Dizel Egzoza Maruz Kalma Zebra Balığı Beyinlerinde Nörodejenerasyonla İlgili Ağların İfadesini Değiştiriyor Bölüm 2

Protein numunesi hazırlama

Protein numuneleri hazırlamak için, 80 ila 100 anestezi uygulanmış larvanın (5 pdf) kafaları dikkatlice izole edildi ve %0,07 beta-merkaptoetanol (ME) içeren %15 önceden soğutulmuş TCA/asetondan oluşan bir lizis tamponuna aktarılmadan önce PBS ile yıkandı. ) ve toplam 500 ul hacimde proteaz inhibitör kokteyli (imalatçıya ihtiyaç duyar).

Son yıllarda protein örneklerinin hafıza üzerindeki etkilerine büyük ilgi duyulmaktadır. Giderek daha fazla insan beslenmenin sağlık açısından önemini, özellikle de proteinin insan vücudundaki önemli rolünü anlamaya başlıyor.

Proteinler insan vücudunun temel yapı malzemeleridir ve insan vücudunda önemli bir rol oynarlar. Bu nedenle protein örnekleri birçok insan için sağlık ve güzellik arayışında önemli bir kanal haline geldi. Protein örnekleri kas geliştirmenin ve vücudu şekillendirmenin yanı sıra kişinin hafızasını da geliştirebilir.

Bazı bilim adamları proteinler ve hafıza arasındaki ilişkiyi incelediler. Uzun süreli yeterli protein alımının fiziksel sağlığın her yönüne, özellikle de hafızaya faydalı olduğunu buldular. Diyetteki protein alımının beyin fonksiyonu ve hafıza üzerinde önemli bir etkiye sahip olduğuna dair giderek artan kanıtlar var.

Protein, insan beynindeki nöronların önemli bir bileşenidir, dolayısıyla günlük protein alımının insanların hafızası ve düşünme yeteneği üzerinde önemli bir etkisi vardır. Uzun süreli protein alımı vücudun protein ihtiyacını karşılamanın yanı sıra beynin aktif ve sağlıklı kalmasına da yardımcı olur.

Ayrıca protein vücudun kan şekeri dengesini korumasına ve istikrarlı bir ruh halini korumasına da yardımcı olabilir. Bu, hafızayı ve düşünme becerilerini korumak için çok önemlidir. Bu nedenle, makul düzeyde protein alımı, insan vücudunun çeşitli bilişsel işlevlerinin ve duygusal durumlarının iyileştirilmesine yardımcı olabilir.

Genel olarak protein örnekleri ile hafıza arasında güçlü bir ilişki vardır. Protein alımınızı artırmak, beyninizi ve vücudunuzu sağlıklı tutmanıza, düşünme becerilerinizi ve hafızanızı geliştirmenize yardımcı olur. Hafızasını geliştirmeye ihtiyaç duyan kişilerin uygun miktarda protein tüketmesi çok önemlidir. Sağlıklı bir vücuda ve keskin bir zihne sahip olmak için proteinli yiyecekleri uygun şekilde yemeli ve makul öğünlere dikkat etmeliyiz. Belleği geliştirmemiz gerektiği görülebilir ve Cistanche Deserticola hafızayı önemli ölçüde geliştirebilir, çünkü Cistanche Deserticola'nın antioksidan, antiinflamatuar ve yaşlanma karşıtı etkileri vardır, bu da beyindeki oksidasyonu ve inflamatuar reaksiyonları azaltmaya yardımcı olabilir, böylece beyni korur. sinir sisteminin sağlığı. Ek olarak, Cistanche Deserticola sinir hücrelerinin büyümesini ve onarımını da teşvik edebilir, böylece sinir ağlarının bağlantısını ve işlevini geliştirebilir. Bu etkiler hafızayı, öğrenmeyi ve düşünme hızını artırmaya yardımcı olabilir ve ayrıca bilişsel işlev bozukluklarının ve nörodejeneratif hastalıkların gelişimini de önleyebilir.

Belleği güçlendirmek için ekleri bil'e tıklayın

Kısa homojenizasyondan sonra proteinler 12 saat boyunca 20 derecede çökeltildi, ardından 12,000 rpm'de 5 dakika boyunca 4 derecede santrifüj edildi. Süpernatan çıkarıldı ve protein peleti iki kez soğuk asetonla (%0.0%7 ME ve proteaz inhibitör kokteylleri içeren) yıkandı. Nihai protein peleti, 7,0 M üre içeren bir lizis tamponunda çözüldü, ve buz üzerinde sonikasyon yoluyla 2.0 M tiyoüre.

