Dendrimer-tesaglitazar Konjugatı, Mikroglia'da Fenotip Değişimini İndükler ve -amiloid Fagositozunu† Geliştirir Bölüm 2

İn vitro biyolojik analizler

Hücre kültürü. BV2 fare mikroglial hücre dizisi, Michigan Çocuk Hastanesi Hücre Kültürü Tesisi'nden elde edildi.

Son yıllarda bilim insanları hücre kültürünün insan hafızasıyla yakından ilişkili olduğunu buldu. Çalışmalar, hücre kültürünün incelenmesi yoluyla hafızadaki ve öğrenme sürecindeki moleküler mekanizmaların keşfedilebileceğini, böylece insanın bilişsel yeteneğinin ve hafızasının geliştirilebileceğini göstermiştir.

Hücre kültürü, biyolojik hücrelerin in vitro koşullar altında büyümesi ve çoğalması için gerekli besinleri içeren bir kültür ortamına yerleştirilmesi işlemini ifade eder. Hücreler yaşamın temel birimleridir ve hücre kültürü, bilim adamlarına hücre davranışını ve yaşam aktivitelerini incelemek için bir platform sağlar. Bilim insanları hücrelerin incelenmesi yoluyla nöron büyümesi ve sinaptik bağlantılar hakkında birçok bilgi keşfettiler. Bu bulgular yalnızca insanların beynin nasıl çalıştığını daha iyi anlamalarına yardımcı olmakla kalmıyor, aynı zamanda yeni tedavi ve ilaçların geliştirilmesine de yardımcı oluyor.

Son yıllarda yapılan araştırmalar hücre kültürünün insan hafızasıyla da yakından ilişkili olduğunu göstermiştir. Bilim adamları, insan hafızasının oluşumu ve bakımının çok sayıda moleküler düzenleme ve sinyal iletimi gerektirdiğini bulmuşlardır. Bu sinyal dağıtım ve düzenleme mekanizmaları, hücre kültüründeki mekanizmalarla birçok benzerliğe sahiptir. Bilim insanları, hücre kültüründeki sinyal dağıtım ve düzenleme mekanizmalarını inceleyerek insan hafızasını ve öğrenme mekanizmalarını daha iyi anlayabilirler.

Ayrıca bazı çalışmalar hücre kültürünün insan hafızasını ve öğrenme yeteneğini belirli şekillerde geliştirebileceğini de göstermiştir. Örneğin, "elektriksel stimülasyon" adı verilen bir yöntem kullanılarak hücrelerin aktivitesi ve nöronlar arasındaki bağlantı uyarılabilir, böylece insanın bilişsel yeteneği ve öğrenme etkileri geliştirilebilir. Bu yöntemin henüz laboratuvar araştırması aşamasında olmasına rağmen gelecekte yeni bir bilişsel eğitim yöntemi olması bekleniyor.

Özetle hücre kültürü ile insan hafızası arasında yakın bir bağlantı vardır. Hücrelerin incelenmesi yoluyla insanın bilişsel mekanizmasını ve hafıza mekanizmasını daha iyi anlayabilir ve ayrıca yeni tedavi yöntemleri ve bilişsel eğitim yöntemlerinin geliştirilmesine yardımcı olabiliriz. Gelecekte hücre kültürü teknolojisinin insanlığa katkısını sabırsızlıkla bekleyelim! Belleği geliştirmemiz gerektiği görülebilir ve Cistanche hafızayı önemli ölçüde geliştirebilir çünkü Cistanche'nin antioksidan, anti-inflamatuar ve anti-aging etkileri vardır, bu da beyindeki oksidasyonu ve inflamatuar reaksiyonları azaltmaya yardımcı olabilir, böylece sağlığı korur. sinir sistemi. Ek olarak Cistanche, sinir hücrelerinin büyümesini ve onarımını da destekleyerek sinir ağlarının bağlantısını ve işlevini geliştirebilir. Bu etkiler hafızayı, öğrenme yeteneğini ve düşünme hızını geliştirmeye yardımcı olabilir ve ayrıca bilişsel işlev bozukluklarının ve nörodejeneratif hastalıkların ortaya çıkmasını önleyebilir.

