Diosminin Kalsiyum Oksalat Böbrek Taşı Oluşum Süreçleri Üzerindeki Çift Modülatör Etkileri: Kristalizasyon, Büyüme, Agregasyon, Kristal Hücre Yapışması, Renal Tübüler Hücrelere İçselleştirme ve Hücre Dışı Matris Yoluyla İstila
Mar 16, 2022
daha fazla bilgi için:ali.ma@wecistanche.com
Supaporn Khamchuna,b,c,1, Sunisa Yoodeea,1, Visith Thongboonkerda,*
aTıbbi Proteomik Birimi, Araştırma ve Geliştirme Ofisi, Tıp Fakültesi Siriraj Hastanesi, Mahidol Üniversitesi, Bangkok 10700, Tayland
bTıbbi Teknoloji Bölümü, Müttefik Sağlık Bilimleri Okulu, Phayao Üniversitesi, Phayao 56000, Tayland
cBütünleştirici Moleküler Biyotıpta Mükemmeliyet Birimi, Müttefik Sağlık Bilimleri Okulu, Phayao Üniversitesi, Phayao 56000, Tayland
Anahtar Kelimeler: Biyoaktif bileşik, Flavonoid, İnhibitör, Modülatör, Nefrolitiazis, Destekleyici, Ürolitiyazis
ÖZ
diosminçeşitli farmakolojik aktivitelere sahip meyve ve bitkilerde bulunan doğal bir flavon glikozittir (biyoflavonoid). Çeşitli hastalıklarda/bozukluklarda diyet takviyesi veya terapötik ajan olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Tavsiye edilmesine rağmen, koruyucu mekanizmalarının kanıtıböbrektaş hastalığı (nefrolitiazis/ürolitiyazis), özellikle en sık görülen tip olan kalsiyum oksalat (CaOx) monohidrat (COM) belirsizliğini korumuştur. Bu çalışmada, böylece sistematik olarak etkilerini değerlendirdik.diosmin(2,5–160 nM'de) çeşitli aşamalardaböbrekCOM kristalizasyonu, kristal büyümesi, agregasyon, kristal hücre yapışması, renal tübüler hücrelere içselleştirme ve hücre dışı matris (ECM) yoluyla istila dahil olmak üzere taş oluşum süreçleri. Sonuçlar gösterdi kidiosminbahsedilen tüm COM böbrek taşı süreçleri üzerinde doza bağlı modülatör etkilere sahipti.diosminkristalizasyon sırasında COM kristal sayısını ve kütlesini önemli ölçüde arttırdı, ancak kristal boyutunu ve büyümesini azalttı. Sürediosminkristal agregasyonunu teşvik etti, kristal hücre yapışmasını ve renal tübüler hücrelere içselleşmeyi inhibe etti. Son olarak, diosmin, ECM yoluyla kristal istilasını destekledi. Verilerimiz, diosmin'in COM üzerindeki etkilerini hem inhibe ettiğini hem de teşvik ettiğini gösteren kanıtlar sağlar.böbrektaş oluşum süreçleri. Diosminin bu ikili modülatör aktivitelerine dayanarak, ürolitiazis önleyici rolü şüphelidir ve kullanımı için dikkatli olunmalıdır.böbrektaş hastalığı
1. Giriş
diosmin(3′,5,7-trihidroksi-4′-methoxyflavone-7-rhamnoglucoside), başta Citrus spp. olmak üzere çeşitli bitki ve meyvelerde yaygın olarak bulunan doğal bir biyoflavonoiddir. [1,2]. Diğer flavonoid olan hesperidin'den sentezlenebilir veya türetilebilir [1,2]. Diosmin tek başına veya hesperidin ile kombinasyon halinde, kronik venöz yetmezlik ve hemoroid gibi venöz ve lenfatik bozuklukların tedavisinde flebotropik bir ilaç olarak yaygın olarak kullanılmaktadır [3,4]. Ek olarak, diosmin, antioksidan ve anti-inflamatuar aktiviteler [5,6], anti-mutajenik ve anti-neoplastik özellikler [7,8], antibiyotik etkileri [9], anti-hiperglisemik özellik [9] dahil olmak üzere birçok başka biyolojik ve farmakolojik aktivite sergiler. 10] ve çoklu organ hasarlarına karşı koruyucu etkiler, yani,
kardiyovasküler [11], retinal [12],böbrek, karaciğer ve beyin hasarı [13].
Böbrektaş hastalığı (veya nefrolitiazis/ürolitiyazis), böbrek içinde gelişen ve biriken katı taşlardan kaynaklanır ve dünyanın her yerinde insanları yüksek tekrarlama oranıyla etkiler [14-17]. Tüm çeşitli nedensel kristaller arasında, kalsiyum oksalat (CaOx), özellikle monohidrat formu (COM), taş oluşturanlarda (böbrek taşı olan hastalar) bulunan en patojenik ve en yaygın kristalli bileşendir [18]. Mekanik olarak, COM kristalleri renal tübüler epitel hücreleri üzerinde en güçlü yapışma kabiliyetine ve en sitotoksik etkiye sahiptir [19,20]. Taş patogenezi sırasında, hem Randall'ın plak modeli hem de intratübüler hipotez, COM kristalizasyonu, büyüme, agregasyon, renal tübüler hücreler veya renal pelvis üzerinde yüzey yapışması ile retansiyon, hücrelere içselleştirme ve içine invazyon dahil olmak üzere COM taş oluşum süreçlerinin ortak özelliklerine sahiptir. ekstraselüler matriks (ECM) yoluyla renal interstisyum [21,22].
Son zamanlarda, birçok çalışma, yeni ve/veya tekrarlayan taş oluşumunu önlemeyi amaçlayan tıbbi bitkiler/meyveler ve bunların biyoaktif bileşiklerini kullanarak ilaç keşfine odaklanmıştır. Birkaç tıbbi bitkiden/meyveden ekstrakte edilen bazı biyoaktif bileşiklerin, özellikle fenolik bileşiklerin (polifenol, flavonoid, flavon glikozit, vb.)böbrekhem in vitro hem de in vivo taş hastalığı [23-25]. Bu faydalı maddeler arasında, birkaç rapor, diosminin hayvan modellerinde böbrek dokusu içinde CaOx kristallerinin birikmesini önleyebileceğini öne sürmüştür [26,27]. Bununla birlikte, KOM böbrek taşı oluşumundaki kesin modülatör rolü (inhibisyon veya teşvik) ve mekanizmaları (aşamalar veya taş oluşum süreçleri) araştırılmamıştır. Bu çalışma bu nedenle sistematik olarakdiosmin(2,5–160 nM'de) çeşitli aşamalardaböbrekkristalizasyon, kristal büyümesi, agregasyon, kristal hücre yapışması, renal tübüler hücrelere içselleştirme ve ECM yoluyla istila dahil olmak üzere taş oluşum süreçleri.
TıklaBöbrek fonksiyonu için Cistanche tubulosa dozu
2. Malzemeler ve yöntemler
2.1. Diosmin hazırlığı
diosmin(Tokyo Chemical Industry; Tokyo, Japonya) yüzde 100 dimetil sülfoksit (DMSO) (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO) ile çözündürüldü ve 2.5, 5, 10, 20, 40, COM kristalleri üzerindeki etkilerini araştırmak için 80 ve 160 nM. Ek olarak, tüm deneylerde negatif kontrol olarak yüzde 100 DMSO kullanıldı.
2.2. Hücre kültürü
Nefronun distal tübüler segmentinden (ATCC; Manassas, VA) türetilen MDCK renal tübüler epitel hücre çizgisi, yüzde 10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiş Eagle's minimum esansiyel ortamında (MEM) (Gibco; Grand Island, NY) çoğaltılmıştır, 60 U/ml penisilin G (Sigma-Aldrich) ve 60 ug/ml streptomisin (Sigma-Aldrich). Hücreler, 37 ◦C'de yüzde 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir inkübatörde tutuldu.
