Ekinakozid Miyokardiyal Yeniden Şekillenmeyi Tersine Çevirir ve Kalp Fonksiyonunu İyileştirir

İletişim:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Yajuan Ni1|Jie Deng1|Xin Liu1|Qing Li1|Juanli Zhang1|Hongyuan Bai1|Jingwen Zhang2

Soyut

Miyokardiyal yeniden şekillenme, HF'nin önemli bir patolojik temelidir, mitokondriyal oksidatif stres, miyokardiyal hipertrofi, fibroz ve apoptozun bir promotörüdür. ECH, geleneksel Çin tıbbı Cistanches Herba'nın ana aktif bileşenidir, birçok çalışma, sinir hücrelerinde ve tümörlerde güçlü bir antioksidan kapasiteye sahip olduğunu, mitokondriyal oksidatif stresi engellediğini, mitokondriyal fonksiyonu koruduğunu göstermektedir, ancak spesifik mekanizma belirsizdir. SIRT1/FOXO3a/MnSOD önemli bir antioksidan eksendir, çalışma ECH'nin bir ligand olarak SIRT1'e kovalent olarak bağlandığını ve beyin hücrelerinde SIRT1 ekspresyonunu yukarı doğru düzenlediğini bulur. ECH'nin SIRT1/FOXO3a/MnSOD sinyal eksenini düzenleyerek ve kardiyomiyositlerde mitokondriyal oksidatif stresi inhibe ederek miyokardiyal yeniden şekillenmeyi tersine çevirebileceğini ve HF'nin kalp fonksiyonunu iyileştirebileceğini varsayıyoruz. Burada, ilk olarak, AC-16 hücreleri ile ISO tarafından hücresel bir oksidatif stres modelini indükledik ve ECH, mitokondriyal ROS seviyesi, mtDNA oksidatif hasar, MMP, karbonillenmiş protein, lipid peroksidasyonu, hücre içi ROS ve ECH ile ön işleme tabi tuttuk. apoptoz tespit edilir, ECH'nin mitokondriyal oksidatif stres üzerindeki etkisini ve in vitro işlevi doğrular. Ardından, ISO tarafından indüklenen bir HF sıçan modeli oluşturuyoruz ve ECH ile ön işleme tabi tutuyoruz. Kalp fonksiyonu, miyokardiyal yeniden şekillenme, mitokondriyal oksidatif stres ve fonksiyon indeksleri, SIRT1/FOXO3a/MnSOD sinyal ekseninin ifadesi ölçülür, veriler ECH'nin kalp fonksiyonunu iyileştirdiğini, miyokardiyal hipertrofiyi, fibrozu ve apoptozun SIRT1/FOXO3a/ ifadesini arttırdığını gösterir. MnSOD sinyal ekseni, mitokondriyal oksidatif hasarları azaltır, mitokondriyal fonksiyonu korur. ECH'nin SIRT1/FOXO3a/MnSOD eksenini yukarı doğru düzenleyerek ve HF sıçanlarında mitokondriyal oksidatif stresi inhibe ederek miyokardiyal yeniden şekillenmeyi tersine çevirdiği ve kalp fonksiyonunu iyileştirdiği sonucuna vardık.

ANAHTAR KELİMELERTekinakozid, kalp yetmezliği, mitokondriyal oksidatif stres, miyokardiyal yeniden şekillenme

taze otlar cistancheilemitokondriyal oksidatif stres

1|GİRİİŞ

Kalp yetmezliği (KY), yüksek prevalansı ve kötü prognozu olan çoğu kardiyovasküler hastalığın nihai sonucudur ve yaşlanan bir popülasyonun ağırlaştırıcı eğilimi ile birlikte, kronik kalp yetmezliğine (KKY) bağlı hastaneye yatış ve mortalite tüm dünyada keskin bir şekilde artmıştır.1 Son 20 yılda kalp yetmezliği için ilaç tedavileri büyük ilerleme kaydetti, ancak etkisi çok sınırlı, bu nedenle acilen yeni ilaçlara ihtiyaç var. Miyokardiyal yeniden şekillenme, KY'nin önemli bir patolojik temelidir ve miyokardiyal hipertrofi, apoptoz, interstisyel fibroz, miyokardiyal hücreler düzensizdir ve ejeksiyon fraksiyonunun (LVEF) azalmasına, sol ventrikül diyastol sonu ve sistolik boyutların artmasına neden olur. (LVIDd ve LVID'ler) ve sol ventrikül fraksiyonel kısalmanın azalması (LVFS).2 Ancak altta yatan mekanizmalar hala tam olarak anlaşılamamıştır. Son yıllarda, çok sayıda çalışma oksidatif stresin miyokardiyal yeniden şekillenmenin önemli bir destekleyicisi olduğunu doğrulamıştır.3-7