Belleği güçlendirmek için ekleri bil'e tıklayın

BV2 hücreleri, %10 ısıyla inaktive edilmiş fetalbovin serumu (HI FBS) ve %1 penisilin/streptomisin (P/S) ile 37 derecede ve %5 CO2 içeren Dulbecco Modified EaglesMedium (DMEM) ortamında kültürlendi.

Hücreler kültür şişesinde birleştiğinde, hücreler %0,05% trypsin-etilendiamin tetra-asetik asit (EDTA) kullanılarak yeni bir şişeye aktarıldı. Deneyler için BV2 hücreleri, %5 HIFBS ve %1 P/S içeren DMEM'ye ekildi. 24-48 saat sonra hücreler, birçok nörolojik hastalıkta mevcut olan nöroinflamatuar ortamı simüle etmek için hücrelerin pro-inflamatuar (M1) fenotipe girmesine izin vermek için 3 saat boyunca 100 ng ml-1 (300 EU ml-1) LPS ile uyarıldı.

Hücreler daha sonra 48 saat boyunca değişen konsantrasyonlarda LPS ve serbest Tesa veya D-Tesa ile birlikte işleme tabi tutuldu, ardından süpernatan ve hücreler işlenmek üzere toplandı. Hiçbir zaman LPS ile tedavi edilmeyen hücreler (LPS yok) ve her zaman yalnızca LPS ile tedavi edilen hücreler (yalnızca LPS) kontrol grupları olarak görev yaptı. Serbest Tesa ve D-Tesa stok çözeltileri, poli(eter sülfonlar) 0.2 µm filtreler kullanılarak sterilize edildi.

D-Tesa hücre ortamında çözünebilirdi. Tesa, %0.1 (h/h)'den daha düşük nihai konsantrasyonda dimetilsülfoksit (DMSO) kullanılarak çözündürüldü. Sitotoksisite, nitrik oksit tahlili ve TNF-ELISA. Sitotoksisite tahlili için, hücreler yukarıda açıklandığı gibi bir 96-kuyu plakasında işlendi ve daha sonra serbest Tesa ve D-Tesa'nın sitotoksisitesi, üreticinin talimatları izlenerek MTT tahlili ile değerlendirildi.

Nitrik oksit tahlili için, hücreler yukarıda açıklandığı gibi 12-kuyu plakalarında işlendi ve daha sonra işlenen hücrelerden süpernatanlar toplandı ve hemen nitrik oksit seviyeleri üreticinin Griess Reaktifi protokolü izlenerek ölçüldü.

TNF-ELISA için, hücreler yukarıda açıklandığı gibi 12-kuyu plakalarında işlendi ve daha sonra işlenen hücrelerden alınan süpernatanlar toplandı ve daha sonraki işlemlere hazır olana kadar -80 derecede saklandı.

Daha sonra numuneler buz üzerinde eritildi ve üreticinin protokolü takip edilerek TNF-ELISA gerçekleştirildi. Bu çalışmalar için hem D-Tesa hem de serbest Tesa sonikasyona tabi tutuldu ve her ikisi de tamamen çözünene kadar vortekslendi. Serbest Tesa'yı çözündürmek için, seyreltilmeden önce ilk olarak DMSO içinde çözündürüldü; burada DMSO'nun nihai konsantrasyonu, tüm serbest Tesa numuneleri için 0.1%(h/h)'nin altındaydı.

D-Tesa hücre kültürü ortamında çözünebildiği için bu numunelere DMSO eklenmedi. Tüm in vitro çalışmalar için, hem serbest Tesa hem de D-Tesa gruplarındaki hücrelere eşdeğer miktarda serbest veya konjuge ilaç uygulandı.

Kantitatif gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR). Hücreler yukarıda açıklandığı gibi 12-kuyu plakalarında işlendi ve süpernatan toplandıktan sonra hücreler Invitrogen™ TRIzol™ Reaktifinde (Fisher Scientific'ten) toplandı ve üreticinin protokolü izlenerek RNA ekstre edildi. Ortaya çıkan RNA'nın konsantrasyonu ve saflığı Nanodrop kullanılarak analiz edildi.

Her numuneden alınan eşdeğer miktarda RNA, üreticinin Yüksek Kapasiteli cDNA Ters Transkripsiyon Kiti (Thermo Fisher Scientific tarafından Applied Biosystems'den) için protokolü takip edilerek cDNA'ya dönüştürüldü.

