinflamatuar bir fenotipe (tipik olarak M1 olarak adlandırılır) dönüşür.

Mikroglial aktivasyonun baskın olarak pro-inflamatuar/anti-inflamatuar (M1/M2) sınıflandırması, makrofaj polarizasyon spektrumunun aşırı basitleştirilmesi olsa da, nöroinflamasyonda ve tedaviye yanıtta mikroglia'nın baskın fenotipini tanımlamak için hala geniş bir terminoloji olarak kullanılmaktadır.

M1-benzeri mikroglia, patojenik proteinlerin (örneğin -amiloid, -sinüklein) üretimini artırarak hem nöron ölümüne neden olan hem de hastalık patolojisini şiddetlendiren reaktif oksijen türlerini ve diğer inflamatuar aracıları serbest bırakır.

Ayrıca, AD gelişimi için başlıca genetik risk faktörleri (TREM2 ve APOE) mikrogliada yüksek seviyelerde eksprese edilir ve TREM2/APOE yolunun AD, amyotrofik lateral skleroz (ALS) ve multipl sklerozda amikroglial fenotip değişimine neden olduğu gösterilmiştir. hayvan modelleri.8

Bu bulgular ayrıca mikroglia'nın birçok insan nörodejeneratif hastalığının patolojisindeki rolünü göstermektedir. Mikroglia fenotipini manipüle etmeye yönelik bir yaklaşım, potansiyel olarak etkili bir terapötik olmanın yanı sıra araştırmacıların nörodejeneratif hastalıklardaki rollerini anlamalarını sağlayacaktır.

Mikroglia'nın M1'den antiinflamatuar ve nöroprotektif (M2) fenotipe değiştirilmesi, birden fazla nörodejeneratif hastalığın tedavisinde terapötik bir strateji olarak önerilmiştir.5,6 Şu anda FDA onaylı iki PPAR agonisti olan tip II diyabet ilaçları rosiglitazon ve pioglitazonun, Makrofajlarda ve mikroglialarda in vitro ve in vivo olarak M1'den M2'ye fenotip değişimi.

9,10 PPAR agonistlerinin, ligand bağımlı transrepresyonun yanı sıra NF-κB bozunmasını ve çekirdekten dışa aktarımını indükleyerek NF-κB aktivitesini azaltarak LPS kaynaklı reaktif oksijen türlerinin salgılanmasını azalttığı gösterilmiştir.11

Üstelik epidemiyolojik çalışmalar, rosiglitazon veya pioglitazon alan diyabet hastalarının AH ve PD geliştirme riskinin azaldığını göstermiştir.12 Daha sonra, rosiglitazon ve pioglitazon AH için faz III klinik araştırmalarla araştırıldı, ancak başarısız oldu.13

Bahsedilen klinik deneylerin başarısızlığının olası bir açıklaması, bu ilaçların kan-beyin bariyerini (BBB) ​​geçerek zayıf taşınması ve dolayısıyla bu klinik deneylere katılan hastaların beyinlerine ulaşan ilaç sayısının sınırlanmasıdır.14

Gerçekten de KBB'nin tüm küçük moleküllü ilaçların beyne ulaşmasını yaklaşık %98 engellediği ve beyne giren ilacın yalnızca bir kısmının mikrogliaya ulaştığı tahmin edilmektedir.15

Ayrıca PPAR, PPAR ailesindeki başka bir nükleer reseptördür.16 Lipid homeostazisinde ve inflamasyonun düzenlenmesinde rol oynar ve PPAR agonistlerinin mikroglia üzerinde anti-inflamatuar etkiler sergilediği de gösterilmiştir.

Nörogörüntüleme, ölüm sonrası doku analizi ve BOS biyobelirteçlerinin kullanıldığı klinik çalışmalar, BBB'nin AD ve Parkinson hastalığının yanı sıra diğer nörodejeneratif hastalıklarda da bozulduğuna dair kanıtlar sağlamıştır.

