Dendrimer-tesaglitazar Konjugatı, Mikroglia'da Fenotip Değişimini İndükler ve -amiloid Fagositozunu† Geliştirir Bölüm 3

D-Tesa patojenik proteinlerin uzaklaştırılmasından sorumlu enzimlerin ekspresyonunu arttırdı

İnsülin parçalayıcı enzim (Ide) ve matris metaloproteaz 9(MMP9), mikroglia tarafından salgılanan, hücre dışı -amiloid ve -sinükleini parçalayan enzimlerdir.71,72 D-Tesa tedavisi, Ide 3.1-kat ekspresyonunu önemli ölçüde arttırdı (p < 0.001) ve yalnızca LPS ile tedavi edilen kontrollerle karşılaştırıldığında (Şekil 6A ve B) MMP9 ekspresyonunu artırma eğilimi (1.8-kat artış, p=0.057) vardır.

Son yıllarda giderek daha fazla çalışma, insülini parçalayan enzimler ile hafıza arasında yakın bir bağlantı olduğunu göstermiştir. Bu keşif bize hafızanın oluşum ve bakım mekanizmasını daha fazla araştırmak için değerli ipuçları sağlıyor.

İnsülin parçalayıcı enzim, ana işlevi kan şekeri dengesini korumak için insülini parçalamak olan önemli bir enzimdir. Ancak son zamanlarda yapılan araştırmalar, insülini parçalayan enzimin sadece metabolik bir rol oynamadığını, aynı zamanda beyindeki nöronların büyümesini ve onarımını da doğrudan etkilediğini ve hafızanın korunmasında önemli bir rol oynadığını göstermiştir.

Birçok çalışma, insülini parçalayan enzim düzeyi ne kadar yüksek olursa hafızanın da o kadar iyi olduğunu göstermiştir. Bunun nedeni, insülini parçalayan enzimlerin nöronların büyümesini ve onarımını teşvik edebilmesi ve böylece beynin öğrenme ve hafıza yeteneğini geliştirebilmesidir. Ek olarak, insülini parçalayan enzimler nöronlar arasındaki bağlantıyı da destekleyebilir, böylece hafızanın ilişkilendirilmesini ve kalıcılığını arttırabilir.

İnsülin parçalayıcı enzimlerin hafızadaki önemli rolü klinik tıp alanında yaygın olarak kullanılmaktadır. Araştırmacılar, insülini parçalayan enzimlerin solunmasıyla yalnızca hafızanın iyileştirilemeyeceğini, aynı zamanda bilişsel yeteneklerin ve depresif belirtilerin de iyileştirilebileceğini bulmuşlardır.

Kısacası insülini parçalayan enzimler ile hafıza arasındaki bağlantı, hafızanın biyolojik mekanizmasını incelemek için bize değerli ipuçları sağlayan çok önemli bir alandır. Gelecekteki araştırmalar insülini parçalayan enzimlerin işlevini ve rolünü daha fazla araştıracak, hafızanın oluşumu ve depolama mekanizmasını daha iyi anlamamıza yardımcı olacak ve insan beyninin öğrenme ve hafıza yeteneğini geliştirmek için daha iyi bir temel sağlayacak. Belleği geliştirmemiz gerektiği görülebilir ve Cistanche hafızayı önemli ölçüde geliştirebilir çünkü Cistanche aynı zamanda hafıza ve öğrenme için çok önemli olan asetilkolin ve büyüme faktörlerinin seviyelerini arttırmak gibi nörotransmiterlerin dengesini de düzenleyebilir. Ayrıca Cistanche kan akışını iyileştirebilir ve oksijen dağıtımını destekleyebilir, bu da beynin yeterli beslenme ve enerji almasını sağlayarak beyin canlılığını ve dayanıklılığını artırır.