Oksidatif stres, reaktif oksijen türlerinin (ROS) veya serbest radikallerin aşırı üretildiği ve hücre bileşenlerinde oksidatif hasara yol açtığı, bu da hücre işlev bozukluğuna neden olduğu bir durumdur.8 Mitokondri, hücre içi ROS'un ana kaynağıdır. solunum elektron taşıma zincirinden sızıntı ve mitokondri, ROS etkilerine karşı en hassas konumdur.9 HF'deki çalışmalar, solunum zincirinin kompleks I'inden artan ROS oluşumunu tespit etti.8 Artan ROS üretimi, öncelikle mitokondriyal bileşenlere saldırır ve aşırı oksidatif strese neden olur. , proteinlerin karbonilasyonu, lipid peroksidasyonu ve DNA hasarı,10 ve mitokondri disfonksiyonu, sonuç olarak aşırı ROS oluşumuna yol açan8 bir kısır döngü oluşturur. Sürdürülen oksidatif stresin miyokardiyal hipertrofiye ve miyokardiyal fibrozise neden olabileceği,11-13 ve mitokondriyal membran proteinlerinin karbonilasyonu ve mitokondriyal membran potansiyelinin kaybı sonucunda mitokondriye bağımlı apoptoz aktivasyonu yoluyla miyokardiyal hücrelerin apoptozisine neden olabileceği gösterilmiştir.14 Yani , mitokondriyal oksidatif stresin inhibisyonunun, miyokardiyal yeniden şekillenmeyi ve hatta HF'yi önlemek için yeni bir strateji olabileceği düşünülmektedir.15-17

Doğal bir feniletanoid glikozit olan Ekinakozit (ECH), geleneksel Çin tıbbı olan Cistanches Herba'nın ana aktif bileşenidir. Son yıllarda, ECH, sinir sistemi ve tümörlerde kapsamlı bir şekilde incelenmiştir ve antioksidan, anti-inflamatuar, anti-apoptoz ve anti-tümör özellikleri gibi çeşitli farmakolojik etkilere sahip olduğu bildirilmiştir.18,19In sinir hücreleri, ECH antioksidan kapasiteyi önemli ölçüde artırır, ROS üretimini azaltır, mitokondriyal membran potansiyelini (MMP) iyileştirir ve hücre canlılığını artırır20, mitokondriyal fonksiyon üzerinde koruyucu etkiler sergiler ve mitokondriyal oksidatif stresi engeller, oksidatif hasara karşı korur ve belleği geliştirir, sonunda önler nörodejenerasyon.21,22 ECH ayrıca SOD aktivitesini arttırır ve beyin dokusu ve retina dokusunda koruyucu bir rol oynar,19,23 ancak antioksidan etkisinin spesifik mekanizması belirsizdir.

SIRT1 oksidatif stres ile yakından ilişkilidir ve SIRT1/FOXO3a/MnSOD sinyal ekseni en önemli antioksidan eksendir ve mitokondriyal oksidatif stresin baskılanmasından sorumludur, MnSOD mitokondride yaygın olarak dağılır ve birincil olarak mitokondriyal ROS'un temizlenmesinden sorumludur. oksidatif stresi inhibe ederek, bu antioksidan ekseni aktive eden bileşikler oksidatif stresi inhibe edebilir.24,25 Son çalışmalar ECH'nin farmakolojik etkilerini p-AKT, mTOR/STAT3, TGF-beta 1/Smads gibi çoklu sinyal yollarını düzenleyerek uyguladığını göstermiştir. , ve SIRT1 sinyal yolu.26-29 yeni bir çalışma, ECH'nin bir ligand olarak SIRT1'e kovalent olarak bağlandığını ve beyin hücrelerinde SIRT1 ekspresyonunu yukarı doğru düzenlediğini bulmuştur.26Bu, ECH'nin kardiyomiyositlerde mitokondriyal oksidatif stresi engelleyebileceğini ve miyokardiyal ters yeniden modelleme. Bununla birlikte, ECH'nin etkileri üzerine araştırmalar sinir sistemi veya tümör üzerine odaklanmıştır, ECH'nin kardiyomiyositlerde mitokondriyal oksidatif stres ve miyokardiyal yeniden şekillenme üzerindeki etkileri ve mekanizmaları bilinmemektedir. Burada, öncelikle ISO tarafından hücresel bir oksidatif stres modelini indükledik ve ECH'nin mitokondriyal oksidatif stres ve in vitro işlevi üzerindeki etkisini doğruladık. Ardından, ISO tarafından indüklenen bir HF sıçan modeli oluşturuyoruz ve ECH'nin, SIRT1/FOXO3a/MnSOD sinyal eksenini yukarı doğru düzenleyerek ve HF sıçanlarında mitokondriyal oksidatif stresi önleyerek miyokardiyal yeniden şekillenmeyi tersine çevirdiğini ve kalp fonksiyonunu iyileştirdiğini gösteriyoruz. Sonuçlar, kalp yetmezliğini önlemek için yeni ilaçların geliştirilmesine yönelik deneysel kanıtlar sağlamayı amaçlamaktadır.