17. Nesil-4 hidroksil ile sonlanan poliamidoamin (G4-PAMAM-OH) dendrimerlerinin, birden fazla farklı nöroinflamasyon hastalığı modelinde sistemik uygulamadan sonra, bozulmuş KBB'yi doğal olarak atladığı ve hedefleme ligandlarına ihtiyaç duymadan aktif mikroglialarda biriktiği gösterilmiştir. kemirgenler, tavşanlar, köpekler ve insan olmayan primatlar dahil.18-28 G4-PAMAM-OH, önemli ölçüde sistemik olarak uygulanabilir ve Rett Sendromu gibi hafif BBB bozulması olan hastalık modellerinde BBB'yi geçebilir.29

Ek olarak, G4-PAMAM-OH'nin beyne alım derecesi, serebral palsili bir tavşan modelinde hastalığın ciddiyeti ile doğru orantılıdır.30 Hidroksil ile sonlanan dendrimerler, yüksek derecede invaziv, lokal dağıtımla karşılaştırıldığında, invaziv olmayan bir şekilde iletilme avantajına sahiptir. poli-εkaprolakton ve PEG gibi diğer nanopartiküller, negatif yüklü PAMAM dendrimerleri, kuantum noktaları ve polietilenimin (PEI) ve dekstran sülfattan oluşan nanoformülasyonlar ile yapılan önceki çalışmalarda gerekli olan kafatası.31-35

Ek olarak, bu hidroksil PAMAM dendrimerleri, ölçeklenebilirlikleri ve iyi tolere edilen in vivo güvenlik profilleri nedeniyle çeviri için ideal bir konumdadır.36–38 Pozitif klinik öncesi etkinlik verileri nedeniyle, a (G4-PAMAM-OH)-N- asetil-sistein birleşimi şu anda çocukluk çağı serebral adrenolökodistrofisi (NCT03500627) ve şiddetli koronavirüs hastalığı2019 (COVID-19) ile ilişkili inflamasyon (NCT04458298) açısından erken klinik deneylerde değerlendirilmektedir.

-4. nesil hidroksil ile sonlandırılmış PAMAMdendrimer'e bağlı tesaglitazar'ın (Tesa) bir dendrimer-ilaç konjugatını inceledik. Tesaglitazar, PPAR ve PPAR agonistlerinin faydalı etkilerini birleştiren güçlü bir PPAR/dual agonistidir. Dendrimere kovalent konjugasyon ve daha sonra salınım için bir karboksilik asit fonksiyonel grubu içerir.

Ek gitarlar geliştirilmiş ve klinik olarak test edilmiştir, ancak daha büyük PPAR/PPAR aktivite oranı, nispeten basit kimyasal yapısı ve güvenlik profili nedeniyle Tesa seçilmiştir.39-43

Tesa daha önce Amerika Birleşik Devletleri'nde tip 2 diyabet için faz III klinik denemelerine ulaşmıştı ancak doza bağlı toksisite nedeniyle başarısız oldu; bu durum kontrollü dendrimer dağıtımıyla gerekli uygulama dozunun azaltılmasıyla önlenebilir.39,40,44Tesa bir PPAR/dual agonisti, nöroinflamasyon bölgesindeki aktifleştirilmiş mikrogliaya hedeflenen iletimi oldukça faydalı olabilir.

Burada, bir dendrimer-tesaglitazar konjugatının (D-Tesa) sentezini ve karakterizasyonunu gösteriyoruz ve bu bileşiğin, mikrogliada 'M1'den M2'ye bir fenotip değişimini tetikleme ve floresan etiketli -amiloidin fagositozunu artırma yeteneğini gösteriyoruz.

Malzemeler ve yöntemler

Malzemeler

1-[3-(Dimetilamino)propil]-3-etil karbodiimid metiyodür(EDC), 4(dimetilamino)piridin (DMAP), CuSO4·5H2O,sodyum askorbat, heksinoik asit ve sığır serum albümini (BSA), Sigma Aldrich US'den satın alındı ​​ve teslim alındığı gibi kullanıldı (St Louis, MO).

Tesaglitazar, AstaTech Inc.'den (Bristol, PA) temin edildi. Etilendiamin çekirdekli PAMAM dendrimer (64 hidroksil uç grubuyla 4. nesil), metanol içinde bir çözelti halinde Dendritech Inc.'den (Midland, MI) alındı.

Dendrimer metanol içerisinde 4 derecede saklandı ve metanol kullanımdan önce buharlaştırıldı. Moleküler ağırlık sınırı (MWCO) 1 kDa olan bir diyaliz membranı Spectrum Laboratories Inc.'den (New Brunswick, NJ) satın alınmıştır.