Çözünmüş protein numuneleri, çözünmeyen parçacıkları çökeltmek için 10 dakika süreyle 4 derecede 15,000 devir/dakikada santrifüjlendi ve nihai protein numunelerinin konsantrasyonu Bradford yöntemi kullanılarak ölçüldü.

TMT tabanlı yüksek verimli proteomik analizi

Örnekler indirgendi, alkile edildi ve ardışık olarak trypsin ve lys-C proteazların eklenmesiyle sindirildi. Peptitler daha sonra üreticinin talimatlarına göre 10-plexTMT izobarik etiketleri kullanılarak etiketlendi. Etiketli numuneler karıştırıldı ve daha sonra yüksek pH'lı ters fazlı kromatografi kullanılarak ince parçalara ayrıldı.

Bireysel fraksiyonlar daha sonra çevrimiçi ters faz kromatografisi ve Thermofsher Fusion Lumos kütle spektrometresinde tandem kütle spektrometrisi kullanılarak LC-MS/MS ile analiz edildi. Veriler, daha önce açıklandığı gibi senkronize öncül seçimine dayalı MS3 yöntemi kullanılarak elde edildi (McAlister ve diğerleri 2014). Veritabanı araması ve TMT raportör iyon bilgilerinin çıkarılması, MaxQuant yazılım platformu kullanılarak gerçekleştirildi (Cox ve Mann 2008).

TMT verilerinin numuneler arasında karşılaştırılması MSStats kullanılarak gerçekleştirildi (Choi ve ark. 2014). Transkriptomik analiz Anestezi uygulanmış embriyolardan yaklaşık 80-100 kafa izole edildi (120 saat), PBS ile yıkandı ve Trizol (Sigma Aldrich, Saint Louis) kullanılarak toplam RNA ekstraksiyonuna tabi tutuldu. , ABD) reaktifini üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.

RNA'nın kalitesi ve miktarı, minimum 50 ng/ul konsantrasyonu ve RNA bütünlük numarasının (RIN) 8 olmasını sağlamak için bir NanoDrop2000 spektrofotometre (Thermo Scientific, MA) ve ayrıca Agilent 2100 Bioanalyzer kullanılarak değerlendirildi. Daha sonra kütüphane hazırlığı, aşağıdakilere göre bir Illumina HiSeq4000 kullanılarak gerçekleştirildi: protokol: "Ribo-Zero Gold ile TruSeq Stranded Total RNA Library Prep iş akışı" ve numuneler aşağıdaki koşullarda sıralandı: "Eşleştirilmiş Son çalışma, R1=75 döngü (antisense iplikçik), İndeks=8 döngü, R2=75 döngüsü (duyu dizisi)."

Veri analizi

Proteomik ve transkriptomik çalışmalara yönelik her iki veri seti, Danio rerio da dahil olmak üzere çeşitli türler için gen açıklamasına izin veren çevrimiçi Metascape aracı kullanılarak eş zamanlı olarak yüklendi ve analiz edildi (Zhou ve ark. 2019). Spesifik yollarda proteom veya transkriptom profili değişikliğinin katkısını değerlendirmek için veriler, Yaratıcılık Yolları Analizi (IPA) yazılımı kullanılarak analiz edilmiştir (Krämer ve ark. 2014).

Gen veya protein tanımlayıcılarını ve karşılık gelen ifade değerlerini içeren veri setleri uygulamaya yüklendi. Her tanımlayıcı, Ingenuity'nin bilgi tabanındaki karşılık gelen nesneyle eşleştirildi.

İfadesi diferansiyel olarak düzenlenen molekülleri tanımlamak için 1.3- katlık bir ifade değişikliği kesme noktası ayarlandı. Fonksiyonel analiz, veri seti için en önemli olan biyolojik işlevleri ve/veya hastalıkları belirledi. Analiz için veri setindeki kesmeyi karşılayan ve biyolojik işlevlerle ilişkilendirilen moleküller dikkate alındı. Sağ kuyruklu Fisher'ın kesin testi, söz konusu veri setine atanan her bir biyolojik fonksiyonun ve/veya hastalığın yalnızca şansa bağlı olma olasılığını belirleyen bir p-değerini hesaplamak için kullanıldı.

Yol analizi

Belirli yollardaki proteom veya transkriptom profil değişikliklerinin katkısını değerlendirmek için her iki veri seti de IPA yazılımına yüklendi (Krämer ve ark. 2014). En önemli değiştirilmiş kanonik yollar daha sonra aşağıda açıklandığı gibi PCR ve western blot kullanılarak daha ayrıntılı olarak değerlendirildi ve yorumlandı.