2.3. COM kristalizasyon deneyi
COM kristalizasyonu daha önce tarif edildiği gibi yapıldı [28,29]. Kısaca, kristalizasyon tamponu (10 mM Tris-HCl ve 90 mM NaCl içerir) (pH 7.4) içinde 500 ul 10 mM CaCl2⋅2H2O 24-kuyulu plakanın (Corning Inc.; Corning, NY). Eşit hacimde (4 ul) kristalizasyon tamponu (boş kontrol), DMSO (negatif kontrol) veyadiosmin(2.5, 5, 10, 20, 40, 80 veya 160 nM) CaCl2 ile karıştırıldı. Son olarak, CaCl2 ve Na2C2O4'ün nihai konsantrasyonlarını sırasıyla 5 mM ve 0.5 mM yapmak için kristalizasyon tamponunda 500 ul 1.0 mM Na2C2O4 ilave edildi. Karışım 25 ◦C'de 1 saat inkübe edildi ve ardından incelendi. Kristal görüntüler, Nikon Eclipse Ti-S ters faz kontrastlı ışık mikroskobu (Nikon; Tokyo, Japonya) altında en az 15 yüksek güç alanından (HPF'ler) rastgele yakalandı. Kristal boyutu ve sayısı, NIS Element D yazılımı sürüm 4.11 (Nikon) kullanılarak her numune için en az 15 HPF'den ölçülmüştür. Kristal kütlesi, aşağıdaki formül kullanılarak 15 HPF'deki en az 100 kristalden hesaplanmıştır: Kristal kütlesi (µm2/HPF)=Her alandaki ortalama kristal boyutu (µm2) × Her alandaki kristal sayısı (/HPF) ( 1)
2.4. COM kristal büyüme testi
Kristal büyüme tahlili daha önce tarif edildiği gibi yapıldı [30,31].
Kısaca, kristalizasyon tamponu içinde eşit hacimde (500 ul) 10 mM CaCl2⋅2H2O ve 1.0 mM Na2C2O4 karıştırıldı (1:1) (h/v) { {12}}kuyu plakası. Karışım, tam kristalleşmeyi sağlamak için 25 ◦C'de 1 saat inkübe edildi. Bu noktada (T0), eşit hacimde (4 ul) kristalizasyon tamponu (boş kontrol), DMSO (negatif kontrol) veyadiosmin(2.5, 5, 1{{1{15}}}}, 20, 40, 80 veya 160 nM) her kuyucuğa ilave edildi ve karışım 60 dakika daha inkübe edildi (T60). T0 ve T60'ta, kristal görüntüler Nikon Eclipse Ti-S ters çevrilmiş faz kontrast ışık mikroskobu altında en az 15 HPF'den rastgele yakalandı. T0 ve T60'taki kristal boyutları, NIS Element D yazılım sürüm 4.11 (Nikon) kullanılarak ölçülürken, kristal büyümesi (Δ Kristal boyutu ile temsil edilir) aşağıdaki formül kullanılarak 15 HPF'de en az 100 kristalden hesaplandı: Δ Kristal boyutu (µm2)=T60'ta kristal boyutu − T0'da (2) kristal boyutu
2.5. COM kristal agregasyon tahlili
Kristal agregasyon tahlili daha önce tarif edildiği gibi yapıldı [32,33]. COM kristalleri, yukarıda kristal büyüme deneyinde bahsedildiği gibi, ancak bir 50-ml konik tüpte (Corning Inc.) daha büyük bir hacimle üretildi ve daha sonra 5 dakika boyunca 2000 g'de santrifüjleme ile toplandı. Süpernatant atılırken COM kristalleri metanol ile üç kez yıkandı. 2000 g'de 5 dakika daha santrifüj edildikten sonra metanol atıldı ve kristaller gece boyunca 25 °C'de havayla kurutuldu. COM kristalleri (1000 ug kuru ağırlık), 6-kuyulu plakanın (Corning Inc.) her oyuğunda 1 ml kristalizasyon tamponu içinde yeniden süspanse edildi. Eşit hacimde (4 ul) kristalizasyon tamponu (boş kontrol), DMSO (negatif kontrol) veyadiosmin(2.5, 5, 10, 20, 40, 80 veya 160 nM) her kuyudaki COM kristal süspansiyonuna ilave edildi. Plaka sürekli olarak bir çalkalama inkübatöründe (Zhicheng; Şanghay, Çin) 150 rpm'de ve 25 °C'de 1 saat süreyle çalkalandı. Bundan sonra, COM kristal agrega oluşumu ("birbirine sıkıca bağlanan üç veya daha fazla ayrı COM kristalinin bir araya gelmesi" [32] olarak tanımlanır) incelendi ve Nikon Eclipse Ti-S ters faz kontrast ışık mikroskobu altında görüntülendi. COM kristal agregatlarının sayısı, kuyu başına en az 15 rastgele HPF'den sayıldı.
2.6. COM kristal hücre yapışma testi
Kristal hücre yapışma deneyi, daha önce tarif edildiği gibi yapıldı [34,35]. Kısaca, COM kristalleri yukarıda belirtildiği gibi 50-ml'lik bir konik tüp içinde üretildi ve daha sonra 2000 g'de 5 dakika santrifüjleme ile toplandı. Süpernatant atılırken COM kristalleri metanol ile üç kez yıkandı. 2000 g'de 5 dakika daha santrifüj edildikten sonra metanol atıldı ve kristaller gece boyunca 25 °C'de havayla kurutuldu. Kristaller, hücrelere müdahale edilmeden önce 30 dakika boyunca UV ışık radyasyonu ile dekontamine edildi.
MDCK hücreleri (2 x 105 hücre/kuyu yoğunluğunda) tohumlandı ve birleşmiş tek tabaka elde etmek için 6-kuyulu plakanın (Corning Inc.) her bir oyuğunda büyütüldü. Kültür ortamı daha sonra COM kristalleri (ml kültür ortamı başına 100 ug kuru ağırlık kristalleri) eklenmeden önce yenilendi. Eşit hacimde (4 ul) kristalizasyon tamponu (boş kontrol), DMSO (negatif kontrol) veyadiosmin(2.5, 5, 10, 20, 40, 80 veya 160 nM) her kuyucuğa ilave edildi. Hücreler ayrıca yüzde 5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ◦C'de 1 saat süreyle inkübe edildi. Daha sonra hücreler, beş kez PBS ile kuvvetli bir şekilde yıkandı ve Nikon Eclipse Ti-S ters çevrilmiş faz-kontrast ışık mikroskobu altında görüntülendi. Renal tübüler hücre yüzeyine yapışık kalan COM kristallerinin sayısı, oyuk başına en az 15 rastgele alandan sayıldı.
Böbrek fonksiyonu için Cistanche
2.7. COM kristal içselleştirme deneyi
Floresan etiketli COM kristalleri daha önce tarif edildiği gibi üretildi [36,37]. Kristalizasyon için kullanılan kimyasalların bileşimleri/konsantrasyonları, düz (etiketlenmemiş) kristaller için yukarıda belirtilenlerle aynıydı, ancak 0.1 µg/ml floresan izotiyosiyanat (FITC) (Thermo Scientific Pierce; Rockford, IL) Na2C2O4 ile karıştırılmadan önce CaCl2~2H2O çözeltisine eklendi. Sonraki adımlar (kristalizasyon ve hasat) yukarıda belirtildiği gibi, ancak karanlıkta gerçekleştirildi.
Renal tübüler epitel hücrelerine kristal içselleştirmeyi değerlendirmek için, MDCK hücreleri (2 x 105 hücre/kuyu yoğunluğunda) ekildi ve elde etmek için 6-kuyu plakasının (Corning Inc.) her bir oyuğunda 48 saat büyütüldü. birleşik tek tabaka. Hücre tek tabakası FITC etiketli COM kristalleri (1000 ug kristal/ml ortam) ile yüzde 5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ◦C'de 1 saat inkübe edildi. Daha sonra hücreler, PBS ile yıkandı ve içselleştirilmemiş (hem yapışkan hem de yapışkan olmayan) kristalleri ortadan kaldırmak için tripsin-EDTA çözeltisi ile inkübe edildi. Dahili kristallere sahip hücrelerin yüzdesi, bir akış sitometresi (BD Accuri C6) (BD Biosciences; San Jose, CA) kullanılarak toplam 10.000 kazanılmış olaydan ölçülmüştür. Düz (etiketlenmemiş) COM kristalleri ile inkübe edilen hücreler, pozitif floresan sinyali için gürültü ve eşiği önceden ayarlamak için kullanıldı. Pozitif floresan sinyallerine sahip hücreler daha sonra sayıldı ve bu yüzde hesaplaması için kullanıldı.