Diğer tüm solventler, susuz formlarında alındığı gibi kullanıldı. Bakır(I), katalize edilmiş alkin-azid siklokatılma (CuAAC) tıklama reaksiyonları dışındaki tüm reaksiyonlar, inert nitrojen altında fırında kurutulmuş cam eşyalar içeren organik bir ortamda susuz koşullar altında gerçekleştirildi. atmosfer.

Hücre kültürü için: Dulbecco'nun Modifiye Eagle Ortamı (DMEM), fetal sığır serumu (FBS), penisilin-streptomisin (P/S), 0.05% trypsin-EDTA ve MTT reaktifi Invitrogen'den (Carlsbad, CA) elde edildi , ABD).

Griess reaktifi Promega'dan (Madison, WI) ve TNF-ELISA, R&D Systems'den (Minneapolis, MN) elde edildi. Analitik dereceli metanol Sigma-Aldrich'ten satın alındı. Tripan mavisi Corning'den (Manassas, VA, ABD) elde edildi.

D-Tesa konjugatları için sentez prosedürleri
Tetraetilen glikol mono azid (2), daha önce yayınlanmış protokol kullanılarak sentezlendi.45

Tesa-TEG-azidin (3) sentezi ve saflaştırılması.
Tesa (950 mg, 2.32 mmol), 10 ml dimetilformamid (DMF) içerisinde çözündürüldü. Karıştırılan bu çözeltiye DMF (1 mi) içindeki tetrametilen glikol mono-azid (2, 662,1 mg, 3,02 mmol) damla damla ilave edildi. Daha sonra reaksiyon karışımına DMAP (255.4 mg, 2.09 mmol) ve EDC (577.5 mg, 3.02 mmol) ilave edildi ve reaksiyon, nitrojen temizliği altında oda sıcaklığında 24 saat karıştırıldı.

Reaksiyon, ince tabaka kromatografisi ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) kullanılarak izlendi. Reaksiyon karışımı, 100 ml diklorometan (DCM) ile seyreltildi ve ham reaksiyon karışımı, bir ayırma hunisine kaydırıldı ve organik katman, ardından üç kez doymuş sodyum bikarbonat çözeltisiyle, ardından doymuş amonyum klorür çözeltisiyle ve son olarak da brinle yıkandı.

Organik katman daha sonra susuz sodyum sülfatla kurutuldu. Organik katmandaki çözücü daha sonra döner bir buharlaştırıcı kullanılarak çıkarıldı ve çözelti, 3 ml DCM içerisinde yeniden çözündürüldü ve berrak 3 elde etmek üzere çözücüler olarak etil asetat/heksan içeren bir gradyan yöntemi kullanılarak bir CombiFlash® kromatografi sistemi ile saflaştırılmak üzere silika jel üzerine emildi. -sarı yağ.

İstenilen saf ürün, yaklaşık %30-40 etil asetatta elüe edilir. (Verim: %70.) 1H NMR (500 MHz, CDCl3) 8 7,27 (d, J=8,6 Hz, 2H), 7,15(d, J=1,9 Hz, 2H), 7,08 (d, J=8,6 Hz, 2H), 6,73 (d, J=8,6 Hz,2H), 4,25–4,14 (m, 2H), 4,07 (t, J {{ 33}},8 Hz, 2H), 3,94 (dd, J =7,8, 5,2 Hz, 1H), 3,67–3,47 (m, 14H), 3,30 (dd, J=8,7) , 3,8 Hz,2H), 3,06 (s, 3H), 3,02 (t, J=6,7 Hz, 2H), 2,91–2,84 (m, 2H),1,08 (t, J=7 .0 Hz, 3H).ESI-MS: teorik C28H39N3O10S: 609.24, elde edilen (M + 1):610.13.

D-YNE'nin sentezi ve saflaştırılması (5).

(480 mg, 4,22 mmol), 20 ml susuz DMF içerisinde karıştırılan bir G4-PAMAM-OH (2,5 g, 0,176 mmol) çözeltisine ilave edildi. Bu karışıma DMAP (430 mg, 3,52 mmol) ve EDC (1 g,5,28 mmol) ilave edildi.

