SOYUT

Melanin, ultraviyole radyasyondan korunmada birincil rolü oynayan insan derisinin ana pigmentidir. Melanin üretimindeki değişiklik, hem estetik hem de sağlıkla ilgili sonuçları olan hiperpigmentasyon hastalıklarına yol açabilir. Bu nedenle, melanogenez baskılayıcıları, tıbbi ve kozmetik tedaviler için yararlı araçlar olarak kabul edilir. Güvenli ve kantitatif olarak mevcut pigment giderici maddeler bulmayı amaçlayan doğal kaynaklara büyük ilgi gösteriliyor. Pek çok fenolik molekülün ortaya çıkışı, tirozinaz gibi melanin sentezinde yer alan fenolaz enzimleri üzerinde olası etkilere işaret ettiğinden, likenlerin bu tür bileşiklerin olası kaynakları olduğu düşünülmektedir. Bu çalışmada, artan polariteye sahip çözücülerde özler elde etmek için dört liken türü, Cetraria islandica Ach., Flavoparmelia caperata Hale ve Letharia vulpina (L.) Hue ve Parmotrema perlatum (Hudson) M. Choisy kullandık, yani. kloroform, kloroform-metanol, metanol ve su. Hücresiz, tirozinaz inhibisyon deneyleri, L. vulpina metanol ekstraktı için en yüksek inhibisyonu gösterdi, ardından C. Islandica kloroform-metanol geldi. Depigmentasyon aktiviteleri için karşılaştırılabilir sonuçlar, MeWo melanom hücreleri ve zebra balığı larvaları gibi in vitro ve in vivo sistemler kullanılarak gözlemlendi. Çalışmamız, liken ekstraktlarının tirozinaz inhibisyonundan hücre ve in vivo modellere kadar depigmente edici etkilerinin ilk kanıtını sunarak, L. vulpina ve C. Islandica ekstraktlarının cilt beyazlatıcı ürünler geliştirmek için daha fazla çalışılmayı hak ettiğini düşündürmektedir.

İlgili araştırmalara göre,cistanche"ömrü uzatan mucize bitki" olarak bilinen yaygın bir bitkidir. Ana bileşenikistanositgibi çeşitli etkilere sahiptir.antioksidan, antienflamatuvarve bağışıklık fonksiyonunun teşviki. Cistanche ve arasındaki mekanizmacilt beyazlatmakcistanche'nin antioksidan etkisinde yatmaktadır.glikozitler. İnsan derisindeki melanin, tirozinin oksidasyonu ile üretilir.tirozinazve oksidasyon reaksiyonu oksijenin katılımını gerektirir, bu nedenle vücuttaki oksijensiz radikaller melanin üretimini etkileyen önemli bir faktör haline gelir. Cistanche, bir antioksidan olan ve vücuttaki serbest radikallerin oluşumunu azaltabilen cistanoside içerir, böylecemelanin üretiminin engellenmesi.

Beyazlatma için Cistanche Tubulosa Takviyesine tıklayın

Daha fazla bilgi için:

david.deng@wecistanche.com WhatsApp:86 13632399501

konularBitki Bilimi, Dermatoloji

anahtar kelimelerTirosinaz, Liken sekonder metabolitleri, Zebra balığı, Melanogenesis, Letharia vulpina, Cetraria Islandica

GİRİİŞ

Omurgalılarda melanin sentezi, melanozom adı verilen lizozom benzeri organeller içinde, melanosit adı verilen özelleşmiş hücreler tarafından gerçekleştirilir. Melanizasyon, çevresel (örn. UV ışınları) ve endojen (örn. -MSH) faktörler, melanokortin-1 reseptörünün (MC1R) uyarılması, cAMP ve MAPK yolları ile sinyal iletimi, mikroftalmi aktivasyonu dahil olmak üzere farklı süreçlerle kontrol edilir. ilişkili transkripsiyon faktörü (MITF) ve melanozom öncesi protein (Pmel), tirozinaz (TYR) ve tirozinaz ile ilgili proteinlerin (TYRP1) ifadesi (D'Mello ve diğerleri, 2016; Cheli ve diğerleri, 2010).

Tirosinaz (EC1.14.18.1), melanin sentezinin anahtar bir enzimidir ve melanizasyonun modülatör ajanlarının bir hedefi olarak geniş çapta araştırılmıştır. Hayvanlarda melanizasyon, bitki ve mikroorganizmalarda esmerleşmeden sorumlu, doğada yaygın olarak bulunan, bakır içeren çok fonksiyonlu bir enzimdir (Kondo ve Hearing, 2011). Enzim, melanin oluşumunun iki farklı reaksiyonunu katalize eder: mikofenolat aktivitesiyle tirozinin hidroksilasyonu ve difenollerin etkisiyle 3,4-dihidroksifenilalaninin (L-DOPA) o-dopakinona oksidasyonu. Bu reaktif o-kinonlar, melanin oluşturmak için enzimatik olmayan polimerizasyona tabi tutulur.