2.8. ECM tahlili yoluyla COM kristal istilası
COM kristalleri, kristal agregasyonu ve kristal hücre yapışma deneyleri için yukarıda tarif edildiği gibi hazırlandı. Kristal invazyon tahlili, önceden belirlenmiş protokole göre yapıldı [38,39]. Kısaca, kristalizasyon tamponu (boş kontrol), DMSO (negatif kontrol), albümin (Sigma-Aldrich) (pozitif kontrol) ile kaplanmış toplam 20 µg COM kristali veyadiosmin(2.5, 5, 1{{10}}, 20, 40, 80 veya 160 nM) 200 ul MEM'e eklendi. Ardından, PBS içindeki 200 ul 0.3 pM Lys-plazminojen (Fitzgerald Industries International; Acton, MA) karıştırıldı ve kristal-protein kompleksi ile 37°C'de 1 saat inkübe edildi. Bağlanmamış plazminojen 2000 g'de 5 dakika santrifüj edilerek atıldı ve pelet bir kez PBS ile yıkandı. Daha sonra, PBS içindeki 100 ul 0.15 pM ürokinaz plazminojen aktivatörü (uPA) (Fitzgerald Industries International), kristal-protein-plazminojen/plazmin kompleksi ile karıştırıldı. Karışım daha sonra ECM göç odası içindeki matris jelin üstüne ilave edildi ve 37 ◦C'de inkübe edildi. 24-h inkübasyondan sonra, migrasyon odasının üst kısmında kalan solüsyon gazlı bez veya kağıt mendil kullanılarak çıkarıldı. Matris jeli içindeki istila edilmiş COM kristalleri daha sonra diferansiyel girişim kontrastı (DIC) modu (Nikon H600L) ile bir ışık mikroskobu kullanılarak görüntülendi. Kristal istila mesafesi, NIS Element D yazılım sürüm 4.11 (Nikon) kullanılarak aynı oda içindeki en az 15 düşük güç alanından (LPF) ölçüldü ve ortalaması alındı.
2.9. istatistiksel analiz
Yukarıdaki deneylerin tümü üç kopya halinde yapıldı (üç bağımsız deney) ve nicel veriler ortalama ± SEM olarak rapor edildi. Tukey'in post-hoc testi ile tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanılarak çoklu karşılaştırmalar yapıldı. Değişkenler arasındaki ilişkiyi belirlemek için Pearson korelasyon testi yapıldı. Tüm istatistiksel analizler SPSS yazılımı (versiyon 18) (IBM SPSS; Armonk, NY) kullanılarak yapıldı. 0.05'ten küçük P değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
3. Sonuçlar
3.1. Diosmin'in COM kristalizasyonu üzerindeki etkisi
Kristalizasyon, sürecin temel erken adımlarından biridir.böbrekher türlü taş oluşum süreçleri. 1-h kristalizasyondan sonra veya olmadandiosminçeşitli konsantrasyonlarda (2.5, 5, 10, 20, 40, 80 veya 160 nM), COM kristal boyutu ve sayısı ölçüldü ve kristal kütlesi hesaplandı. Kristalizasyon tamponu ve seyreltici DMSO, sırasıyla boş ve negatif kontroller olarak görev yaptı. Veriler, boş ve negatif kontrollerle karşılaştırıldığında, tüm dozlarda (2.5-160 nM) disominin kristal boyutunu önemli ölçüde azalttığını ancak doza bağlı bir şekilde kristal sayısını arttırdığını gösterdi (Şekil 1A–1C). Kristal sayısı ile uyumlu olarak kristal kütlesi doza bağlı olarak arttı (Şekil 1D). Genel olarak, bu veriler, diosmin'in COM kristalleşmesini (neokristaller) desteklediğini gösterir.
3.2. Diosmin'in COM kristal büyümesi üzerindeki etkisi
modülatör etkisidiosminCOM kristal büyümesi üzerinde, neokristaller yokken ilk kristalizasyon aşamasının tamamlanmasını takiben 60-dakika daha inkübasyondan sonra kristal boyutundaki (Δ Kristal boyutu) değişiklik ölçülerek değerlendirildi. Sonuçlar, disominin tüm dozlarının (2.5-160nM) boş ve negatif kontrollere kıyasla doza bağlı bir şekilde Δ Kristal boyutunu önemli ölçüde azalttığını gösterdi (Şekil 2). Bu bulgular, diosmin'in COM kristal büyümesini engellediğini göstermektedir.
3.3. Diosmin'in COM kristal agregasyonu üzerindeki etkisi
Kristal büyümesine ek olarak, birbirine sıkıca yapışan tek tek kristallerin toplanması, işlem sırasında bir başka önemli adımdır.böbrektaş patogenezi. Yüksek derecede kristal agregasyonu nihayetinde taş büyümesine ve küçük renal tübüler lümenin tıkanmasına yol açabilir. Boş ve negatif kontrollerle karşılaştırıldığında,diosmin10-160nM'de doza bağlı olarak artan COM kristal agrega sayısı (Şekil 3). Bu sonuçlar, diosmin'in COM kristal agregasyonunu desteklediğini gösterir.
Böbrek fonksiyonu için Cistanche
3.4. Diosmin'in COM kristal hücre yapışması üzerindeki etkisi
Nedensel kristallerin tutulması, önemli adımlardan biridir.böbrektaş oluşumu ve kristallerin idrar çıkışı ile birlikte dışarı atılmasını önleyen kristal hücre yapışması ile indüklenebilir. Böylece modülatör aktivitesini değerlendirdik.diosminCOM kristal hücre yapışması üzerine. Veriler, 5-160nM'de diosmin'in, boş ve negatif kontrollerle karşılaştırıldığında doza bağımlı bir şekilde, COM kristallerinin renal tübüler hücreler üzerindeki yapışma kapasitesini önemli ölçüde azalttığını ortaya koydu (Şekil 4). Bu veriler, diosmin'in COM kristal hücre yapışmasını engellediğini gösterir.
3.5. Diosmin'in COM kristalinin renal tübüler hücrelere içselleştirilmesi üzerindeki etkisi
Adezyondan sonra, bazı COM kristalleri renal tübüler hücrelere içselleştirilebilir ve daha sonraki birkaç hücresel yanıta neden olabilir [37,40]. Kristal içselleştirme, FITC etiketli COM kristalleri kullanılarak değerlendirildi ve akış sitometrisi ile nicelendirildi. Teknik gürültüyü çıkarmak ve floresan yoğunluğunun FITC sinyalinden olmasını sağlamak için düz COM kristalleri (etiketsiz) kullanıldı. Boş ve negatif kontroller ile karşılaştırıldığında, içselleştirilmiş kristallere sahip hücrelerin yüzdesi, şu şekilde önemli ölçüde azaldı:diosmin10-160nM'de doza bağlı bir şekilde (Şekil 5). Bulgular, disominin, COM kristalinin renal tübüler hücrelere içselleştirilmesini engellediğini göstermektedir.
3.6. ECM yoluyla COM kristal istilası üzerinde diosmin etkisi
ECM yoluyla kristal istilası, sırasında patojenik/yıkıcı bir süreçtir.böbrekçeşitli inflamatuar yanıtları ve kaskadları tetikleyebilen ve böylece hastalık mekanizmalarını kötüleştirebilen taş patogenezi. Bu fenomeni, kristal-protein kompleksinin plazminojen-plazmin aktivitesine dayanan yerleşik bir protokol kullanarak inceledik [38,39]. Sonuçlar, tüm disomin dozlarının (2.5-160nM), doza bağlı bir şekilde ECM yoluyla COM kristal istilasını önemli ölçüde arttırdığını gösterdi (Şekil 6). İlginçtir,diosmin160 nM'de, COM kristal istilası için bilinen güçlü promotör olan albümin ile karşılaştırılabilir COM kristal istilasını destekleyebilir [41] (Şekil 6). Bu sonuçlar, diosmin'in ECM yoluyla COM kristal istilasını güçlü bir şekilde desteklediğini gösterir.