2|MALZEMELER VE YÖNTEMLER

2.1|Hücre kültürü ve tedavisi

AC16 hücreleri, Bena Culture Collection'dan satın alınır. Hücreler, yüksek glikoz Dulbecco'nun modifiye Eagle's ortamında (DMEM; Hyclone, GE Healthcare, ABD) yüzde 10 cenin sığır serumu ilavesinde (yüzde 10 FBS; Gibco) T-75 şişelerinde (Corning Glassworks, Corning, NY, ABD). Koşullar, yüzde 5 CO2 içeren nemli bir atmosferde 37 derecede tutulur. Hücreler yüzde 70 -80 izdihama ulaştığında, ISO (Sigma, ABD) grup hücreleri, 24 saat boyunca 10uM ISO (Sigma, ABD) içeren bir ortam ile inkübe edilir, ECH grup hücreleri, 50uM ECH (MCE) ile ön işleme tabi tutulur. , ABD) 30 dakika önceden ISO'ya maruz kalmak için. Kontrol hücrelerine (Ctrl) hiçbir şey uygulanmaz.

satılık cistancheAyıkla

2.2|Luminol kemilüminesans kullanılarak mitokondriyal ROS seviyesinin tespiti

Mitokondri, üreticinin talimatlarına göre Mitokondri İzolasyon Kiti (Sigma, ABD) kullanılarak AC-16 hücrelerinden izole edilir ve saflaştırılır. Protein konsantrasyonları, BCA protein tahlil kiti (Biotech) tarafından belirlenir. Mitokondriyal ROS seviyesi, bir Elisa kiti kullanılarak luminal (3-aminoftalik hidrazid 5-amino-2,3-dihidro-1,4-ftalazindion) tarafından tespit edilir. (GERMED SCIENTIFIC INC, USA), ROS ile reaksiyona girerek yaklaşık 460nm'de tepe noktasına sahip bir bant spektrumu olan fotonların emisyonuna neden olur ve Relative Light Unit (RLU) kemilüminesans ölçüm cihazı tarafından algılanır ve RLU/ug'a dönüştürülür. mitokondriyal protein.

2.3|8-OHdG, mitokondriyal DNA'nın oksidatif hasarını değerlendirmek için kullanılır

Mitokondriyal DNA oksidatif hasarı, 8-Hidroksi-2-deoksiguanozin (8-OHG) içeriği saptanarak değerlendirilir. Hücrelerdeki saflaştırılmış mitokondri, yukarıdaki gibi bir mitokondri izolasyon kiti (Sigma) kullanılarak izole edilir. Protein konsantrasyonları, BCA protein tahlil kiti (Biotech) tarafından belirlenir. Daha sonra, üreticinin talimatlarına göre bir Elisa kiti (GERMED SCIENTIFIC INC, ABD) kullanılarak 8-OHdG seviyesini belirlemek için ayrıştırılırlar. Renk değişiminin absorbansı, 450 nm dalga boyunda bir spektrofotometrede ölçülür. Numunelerdeki 8-OHdG konsantrasyonu daha sonra numunelerin OD'si standart eğriyle karşılaştırılarak belirlenir ve ng/ml'ye dönüştürülür.

2.4|JC ile MMP Ölçümü-1

Mitokondri izole edilir ve AC-16'den saflaştırılır ve protein konsantrasyonu yukarıda belirtildiği gibi belirlenir. Daha sonra mitokondri 1 mg/ml konsantrasyonda yeniden süspanse edilir, MMP üreticinin talimatlarına göre bir JC-1 tahlil kiti kullanılarak ölçülür. Floresan yoğunluğu uyarma dalga boyunda: 490 nm, yarık 5 nm, emisyon dalga boyu: 590 nm, yarık 5 nm'de bir spektrofotometre aleti ile ölçülür,30 sonuçlar FLU/ugP olarak temsil edilir.