İnsan derisindeki melanin, UV kaynaklı hasara karşı korunmak için gerekli bir pigment olmasına rağmen, aşırı melanin üretimi melazma, efelitler ve lentijinler gibi hiperpigmentasyon bozukluklarına neden olur (Mukherjee ve ark., 2018). Bu koşullar birçok insan için bir sorun teşkil etmektedir ve sonuç olarak, depigmentasyon ajanları arayışı tıp ve farmasötik alanlarda büyük ilgi çekmiştir (Solano, 2014). Bu nedenle, güvenli ve kantitatif olarak mevcut pigmentasyon inhibitörleri açısından zengin yeni doğal aktif ürünleri keşfetmek için önemli araştırma çabaları yönlendirilmiştir (Li ve diğerleri, 2013; Lo ve diğerleri, 2013; Wang ve diğerleri, 2011). Ana strateji, tirozinaz inhibitörleri olarak kullanılacak doğal ürünlere artan bir ilgi ile tirozinazı hedeflemektir (Leyden ve diğerleri, 2011). Literatürde, doğal kaynaklardan elde edilen çok sayıda tirozinaz inhibitörünün, pigmentasyon cilt bozukluklarını tedavi etmek için olası kullanımları bildirilmiştir (Mukherjee ve diğerleri, 2018; Parvez ve diğerleri, 2007). Bu bileşiklerin çoğu için inhibitör aktivite, yüksek antioksidan güç sağlayan fenolik yapılarıyla ilişkilendirilmiştir. Çeşitli kanıtlar, likenlerin bu tür bileşiklerin olası kaynakları olarak araştırılmaya değer olduğunu göstermektedir (Brandão ve diğerleri, 2017; Higuchi ve diğerleri, 1993; Honda ve diğerleri, 2016; Lopes, Coelho & Honda, 2018).

Likenler, heterotrofik bir mantar (mikobiyont) ile bir veya daha fazla fotosentetik ortak (fotobiyontlar) arasındaki simbiyotik birlikteliklerdir (Nash III, 2006). Simbiyozun bir sonucu olarak, mikobiyont, çoğu bu organizmalara özgü olan birkaç ikincil metabolit (liken maddeler olarak adlandırılır) üretir (Ranković & Kosanić, 2015). Bu metabolitler, otoburlar veya UV radyasyonu gibi biyotik ve abiyotik faktörlere karşı korunmaya yardımcı olabilir (Phinney, Solhaug & Gauslaa, 2018). Bunların çoğu, esas olarak asetat-poli malonat yolundan türetilen fenolik bileşiklerdir ve birkaç biyolojik aktivite sağlamaları beklenir. Buna göre likenler dünya çapında geleneksel ilaçlarda farklı amaçlarla kullanılırken (Crawford, 2015; Devkota ve ark., 2017), bitkisel ve farmasötik uygulamalar için farklı liken maddeleri ele alınmıştır (Einarsdóttir ve ark., 2010; Gül¸ cin ve diğerleri, 2002; Ranković & Kosanić, 2015). Farklı özellikler arasında, bu bileşiklerin fenolik doğası, tirozinaz gibi fenolaz enzimlerinin aktivitesi üzerinde etkilere işaret etmektedir (Honda ve diğerleri, 2016). Likenler, bazıları tirozinaz inhibitörleri olarak tanınan iyi doğal antioksidan kaynaklarıdır (Behera, Adawadkar & Makhija, 2004). Bazı patentler ayrıca liken özleri veya liken bileşikleri ile ilgili tirozinazlara karşı faaliyetler iddia etmektedir (Takayama ve ark., 2010), ancak bunlar, yapısal aydınlatma için yeterli miktarda ve saflıkta liken maddelerinin elde edilmesindeki zorluklar nedeniyle uzun süredir ihmal edilmiş ve göz ardı edilmiştir. farmakolojik testler (Boustie, Tomasi & Grube, 2011; Muggia, Schmitt & Grube, 2009).