Ortaya çıkan cDNA, FAST-SYBR yeşil reaktifi kullanılarak ve üreticinin protokolü izlenerek qRT-PCR analizi için kullanıldı. Ct değerleri makine tarafından hesaplandı ve veriler 2−ΔΔC yöntemi kullanılarak analiz edildi.

Her farklı işaretleyici için ΔΔCt değeri, LPS Yok grubu için ΔCt'nin her numune için ΔCt'den çıkarılmasıyla hesaplandı. ΔCt değeri, ilgili gen için Ct değeri eksi verilen her örnek için GAPDH için Ct idi.

Tüm gruplar için 2−ΔΔCt hesaplandıktan sonra hepsi LPS'siz gruba normalleştirildi, böylece LPS'siz gruba tüm işaretleyiciler için göreceli ifade düzeyi 1.0 verildi. QRT için kullanılan ileri ve geri primer dizileri -PCR aşağıdaki tabloda gösterilmektedir. Tüm diziler 5′→3′ şeklinde yazılır.

Ek olarak, iNOS/Nos2 (qmmuCID0023087), TLR4 (qmmuCID0023548), CD206/Mrc1 (qmmuCID0012670),TGF- 1 (qmmuCID0017320), IL-10 (qmmuCID0015452),SOCS1 için ticari olarak temin edilebilen primerler BIORAD'dan satın alındı. (qmmuced0024846), CD36 (qmmucid0014852), Ide(qmmuced0049796), MMP9 (qmmucid0021296), CCL1(qmmuced0038249), TLR8 (qmmuced0039837), CD86(qmmucid0006086), STAT6 (qmmucid000) 6404) ve PPAR (qmmucid0018821). Fagositoz tahlili.

Serbest Tesa ve D-Tesa'nın -amiloid fagositozu üzerindeki etkisi, daha önce bildirilen bir yöntem kullanılarak belirlendi.47 Kısaca, -amiloid1–42 etiketli HiLyte™ Flour 488- (Anaspec Inc.'den) DMSO (nihai DMSO konsantrasyonu) içinde çözüldü 0.5% (h/h)) altında ve PBS içerisinde 5 µg ml−1'e seyreltildi.

Hücrelerin yukarıda belirtilen tedavi şemasıyla Tesa ve D-Tesa ile işlenmesinden sonra, hücrelere 2 saat süreyle -amiloid çözeltisi uygulandı. Daha sonra hücreler, iki değerlikli katyonlar (kalsiyum ve magnezyum) içeren Hank Dengeli Tuz Çözeltisi ile üç kez yıkandı, trypsin kullanılarak oyuklardan çıkarıldı ve FACS tamponu (Invitrogen'den) içerisinde yeniden süspanse edildi.

Numuneler buz üzerinde saklandı ve hemen bir Sony Cell Sorter SH800 akış sitometri makinesinde çalıştırıldı ve veriler ilgili yazılımla analiz edildi.

Geçit, floresan amiloid ile işlenmemiş hücreler kullanılarak ayarlandı ve gösterilen sonuçlar, arka plan floresansının üzerinde floresans sergileyen her gruptaki hücrelerin yüzdesidir.

HiLyte™ 488-etiketli -amiloidin ortalama floresan yoğunluğu (MFA) da her grup için rapor edildi. Bu tahlil iki kopya halinde gerçekleştirildi. İstatistik. Gösterilen tüm veriler, aksi belirtilmedikçe her biri üç kopya halinde gerçekleştirilen üç ayrı deneyin sonucudur. İstatistikleri gerçekleştirmek için GraphPad Prism 5 ve Microsoft Excel kullanıldı.

BonferroniCorrection ile iki kuyruklu, eşleştirilmiş Öğrenci t testleri gerçekleştirildi. Aykırı değerleri belirlemek için Grubbs testi kullanıldı. Verileri çizmek için Windows için GraphPad Prism 5 kullanıldı (San Diego, CA). Gösterilen veriler ortalama + SEM'dir.

Sonuçlar ve tartışma

D-Tesa'nın sentezi ve karakterizasyonu

Beyindeki aktive edilmiş mikroglial hücrelere hedeflenmiş, hücre içi dağıtıma izin vermek için Tesa, G4-PAMAM-OH'nin yüzeyinde, ilaç ile dendrimer-bağlayıcı arasında bölünebilir ester bağları ile kovalent olarak konjuge edildi (Şekil 1).