Şekil 1. EtkisidiosminCOM kristalizasyonu üzerine. Kristalizasyon tahlili, eşit hacimde (4ul) kristalizasyon tamponu (boş kontrol), DMSO (negatif kontrol) veya diosmin (2.5-160nM) ile yapıldı. (A): 1-h kristalizasyondan sonra her koşulda kristal morfolojisi. Orijinal büyütme, tüm paneller için 400× idi. (B): Kristal boyutu. (C): Kristal numarası. (D): Kristal kütlesi ("Malzemeler ve Yöntemler"deki Formül 1'e bakınız) 15 HPF'de en az 100 kristalden analiz edilmiştir. Her çubuk, 3 bağımsız deneyden elde edilen verilerin ortalama ± SEM'sini temsil eder. *=s< 0.05="" vs.="" blank="" control;="" #="">< 0.05="" vs.="" dmso.="">
Şekil 2. EtkisidiosminCOM kristal büyümesi üzerine. Kristal büyüme tahlili, kristalizasyon tamamlandıktan sonra (neokristalizasyonu önlemek için) eşit hacimde (4ul) kristalizasyon tamponu (boş kontrol), DMSO (negatif kontrol) veya diosmin (2.5-160nM) ile yapıldı. (A): T0 ve T60'daki her koşulda kristal morfolojisi. Orijinal büyütme, tüm paneller için 400 × idi. (B)-(J): Her gruptaki T0 ve T60'ta bireysel kristallerden ölçülen kristal boyutlarının histogramları. (K): Δ Kristal boyutu ("Malzemeler ve Yöntemler"deki Formül 2'ye bakın) 15 HPF'de en az 100 kristalden analiz edildi. Her çubuk, 3 bağımsız deneyden elde edilen verilerin ortalama ± SEM'sini temsil eder. *= p < 0.05="" ve="" boş="" kontrol;="" #="p">< 0.05="" ve="">
Şekil 3. EtkisidiosminCOM kristal toplama üzerinde. Kristal agregasyon tahlili, eşit hacimde (4ul) kristalizasyon tamponu (boş kontrol), DMSO (negatif kontrol) veya diosmin (2.5-160nM) ile yapıldı. (A): Toplanmış COM kristallerinin mikrografları (noktalı dairelerle etiketlenmiştir). Orijinal büyütme, tüm paneller için 400 × idi. (B): Kristal kümelerinin sayısı, her kuyudaki en az 15 rastgele HPF'den sayıldı. Her çubuk, 3 bağımsız deneyden elde edilen verilerin ortalama ± SEM'sini temsil eder. *=s< 0.05="" vs.="" blank="" control;="" #="p" <="" 0.05="" vs.="" dmso.="">
4. EtkisidiosminCOM kristal hücre yapışması üzerine. Kristal hücre yapışma deneyi, eşit hacimde (4ul) kristalizasyon tamponu (boş kontrol), DMSO (negatif kontrol) veya diosmin (2.5-160nM) ile yapıldı. (A): PBS ile kuvvetli yıkamalarla bağlanmamış kristalleri çıkardıktan sonra hücre tek tabakasına sıkıca yapışan kalan kristallerin mikrografları. Orijinal büyütme, tüm paneller için 200 × idi. (B): Yapıştırılan kristallerin sayısı, her kuyudaki en az 15 rastgele alandan sayıldı. Her çubuk, 3 bağımsız deneyden elde edilen verilerin ortalama ± SEM'sini temsil eder. *= s<0.05 vs.="" blank="" control;="" #="p"><0.05 vs.="">
Şekil 5. EtkisidiosminCOM kristalinin renal tübüler hücrelere içselleştirilmesi üzerine. Kristal içselleştirme deneyi, FITC etiketli COM kristalleri (FITC-COM) kullanılarak gerçekleştirilirken, arka plan/gürültü çıkarma için düz (etiketlenmemiş) COM kristalleri kullanıldı. Test, eşit hacimde (4ul) kristalizasyon tamponu (boş kontrol), DMSO (negatif kontrol) veya diosmin (2.5–160nM) ile yapıldı. (A): Yüzde 0.1 tripsin/2.5 mM EDTA ile içselleştirilmemiş kristalleri çıkardıktan sonra hücrelerin boyutunun (y ekseni) ve FITC-floresan yoğunluğunun (x ekseni) akış sitometrik nokta-grafik analizi. (B): Dahili FITC etiketli COM kristallerine sahip hücrelerin yüzdesi. Her çubuk, 3 bağımsız deneyden elde edilen verilerin ortalama ± SEM'sini temsil eder. *= s<0.05 vs.="" fitc-com="" +="" blank="" control;="" #="">< 0.05="" vs.="" fitc-com="" +="" dmso.="">
Şekil 6. EtkisidiosminECM yoluyla COM kristal istilasında. ECM tahlili yoluyla kristal istilası, kristalizasyon tamponu (boş kontrol), DMSO (negatif kontrol), albümin (pozitif kontrol) veya diosmin (2.5-160nM) ile kaplanmış COM kristalleri kullanılarak yapıldı. (A): COM kristallerinin mikrografları, ECM geçiş odasını işgal etti veya geçti. Orijinal büyütme, tüm paneller için 100 × idi. (B): Kristal istila mesafesi, her bölmede en az 15 rastgele LPF'den ölçülmüştür. Her çubuk, 3 bağımsız deneyden elde edilen verilerin ortalama ± SEM'sini temsil eder. *= s<0.05 vs.="" blank="" control;="" #="p" <="" 0.05="" vs.="">
4. Tartışma
Böbrek taşı hastalığına böbrek taşının içinde taş oluşumu neden olur.böbrekve pelvocalyceal sistem. Yaygın böbrek taşı oluşum süreçleri, COM kristalizasyonu, büyümesi, agregasyonu, kristal hücre adezyonu ile retansiyonu ve ECM'den zengin renal interstisyum yoluyla invazyonu içerir [21,22]. Çeşitli ilaçlar ve/veya besin takviyeleri kullanarak bu hastalığı önlemek için çeşitli girişimler vardır. Son zamanlardaki birçok kanıt, narenciye meyvelerinden ekstrakte edilen flavonoidler, flavon glikozitler ve diğer bileşiklerin böbrek taşı hastalığı ve diğer bozukluklar üzerinde önleyici etkileri olabileceğini bildirmiştir [23-25]. Bunların arasında,diosminEsas olarak narenciye meyvelerinde bulunan doğal bir flavon glikozit ve hesperidin türevi olan [1,2], yaralanma ve hasara karşı önleyici bir rol oynadığı öne sürülmüştür.böbrekdoku [13,42]. Ayrıca, hayvan modellerinin kullanıldığı birkaç önceki çalışmada anti-ürolitiyazis rolü bildirilmiştir [26,27]. Yine de, diosminin böbrek taşı önlemedeki yararlı etkileri ve altında yatan mekanizmalar belirsizliğini korudu. Böylece diosmin'in COM kristalleri üzerindeki modülatör aktivitesini inceledik. COM'un çeşitli aşamalarında sistematik analizler yapıldı.böbrekkristalizasyon, kristal büyümesi, agregasyon, kristal hücre yapışması, renal tübüler hücrelere içselleştirme ve ECM yoluyla istila dahil olmak üzere taş oluşumu.
Oral alımından sonradiosmin, insanlarda plazma seviyesi {{0}},5 ila 200ng/ml (veya 0,8–300nM) arasında değişmektedir [43,44]. Maksimum plazma konsantrasyonu (Cmax) yaklaşık 50ng/ml (veya 85nM)'dir [43,44]. Bu nedenle, bu çalışmamızda kullanılan diosmin dozajları (2.5-160nM), farmakokinetiği için farmakolojik olarak ilgili aralıktaydı. Öneriye göre diosmini tamamen çözmek için seyreltici olarak DMSO kullanıldığından, seyrelticinin kendisinden veri yorumlamasını engelleyebilecek hiçbir etkinin olmadığından emin olmak için kör kontrole ek olarak bu çalışmada negatif kontrol olarak DMSO kullanıldı. Tüm deneylerde, veriler, gözlemlenen DMSO'dan önemli bir etki olmadığını ve negatif kontrolden türetilen tüm nicel verilerin, boş kontrolünkilerle karşılaştırılabilir olduğunu gösterdi.
COM kristalizasyon tahlili, tüm konsantrasyonlarındiosmin(2.5, 5, 10, 20, 40, 80 ve 160nM) COM kristal boyutunu azaltabilir, ancak diğer yandan kristal sayısını arttırabilir. Kristal kütlesi hem kristal boyutunun hem de sayısının son ürünü olduğundan ve COM kristalizasyon derecesini yansıtmakla daha alakalı olduğundan, daha sonra diosmin'in bu kristal indeksini etkileyip etkilemediğini değerlendirdik. Veriler, tüm diosmin konsantrasyonlarının, kristal sayısı hakkındaki verilerle tutarlı olarak, COM kristal kütlesi üzerinde teşvik edici etkiye sahip olduğunu gösterdi. Kristalizasyondan sonra, COM kristalleri bir sonraki adım için daha büyük boyuta büyüyebilir.böbrektaş oluşumu.