Belleğinizi geliştirmenin yollarını bilin'e tıklayın

Ücretsiz Tesa, İde 2-kat ifadesini önemli ölçüde arttırdı (p=0.011) ve MMP92-katını anlamlı olmayan bir şekilde arttırdı (p=0.35) (Şekil 6A) ve B). Nörodejeneratif hastalıklarda M2 mikroglia, -amiloid, -sinüklein ve diğer patojenik proteinleri enzimatik bozunma veya fagositoz yoluyla ortadan kaldırabilir ve D-Tesa, bu süreçlerde yer alan proteinleri (örn. Ide ve MMP9) yukarı düzenler.71-73.

İdeekspresyonun AD ve PD patolojisinde aşağı regüle edildiği ve sonuçlarımızla tutarlı olarak PPAR agonistleri tarafından yukarı regüle edildiği bilinmektedir.

71,72 İşlevsel olarak, Ide düzeylerinde yalnızca 2- kat artışın amiloid birikimini ve nöron ölümünü in vivo azalttığı gösterilmiştir.74,75 Bu nedenle, D-Tesa tarafından gözlemlenen Ide'de 3- kat artış ve freeTesa ile Ide'nin 2-kat artması in vivo terapötik açıdan etkili olabilir.

D-Tesa -amiloidin fagositozunu artırır

CD36, -amiloidin fagositozunu ve bozunmasını kolaylaştıran bir mikroglial temizleyici reseptördür.73 AD'deki aşağı regülasyonu, -amiloidin uzaklaştırılmasının azalmasıyla sonuçlanır, ancak PPAR aktivasyonu ile yukarı doğru düzenlenir.

Hem D-Tesa hem de serbest Tesa, yalnızca LPS'ye maruz kalan hücrelerle karşılaştırıldığında CD36 ekspresyon düzeylerini önemli ölçüde artırdı (D-Tesa ve serbest Tesa için p < 0.0001'e karşılık p < 0,005) , sırasıyla), ancak D-Tesa, serbest Tesa'dan çok daha etkiliydi (D-Tesa ve serbest Tesa için sırasıyla 6-kat artışa karşı 2.{8-kat artış, p < 0,0005) (Şekil 6C) ).

Sonuçlarımız pioglitazon (başka bir PPAR agonisti) ile yapılan ve -amiloidin mikroglial fagositozunun PPAR ve CD36-bağımlı bir mekanizma aracılığıyla gerçekleştiğini gösteren önceki çalışmalarla tutarlıdır.73

D-Tesa tedavisinden CD36'nın yukarı regülasyonunun bu hücrelerin artan fagositik yeteneği ile ilişkili olup olmadığını araştırmak için, -amiloidin fonksiyonel bir fagositoz tahlilini gerçekleştirdik. 73

Kısaca, hücreleri önceki in vitro analizlerde yaptığımız gibi tedavi ettikten sonra, iki saat boyunca hücrelere floresan etiketli -amiloid1-42 uyguladık, hücreleri yıkadık ve ardından -amiloidin hücresel alım boyutunu araştırmak için akış sitometrisi gerçekleştirdik. D-Tesa hem -amiloidi fagosite eden hücrelerin yüzdesini hem de hücre başına içselleştirilen ortalama -amiloid miktarını arttırdı (Şekil 7A ve B).

Buna karşılık, serbest Tesa, -amiloidin fagositozunda hiçbir iyileşme sağlamadı. D-Tesa'nın Tesa'ya kıyasla üstün etkileri muhtemelen dendrimer konjugasyonunun mümkün kıldığı gelişmiş hücresel içselleştirmeye atfedilebilir.