2.5|AC-16 Hücrelerinde akış sitometrisi ile apoptotik hücrelerin tespiti

Akış sitometrisi, hücresel apoptozu değerlendirmek için kullanılır. Tedarikçinin talimatlarına göre apoptotik ve nekrotik hücreleri tespit etmek için bir Annexin V-FITC/PI apoptoz tespit kiti (CWBIO, Çin) kullanılır. Erken evre apoptoz, geç evre apoptoz veya nekroz, hücresel enkaz ve canlı hücreler, annexin V ( plus )/PI (-), annexin V ( plus )/PI ( plus ), annexin V (-)/PI olarak tanımlanır ( artı ) ve ek V (-)/PI (-), sırasıyla. Floresan yoğunlukları, bir akış sitometresi (BD FACVerse™ Akış Sitometresi, BD Biosciences, San Jose, CA, ABD) kullanılarak analiz edilir. Her deney 3 kez tekrarlanır.

2.6|Akış sitometresi ile hücre içi ROS'u değerlendirdi

Tedaviden sonra hücreler tripsinize edilir, iki kez PBS ile yıkanır. Hücreler daha sonra PBS içinde yeniden süspanse edilir, DCFH-DA (Beyotime, Çin) ile 1 uM nihai konsantrasyonda boyanır ve 1 saat boyunca 37 derecede CO2 ile inkübatörde inkübe edilir ve daha sonra 488 nm eksitasyonda bir akış sitometresinde test edilir. . Floresan yoğunluğu, hücre içi ROS seviyesini temsil eder.

2.7|AC-16 hücrelerinin mitokondrilerindeki karbonil protein içeriğini test edin

Tedaviden sonra, saflaştırılmış mitokondri izole edilir ve buz üzerinde sonikasyona tabi tutulur ve mitokondriyal nükleik asitleri çökeltmek için yüzde 1 streptomisin sülfat ile işleme tabi tutulur, protein konsantrasyonu belirlenir. Karbonil protein içeriği, kitin talimatlarına göre karbonil grubunun dinitrofenilhidrazin (DNPH) ile türetilmesine dayanan bir Elisa kiti (GERMED SCIENTIFIC INC, ABD) kullanılarak test edilir, OD bir mikroplaka okuyucu ile ölçülür ve nmol/ mg proteini standart eğri ile karşılaştırarak.

2.8|AC-16 hücrelerinin mitokondrilerindeki lipid peroksidasyon seviyesinin belirlenmesi

Tedaviden sonra hücreler toplanır ve parçalanır, mitokondri izole edilir ve saflaştırılır ve ultrason ile parçalanır, protein konsantrasyonu BCA protein test kiti (Biotech) tarafından belirlenir, lipid peroksidasyonu TBARS testi yoluyla malondialdehit (MDA) seviyesi ile belirlenir , bir kit (Nan jing Jian cheng, Çin) kullanılarak ve üreticinin protokolü izlenerek MDA seviyesi ölçülür. OD, bir mikroplaka okuyucu tarafından 586 nm'de saptanır ve standart eğri ile karşılaştırılarak μmol/g proteine ​​dönüştürülür.

2.9 | Hayvanlar ve tedavi

120-140g ağırlığındaki genç erkek Sprague-Dawley sıçanları, Xi'an Jiao tong Üniversitesi Laboratuar Hayvan Merkezi'nden (Shaanxi, Çin) elde edildi. Araştırma, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yayınlanan Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzuna uygundur (NIH yayın no.85-23, 1996'da revize edilmiştir) ve deney protokolleri yerel yetkililer tarafından onaylanmıştır ( Xi 'a Jiao tong Üniversitesi Tıp Bölümü Biyomedikal Etik Kurulu). HF sıçan modeli daha önce tarafımızca anlatıldığı gibi oluşturulmuştur.31 Kısaca, Isoproterenol (10 mg/kg) 2 hafta boyunca intraperitoneal enjeksiyonla günde bir kez (HF grubu olarak tanımlanır), ECH 20 ile uygulanır. ISO tedavi edilmeden 30 dakika önce (ECH grubu olarak tanımlanır) intraperitoneal enjeksiyonla günde bir kez ug/g ve uygulama 2 hafta sürer. Kontrol hayvanlarına yüzde 0,9 NaCl (Ctrl grubu olarak tanımlanır) uygulanır. Kalp fonksiyonunu değerlendirmek için ekokardiyografi ölçümleri yapılır.