İlk adımda, Tesa (1), ilaç ve bağlayıcı arasında bir ester bağlantısına sahip olan Tesa-TEG-azid (3) üretmek üzere tetrametilen glikol azid (TEG-azid)(2) ile reaksiyona sokuldu (Şekil 1A).

Bileşik (3)'ün HPLC'si, %99'un üzerinde saflıkla 13.4 dakikalık bir tutma süresi gösterdi (Şekil S1B†). (3)'ün kütle spektrumu, Tesa-TEG-azid moleküler ağırlığına karşılık gelen 610.13 [M + 1]+ değerinde bir zirve gösterdi ve bu da ürünün oluşumunu doğruladı (Şekil S2†). Ayrı olarak, G4-PAMAM-OH dendrimer (4), D-YNE'yi (5) üretmek için bir esterifikasyon reaksiyonu kullanılarak 5-heksinoik asit ile reaksiyona sokuldu (Şekil 1B).

Son olarak Tesa-TEG-azid (3) ve D-YNE (5), yüksek verimli bakır-katalizedazid-alkin siklokatılımı (CuAAC) click reaksiyonuyla reaksiyona sokularak D-Tesa (6) üretildi (Şekil 1B).48 1H NMR tüm ara ürünlerin ve nihai ürünün başarılı sentezini doğruladı; D-Tesa (6), D-Tesa'nın başarılı sentezini gösteren dendrimer ve ilaç bağlayıcı protonların karakteristik zirvelerini içeriyordu (Şekil 2A).

Nihai D-Tesa konjugatının NMR'si, her bir dendrimere ortalama on Tesa molekülünün bağlandığını ortaya çıkardı. HPLC, başarılı kovalent konjugasyonu doğruladı, çünkü D-Tesa, hem D-YNE hem de TesaTEG-azid'den bir kayma sergiledi (Şekil 2B ve S1†).

Tesa'nın sulu çözünürlüğü zayıf olup, 0,0035 mg mL-1,49 olduğu tahmin edilmektedir. Tesa onhidroksil dendrimerinin konjugasyonu, suda çözünürlüğünü bu tahmine göre birkaç kat arttırmıştır. D-Tesa'nın suda çözünürlüğü 22 mg mL-1'dir ve Tesa, D-Tesa'nın kütlesinin ~%19'unu oluşturduğundan, 4.2 mg ml-1 eşdeğer Tesa çözünmüştür (Şekil 3A).

Dendrimerin sağladığı artan çözünürlük, formülasyon kolaylığını artırır ve potansiyel olarak toksik eksipiyanlara olan ihtiyacı ortadan kaldırır.50 Bu faydaların tümü, dendrimerin, serbest ilaçları BBB üzerinden in vivo olarak mikrogliaya iletme ve potansiyel olarak zararlı etkileri azaltma konusundaki üstün yeteneğine ek olarak sağlanır. terapötik etki elde etmek için doza ihtiyaç vardı.18-28 Son olarak, D-Tesa'nın ortalama boyutu 7,75 ± 0,29 nm (Şekil S3†) ve zeta potansiyeli 2,86 ± 0,38 mV'ydi. (sırasıyla N=5 ve N=3 ölçümü).

İlaç salınımı

D-Tesa'yı, aktifleştirilmiş mikrogliaların endozom/lizozomlarındaki düşük pH ve yüksek esteraz konsantrasyonu ortamında hücre içi olarak Tesa'yı salacak şekilde tasarladık. PAMAM dendrimerlerinin esas olarak sıvı faz endositozu yoluyla hücrelere girdiğini ve konjugatları içeren keseciklerin lizozomlara dönüştüğünü daha önce bildirmiştik.51

Daha önce yapıldığı gibi, lizozomların koşullarını taklit etmek için D-Tesa'yı esterazların varlığında sodyum sitrat tamponunda (pH 5,5) 37 derecede inkübe ettik.52-54 Ayrıca plazma koşullarını taklit eden koşullar altında salımını da araştırdık (fosfat tamponlu salin [PBS) ] tampon, pH 7.4).

Plazma koşulları altında, 48 saat sonra Tesa'nın yalnızca %1,5'i salınır ve 25. günde Tesa'nın %20'sinden azı salınır, bu da konjugatın plazma stabilitesinin olduğunu gösterir (Şekil 3B).