Bu, floresan etiketli G4-PAMAM-OH ile tedavi edilen BV2 hücrelerinin %95'inden fazlasının dendrimeri otuz dakika içinde içselleştirdiğini ve dendrimeri içselleştirmeye en az 24 saat boyunca devam ettiğini ortaya koyan önceki çalışmayla tutarlıdır.76

Benzer şekilde, küçük molekül minosiklin'in floresan etiketli G4-PAMAM-OH'ye konjugasyonu, BV2 hücrelerinin %99'unun floresan etiketli dendrimer-ilaç konjugatını 3 saat içinde içselleştirdiğini gösterdi.26 Ayrıca konjugatın nitrikoksit düzeylerini daha iyi azalttığını da gösterdiler. Sonuçlarımızla tutarlı olarak BV2 hücrelerini LPS ile tedavi ettikten sonra serbest ilaca geçtik.

D-Tesafagositoz ile tedavi edilen hücreler, LPS ile tedavi edilen kontrol hücrelerine göre 1.9-kat daha fazla -amiloid aldı (p < 0.001), bu da 2.5-kat artışla karşılaştırılabilir Yamanaka ve ark.73 tarafından rapor edilen, pioglitazon ile tedavi edilen sıçan primer mikroglial hücreleri tarafından -amiloid fagositozu. Önceki çalışmadaki -amiloid fagositozunun biraz daha yüksek olması, hücrelerini bizim yaptığımız gibi LPS ile birlikte tedavi etmemelerinden veya birincil mikroglia'nın PPAR'ı eksprese etmesinden kaynaklanıyor olabilir. bu çalışmada kullanılan BV2 hücrelerinden daha yüksek bir seviye.77

Bu nedenle, çalışmamızdaki in vitro deneylerden tahmin edilenden daha düşük bir D-Tesa dozu, in vivo çalışmalarda ve insanlarda muhtemelen etkili olabilir, çünkü BV2 hücrelerinin, birincil mikrogliadan daha düşük seviyelerde PPAR ifade ettiği bilinmektedir.77

Mikroglia birçok nörodejeneratif hastalıkta rol oynamıştır ve BBB, mikroglia fenotipini proinflamatuar, nörotoksik M1 fenotipinden antiinflamatuar, nöroprotektif M2 fenotipine dönüştürebilen birçok ilacın beyindeki terapötik seviyelere ulaşmasını engellemiştir.5,6, 14,15

Örneğin, iki PPAR agonisti pioglitazon ve rosiglitazonun her biri, mikroglia fenotipini değiştirme yetenekleri nedeniyle Alzheimer hastalığı için faz III klinik denemeler yoluyla araştırıldı, ancak muhtemelen KBB boyunca zayıf aktarım nedeniyle başarısız oldu.13,14 Bu nedenle, değiştirmeye yönelik klinik ilgi vardır. Nörodejeneratif hastalıklarda mikroglia fenotipi.

Böyle bir yaklaşım, ilacın mikrogliaya bir yanıt oluşturmak için yeterli seviyelerde verilmesini gerektirir. Bu amaçla, G4-OH-PAMAM dendrimerlerinin sistemik enjeksiyondan sonra birçok hayvan modelinde ilaçları mikrogliaya ilettiği gösterilmiştir ve sonuç olarak şu anda ccTLD (NCT03500627) ve şiddetli COVID tedavisi için klinik deneylerde değerlendirilmektedir. -19 ilişkili inflamasyon (NCT04458298).18–28

Mikroglial fenotipi değiştirmenin yararlı etkilerini mikrogliaya ilaç verme yeteneği ile birleştirmek için tesaglitazar'ı (bir PPAR / ikili agonist) bir G4-OH-PAMAMdendrimer'e bağladık (Şekil 1-3). D-Tesa'nın, M1 mikroglia fenotipini bir M2 fenotipine doğru değiştirebildiğini (Şekil 4 ve 5) ve bunun zararlı reaktif oksijen türlerinin salgılanmasında bir azalmaya yol açtığını gösterdik.

Ayrıca, D-Tesa ile tedavi edilen mikrogliaların, -sinüklein ve -amiloid gibi patolojik proteinleri parçalayan enzimlerin ekspresyonunu arttırdığını ve ayrıca fonksiyonel bir analizde -amiloidin fagositozunu yukarı regüle ettiğini gösterdik (Şekil 6 ve 7).