2.10|ekokardiyografik ölçümler

Hayvanlara, 300 mg/kg kloral hidratın intraperitoneal enjeksiyonu ile anestezi uygulanır. 7,5 MHz (HP, ABD) ultrason dönüştürücülü SONOS-2500 ultrason sistemi ekokardiyografik incelemeler yapmak için kullanılır. Sol ventrikül ejeksiyon fraksiyonu (LVEF), sol ventrikül fraksiyonel kısalması (LVFS), sol ventrikül diyastol sonu boyutları (LVIDd), sol ventrikül sistol sonu boyutları (LVID'ler), kalp hızı (HR), diyastolde ventriküler septal kalınlık (IVSTd) ), diyastolde sol ventrikül arka duvar kalınlığı (LVPWTd) daha önce tarafımızca tarif edildiği gibi ölçülür.32

ŞEKİL 1 50μmol ECH, AC-16 hücrelerinin 10μmol/L ISO tarafından indüklenen mitokondriyal oksidatif stresini etkili bir şekilde inhibe eder ve mitokondriyal fonksiyonu korur ve apoptozu azaltır.

2.11|Kalp ağırlığının vücut ağırlığına oranı (HW/BW) ölçülür

Sıçan anesteziden önce tartılır, taze kalp izole edilir ve kan 0.1mol/L PBS ile yıkanır, damarları ve diğer fazla dokuyu kesip atar ve kalp tartılır, ardından HW/BW(mg/100g) hesaplandı.

2.12|histolojik boyama

Sıçanların kalpleri parçalara ayrıldı ve yüzde 4 paraformaldehit içinde sabitlendi, parafine gömüldü ve 5 um kalınlığında dilimler halinde kesildi. Patolojik değişiklikleri gözlemlemek için Haematoxylin-Eosin (HE) boyaması ve sıçan miyokard dokusunun kollajen liflerini değerlendirmek için Masson trikromu kullanılır. Kardiyak kollajen hacim fraksiyonu (CVF) ve kardiyomiyositlerin kesit alanı, Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, MD, ABD) ile ölçülür.

2.13|TUNEL boyama

Sol ventrikülden miyokardiyal doku toplanır ve TUNEL testi daha önce tarafımızca açıklandığı gibi yapılır32

2.14|Transmisyon elektron mikroskobu

Taze kalp dokusu yüzde 2,5 glutaraldehit içinde 4 derecede sabitlenir, doku daha sonra hacim olarak 1 mm3'e kesilir ve tekrar yüzde 2.5 glutaraldehit içinde 4 derecede 2 saat sabitlenir, ardından 0.1mol/L PBS ile yıkanır, sabitlenir yüzde 1 ozmik asit içinde, asetonla dehidre edilmiş, epoksi reçinesi ile gömülmüş, yaklaşık 800nm inceliğinde ultra ince dilimler yapılmış, uranil asetat ve kurşun sitrat ile boyanmış ve daha sonra bir transmisyon elektron mikroskobu altında gözlemlenmiştir (H{ {13}}, Hitachi Limited, Japonya). ECH'nin mitokondriyal morfolojideki koruyucu etkisini ölçmek için, ortalama mitokondriyal çevre, ortalama mitokondriyal kesit alanı, mitokondrideki dejenerasyon yüzdesi ve vakuolizasyon yüzdesi Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, ABD) ile istatistiksel olarak analiz edilir.

2.15|kantitatif PCR

Total RNA, Trizol reaktifi (Invitrogen, Carlsbad, ABD) ile sol ventrikül dokusundan hazırlanır. cDNA, TUREscript 1st Strand cDNA Sentez Kiti (Takara, Japonya) kullanılarak sentezlenir. Gerçek zamanlı PCR için kullanılan kolajen I'in spesifik primer sekansları aşağıdaki gibidir: ileri: 5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTC-3', ters: 5′-GTGGAGTCGGCAATTGCA-3′. GAPDH ileri 5'-GGC AAG GTC ATC CCA GAG CT-3', ters 5'-CGC CTG CTT CAC CAC CTT CT-3'.Gerçek zamanlı kantitatif PCR (qPCR), SYBRPremix Ex ile gerçekleştirilir Taq (Mükemmel Gerçek Zamanlı) (Takara, Japonya). Göreceli mRNA seviyesi, 2-ΔΔCT yöntemine göre GAPDH'ye normalize edilerek hesaplanır.

2.16|SIRT1, FOXO3a, MnSOD protein ekspresyonunun Western blot analizi

Sol ventrikül dokusunun toplam proteini, Proteaz İnhibitör Kokteyli (Sigma-Aldrich) ile soğuk RIPA Tamponu (BioRad, ABD) kullanılarak buz üzerinde özütlenir. Konsantrasyon BCA yöntemi ile belirlenir. Western blot prosedürleri daha önce tarif edilmiştir.33 Kısaca, protein numunesi yüzde 15 sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jelleri üzerinde fraksiyonlanır, PVDF membranlarına (BioRad, ABD) aktarılır, yüzde 5 yağsız süt ile bloke edilir ve fareden MYH antikoru ile inkübe edilir. (1:200 oranında seyreltilmiş, Santa Cruz, ABD). Daha sonra yaban turpu peroksidazla konjuge keçi fare antikoru (1:2 seyreltilmiş,000, Santa Cruz, ABD) ile inkübe edildi. Göreceli protein seviyesi, ortalama ışın değerinin -aktin'e normalleştirilmesiyle hesaplanır. Protein bantları bir kemilüminesans sistemi (ChemiDoc XRS, BioRad) tarafından tespit edilir.