Kristalizasyonun aksine, tüm konsantrasyonlarda diosmin, doza bağlı bir şekilde COM kristal büyümesi üzerinde inhibitör etki gösterdi. Daha önceki bazı çalışmalar, CaOx kristallerinin çözünürlüğünün, glikosilasyonlu hidroksiantrakinon türevleri ile artırılabileceğini bildirmiştir [45]. Ek olarak, bu tür biyoaktif bileşiklerdeki şekerlerin varlığı, muhtemelen moleküler yapıdaki hidroksil grupları nedeniyle serbest kalsiyum iyonuna bağlanabilir ve böylece CaOx kristallerinin oluşumunu engelleyebilir [45,46]. Diosmin ayrıca, bu mekanizmaya dayalı COM kristalizasyonu sürecinde, çözünmüş kalsiyum ve oksalat iyonlarının renal tübüler sıvıdaki COM kristalli partiküllere geçişini de etkileyebilir.
Bununla birlikte, COM kristal agregasyonu 10-160nM tarafından desteklendidiosmindiosminin, kristal kümelerini oluşturmak üzere birbirine bağlanmak üzere tek tek kristalleri toplamak için bir bağlayıcı veya yapışkan molekül olarak hareket etme kabiliyetini ima eder. Bu bağlanma aynı zamanda bireysel kristaller arasında yapışkan köprülerin ilerlemesi ile sonuçlanır ve COM kristallerinin büyük yapı oluşumunu indükleyebilir, bu da taş nidusun içinde kolayca birikmesine katkıda bulunur.böbrek[32].
Kristallerin renal tübüler hücre yüzeylerine yapışması yoluyla COM kristal retansiyonu, böbrek taşı oluşumu için bir başka önemli adım olarak belirlenmiştir [47]. Verilerimiz, diosmin'in, COM kristallerinin MDCK renal tübüler hücrelerinin apikal yüzeylerine bağlanma kabiliyetini azaltabileceğini ortaya koydu. Önceki bazı çalışmalar, CaOx kristalleri üzerine kaplanmış veya renal tübüler hücreler üzerinde eksprese edilen glikozaminoglikanların (polisakkarit bileşikleri), CaOx kristallerinin renal tübüler hücrelere yapışma kabiliyetine müdahale edebileceğini göstermiştir [48]. Ek olarak, renal tübüler hücreler üzerindeki kristal reseptörlerin ekspresyonu, kristal hücre adezyonunu belirleyen önemli mekanizmalardan biridir [21]. CaOx kristalleri apikal membranların, özellikle mikrovillilerin yaralanmasına neden olurken, epigallocatechin gallate (EGCG) gibi bazı polifenoller, kristal hücre yapışmasını ve hücresel hasarı önleyebilir [49]. Ayrıca, çeşitli bitki ekstraktlarındaki flavonoid maddenin idrar pH seviyesini arttırdığı ve kristal hücre yapışmasının inhibisyonuna yol açtığı daha önce bildirilmiştir [50,51]. Belki,diosminayrıca COM tarafından indüklenen bu tür hücresel hasarı hafifletebilir, böylece kristal hücre yapışmasını azaltabilir.
COM kristal içselleştirmesinin esas olarak aktin hücre iskeleti aracılı makropinositoz yolu yoluyla endositoz ile ortaya çıktığı gösterilmiştir [40]. Quercetin gibi flavonoidlerin, makropinositoz için gerekli olan aktin hücre iskeletini etkilediği bildirilmiştir [52,53]. Bulgularımız, diosmin'in MDCK hücrelerinin COM kristallerini içselleştirme yeteneğini önemli ölçüde azalttığını gösterdi. Diosminin bu tür inhibitör etkisi, makropinositoz yolunu doğrudan etkileyen hücreler içinde aktin hücre iskeletinin toplanması veya organizasyonu ile ilişkili olabilir [54,55].
İçselleştirmeden sonra, COM kristalleri endolizozomlar tarafından bozunur ve bu da renal interstisyumda serbest kalsiyum ve oksalat iyonlarının artmasına neden olur [37]. Kalsiyum ve oksalat iyonlarındaki bu tür artışlar, renal interstisyumda COM neokristalizasyonuna yol açabilir [56,57]. Ek olarak, interstisyel COM kristallerinin varlığı, artan paraselüler geçirgenlik ve kristal translokasyonu ile sonuçlanan sıkı bağlantı ve paraselüler adhezyon bariyerlerinin kusurlarından olabilir [58-60]. Bu kristaller daha sonra ECM yoluyla renal interstisyumu istila edebilir ve daha sonra birkaç inflamatuar yanıtı ve doku hasarını tetikleyebilir [58-60]. Bu çalışmada, COM kristallerinin ECM göç odası yoluyla istilasının tüm diosmin konsantrasyonları tarafından indüklendiğini gözlemledik. Diosmin, COM kristal yüzeylerine bağlanabilir ve ECM göç odasında kristal göçünü sağlayan plazminojen-plazmin sistemi ile etkileşime girebilir [38,39].
böbrek için cistanche
ÇünküdiosminCOM taş oluşumunun farklı çeşitli süreçleri üzerinde hem inhibe edici hem de teşvik edici etkileri indükledik, bu nedenle Pearson korelasyon testi kullanarak aralarındaki ilişkiyi belirledik. Korelasyon analizi, kristal sayısının hem kristal boyutu hem de kristal büyümesi (Δ Kristal boyutu) ile ters orantılı olduğunu ortaya çıkardı (Şekil 7A ve B). Kristal boyutu, kristal büyümesi ile güçlü bir şekilde ilişkilidir (Şekil 7C), ancak kristal kütlesi ile ters orantılıdır (Şekil 7D). Son olarak, kristal kütlesi hem kristal sayısı hem de kristal agregasyonu ile güçlü bir şekilde ilişkilidir (Şekil 7E ve F). Korelasyon analizinden elde edilen veriler, kristal sayısı ve kristal kütlesinin kristal boyutundan ziyade kristalleşmeyi yansıtmak için daha uygun olduğunu göstermektedir (Şekil 7A, D ve E). Ek olarak, kristalizasyon sırasında neokristallerin boyutu, önceden oluşturulmuş kristallerin büyümesi ile ilişkilidir (Şekil 7C), oysa kristalleşme derecesi (kristal sayısı ve kristal kütlesi tarafından yansıtıldığı gibi) kristal agregasyon derecesi ile yakından ilişkilidir (Şekil 7E ve F). Bununla birlikte, bu korelasyonlar büyük olasılıkla diosmin etkilerine özgüyken, diğer modülatörlerin etkileri aynı korelasyonlara sahip olabilir veya olmayabilir. Örneğin, fibronektin kristal kütlesini azaltır ve kristal büyümesini engeller, ancak kristal agregasyonunu teşvik eder [31]. Ek olarak, bozulmamış canlı Escherichia coli, kristal boyutunu ve kütlesini arttırır ancak kristal sayısı üzerinde hiçbir etkisi yoktur [33]. Bu veriler, çeşitli COM kristal tahlilleri arasındaki korelasyonların tüm modülatörler için evrensel olmadığını gösterir.