Her ne kadar D-Tesa'nın BBB'yi bypass etme ve mikrogliada birikme yeteneğini gösteren veriler sunmasak da, daha önce benzer ilaç yüklemesi, boyutu ve zeta potansiyeline sahip G4-OH-PAMAM ilaç konjugatlarının mikrogliadan geçme yeteneğine sahip olduğunu göstermiştik. KBB'yi bozuyor ve intravenöz uygulamadan sonra mikroglia'da birikiyor.26,36,52

Bu sonuçlar, birden fazla nörolojik hastalığın tedavisi için D-Tesa'nın daha da geliştirilmesini desteklemektedir. Bu yazıda Alzheimer ve Parkinson hastalıklarına odaklanırken, D-Tesa, birden fazla nörolojik hastalıkta klinik çeviri potansiyeline sahiptir. Çoklu nörodejeneratif hastalıkların patolojisinde mikroglia'nın benzer rolü nedeniyle, PPAR agonisti pioglitazon da araştırılmıştır veya şu anda Parkinson hastalığı,78 ALS,79 adrenomiyelonöropati (NCT03864523), multipl skleroz (NCT03109288) ve hematom için faz II klinik çalışmalarda araştırılmaktadır. intraserebral kanamada çözünürlük (NCT00827892).

Bu klinik denemeler de pioglitazonun BBB boyunca zayıf iletimi nedeniyle başarısız olursa, D-Tesa bu dağıtım engelinin üstesinden gelebilir ve bu hastalıklara sahip hastaları tedavi edebilir.

Diğer gruplar, PPAR agonistlerinin makrofajlara verilmesini geliştirmek için nanopartiküllerden yararlandı, ancak bu agonistleri mikrogliaya ulaştırmaya çalışmadılar. Osinski ve arkadaşları, leptin eksikliği olan bir erkek obezite modelinde Tesa yüklü lipozomların çoğunlukla iç organ beyaz yağındaki makrofajlar tarafından alındığını gösterdi.80

Ayrıca Tesa yüklü lipozomların M1 işaretleyicisi Mcp-1'nin ifadesini değiştirmediğini, ancak M2 işaretleyicisi Arg1'in ifadesini artırdığını, serbest Tesa ile tedavinin toplam M1 makrofaj sayısını ve Mcp{{6'nın ifadesini azalttığını da gösterdiler. }} ve Arg1'in ifadesini artırmadı.

Nakashiro ve ark. babaoskleroz bağlamında makrofajlara pioglitazon (bir PPAR agonisti) iletmek için poli(laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) nanoparçacıklarını kullandı.81

İn vivo olarak PLGA-pioglitazonun kandaki bağışıklık hücrelerinin seviyelerini azalttığını gösterdiler. LPS ve interferon- ile tedavi edilen birincil kemik iliğinden türetilen makrofajlarda, PLGA-pioglitazonun IL-4 ve IL-10'yi (M2 belirteçleri) artırdığını ve IL-6 veya TNF düzeylerini azaltmadığını buldular.

Bulguları bizimkine benzer; M2 belirteçleri nanopartikül-PPAR agonisti tedavisiyle artarken IL-6 ve TNF- seviyeleri azalmadı. Di Mascolo ve ark. rosiglitazon (başka bir PPAR agonisti) sağlamak için PLGA-polivinil alkol nanopartikülleri kullanıldı.82

Laboratuvar ortamında nanoparçacık-ilaç komplekslerinin kemik iliği kaynaklı makrofajlarda iNOS, TNF- ve IL-1 ekspresyonunu azalttığını gösterdiler. Onlar hücrelerini LPS ile uyarmadan önce nanoparçacık ilacı ile ön işleme tabi tutarken, biz hücreleri D-Tesa ile işleme tabi tutmadan önce LPS ile ön işleme tabi tuttuk; bu da TNF- ve IL-1'de bir azalma gözlemlemememizin bir nedeni olabilir, ancak aynı zamanda gözlemledik iNOS ifadesinde azalma.