Lizozomal koşullar altında, ilk 48 saat içinde Tesa'nın yaklaşık %60'ı D-Tesa'dan salınır ve 19 gün içinde Tesa'nın neredeyse %100'ü salınır. Bu sonuçlar, D-Tesa'nın, fizyolojik olarak ilgili lizozomal koşullar altında inkübe edilen ilk iki hafta boyunca serbest ilacın sürekli, tetiklenmiş salınımını sağladığını göstermektedir.

Ek olarak, ilk 48 saatte simüle edilmiş plazma koşullarında (pH 7,4 grubu) minimum Tesa salınımı önemlidir, çünkü bu, böbrek temizlenmeden önceki tipik G4-PAMAM-OH dolaşım süresi olduğundan, bir miktar Tesa muhtemelen böbreklerden salınacaktır. mikrogliaya ulaşmadan önce konjuge olurlar.24

D-Tesa, M1 belirteçlerinin ekspresyonunu azalttı ve M2 belirteçlerini arttırdı

D-Tesa'nın M1'den M2'ye fenotip değişimini tetikleme yeteneğini değerlendirmek için, D-Tesa'nın bir fare mikroglial hücre çizgisi (BV2) kullanarak M1 ve M2 işaretleyicilerinin ekspresyonunu in vitro değiştirme yeteneğini değerlendirdik.

BV2 hücreleri, fare mikroglial hücrelerinin ölümsüzleştirilmesiyle oluşturuldu ve mikroglial inflamatuar yanıtı incelemek için birincil mikroglia hücrelerine uygun bir alternatif olduğu gösterildi.55,56 Deneylerimizde, birçok nörolojik hastalıkta mevcut olan nöroinflamatuar ortamı taklit etmek için mikrogliaya 100 mikroglia ile ön tedavi uyguladık. ng ml−1 (ml başına 300 endotoksinunit (AB)) LPS, 3 saat süreyle.

Daha sonra hücreleri 48 saat boyunca LPS ve serbest Tesa veya D-Tesa ile birlikte işleme tabi tuttuk ve ardından örnekleri topladık. Hücreleri eşdeğer ilaç bazında 1,5, 15 ve 150 µM serbest Tesa veya D-Tesa konsantrasyonlarında tedavi ettik.

MTT tahlili, bu konsantrasyonlarda serbest Tesaor D-Tesa'nın sitotoksisiteye neden olmadığını gösterdi (Şekil S4†). Tesa ve D-Tesa'nın en etkili dozunu belirlemek için Tesa ve D-Tesa ile ilk doz bulma çalışması yapıldı.

1,5 ve 15 uM serbest Tesa ve D-Tesad ile tedavi, sırasıyla Griess Reaktifi ve bir TNF-ELISA ile belirlendiği üzere nitrik oksit veya TNF-sekresyonunu değiştirmedi (Şekil S5†). Bu sonuçlara dayanarak, qRT-PCR analizlerimizde bu düşük konsantrasyonları analiz etmedik.

Pek çok nörodejeneratif hastalıkta, proinflamatuar M1 mikroglia'nın önemli bir nörotoksik fonksiyonu, nöronları doğrudan öldüren reaktif oksijen türlerinin (örn., nitrik oksit) salgılanmasıdır.57,58 Daha sonra, potansiyel bir terapötik stratejinin, bu moleküllerin salgılanmasını azaltmak olacağı varsayılmıştır.

D-Tesa'nın bu etkiyi yaratma yeteneğini değerlendirdik. LPS uyarımından sonra D-Tesa, salgılanan nitrik oksit ve indüklenebilir nitrik oksit sentaz (iNOS)mRNA düzeylerini 3.7-kat (p < 0.0001) ve 2-kat (p {{) azalttı 7}}.011), yalnızca LPS (yalnızca LPS) ile tedavi edilen hücrelerle karşılaştırıldığında (Şekil 4A ve B).

Öte yandan, serbest Tesa, salgılanan nitrik oksidi daha orta derecede azalttı (1.4-kat, p=0.004) ve iNOS mRNA ifadesinde önemli bir azalmaya yol açmadı (Şekil 4A ve B). ).