Son olarak, çeşitli tahlillerden elde edilen sonuçları özetledik ve bunları patojenik mekanizmalarla bütünleştirdik.böbrektaş hastalığı (Şekil 8'deki şemalara bakın). Korelasyon analizinden, diosmin kristalleşmeyi destekler (Şekil 8A). Kristalleşme ve kristal büyümesi arasında,diosminkristalleşmeyi teşvik ederek iyi bir denge sağlar, ancak diğer yandan kristal büyümesini engeller (Şekil 8B). Tek başına COM kristalleri üzerindeki tüm etkilerle ilgili olarak (aynı zamanda müdahale eden hücreler ve ECM dikkate alınmadan), diosminin teşvik edici aktivitesi, hem kristalleşmeyi hem de kristal agregasyonunu teşvik ettiği, ancak sadece kristal büyümesini engellediği için COM kristalleri üzerindeki inhibe edici aktivitesinden daha belirgindir ( Şekil 8C). Kristalleşme artmasına rağmen, kristal boyutu azalır ve büyüme inhibisyonu ile ilişkilidir (Şekil 7C). Bu veriler Kavanagh ve ark. [61-63], kristalleşmenin artmasının çözeltideki kalsiyum ve oksalat iyonlarının aşırı doygunluğunun azalmasına yol açtığını ve böylece büyümeyi azalttığını gösterdi. Bununla birlikte, kristal büyümesi belirleyici olan tek faktör değildir.böbrektaş patogenezi [64], özellikle kristal kütlesi baskın olduğunda ve kristal malzemelerin küçük tübüler segmentlerde (intratübüler hipotezde) sıkışma şansını artırabilen kristal agregasyonundaki artışla ilişkili olduğunda (Şekil 7F) taş oluşum şansı. Ayrıca, önceki bir çalışma, kristal sayısındaki artışın kristal agregasyonundaki artış ve taş büyümesi ile ilişkili olduğunu gösteren bulgularımızla uyumlu verileri göstermiştir [63].
Şekil 7. Korelasyon analizi. (A)–(F): COM kristal sayısı, kristal boyutu, Δ Kristal boyutu, kristal kütlesi ve bir dizi kristal agregası arasındaki korelasyonlar Pearson korelasyon testi ile analiz edildi..
Şekil 8. Modülatör etkilerini özetleyen şemalardiosminCOM'daböbrektaş oluşum süreçleri. (A): diosmin'in COM kristalizasyonu üzerindeki etkileri. (B): diosmin'in COM kristalizasyonu ve kristal büyümesi üzerindeki etkileri. (C): diosmin'in COM kristalizasyonu, büyümesi ve toplanması üzerindeki etkileri. (D): Diosmin'in tüm COM böbrek taşı oluşum süreçleri üzerindeki etkileri.
Renal tübüler hücreler ve ECM ile etkileşimler düşünüldüğünde,diosminCOM'da böbrek taşı oluşumu çok daha belirgin hale gelir (Şekil 8D). Diosmin, kristal hücre yapışmasını engeller, böylece kristalin hücrelere içselleşmesini azaltır. Bu, daha küçük boyutlu COM kristallerinin, son çalışmamızda [34] ve başka bir grup tarafından önceki çalışmada [65] bildirildiği gibi, daha büyük olanlara kıyasla renal tübüler hücreleri bağlamada daha az yapışkanlık kabiliyetine sahip olduğu açıklanabilir. Daha küçük COM kristallerinin daha az yapışma kabiliyeti, hücre yüzeyine daha az yapışma kuvvetinden ve sırasıyla atomik kuvvet mikroskobu ve proteom analizi ile belirlendiği üzere bunlara bağlı daha az sayıda COM kristal reseptöründen kaynaklanmaktadır [34]. Diosmin ayrıca kristal içselleştirmeyi de engeller. İçselleştirme sürecinin dikkatli yorumlanması gereken iki ucu keskin bir kılıç olduğunu unutmayın. Hücrelerin endolizozomlar tarafından kristalleri ortadan kaldırmak için kullandığı savunma mekanizmalarından birinde içselleştirme veya endositoz. Bununla birlikte, bozulmamış kristallerin bozunması, hücre içi bölmeden neokristaller üretebilecekleri renal interstisyuma hareket edebilen serbest kalsiyum ve oksalat iyonları üretir [56,57]. Öte yandan, diosmin, böbrek taşı patogenezi için önemli mekanizmalardan biri olan (özellikle Randall'ın plak modelinde) ECM yoluyla kristal istilasını teşvik eder [58-60]. Genel olarak, Şekil 8D, diosmin'in COM üzerindeki tüm ikili modülatör etkilerini özetler.böbrektaş oluşum süreçleri. Bu teşvik edici ve engelleyici etkilerin dengesinin (matematiksel bir denklemden farklı olarak) tam olarak hesaplanamayacağına dikkat edilmelidir. Ayrıca, taş oluşum süreçlerine de müdahale edebilen başka içsel ve dışsal faktörler de vardır. Son olarak, diosmin ayrıca, göz önünde bulundurulması gereken antioksidan ve anti-inflamatuar özellikleri de dahil olmak üzere böbrek taşı oluşumu üzerinde birkaç dolaylı etki gösterir [5,6]. Bu nedenle, bu ikili modülatör etkilerin nihai sonucudiosminCOM'daböbrektaş oluşumu için daha fazla in vivo araştırma ve geniş kohort prospektif çalışmaya ihtiyaç vardır.
5. Sonuçlar
Özetle, burada diosminin COM kristal modülasyonu üzerindeki ikili etkilerini doza bağlı bir şekilde rapor ediyoruz. COM kristal büyümesini, kristal hücre yapışmasını ve renal tübüler hücrelere içselleşmeyi engellerken,diosminECM yoluyla COM kristalleşmesini, kümelenmesini ve istilasını destekler. Bu nedenle antiürolitiazis rolü şüphelidir ve böbrek taşı hastalığında kullanımı için dikkatli olunmalıdır.
CRediT yazarlık katkı beyanı
Supaporn Khamchun: Kavramsallaştırma, Metodoloji, Yazılım, Doğrulama, Resmi analiz, Araştırma, Veri küratörlüğü, Yazma – orijinal taslak, Görselleştirme, Sunisa Yoodee: Kavramsallaştırma, Metodoloji, Yazılım, Doğrulama, Resmi analiz, Araştırma, Veri küratörlüğü, Yazma – orijinal taslak, Görselleştirme, Thongboonkerd'i Ziyaret Edin: Kavramsallaştırma, Metodoloji, Yazılım, Doğrulama, Kaynaklar, Yazma – inceleme ve düzenleme, Denetim, Proje yönetimi, Finansman edinme.
Çıkar çatışması beyanı
Yazarlar çıkar çatışması YOKTUR.
Teşekkür
Kittiya Suwannakud'un teknik yardımı için minnettarız. Bu çalışma, Ulusal Yüksek Öğrenim Bilim Araştırma ve Yenilik Politikası Konseyi Ofisi (NXPO) tarafından PMU-B ve Tayland Araştırma Fonu (IRN60W0004) aracılığıyla desteklenmiştir. VT, Siriraj Hastanesi Tıp Fakültesi "Chalermphrakiat" Grant tarafından da desteklenmektedir.
Referanslar
[1] A. Bogucka-Kocka, M. Wozniak, M. Feldo, J. Kockic, K. Szewczyk,diosmin– izolasyon teknikleri, bitki materyalinde ve farmasötik formülasyonlarda belirleme ve klinik kullanım, Nat. Ürün Komün. 8 (2013) 545–550.
[2] Y. Zheng, R. Zhang, W. Shi, L. Li, H. Liu, Z. Chen, L. Wu, Doğal sağlığa faydalı bileşik diosmin'in metabolizması ve farmakolojik aktiviteleri, Food Funct. 11 (2020) 8472–8492.
[3] MR Cesarone, G. Belcaro, L. Pellegrini, A. Ledda, G. Vinciguerra, A. Ricci, A. Di Renzo, I. Ruffini, G. Gizzi, E. Ippolito, F. Fano, M. Dugall , G. Acerbi, U. Cornelli, M. Hosoi, M. Cacchio, Venoruton vs Daflon: kronik venöz yetmezlikte yaşam kalitesi üzerindeki etkilerin değerlendirilmesi, Angiology 57 (2006) 131–138.
[4] KA Lyseng-Williamson, CM Perry, Mikronize saflaştırılmış flavonoid fraksiyonu: kronik venöz yetmezlik, venöz ülserler ve hemoroidlerde kullanımının gözden geçirilmesi, Drugs 63 (2003) 71–100.
[5] AS Shalkami, M. Hassan, AG Bakr, Anti-inflamatuar, asetik asit kaynaklı ülseratif kolitte diosmin'in antioksidan ve anti-apoptotik aktivitesi, Hum. Tecrübe. Toksikol. 37 (2018) 78–86.
[6] M. Berkoz, Diosmin, lipopolisakkarit ile indüklenen RAW264.7 makrofajlarındaki proinflamatuar mediatörleri NF-kappaB ve MAPKs sinyal yolları aracılığıyla baskılar, Gen. Physiol. Biyofiz. 38 (2019) 315–324.