2.17|Sıçan miyokardında mitokondriyal oksidatif stres ölçümü

Sıçan miyokardiyumunun saflaştırılmış mitokondrileri, üreticinin talimatlarına göre Mitokondri İzolasyon Kiti (Sigma, ABD) kullanılarak izole edilir, mitokondriyal ROS, MMP, mtDNA'nın oksidatif hasarı, karbonillenmiş protein içeriği ve mitokondrideki lipid peroksidasyon seviyesinin tümü aynı yöntemler kullanılarak tespit edilir. Yukarıda açıklanan hücre deneyleri. Not olarak, miyokardiyal dokudaki ROS, DCFH-DA floresan probları ile tespit edilir, floresan yoğunluğu enzim etiketleme ölçüm cihazı ile tespit edilir, sonuçlar RLU/ug mitokondriyal protein olarak temsil edilir.

2.18|istatistiksel analiz

Tüm veriler ortalama ± SEM olarak sunulmuştur. Tek yönlü ANOVA, çoklu gruplar arasındaki farklılıkları karşılaştırmak için kullanılır, ardından anlamlılık için Tukey post hoc testi yapılır. Tüm istatistikler SPSS15.0 yazılımı (SPSS Inc, IL, ABD) kullanılarak belirlenir. P < .05="" olasılık="" değeri="" anlamlı="" kabul="">

3|SONUÇLAR

3.1|50 μM ECH, AC-16 hücrelerinde mitokondriyal oksidatif hasarı ve apoptozu etkili bir şekilde inhibe eder

İşlenmemiş hücreler bir Ctrl grubu olarak ayarlanır. İlk olarak, Şekil 1A'nın gösterdiği gibi, ECH, ISO tarafından indüklenen mitokondriyal ROS'u inhibe eder. ISO ile muamele edilmiş hücreler, Ctrl ile karşılaştırıldığında mitokondriyal ROS'ta önemli bir artış gösterir ve bu artış, 50 μM ECH ile ön muamele ile önemli ölçüde hafifletilir. İkinci olarak, ECH, ISO tarafından indüklenen mtDNA'nın oksidatif hasarını engelleyebilir. 8-OHdG'nin oksidatif stresten kaynaklanan en bol DNA lezyonlarından biri olduğuna ve oksidatif DNA hasarı ve onarımının bir biyobelirteç olduğuna inanılmaktadır. Şekil 1B'nin gösterdiği gibi, AC-16 hücrelerinden saflaştırılmış mitokondrilerdeki 8-OHdG içeriği tespit edildi, sonuçlar ISO ile muamele edilmiş hücrelerden mitokondrilerdeki 8-OHdG seviyesinin önemli ölçüde arttığını gösteriyor, ancak değişiklik 50 μM ECH ile tersine çevrildi. Üçüncüsü, ECH, ISO tarafından bozulan MMP'yi korumak için etkilidir. Flüoresan yoğunluğu, Ctrl hücreleriyle karşılaştırıldığında ISO ile tedavi edilen hücrelerde önemli ölçüde azalırken, 50 μM ECH ile ön işlem, Şekil 1C'nin gösterdiği gibi, MMP'nin azalmasını önemli ölçüde azaltır. Dördüncüsü, ECH, AC-16 hücrelerinde mitokondriyal proteinin oksidatif hasarına karşı koruma sağlar. Şekil 1D'nin gösterdiği gibi, ISO tedavi hücrelerinin mitokondrilerindeki karbonil protein içeriği önemli ölçüde artar ve ECH etkiyi azaltır. Beşinci olarak, ECH, ISO tarafından indüklenen AC-16 hücrelerinde mitokondriyal lipid peroksidasyonunu da inhibe eder. Şekil 1E'nin gösterdiği gibi, ISO hücrelerinin mitokondrilerindeki lipid peroksitlerin seviyesi, açıkça Ctrl hücrelerindekinden daha yüksektir, bu artış ise 50μM ECH ön işlemi ile önemli ölçüde azaltılır. Sonuç olarak, ECH hücre içi ROS birikimini engeller. Şekil 1F'nin gösterdiği gibi, ISO hücrelerindeki hücre içi ROS seviyesi, ECH ile ön işleme tabi tutulmuş hücrelerde belirgin şekilde artar ve belirgin şekilde azalır. Şekil 1G, AC-16 hücrelerinin apoptoz hızının, 10μM ISO ile 24 saatlik inkübasyonların ardından Ctrl hücrelerine kıyasla önemli ölçüde arttığını gösterirken, 50 μM ECH'li ön-muamele hücreleri, ISO kaynaklı apoptozu önemli ölçüde azaltır.