Western lekeleme

Toplam 25 µg protein, %12'lik bir NuPAGE'ye (Novex, CA) yüklendi ve açıklandığı gibi PVDF membranlarına (Novex, CA) aktarıldı (MahmoudianSani ve diğerleri. 2017; Rafee ve diğerleri. 2019). Membranlar, Tris tamponlu salin içinde %5 yağsız süt ve %0.01 tween 20 (TBST tamponu) ile 30 dakika oda sıcaklığında bloke edildi ve daha sonra tavşan poliklonal anti-Cyp1A1 (Abcam, CA) veya fare monoklonal anti-GAPDH() ile 4 derecede gece boyunca inkübe edildi. Abcam, CA), %1 yağsız süt içeren TBST tamponunda seyreltildi.

TBST'de yıkandıktan sonra lekeler, ikincil eşek anti-tavşan-HRP (Abcam, CA) veya keçi anti-fare-HRP (Santa Cruz, CA) antikorları ile 2 saat boyunca inkübe edildi, ardından Pierce™ ECL Plus western blot substratı ile geliştirildi ( Thermo Fisher Scientific, ABD). Bantlar, bir LI-COR Tarayıcı kullanılarak görüntüleme yoluyla görselleştirildi ve dansitometri (LI_COR Biosciences,NE) aracılığıyla analiz edildi.

Gerçek zamanlı PCR

Üreticinin talimatları izlenerek TRIzol reaktifi (Sigma Aldrich, Saint Louis, ABD) kullanılarak kafalardan toplam RNA izole edildi ve ardından bir NanoDrop 2000 spektrofotometre (Thermo Scientific, MA) kullanılarak ölçüldü. Her bir RNA numunesinden 1 ug'lik bir miktar, iScript™ ters transkripsiyon süper karışımı (Bio-Rad, CA) kullanılarak ters kopyalandı ve SsoAdvancedUniversal SYBR Green süper karışımı (Bio-Rad, CA) kullanılarak gerçek zamanlı PCR yapıldı ve primerler listelendi Ek Tablo 1'de. Göreli ifade seviyeleri 2−ΔΔCT yöntemi kullanılarak hesaplandı ve anlamlı farklılıkları değerlendirmek için istatistiksel T testi kullanıldı.

Sonuçlar ve tartışma

Proteomik ve transkriptomik analizler, hastalık süreçlerinin ve çevresel uyaranlara verilen yanıtın altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için iki önemli araçtır (Duan ve ark. 2017; García-Estrada ve ark.2013; Jami ve ark. 2014a, b, 2015; Kosalková ve ark.2012). . Burada DEPe'ye maruz kalan zebra balığı embriyolarının kafalarında hem transkriptomik hem de proteomik seviyelerde derin ekspresyon analizleri yaptık.

Çoğunlukla beyin dokusundan oluşan kafalar, diğer dokuların ekspresyon profillerini ortadan kaldırmak için izole edildi çünkü CNS'nin içsel patolojik yolaklarının belirlenmesiyle ilgileniyoruz.

Zebra balığı embriyolarının kafalarının ifade profili

Profil analizi, 26'dan fazla000 kodlama geninden 11.172 tespit edilmiş protein ve 14.748 mRNA hedefi ortaya çıkardı (Howe ve ark. 2013). TMT etiketli numunelerden tanımlanan 11.172 protein arasında (Ek Tablo 2), 141 protein önemli ölçüde yukarı regüle edildi ve 607'si aşağı regüle edildi (Ek Tablo 3 ve Şekil 1a). Benzer şekilde, RNA sekans analizinde tespit edilen 14.748 transkript (Ek Tablo 4) arasında 367 transkript yukarı regüle edildi ve 149'u aşağı regüle edildi (Şekil 1b ve Ek Tablo 5).
Çoğu durumda, yukarı regüle edilmiş proteomik ve transkriptomik analizlerden elde edilen bulgular tutarlıydı. Örneğin, üst düzeyde yukarı regüle edilen proteinler arasında sitokrom P450 Cyp1a, Cyp1c1, Guaninenükleotit bağlayıcı protein alt birimi gama, Anneksin, Pleksin B2b kısa izoformu, Dehidrojenaz/redüktaz (SDR ailesi) üyesi 13-gibi 1, retina/epifiz bezinin S-antijeni bulunur (arrestin) b ve Sülfotransferaz6B1.

Benzer şekilde, en yüksek transkriptomik regülasyona sahip genler arasında sitokrom P450 (Cyp1a), kemokin (C-C motifi) ligandı 27a, aril-hidrokarbon reseptör baskılayıcı A, sitokrom P450 (Cyp1b) ve Rh ailesi C glikoproteini bulunur. Öte yandan, aşağı regüle edilmiş proteinler ve transkriptler, her zaman yüksek korelasyona sahip değildi.