D-Tesa, nitrik oksit salgısını baskılayan serbest Tesain'den çok daha etkiliydi. Daha sonra, mikrogliaların M1 veya M2 fenotipinde olup olmamasına bağlı olarak mikroglia, M1 patojen öldürme tepkisi için nitrik oksit, M2 yara iyileşme tepkisi için sırasıyla orornitin ve üre üretmek üzere L-arginini metabolize etmek için iNOS veya Arginaz 1'i (Arg1) yukarı doğru düzenler. 59

iNOS'un aşağı regülasyonuyla tutarlı olarak D-Tesa, Arg1 mRNA düzeylerini yalnızca LPS kontrolüne kıyasla 2- kat (p=0.011) artırırken, ücretsiz Tesa ifadeyi önemli ölçüde artırmadı (p=0 .40) (Şekil 4C).

D-Tesa ve daha az ölçüde serbest Tesa, mikroglia'yı, yara iyileşmesi için sitotoksik nitrikoksit salmaktan L-arginin'i metabolize etmeye dönüştürdü; bunun, nörodejenerasyonda mikroglia'nın neden olduğu nörotoksisiteyi azaltma ve potansiyel olarak tersine çevirme konusunda etkileri vardır.5-7,10

D-Tesa tedavisiyle iNOS ve salgılanan nitrik oksit seviyelerinin aşağı regülasyonu, PPAR'ın doğal ligandının (15-deoksi-Δ12,14-prostaglandin J2) tedavi edilen LPS'de iNOS ve nitrik oksit ekspresyonunu ve salgısını azalttığını gösteren önceki çalışmayla elde edilmiştir. birincil mikroglia.60

IL-10, IL-4 ve TGF- 1'nin tümü, beyinde nöroprotektif, antiinflamatuar bir ortam oluşturabilen, alternatif olarak aktive edilen M2 mikroglia tarafından salgılanan sitokinlerdir.58,61,62 bu amaçla D-Tesa, IL-105.5-kat (p=0.011) ve IL-4 8.2-kat (p {) ifadesini artırdı {15}}.013) yalnızca LPS kontrolüne kıyasla (Şekil 4D ve E).

Ücretsiz Tesa, ortalamaların 1.7-kat (p=0.066) ve 2.{{7} olmasına rağmen, IL-10 veya IL-4 düzeylerini önemli ölçüde artırmadı. Yalnızca LPS kontrollerine kıyasla Tesa ile tedavi edilen mikroglia için sırasıyla } kat (p=0.11) daha yüksek (Şekil 4D ve E). Ek olarak D-Tesa, TGF- 1 2.3-kat ifadesini artırdı (p=0.015) ve serbest Tesa, ifadeyi önemli ölçüde değiştirmedi (Şekil 4F).

Böylece D-Tesa, mikrogliaların LPS tedavisinden sonra anti-inflamatuar sitokinlerin salgılanmasını indükler ve bu, nörodejeneratif hastalıklarda mevcut olan nörotoksik, pro-inflamatuar ortamı hafifletebilir.5-7,10

M2-alt tipi işaretleyicilerin D-Tesa kaynaklı ifadesi

CD206, Ccl1 ve TLR8, sırasıyla M2a, M2b ve M2c mikroglia alt türleri için spesifik işaretleyicilerdir.58 D-Tesa yukarı regüle edilmişCD206 ifade 4.{{10 }}kat (p < 0,001), Ccl1 3.5-kat (p < 0,005) ve TLR8 5-kat (p < 0,01), ücretsiz Tesa ise bu üç işaretleyiciden herhangi biri (Şekil 5A-C).

Bu veriler, D-Tesa ile tedavi edilen mikroglia'nın, üç M2 alt tipinin tümünün belirteçlerinde anlamlı yukarı regülasyon gösterdiğini göstermektedir; bu, mikroglia fenotipinin ikili değil plastik olduğu anlayışıyla uyumludur.63-65

M1/M2 terminolojisi, mikroglia'nın aktivasyon durumlarının bir spektrumunda var olabileceği karmaşıklığı fazlasıyla basitleştirir; bu süreklilik boyunca üç farklı M2 fenotipi (M2a, M2b ve M2c) karakterize edilmiştir ve D-Tesa, bu durumların her biri ile tutarlı belirteçlerin ekspresyonunu indükler.58,61,63,66,67 M2a mikroglia, patojenik fagositozun artmasında rol oynar. temizleyici reseptörleri düzenleyerek, doku onarımını ve anti-inflamatuar eylemleri gerçekleştirerek proteinleri etkiler.