[7] M. Rajasekar, K. Suresh, K. Sivakumar, Diosmin, 7,12 dimetilbenz(a)antrasen kaynaklı zararlı bukkal kese karsinogenezinde STAT-3 sinyallemesinin modülasyonu yoluyla apoptozu indükler, Biomed. Eczacılık 83 (2016) 1064–1070.
[8] A. Lewinska, J. Adamczyk-Grochala, E. Kwasniewicz, A. Deregowska, M. Wnuk, Diosmin kaynaklı yaşlanma, apoptoz ve farklı p53 durumu ve ERK aktivitesi meme kanseri hücrelerinde otofaji, Toxicol. Lett. 265 (2017) 117–130.
[9] AC Pushkaran, V. Vinod, M. Vanuopadath, SS Nair, SV Nair, AK Vasudevan, R. Biswas, CG Mohan, Amoksisilin-klavulanik asit ile yeniden kullanılan ilaç diosmin kombinasyonu, mikobakteriyel büyümenin sinerjik inhibisyonuna neden olur, Sci. 9 (2019) 6800.
[10] CC Hsu, MH Lin, JT Cheng, MC Wu, Bir narenciye flavonoidi olan diosmin'in antihiperglisemik etkisi, tip I benzeri diyabetik sıçanlarda endojen beta-endorfin yoluyla indüklenir, Clin. Tecrübe. Eczacılık Fizol. 44 (2017) 549–555.
[11] O. Senthamizhselvan, J. Manivannan, T. Silambarasan, B. Raja,diosminön tedavi, kardiyak fonksiyonu iyileştirir ve iskemi/reperfüzyondan sonra sıçan kalbindeki oksidatif stresi bastırır, Eur. J. Ecz. 736 (2014) 131–137.
[12] N. Tong, Z. Zhang, Y. Gong, L. Yin, X. Wu, Diosmin, sıçan retinasını iskemi/reperfüzyon hasarından korur, J. Ocul. Eczacılık orada. 28 (2012) 459-466.
[13] AE Elhelaly, G. AlBasher, S. Alfarraj, R. Almeer, EI Bahbah, MMA Fouda, SG Bungau, L. Aleya, MM Abdel-Daim, Hesperidin ve diosmin'in akrilamid kaynaklı karaciğer, böbrek, ve sıçanlarda beyin oksidatif hasarı, Environ. bilim Kirlilik. Araş. Int. 26 (2019) 35151–35162.
[14] C. Thongprayoon, AE Krambeck, AD Rule, Gerçek yükünün belirlenmesiböbrektaş hastalığı, Nat. Nefrol. 16 (2020) 736–746.
[15] K. Bishop, T. Momah, J. Ricks, Nephrolithiasis, Prim. Bakım 47 (2020) 661–671.
[16] A. Viljoen, R. Chaudhry, J. Bycroft, Böbrek taşları, Ann. Klinik. Biochem 56 (2019) 15–27.
[17] PM Ferraro, R. Marano, A. Primiano, J. Gervasoni, M. Bargagli, G. Rovere, PF Bassi, G. Gambaro, Nefrolitiazisli hastalarda taş bileşimi ve vasküler kalsifikasyonlar, J. Nephrol. 32 (2019) 589–594.
[18] G. Schubert, Taş analizi, Urol. Araş. 34 (2006) 146–150.
[19] A. Vinaiphat, S. Aluksanasuwan, J. Manissorn, S. Sutthimethakorn, V. Thongboonkerd, Renal tübüler hücrelerin farklı tip ve dozlarda kalsiyum oksalat kristallerine yanıtı: bütünleştirici proteom ağ analizi ve işlevsel araştırmalar, Proteomiks 17 (2017) ), 1700192.
[20] P. Peerapen, S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Protein ağ analizi ve renal tübüler epitel hücrelerinde kalsiyum oksalat kristalinin neden olduğu sitotoksisitenin fonksiyonel çalışmaları, Proteomiks 18 (2018), 1800008.
[21] KP Aggarwal, S. Narula, M. Kakkar, C. Tandon, Nefrolithiasis: renal taş oluşumunun moleküler mekanizması ve modülatörlerin oynadığı kritik rol, Biomed. Araş. Int. 2013 (2013), 292953.
[22] VN Ratkalkar, JG Kleinman, Taş oluşum mekanizmaları, Clin. Rev. Kemik Madenci. Metab. 9 (2011) 187–197.
[23] X. Zeng, Y. Xi, W. Jiang, Flavonoidlerin ve flavonoid bakımından zengin bitki özlerinin ürolitiyazise karşı koruyucu rolleri: bir inceleme, Kritik. Rev. Gıda Bilimi. Nutr. 59 (2019) 2125–2135.
[24] MC Nirumand, M. Hajialyani, R. Rahimi, MH Farzaei, S. Zingue, SM Nabavi, A. Bishayee, Diyet bitkileriböbrektaşlar: klinik öncesi ve klinik kanıtlar ve moleküler mekanizmalar, Int. J. Mol. bilim 19 (2018) 765.
[25] S. Ahmed, MM Hasan, H. Khan, ZA Mahmood, S. Patel, Kalsiyum oksalat ürolitiyazis hafifletmede polifenollerin mekanik anlayışı, Biomed. Eczacılık 106 (2018) 1292–1299.
[26] VV Prabhu, D. Sathyamurthy, A. Ramasamy, S. Das, M. Anuradha, S. Pachiappan, Deney farelerinde kimyasal kaynaklı ürolitiyaziste diosmin'in (bir narenciye flavonoidi) koruyucu etkilerinin değerlendirilmesi, Ecz. Biol. 54 (2016) 1513–1521.
[27] A. Noorafshan, S. Karbalay-Doust, F. Karimi,diosminsıçanlarda böbrek taşı hastalığında kalsiyum oksalat birikimini ve doku dejenerasyonunu azaltır: stereolojik bir çalışma, Korece J. Urol. 54 (2013) 252–257.
[28] V. Thongboonkerd, T. Semangoen, S. Chutipongtanate, Kalsiyum oksalat kristallerinin tiplerini ve morfolojilerini belirleyen faktörler: molar konsantrasyonlar, tamponlama, pH, karıştırma ve sıcaklık, Clin. Chim. Açta 367 (2006) 120-131.
[29] V. Thongboonkerd, T. Semangoen, S. Sinchaikul, ST Chen, Distal renal tübüler hücrelerde kalsiyum oksalat monohidrat kristalinin neden olduğu sitotoksisitenin proteomik analizi, J. Proteome Res. 7 (2008) 4689–4700.
[30] P. Amimanan, R. Tavichakorntrakool, K. Fong-ngern, P. Sribenjalux, A. Lulitanond, V. Prasongwatana, C. Wongkham, P. Boonsiri, WJ Umka, V. Thongboonkerd, Uzama faktörü Tu on Escherichia coli böbrek taşı hastalarının idrarından izole edilen kalsiyum oksalat kristal büyümesini ve agregasyonunu teşvik eder, Sci. 7 (2017) 2953.
[31] S. Khamchun, K. Sueksakit, S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Fibronektinin kalsiyum oksalat kristalizasyonu, büyümesi, toplanması, renal tübüler hücrelere yapışması ve hücre dışı matris yoluyla istilası üzerindeki modülatör etkileri, J. Biol. Inorg. Kimya 24 (2019) 235–246.
[32] S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Kalsiyum oksalat kristal agregasyonunun derecesini değerlendirmek için agregasyon indekslerinin tanımlanması ve sistematik analizleri, Front. Kimya 5 (2017) 113.
[33] R. Kanlaya, O. Naruepantawart, V. Thongboonkerd, Flagellum, canlı Escherichia coli'nin kalsiyum oksalat kristalizasyonu, kristal büyümesi ve kristal agregasyonu üzerindeki etkilerini teşvik etmekten sorumludur, Front. Mikrobiyol 10 (2019) 2507.
[34] P. Peerapen, V. Thongboonkerd, Farklı boyutlardaki kalsiyum oksalat monohidrat kristallerinin diferansiyel bağlı proteinleri ve yapışma yetenekleri, Int. J. Biol. Makromol. 163 (2020) 2210–2223.
[35] K. Fong-ngern, K. Sueksakit, V. Thongboonkerd, Yüzey ısı şoku proteini 90, renal tübüler epitel hücrelerinin apikal membranı üzerindeki kalsiyum oksalat kristali için potansiyel bir reseptör olarak hizmet eder, J. Biol. Inorg. Kimya 21 (2016) 463-474.