Örneğin, Kompleksin 2, Spektrin alfa, Kardiyak miyozin hafif zinciri-1, SEC23 etkileşimli protein, ATPsentaz membran alt birimi EA, Sitokrom b ve NAD'ye bağımlı protein deasetilaz, yüksek düzeyde aşağı regüle edilen proteinler arasında yer alırken, retinalouter segment membran proteini 1a , çözünen taşıyıcı aile 5 (iyodür taşıyıcı), FBJ murin osteosarkom viral onkogen homolog B, kompleks 4c, FOS benzeri antijen 1a, opsin 1 ve v-fos, transkripsiyonun en yüksek aşağı regülasyonunu gösterir (Tablo 1 ve 2).

Zebra balığı proteinlerini tanıyan antikorlar sınırlıdır, ancak bu değişikliklerin bir örneğini western blot analizi kullanarak doğruladık. Cyp1A proteininin yukarı regülasyonu ve Kompleksin 2'nin (CPLX2) aşağı regülasyonu, bir yükleme kontrolü olarak GAPDH kullanılarak doğrulandı (Şekil 2a). Daha yüksek TAT ve UGT1B1 transkripsiyonu seviyeleri ve daha düşük CHNRB ve TH2 seviyeleri, dahili kontrol olarak Elf-alfa kullanılarak qPCR ile de doğrulandı (Şekil 2b).

Gen açıklaması

Gen açıklaması konusunda yararlı bilgiler sağlayabilecek çeşitli çevrimiçi biyoenformatik araçlar ve yazılımlar vardır. Bunlardan Danio rerio için gen açıklaması yapma özelliğine sahip olan Metascape (Zhou ve ark. 2019) bu çalışmada kullanılmıştır.

Proteomik ve transkriptomik çalışmalara yönelik veri setleri eşzamanlı olarak yüklendi ve bu çevrimiçi araç kullanılarak analiz edildi. Yazılımdaki hem proteomik hem de transkriptomik değişikliklerin çıktısı birleştirildikten sonra, ksenobiyotik uyarana yanıt, ksenobiyotiklerin sitokrom P450 tarafından metabolize edilmesi ve gen ifadesinin sirkadiyen düzenlenmesi gibi çeşitli süreçler DEPe tedavisi üzerine indüklendiği bulundu (Şekil 3a).

Bu analiz aynı zamanda "Görsel algı", "Fototransdüksiyon" ve "G proteinine bağlı reseptör içselleştirmesi" gibi biyolojik süreçlerin bastırılmış düzeylerini de öne sürdü. Erken gelişim sırasındaki DEPe tedavisi daha küçük gözlerle sonuçlandığından (veriler gösterilmemiştir) görmeyle ilgili ifade profillerindeki değişiklikler beklenmedik değildi.

Ksenobiyotik metabolizma sinyali

Yabancı doğal veya sentetik kimyasal bileşikler olan ksenobiyotikler, hücresel stres tepkisini tetikleyerek farklılaşmaya, çoğalmaya, apoptoza veya nekroza yol açabilir. Aslında vücudun, ksenobiyotiklere ve aynı zamanda toksik endojen bileşiklere ve bunların metabolitlerine karşı, bunların eliminasyonu ve detoksifikasyonunda rol oynayan enzimlerin ve taşıyıcıların ekspresyonu yoluyla aktif olarak korunması gerekir.

Bu enzimler üç gruba ayrılır: Ksenobiyotiklere polarite kazandıran Faz I enzimleri (CYP, ALDH, FMO); Sülfat, glukuronik asit ve glutatyon gibi hidrofilik moleküllerin ksenobiyotiklere konjugasyonu yoluyla hidrofiliklik sağlayan Faz II enzimleri (UGT, GST, SULT) ve Faz II sırasında oluşan ksenobiyotikleri veya konjugatları taşıyan Faz III enzimleri (MDR1, OATP2, MRP) hücre dışı alana.

Bu enzimler, spesifik reseptörleri (CAR, PXR, AHR) ve transkripsiyon faktörlerinin (NRF2, MAF) MAPK aracılı aktivasyonunu içeren sinyalleme basamakları yoluyla indüklenir (Omiecinski ve ark. 2011).