Bu çalışma, in vivo Zebra balığı deneyleri de dahil olmak üzere, liken maddelerinin hem hücresiz hem de hücresel çeşitli pigmentasyon modelleri üzerindeki biyolojik etkilerini araştırmayı amaçlamıştır. Ayrıca, pigment giderici bileşiklerin ekstraksiyonu ve farmasötik ve kozmetik pigment giderici ürünlerin hazırlanması için likenlerden yararlanma olasılığı hakkında ipuçları sağladık. Melanizasyon üzerindeki liken etkilerine ilişkin sınırlı bilgi nedeniyle, önce geniş dağılımları ve bollukları ile bilinen farklı türler üzerinde yürütülen bir tarama gerçekleştirdik, yani. Cetraria Islandica Ach., Flavoparmelia caperata Hale, Letharia vulpina (L.) Hue ve Parmotrema perlatum (Hudson) M. Choisy. Her türden, saf kloroformdan suya artan polariteye sahip çözücüler kullanarak bir dizi dört ekstrakt elde ettik. İlk araştırma olarak, tüm ekstraktlar hücresiz, tirozinaz inhibisyon deneylerinde test edildi. Belirgin doza bağımlı inhibe edici aktivite gösteren özler, sırasıyla melanin üreten melanom hücrelerinin (MeWo) kültürleri ve gelişen zebra balığı embriyoları kullanılarak in vitro ve in vivo melanizasyon modellerinde kullanıldı. Melanojenik düzenleyici bileşiklerin fenotip tabanlı taranması için yakın zamanda bir in vivo model olarak kurulduğu için zebra balığı kullandık (Lin ve diğerleri, 2011). Özellikle zebra balığı, bakım kolaylığı ve ilaç uygulaması, kısa üreme döngüsü, dış döllenme ve gelişme gibi benzersiz özellikler sergilediği, gelişim ortamının manipüle edilmesine ve şeffaf aracılığıyla optik ölçümlere izin verdiği için ilaç etkilerini değerlendirmek için önemli bir omurgalı modeli haline geldi. vücut duvarı.

MALZEMELER VE YÖNTEMLER

Kimyasallar

Aksi belirtilmedikçe tüm reaktifler Sigma-Aldrich'ten (Milano, İtalya) satın alındı.

Liken türleri ve ekstrakt hazırlama

F. caperata ve P. perlatum'un Thalli'si, Doğu Liguria'nın (Kuzeybatı İtalya) bir ormanlık alanında, L. vulpina Valtournenche'nin (KD Valle d'Aosta, İtalya) bir ormanlık alanında toplanmıştır ve C. Islandica, Kubja'dan satın alınmıştır. Ürditalu (Tallinn, Estonya). İtalyan mevzuatına göre liken toplama için herhangi bir izne gerek yoktur. Liken materyalleri, tanımlama anahtarları ve nokta testleri yardımıyla mikroskop analizi kullanılarak birimiz (PG) tarafından tanımlandı. Daha sonra liken materyali birikintilerden arındırılmış, gece boyunca oda sıcaklığında kurumaya bırakılmış ve kullanılana kadar oda sıcaklığında kağıt torbalarda saklanmıştır.

Kurutulmuş liken thalli, oda sıcaklığında (yaklaşık 23 °C) kloroformdan suya dört çözücü polaritesi ile ekstre edildi: kloroform, kloroform-metanol (9:1), metanol ve su (her biri 70 mL'de 14.4 g F. caperata). solvent, 60 mL'de 10,4 g P. perlatum, 75 mL'de 13,3 g L. vulpina ve 500 mL'de 100,6 g C. Islandica). Ekstraksiyonlar, sık sık çalkalanarak 5 gün boyunca ve her solvent için 3 kez gerçekleştirildi. Süpernatan sıvı daha sonra süzüldü ve kurutulmuş özler elde etmek için bir döner sistemde (Rotavapor Heidolph, Schwabach, Almanya) indirgenmiş basınç altında kuruyana kadar buharlaştırıldı (Souza ve diğerleri, 2016). Liken özü verimleri Tablo 1'de rapor edilmiştir.

Tirozinaz inhibisyon deneyi

Geleneksel TLC kromatografik profili, literatür protokolleri (Culberson & Kristinsson, 1970; White & James, 1985) izlenerek 20x20 cm plakalar (Merck silika jel 60 F254) üzerinde gerçekleştirildi. Kısaca, L. vulpina metanolik ekstraktı ve C. Islandica kloroform-metanol ekstraktı numuneleri, ekstraksiyon solventlerinde yeniden çözündürüldü ve ardından bir kılcal boru kullanılarak bir TLC plakası üzerinde lekelendi. TLC profili, mobil faz (çözücü C) olarak toluen:asetik asit (200:30 mi) kullanılarak gerçekleştirildi. Solvent cephesine ulaşıldıktan sonra plaka oda sıcaklığında kurumaya bırakıldı. Kurutulmuş plakalar, pigmentleri renkli noktalar olarak tespit etmek için önce görünür ışıkta (gün ışığı) ve ardından 254 ve 350 nm uyarımları kullanılarak floresan ışığında incelendi ve fotoğraflandı.

Her noktada tirozinaz inhibisyon aktivitesinin varlığını görselleştirmek için, TLC plakalarına L-tirozin solüsyonu (yaklaşık 2.5 x 10-5 mmol/cm2) ve ardından tirozinaz solüsyonu (yaklaşık 3.6 U/cm2) püskürtüldü. Tirozinaz inhibe edici aktiviteye sahip noktalar, koyu bir arka plan üzerinde beyaz görünüyordu (Wangthong ve diğerleri, 2007).