[36] S. Chaiyarit, S. Mungdee, V. Thongboonkerd, Kristal-hücre etkileşimi ve içselleştirme araştırmaları için kalsiyum oksalat kristallerinin radyoaktif olmayan etiketlenmesi, Anal. Yöntem 2 (2010) 1536–1541.
[37] S. Chaiyarit, N. Singhto, V. Thongboonkerd, Kalsiyum oksalat monohidrat kristalleri renal tübüler hücrelere içselleştirilir ve endolizozomlar tarafından çözülür, Chem. Biol. Etkileşime girmek. 246 (2016) 30–35.
[38] W. Chiangjong, V. Thongboonkerd, Plazminojen/plazmin aktivitesine dayalı olarak hücre dışı matris yoluyla proteinlerin kalsiyum oksalat kristal istilası üzerindeki teşvik edici etkilerini değerlendirmek için yeni bir tahlil, Talanta 101 (2012) 240–245.
[39] W. Chiangjong, V. Thongboonkerd, Kalsiyum oksalat kristalleri renal tübüler hücrelerden enolaz-1 sekresyonunu arttırdı, bu da daha sonra renal interstisyum yoluyla kristal ve monosit istilasını arttırdı, Sci. 6 (2016) 24064.
[40] R. Kanlaya, K. Sintiprungrat, S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Makropinositoz, kalsiyum oksalat kristallerinin renal tübüler hücrelere endositozu için ana mekanizmadır, Cell Biochem. Biyofiz. 67 (2013) 1171–1179.
[41] S. Sassanarakkit, P. Peerapen, V. Thongboonkerd, StoneMod: a database for forböbrekdeneysel kanıtlara sahip taş modülatör proteinler, Sci. 10 (2020) 15109.
[42] G. Eraslan, ZS Sarıca, LC Bayram, MY Tekeli, M. Kanbur, M. Karabacak, Diosmin'in aflatoksin kaynaklı karaciğer ve böbrek hasarı üzerindeki etkileri, Environ. bilim Kirlilik. Araş. Int. 24 (2017) 27931–27941.
[43] R. Russo, D. Chandradhara, N. De Tommasi, İki ürünün karşılaştırmalı biyoyararlanımıdiosminsağlıklı gönüllülere oral uygulamadan sonra formülasyonlar, Molecules 23 (2018) 2174.
[44] JQ Silveira, TB Cesar, JA Manthey, EA Baldwin, J. Bai, S. Raithore, Sağlıklı insanlarda ticari olarak işlenmiş portakal suyuna karşı tek doz taze sıkılmış portakal suyu alımından sonra flavanon glikozitlerin farmakokinetiği, J. Agric . Gıda Kimyası 62 (2014) 12576–12584.
[45] A. Frackowiak, P. Skibinski, W. Gawel, E. Zaczynska, A. Czarny, R. Gancarz, Kalsiyum oksalat kristallerinin oluşumunu engelleme ve çözme yeteneğine sahip hidroksiantrakinonun glikozit türevlerinin sentezi. Böbrek taşı tedavisinde potansiyel bileşikler, Eur. J. Med. Kimya 45 (2010) 1001–1007.
[46] F. Grases, J. Perello, B. Isern, RM Prieto, Distrofik kalsinozis kutisi önlemek için myo-inositol heksafosfat bazlı kremin incelenmesi, Br. J. Dermatol. 152 (2005) 1022–1025.
[47] V. Thongboonkerd, Kristal-hücre etkileşimlerinin proteomikleri: böbrek taşı araştırması için bir model, Hücreler 8 (2019) 1076.
[48] CF Verkoelen, Renal taş hastalığında kristal tutulması: glikozaminoglikan hyaluronan için çok önemli bir rol? J. Am. Soc. Nefrol. 17 (2006) 1673-1687.
[49] K. Fong-ngern, A. Vinaiphat, V. Thongboonkerd, Kalsiyum oksalat kristali tarafından indüklenen renal tübüler epitel hücrelerinde Microvillar hasarı ve epigallocatechin-3-gallat'ın koruyucu rolü, FASEB J. 31 (2017) 120 -131.
[50] J. Zhou, J. Jin, X. Li, Z. Zhao, L. Zhang, Q. Wang, J. Li, Q. Zhang, S. Xiang, Total flavonoids of Desmodium styracifolium, hidroksi- oluşumunu hafifletir. Sıçanlarda L- prolin kaynaklı kalsiyum oksalat ürolitiyazis, Urolithiasis 46 (2018) 231-241.
[51] J. Manissorn, K. Fong-ngern, P. Peerapen, V. Thongboonkerd, İdrar pH'ının kalsiyum oksalat kristalizasyonu, kristal hücre yapışması ve renal tübüler hücrelere içselleştirme üzerindeki etkileri için sistematik değerlendirme, Sci. 7 (2017) 1798.
[52] S. Cui, J. Qian, P. Bo, Aktin hücre iskeleti interferansı yoluyla quercetin ile ön tedavi ile indüklenen Candida albicans'ın fagositozu üzerindeki inhibe edici etki, J. Tradit. Çene. Med. 33 (2013) 804-809.
[53] S. Cui, Q. Wu, J. Wang, M. Li, J. Qian, S. Li, Quercetin, iNOS/FAK/paxillin yolunu baskılayarak ve hücre iskeletini modüle ederek LPS kaynaklı makrofaj göçünü inhibe eder, Cell Adhes . Göçmen 13 (2019) 1–12.
[54] Y. Li, WG Gonzalez, A. Andreev, W. Tang, S. Gandhi, A. Cunha, D. Prober, C. Lois, ME Bronner, Macropinocytosis-aracılı membran geri dönüşümü, F- ileterek nöral krest göçünü yönlendirir. lamellipodyuma aktin, Proc. Natl. Acad. bilim ABD 117 (2020) 27400–27411.
[55] H. Inaba, K. Yoda, H. Adachi, The F-actin-binding RapGEF GflB, Dictyostelium'da etkin makropinositoz için gereklidir, J. Cell Sci. 130 (2017) 3158–3172.
[56] A. Khan, Prevalans, patofizyolojik mekanizmalar ve ürolitiazisi etkileyen faktörler, Int. Urol. Nefrol. 50 (2018) 799-806.
[57] AP Evan, EM Worcester, FL Coe, J. Williams Jr., JE Lingeman, İnsan böbrek taşı oluşum mekanizmaları, Urolithiasis 43 (Ek 1) (2015) 19–32.
[58] S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Mitokondriyal disfonksiyon veböbrektaş hastalığı, Ön. Fizol. 11 (2020), 566506.
[59] SR Khan, Taş oluşumunun "sabit parçacık" modelinin histolojik yönleri: hayvan çalışmaları, Urolithiasis 45 (2017) 75-87.
[60] VY Bird, SR Khan, Taşlar nasıl oluşur? Taş oluşumu ile ilgili teorilerin birleştirilmesi mümkün müdür? Kemer Esp. Urol. 70 (2017) 12–27.
[61] JP Kavanagh, Kalsiyum oksalat kristalizasyonu çalışması için yöntemler ve bunların ürolitiyazis araştırmalarına uygulanması, Scanning Microsc. 6 (1992) 685–704, tartışma 704-5.
[62] JP Kavanagh, L. Jones, PN Rao, Kalsiyum oksalat kristalizasyon kinetiği, insan ve yapay idrarın farklı konsantrasyonlarında, sabit kalsiyum oksalat oranı, Urol. Araş. 27 (1999) 231–237.
[63] NK Saw, PN Rao, JP Kavanagh, A. nidus, kristalüri ve kümelenme: taş büyütme için temel bileşenler, Urol. Araş. 36 (2008) 11–15.
[64] A. Borissova, GE Goltz, JP Kavanagh, TA Wilkins, Tersine mühendislik böbreği: nefronda kalsiyum oksalat monohidrat kristalleşmesini modelleme, Med. Biol. Müh. Bilgisayar. 48 (2010) 649–659.
[65] LA Thurgood, ES Sorensen, RL Ryall, Ultrafiltrelenmiş insan idrarında kalsiyum oksalat dihidrat kristallerinin Madin-Darby köpek böbrek (MDCK) hücrelerine bağlanmasında intrakristal ve yüzeye bağlı osteopontinin etkisi, BJU Int. 109 (2012) 1100–1109.