Çözüm

Şu anda pek çok nörodejeneratif hastalık için patolojiyi değiştiren bir tedavi mevcut değil ve nüfus yaşlanmaya devam ettikçe, bu hastalıkların tedavi yaygınlığı ve maliyeti artmaya devam edecek ve bu da geliştirilmesi gereken bir çözüme olan acil ihtiyacın altını çizecek. Son zamanlarda pro-inflamatuar M1 mikrogliaları, çoklu nörodejeneratif hastalıkların patolojisinde kritik öneme sahiptir.

Sonuç olarak, mikroglia'da 'M1'den M2'ye fenotip değişimini tetikleyebilen ilacın kan-beyin bariyeri boyunca iletilebilmesi, başta Alzheimer ve Parkinson hastalığı olmak üzere birçok hastalık için terapötik potansiyele sahiptir.

D-Tesa, nörotoksik maddelerin mikroglial salgılanmasını azaltmak için sistemik uygulamadan sonra mikrogliaya 'M1'den M2'ye kadar' indükleyici bir ilaç vermek ve aynı zamanda beyindeki patojenik proteinlerin bozunmasını ve fagositozunu artıran bir anti-inflamatuar durumu indüklemek üzere tasarlanmıştır. Yüksek verimli tıklama kimyası yaklaşımını kullanarak D-Tesa'yı başarıyla sentezledik.

İlaç dendrimere, lizozomal koşullarda hücre içi olarak bölünebilen bir ester bağı yoluyla bağlanır; lizozomal koşullar altında ilk 48 saatte Tesa'nın yaklaşık %60'ı salınır.

D-Tesa'nın, M1'den M2a/M2b/M2c'ye fenotip değişimini indüklemede in vitro olarak Tesa'dan daha üstün olduğu gösterilmiştir; bu, nitrik oksit salgısının azalmasına, -sinüklein ve -amiloid parçalayıcı enzimlerin ekspresyonunun artmasına ve -amiloidin fagositozunun artmasına neden olur.

Böylece D-Tesa, dendrimerin faydalı dağıtım özelliklerini Tesa'nın M1'den M2'ye geçiş özellikleriyle birleştirir. Mikroglia'nın ortak rolü ve M1'den M2'ye fenotip değişimini tetiklemenin ortak terapötik faydası nedeniyle D-Tesa, hastalık ilerlemesinin doğru aşamasında uygulandığında birçok nörolojik bozukluğu tedavi etme potansiyeline sahiptir.

Yazar katkıları

LD, AS, KL, RS, SK ve RMK deneyleri kavramsallaştırdı. LD, AS ve RS, dendrimer-ilaç konjugatının sentezini ve karakterizasyonunu gerçekleştirdi. LD, KL ve JJ hücre deneylerini gerçekleştirdi. LD ve K. L. istatistikleri gerçekleştirdi. LD ve AS taslağı yazdılar ve tüm yazarlar taslağı düzenlediler.

Çıkar çatışmaları

RMK ve SK, nörolojik hastalıklarda mikrogliaya hedeflenen dağıtım için hidroksil sonlu dendrimerin kullanılmasının yanı sıra bu yazıda açıklanan dendrimer teknolojisiyle ilgili patentlerin ortak mucitleridir.

Platformun klinik gelişimine öncülük eden Ashvattha Therapeutics, Orpheris Inc. ve RiniSight Inc. şirketlerinin kurucu ortaklarıdırlar. SK ve RMK, AshvatthaTherapeutics Inc.'in Yönetim Kurulu Üyeleridir. RS, şu anda AshvatthaTherapeutics'te çalışmaktadır ve şirkette hisse sahibidir; işR. S.'nin bu makale için yaptığı performans Ashvattha'ya katılmadan önce yapılmıştı. Çıkar çatışması JohnsHopkins Üniversitesi tarafından yönetilmektedir.