Hücre kültürü, hücre canlılığı ve melanin deneyleri

MeWo insan melanom hücre dizisi (cat. HTB-65, ATCC, Manassas, VA, ABD, Pastorino ve diğerleri (2017) tarafından bildirildiği üzere hücre canlılığı testi için ve tarafından açıklandığı gibi melanin testi için kullanıldı. Cornara ve diğerleri (2018).

Zebra balığı depigmentasyon testi

Yetişkin zebra balığı (Danio rerio) ticari bir satıcıdan temin edildi ve 27°C'de, pH 7,0–7,5'te 500–530 /cm su iletkenliğine sahip bir sirkülasyon sisteminde 14/10 sabit ışık/ karanlık fotoperiyod Hayvanların veteriner bakımı İtalyan yasalarına (D.to L.Vo 26/2014) göre gerçekleştirildi ve deneyler Kurumsal Etik İnceleme Kuruluşu (Cenova Üniversitesi) ve İtalya Sağlık Bakanlığı (izin 720/) tarafından onaylandı. 2015-PR). Yetişkin zebra balığının yumurtlaması standart yöntemlere göre yapıldı. Özellikle sabahları ışık açılarak indüklenen doğal yumurtlamadan senkronize embriyolar elde edildi. Embriyolar, 2 ml embriyo ortamı ve oyuk başına 15 embriyo içeren 6-kuyu plakalarına dizildi. Ekstrakt stok solüsyonları, kullanımdan hemen önce embriyo ortamı ile istenen konsantrasyonlara seyreltildi (L. vulpina metanol ekstraktı: 6–45 µg/ml; C. Islandica kloroform-metanol ekstraktı: 5–65 µg/ml). Seyreltilmiş ekstraktlar her bir oyuğa eklendi ve 8 ila 56 hpf'de (döllenmeden saatler sonra) inkübe edildi, sonuçta 48 saat maruz kalma sağlandı. Arbutin 10 mM pozitif kontrol olarak kullanıldı. Test bileşiklerinin eşit dağılımını sağlamak için ortamın değiştirilmesi her 24 saatte bir yapıldı. 56 hpf'deki embriyolar, forseps ile koryondan arındırıldı, trikain metansülfonat çözeltisi (Sigma Aldrich) içinde anestezi uygulandı ve ardından bir stereomikroskop (Leica M205C) altında fotoğraflandı. Pigmentasyon üzerindeki etkiler, ImageJ yazılımı v. 1.74 kullanılarak değerlendirildi. Zebra balığı pigmentasyon alanını değerlendirmek için piksel ölçüm analizörü işlevi kullanıldı.

istatistiksel analiz

Tirosinaz inhibisyonu, MTT ve zebra balığı pigmentasyon verileri ile elde edilen doz-yanıt eğrileri, sırasıyla medyan ve eşik seviyeleri olarak kabul edilen IC50 ve IC05 değerlerini veren bir lojistik regresyon modeli ile analiz edildi. İstatistiksel karşılaştırmalar, R 3.0.1 (R Core Team, 2013) ortamında, ANOVA testi, Bonferroni düzeltmeli t Student ve çoklu karşılaştırmalar için Dunnett testleri kullanılarak yapıldı.

SONUÇLAR

Tirozinaz aktivitesi üzerindeki etkiler

Liken ekstraktları, hücre içermeyen bir testte in vitro olarak değerlendirilen, mantar tirozinaz aktivitesi üzerinde bir modülatör etkiler kompleksi gösterdi. Bazı ekstraktlar, özellikle F. caperata metanol, kloroform ve L. vulpina su ekstraktları olmak üzere tirozinaz aktivasyonunu indükledi, diğerleri bifazik davranış gösterirken, bazıları inhibe ediciydi (Şekil 1 ve Tablo 2). Özellikle, kloroform-metanol (Şekil 1B) ve metanol özütleri (Şekil 1C), doza bağımlı etkilerle birlikte genel olarak daha güçlü tirozinaz inhibisyonu göstermiştir. En güçlü inhibisyon aktivitesi L. vulpina'nın metanol ekstraktı için kaydedildi (Şekil 1C), ardından C. Islandica'nın kloroform-metanol ekstraktı (Şekil 1B). Bu ekstraktların inhibe edici aktiviteleri, yüzde 95 CI ile IC50 değerlerinin tahmin edilmesine izin veren yegane aktivitelerdi (Tablo 2). Pozitif kontrol olarak, bu deneylerde 13,9 µg/ml'lik bir IC50 ile kojik asit kaynaklı tirozinaz inhibisyonu (yüzde 95 güven aralığı: 12,4–15,7).

Daha fazla bilgi için: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501