ŞEKİL 2 ISO ile indüklenen HF sıçanlarının kardiyak hipertrofisi rahatlar ve kalp fonksiyonu ECH tedavisi ile önemli ölçüde iyileşir.

3.2|ECH, miyokardiyal yeniden şekillenmeyi tersine çevirir ve ISO ile indüklenen HF sıçanlarının kardiyak fonksiyonunu iyileştirir

Şekil 2A'da gösterildiği gibi, HF sıçanlarındaki kalpler bariz hipertrofidir ve ECH ile tedavi ile tersine çevrilir. Şekil 2B-D ve L'nin gösterdiği gibi, ECH HW/BW'yi azaltır. Ekokardiyografi sonuçları, LVEF ve LVFS'nin KY grubunda önemli ölçüde azaldığını, LVIDd, LVID'ler ve IVSTd'nin KY grubunda önemli ölçüde arttığını göstermektedir. Bununla birlikte, ECH, LVIDd, LVIDs, IVSTd'yi önemli ölçüde azaltır ve LVEF ve LVFS'yi iyileştirir, üç grup arasında HR'de anlamlı bir fark yoktur, LVPWTd KY'de artar, ancak ECH ve Ctrl veya ECH ve HF arasında fark yoktur. Şekil 2E-K gösterir. HE boyama sonuçları, HF sıçanlarda miyokardiyal hipertrofi, düzensizlik veya dejenerasyon nekrozu, inflamatuar hücre infiltrasyonu ve interstisyel hiperemi ve ödemin bu hasarları önemli ölçüde azalttığını, miyokardiyal hipertrofi ve düzensiz bozukluğun rahatladığını gösterir. Şekil 3A'da gösterildiği gibi dejenerasyon nekrozu ve inflamatuar infiltrat azalır. Kardiyomiyosit kesit alanı ölçülür, ISO'dan sonra önemli ölçüde artar ve Şekil 3E'de gösterildiği gibi ECH ile tedavi edilen grupta azalır. Masson boyama ile kolajen birikiminin değerlendirmeleri, HF sıçanlarında sol ventriküler kolajen içeriğinin belirgin bir şekilde arttığını ve açıkça CVF'yi azaltan ECH ile tedaviden sonra açıkça azaldığını ortaya koymaktadır. Gerçek zamanlı PCR analizi, prokollajen tip Ⅰ transkriptlerinin ISO sıçanlarında yukarı-düzenlendiğini ve ECH sıçanlarında aşağı-düzenlendiğini ortaya koymaktadır, bu sonuçlar Şekil 3B ve FG'nin gösterdiği gibi birbiriyle tutarlıdır, veriler ECH'nin kollajen birikimini etkili bir şekilde azalttığını göstermektedir. . Kardiyomiyositlerdeki TUNEL pozitif hücre sayısı HF sıçanlarında Ctrl ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde artmıştır, ECH miyokardiyal hücre apoptozunu belirgin şekilde azaltır ve Şekil 3C-D, sırasıyla düşük ve yüksek güç alanlarındaki TUNEL pozitif hücrelerin temsili görüntüsünü gösterir ve Şekil 3H, miyokardiyal hücrelerin apoptoz oranını gösterir. Bu sonuçlar, ECH'nin miyokardiyal hipertrofiyi, miyokardiyal interstisyel fibrozu ve apoptozu etkili bir şekilde tersine çevirdiğini ve ISO tarafından indüklenen HF sıçanlarında kalp fonksiyonunu iyileştirdiğini göstermektedir.

ŞEKİL 3 Histolojik boyamanın sonuçları, ECH'nin, ISO tarafından indüklenen HF sıçanlarının sol ventriküler yeniden şekillenmesini tersine çevirdiğini gösterir.