Teşekkür

In vitro deneylere ilişkin faydalı tartışmalar için Elizabeth Smith Khoury'ye teşekkür ederiz. Bu proje, JohnsHopkins ve NICHD'den (bağış numarası HD076901) (RMK) Patz Distinguished Professorship Endowment tarafından finanse edildi. Sony akış sitometresine erişim için Wilmer Core Grant for Vision Research, Microscope ve Core Module'e (bağış numarası EY001865) teşekkür ederiz.

Servier Medical Arts'a, grafiksel özet oluşturmak üzere değiştirilen Yaratıcı Ortak Attribution 3.0 Genel Lisans kapsamında lisanslanan resim koleksiyonlarını (http://smart.servier.com/) kullandığı için teşekkür ederiz.

Referanslar

1 CL Gooch, E. Pracht ve AR Borenstein, Amerika Birleşik Devletleri'ndeki nörolojik hastalığın yükü: Bir özet rapor ve eylem çağrısı, Ann. Neurol., 2017, 81, 479–484.

2 JL Cummings, T. Morstorf ve K. Zhong, Alzheimer hastalığı ilaç geliştirme hattı: az sayıda aday, sık görülen başarısızlıklar, Alzheimer Res. Ter., 2014, 6, 37.

3 P.-P. Liu, Y.Xie, X.-Y. Meng ve J.-S. Kang, Alzheimer hastalığına yönelik hipotezlerin ve klinik araştırmaların tarihçesi ve ilerlemesi, Sinyal İletimi Hedefli Ther., 2019, 4, 1–22.

4 C. Soto ve S. Pritzkow, Nörodejeneratif hastalıklarda protein yanlış katlanması, toplanması ve konformasyonel suşlar, Nat. Neurosci., 2018, 21, 1332–1340.

5 VH Perry ve C. Holmes, Nörodejeneratif hastalıkta Mikroglial hazırlama, Nat. Rev. Neurol., 2014, 10, 217–224.

6 Y. Tang ve W. Le, Nörodejeneratif Hastalıklarda M1 ve M2Mikroglia'nın Farklı Rolleri, Mol. Neurobiol.,2016, 53, 1181–1194.

7 MW Salter ve B. Stevens, Microglia, beyin hastalıklarında merkezi oyuncular olarak ortaya çıkıyor, Nat. Med., 2017, 23, 1018–1027.

8 S. Krasemann, ve diğerleri, TREM2-APOE Yolu, Nörodejeneratif Hastalıklarda Disfonksiyonel Mikrogliaların Transkripsiyonel Fenotipini Yönlendiriyor, Bağışıklık, 2017, 47, 566–581.e9.

9 Q. Zhao, ve diğerleri, Kronik hafif stresli bir fare modelinde pioglitazonun antidepresan benzeri etkileri, mikroglial aktivasyon fenotiplerinin PPAR aracılı değişimi ile ilişkilidir, J. Neuroinflammation, 2016, 13, 259.

10 L. Wen, ve diğerleri, Peroksizom Proliferatörüyle Aktive Edilen Bir Reseptörde Mikroglia'nın M2 Fenotipine Polarizasyonu Gama Bağımlı Şekil, Farelerde Travmatik Beyin Hasarının Neden Olduğu Aksonal Hasarı Azaltır, J. Neurotrauma,2018, 35, 2330–2340.

11 W. Cai ve diğerleri, Peroksizom proliferatörüyle aktifleştirilen reseptör (PPAR): CNS hasarı ve onarımında ana kapı bekçisi, Prog. Neurobiol., 2018, 163–164, 27–58.12 B. Brakedal, ve diğerleri, Glitazone kullanımı, Parkinson hastalığı riskinin azalmasıyla ilişkilidir, Mov. Disord., 2017, 32, 1594–1599.

For more information:1950477648nn@gmail.com