M2b mikroglia, IL-1, TNF- ve IL-6'yi ifade etmeleri bakımından M1 mikroglia'ya benzer; ancak M2b, IL-10'yi yüksek seviyelerde ifade etmeleri ve iNOS ifadesini aşağı regüle etmeleri açısından M1 mikrogliasından farklıdır. M2b makrofajları ve mikroglia, Th2 T hücrelerini uyarır; bu, M2b'nin bir anti-inflamatuar tepkiyi tetiklemedeki rollerinden birinin göstergesidir.

M2cmikroglia yara iyileşmesinde, doku yeniden modellenmesinde, demir tutulmasında ve proinflamatuar sinyallemeyi azaltan STAT3 aktivasyonunda rol oynar.58,61,63,66Tesa'nın PPAR aktivitesi, PPAR ve bunun yukarı akış sinyalleme proteininin (STAT6) ekspresyonunun artmasına neden olan bir ileri besleme döngüsünü uyarır. her ikisi de M2a işaretçileridir.58D-Tesa, PPAR 2.3-kat (p=0.0036)ve STAT6 3 ifadesini artırdı.4- kat (p < 0,001), serbest Tesa ise PPAR ifadesinde önemli bir artış olmadan (1,58-kat artış, p=0.17) (Şekil 5D ve E).

STAT6 ve PPAR'ın artan ekspresyonu, antiinflamatuar gen üretimi ve NF-κB aktivitesini inhibe ederek proinflamatuar sinyallerin inhibisyonu ile sonuçlanır. M2a mikroglia, mikroglia'nın STAT6 ve PPAR aracılığıyla sinyal veren IL-4 ile işlenmesiyle indüklenebildiğinden, bu iki aşağı akış sinyal proteininin yukarı regülasyonu, ileri beslemeli M2a polarizasyonuyla sonuçlanabilir.68

Tahlillerimizde LPS aktivasyonu, IL-6, TNF- ve IL-1 seviyelerini artırdı ve D-Tesa ile tedavi, bu sitokinlerin ekspresyonunu daha da yukarı regüle etti (Şekil S6A–D†), ki bu da muhtemelen M2b fenotipini indükleyen D-Tesa nedeniyle (Şekil 5B).

Ücretsiz Tesa, IL-6 ifadesini arttırdı ve TNF- ve IL-1 ifadesini önemli ölçüde değiştirmedi (Şekil S6A–D†). Bu sitokinler M1 mikroglia tarafından salgılanırken, M2b mikroglia da bu sitokinleri eksprese eder.58,61 CD86, hem M1 hem de M2b mikroglia'nın bir belirtecidir ve D-Tesa tedavisiyle artar (Şekil S6E†).

Ek olarak, sitokin sinyalleme baskılayıcısı (SOCS), sitokinler tarafından aktive edilen çoklu sinyalleme yollarını baskılayarak mikroglia'nın fenotipik polarizasyonunu düzenleyen bir hücre içi protein ailesidir.69 SOCS1'in bu ailenin bir üyesidir ve LPS/TLR4'ü inhibe ettiği gösterilmiştir. aracılı NF-κB ve JAK2 sinyali, böylece LPS/TLR4 yolu yoluyla M1 mikroglia tarafından salınan TNF-, IL-1 ve IL-6 miktarını azaltır.

D-Tesa, yalnızca LPS kontrolüne kıyasla SOCS1 ekspresyonunu yukarı regüle eder (Şekil S6F†), bu da D-Tesa tarafından sergilenen IL-6, TNF- ve IL-1'deki artışın, M2b fenotipi ve M1-uyarıcı fenotip olan LPS/TLR4'ün geliştirilmesi yoluyla değil.

Ayrıca LPS, TLR4 yoluyla sinyal verir ve aşırı hücresel aktivasyonu önlemek için mikroglia negatif bir geri besleme mekanizmasına sahiptir; bu sayede TLR4 aktivasyonu, TLR4.70'in ekspresyonunun azalmasına yol açar.

Ücretsiz Tesa ve D-Tesa ile tedavi TLR4 düzeylerini sırasıyla 3.6-kat (p <0.001) ve 3.7-kat (p < 0.001) artırdı (Şekil 5F), Tesa ve D-Tesa'nın tipik LPS/TRL4 negatif geri besleme sinyal yolunu değiştirdiğini düşündürmektedir.

For more information:1950477648nn@gmail.com