Reaksiyon karışımı, oda sıcaklığında 24 saat boyunca nitrojen temizliği altında karıştırıldı. Reaksiyonun tamamlanması üzerine reaksiyon karışımı, 1000 MWCO'luk bir diyaliz tüpüne aktarıldı. DMF diyalizi, 24 saat süreyle gerçekleştirildi ve DMF, yaklaşık her altı saatte bir değiştirildi.

Daha sonra 24 saat boyunca deiyonize (DI) su ile diyaliz uygulandı ve su yaklaşık altı saatte bir değiştirildi. Son olarak, elde edilen diyaliz tüpü içeriği 48 saat boyunca liyofilize edilerek beyaz, yumuşak bir toz elde edildi.(Verim: %61.) 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 8,10–7,67 (m, dendrimerinternal amid H), 4,72 (s, dendrimer yüzeyi OH), 4,01 (t,ester –CH2), 3,32 (m, dendrimer –CH2), 3,06 (m, dendrimerand bağlayıcı –CH2), 2,85–2,58 (m, dendrimer –CH2), 2,56–1,89(m, dendrimer ve bağlayıcı –CH2), 1,78–1,61 (m, bağlayıcı –CH2). D-Tesa'nın (6) sentezi ve saflaştırılması.

Tesa-TEG-azid (3,177,8 mg, 0,3{{10}}3 mmol), karıştırılan bir D-YNE(5, 35{{2{{27}) karışımına ilave edildi }}} mg, 0,023 mmol) 5 ml 1:1 tetrahidrofuran (THF) ve su ile 0,5 ml DMF karışımı içinde, mikrodalga reaktörde güvenli 20 ml'lik bir şişe içinde karıştırıldı. CuAAC click reaksiyonu için reaksiyon karışımına bakırsülfat pentahidrat (11,6 mg, 0,0467 mmol) ve (+)-sodyum-Laskorbat (9,3 mg, 0,0467 mmol) ilave edildi.

Şişe kapatıldı ve reaksiyon kabı daha sonra bir Biotage® Başlatıcı mikrodalga reaktörüne yerleştirildi ve 20 W mikrodalga radyasyonu altında 8 saat boyunca 50 derecede karıştırılarak reaksiyona sokuldu. Reaksiyon karışımı 1000 MWCO diyaliz tüpüne aktarıldı ve DMF diyalizi 24 saat boyunca gerçekleştirildi; DMF, yaklaşık olarak her 4 saatte bir taze solvent ile değiştirildi.

Daha sonra diyaliz tüpünün içeriği afalkon tüpüne aktarıldı ve eşdeğer miktarda DI su ilave edildi. Ayrıca şahin tüpünün içeriğine 200 µl etilendiamintetraasetik asit disodyum tuzu çözeltisi ilave edildi.

Bu karışım daha sonra yeni bir 1000 MWCO diyaliz tüpüne yerleştirildi ve 12 saat süreyle 1000 ml DIsu içerisinde EDTA çözeltisi ilave edilerek diyaliz yapıldı ve ardından 12 saat süreyle su diyalizi yapıldı.

Karışım daha sonra 48 saat boyunca liyofilize edildi ve beyaz, yumuşak bir toz elde edildi. (Verim: %64.) 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 8,2–7,6 (m, dendrimer internalamid H), 7,36 (d, Tesa ArH), 7,21 (d, Tesa ArH), 7,03 (d, TesaArH), 6,76 (d, Tesa ArH), 4,37 (s, Tesa H), 4,18–4,04 (m, bağlayıcı H), 3,96 (dd, Tesa ve bağlayıcı H), 3,70 (m, Tesa ve bağlayıcı H) ,3,58–3,14 (m, dendrimer –CH2), 3,14–2.86 (m, dendrimer–CH2), 2,87–2,49 (m, dendrimer ve bağlayıcı –CH2), 2,25 (m, dendrimer –CH2) , 1,82–1,67 (m, bağlayıcı –CH2), 0,97 (t, Tesa –CH3).

Karakterizasyon teknikleri

Nükleer manyetik rezonans (NMR). NMR spektrumları oda sıcaklığında bir Bruker 500 MHz spektrometresine kaydedildi. Proton kimyasal kaymaları (δ) ppm cinsinden rapor edilir.