Aktivatörlerin yokluğunda yapısal olarak aktif reseptör (CAR), CCRP ve HSP90 ile bir kompleks olarak sitoplazmada bulunur. Ancak bir aktivatör mevcut olduğunda, CAR çekirdeğe yer değiştirir ve bir heterodimer oluşturmak için RXR'ye bağlanır ve ayrıca DR3, DR4, ER6 ve ER8 gibi tekrar motifinin çeşitli varyantlarına bağlanır ve gen ekspresyonu düzenlemesine katkıda bulunur (Ek Tablo 2).

Proteomik analizimiz ksenobiyotik metabolizmasının aktivasyonunu ortaya çıkardı. Aslında, CYP1A1, CYP3A7, HMOX1 (hem oksijenaz 1), CAT (katalaz) ve CES1'in (karboksilesteraz 1) açık şekilde yukarı regülasyonu, Faz I metabolizmasının indüksiyonunu gösterirken, UGT1A1 (UDP glukuronosiltransferaz ailesi 1 üyesi A1) ve GSTP1'in ekspresyonunun arttığını gösterir. glutatyonS-transferaz pi 1), Faz II metabolizmasının aktivasyonunu gösterir.

İlginç bir şekilde, SULT1A1 (sülfotransferaz ailesi 1A üyesi 1), SULT1C2 (sülfotransferaz ailesi 1C üyesi 2) ve SULT2B1 (sülfotransferaz ailesi 2B üyesi 1) gibi sülfat transferazların aşağı regülasyonu, Faz II metabolizmasında artan hidrofilikliğin tercihen glukuronik asit ve glutatyon ile konjugasyon yoluyla meydana gelme eğiliminde olduğunu göstermektedir. , ancak sülfat konjugasyonu değil (Şekil 4).

CYP1A, CYP1B, CYP3A7, GSTO1, GSTP1 ve UGT1A1'in tümü RNA seviyelerinde yukarı doğru düzenlendiğinden, transkriptomik çalışmanın sonuçları oldukça tutarlıdır. Ancak SULT2B1, RNA seviyesinde yukarı regülasyon gösterir (ancak protein seviyelerinde yeterince temsil edilmez).

Bunun nedeni DEPe ile tedavi sonrasında sülfat transferaz enziminin bozunmasını veya inaktivasyonunu indükleyen diğer mekanizmaların devreye girmesi olabilir. Özellikle şaşırtıcı olan şey, ksenobiyotik metabolizmasındaki bu değişikliklerin balığın kafalarında (muhtemelen beyinlerinde) meydana gelmesidir. Ksenobiyotik genlerin ekspresyonu memelilerin sinir sisteminde tanımlanmıştır ancak bu, bunların zebra balığı beyinlerindeki ilk raporudur (McMillan ve Tyndale 2018).

Bu bulgular, farklı çevresel polisiklik aromatik hidrokarbon gruplarının (PAH'lar) embriyo gelişimi üzerindeki etkilerini test eden ve ayrıca her tedavi rejiminin transkriptom profili üzerindeki etkisini değerlendiren Shankar ve iş arkadaşları tarafından yürütülen benzer bir çalışma ile tutarlıdır.

48 döllenme sonrası (hpf) embriyonun tüm gövdesinde, Cyp1a'nın hem transkripsiyon hem de protein seviyelerinde yukarı regüle edilmesinin, ksenobiyotik AHR aktivasyonunun ve aşağı yöndeki transkriptomik değişikliklerin erken ve güvenilir bir biyobelirteç olduğunu gösterdiler (Shankar ve ark. 2019).

NRF2-aracılı oksidatif stres tepkisi

Oksidatif stres apoptozu ve nekrozu tetikleyebilir ve nörodejenerasyonda rol oynadığına inanılmaktadır (Ahmadinejad ve ark. 2017; Jami ve ark. 2014b, 2015). Oksidatif strese karşı önemli bir hücresel savunma tepkisi, antioksidan ve detoksifiye edici enzimlerin indüksiyonudur.

Nükleer faktör-eritroid 2-ilişkili faktör 2(Nrf2), promoter antioksidan yanıt elemanlarına (ARE) bağlanır ve bunların transkripsiyonunu aktive eder. Aktif olmayan Nrf2, aktin bağlayıcı bir protein olan Keap1 ile ilişkilidir ve sitoplazmada tutulur.

Oksidatif stresle tetiklenen Nrf2, protein kinaz C, fosfatidilinositol 3-kinaz ve MAP kinaz yollarına yanıt olarak fosforile edilir. Fosforile edilmiş Nrf2 daha sonra çekirdeğe yer değiştirebilir ve AREs'i bağlayarak detoksifikasyon ve antioksidan enzimleri işlemden geçirebilir (Ek Tablo 3) (Ma 2013).

For more information:1950477648nn@gmail.com