1H NMR, dendrimerin dahili amid protonlarının δ 7,6-8,2 ppm'deki zirvelerini, δ 7,36-6,76 ppm'deki Tesa'nın aromatik protonları ve metil protonları ile karşılaştırarak proton entegrasyon yöntemiyle her bir D-Tesa molekülüne bağlı Tesa moleküllerinin sayısını belirlemek için kullanıldı. Alifatik bölgede Tesa. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC).

a1525 ikili pompa, bir Hat içi gaz giderici AF, bir 717 plus otomatik örnekleyici, bir 2998 fotodiyot dizisi detektörü ve Waters Empower yazılımıyla arayüzlenen bir 2475 çoklu floresans detektörü ile donatılmış HPLC (Waters Corporation, Milford, Massachusetts) kullanıldı.

5 μm parçacık boyutuna, 25 cm uzunluğa ve 4,6 mm iç çapa sahip bir Simetri C18 ters faz kolonu (Tosoh, Japonya) kullanıldı. Bileşikler PDA dedektörleri kullanılarak 210 nm ve 254 nm'de izlendi.

Çözücü A, %0.1 trifloroasetik asit (TFA) içeren HPLC dereceli suydu ve Çözücü B, %5 su ve %0.1 TFA içeren asetonitril (ACN) idi. Kullanılan yöntem 1{'de başladı. {7}}0 : 0 (ACN: su), 5 dakikada 10: 90'a (su: ACN) düştü, 15 dakika bu polaritede kaldı ve 5 dakikada 100 : 0'a (ACN: su) döndü dakika.Akış hızı 1 ml dk-1'de tutuldu.Kütle spektroskopisi.

ESI-MS, solvent sistemi olarak asetonitril/su (9:1) kullanılarak BrukermicroTOF-II kütle spektrometresinde gerçekleştirildi. Ampirik formülü doğrulamak için protonlanmış tepeler [M + nH]n+ veya eklentiler [M + nX]n+ (X=Na, K veya NH4) şeklindeki moleküler iyonlar kullanıldı.

Dinamik ışık saçılımı ve ζ potansiyeli. Parçacık boyutunu ve ζ-potansiyel dağılımını belirlemek için 50 mW He-Ne lazer (633 nm) ile donatılmış bir Zetasizer NanoZS (Malvern Instrument Ltd, Worchester, Birleşik Krallık) kullanıldı. D-Tesa, DLS için 0,2 mg ml-1 konsantrasyonuna kadar DI su içinde ve ζ potansiyeli için 10 mM sodyum klorür içinde 0,1 mg ml-1 konsantrasyonuna kadar çözüldü.

Ölçümler daha önce anlatıldığı gibi 173 derecelik saçılma açısı kullanılarak 25 derecede yapıldı.27,46İlaç salım çalışması. D-Tesa, lizozomal koşulları taklit etmek için fosfat tampon çözeltisi (pH 7.4) tomimik plazma koşulları veya sodyum sitrat çözeltisi (pH 5.5) içerisinde 1 mg ml-1 konsantrasyonunda çözüldü.

Domuz karaciğerinden (Sigma Aldrich'ten) elde edilen esterazlar, salım çalışmasının başlangıcında sodyum sitrat çözeltisine ilave edildi ve çalışma boyunca yaklaşık olarak her 3 günde bir yenilendi.

Her bir flakon 15 ml numune içermekteydi ve deney süresince 37 derecede sürekli olarak çalkalandı. Farklı zaman noktalarında, her pH'tan 200 ul'lik kopya numuneler toplandı ve ardından esteraz aktivitesi, 200 ul metanol eklenerek söndürüldü. Sıfır saatlik zaman noktası numuneleri kontrol görevi gördü.

Numuneler herhangi bir hidrolizi daha da önlemek için -80 derecede saklandı. Numuneler ayrıca HPLC ile analiz edildi ve serbest ilaç zirvesi için eğrinin altındaki alan (210 nm'de) hesaplandı. Eğrinin altındaki alan, serbest Tesa'nın bilinen konsantrasyonlarının HPLC'de 210 nm'de çalıştırıldığı bir kalibrasyon eğrisi kullanılarak salınan ilaç miktarıyla ilişkilendirildi.

For more information:1950477648nn@gmail.com