3.3|ECH, HF sıçanlarında miyokardiyal ultrayapıyı korur

İletim elektron mikrografları sonuçları, Şekil 4A-B'nin gösterdiği gibi, miyokardiyal ultrastrüktüre verilen hasarın ECH tarafından azaltılabileceğini göstermektedir. Miyofibriller dikey yerleşimlidir, sarkomer yapısı belirgindir, miyofilamentler düzgün bir şekilde düzenlenmiştir ve Z çizgisi açıktır. Mitokondri düzgün bir şekilde düzenlenmiştir ve yapı Ctrl farelerinde açıktır. Bununla birlikte, miyofibriller düzensiz, yırtılmış ve çözülmüştür, sarkomer yapısı bulanık, Z çizgisi yok, miyokardiyal kasılma bölgesi görünür, mitokondri sayısı ve hacmi artmış, mitokondri farklı şekil ve boyutlarda, düzensiz düzenlenmiş, HF sıçanlarında yapı belirsizdir, şişme ve krista parçalanması, çökme veya kümelenme ve vakuol içinde çözünme. ECH açıkça bu değişiklikleri hafifletir, kalp kası liflerinin çoğu düzgün bir şekilde düzenlenmiştir ve miyokardiyal filamentler açıktır, Z çizgisi vardır, ancak filamentlerin bir miktar çözünmesi belirgindir, sarkomer yapısı açıktır, mitokondri yoğunluğu azalır, şekiller ve boyutlar rahatlar, daha düzgün düzenlenir, mitokondri şişmesi ve krista parçalanması, çökme veya kümelenme ve vakuolizasyon HF ile karşılaştırıldığında ECH ile belirgin şekilde azalır. Mitokondri şişmesi ve crista parçalanması, çökme veya kümelenme ve kısmi vakuolizasyon mitokondriyal dejenerasyon olarak tanımlanır. Sonuçlar, Şekil 4C-F'de gösterildiği gibi, ECH'nin miyokardiyal ultrastrüktürü etkili bir şekilde koruduğunu ve özellikle HF sıçanlarında mitokondriyal morfolojiyi koruduğunu göstermektedir.

ŞEKİL 4 ECH, ISO tarafından indüklenen HF sıçanlarının kardiyomiyositlerinin ultra yapısını ve mitokondriyal morfolojisini korur.

3.4|ECH, SIRT1, FOXO3a ve MnSOD'nin protein ekspresyonunu yukarı doğru düzenler

Western Blot analizi, SIRT1, FOXO3a ve MnSOD'nin protein ekspresyon seviyesinin HF sıçanlarında önemli ölçüde aşağı regüle edildiğini gösterir, ancak ECH açıkça azalmış protein ekspresyonunu yukarı regüle eder. İmmünoblotlamanın temsili protein bantları ve istatistiksel analiz sonuçları Şekil 5'te gösterilmiştir. Verilerin bir kısmı ECH'nin SIRT1, FOXO3a ve MnSOD'nin protein ekspresyonunu arttırdığını gösterir.

3.5|ECH, sol ventrikül miyokard dokusunda mitokondriyal oksidatif stresi inhibe eder

Bu bölümde mitokondriyal ROS, MMP, mitokondriyal DNA'nın oksidatif hasarı, karbonil protein içeriği ve mitokondrilerdeki lipid peroksidasyon düzeyi sıçanların sol ventrikül miyokardiyal dokusunda ölçülmekte ve sonuçlar hücre deneyleriyle tutarlı, yani, ECH, mitokondriyal ROS'u azaltır, MMP'yi korur, mtDNA'nın hasar derecesini hafifletir, Şekil 6'da gösterildiği gibi mitokondriyalde karbonil protein içeriğini ve lipid peroksidasyonunu azaltır.

ŞEKİL 5 ECH, HF sıçanlarında aşağı regüle edilen SIRT1, FOXO3a ve MnSOD'nin protein ekspresyon seviyesini yukarı regüle eder.

4|TARTIŞMA

Bu çalışma, ECH'nin SIRT1/FOXO3a/MnSOD sinyal eksenini yukarı doğru düzenleyerek ve mitokondriyal oksidatif stresi inhibe ederek miyokardiyal yeniden şekillenmenin önlenmesinde ve kalp fonksiyonunun iyileştirilmesinde etkili roller uyguladığını göstermektedir.

Mitokondri, ROS'a yakınlıkları nedeniyle oksidatif fosforilasyonun bir yan ürünü olarak ROS'un ana oluşum bölgesidir, mitokondriyal proteinler, lipidler ve mtDNA'nın, aşırı mitokondriyal ROS emisyonundan sonra oksidatif hasarın birincil hedefleri olduğuna inanılmaktadır,34,35 bu hasar ROS'un daha fazla üretimini uyarır, kısır döngü devam eder, ROS ve oksidatif stres, çoklu sinyal yollarının aktivasyonu yoluyla miyokardiyal hipertrofiye, apoptoza, interstisyel fibrozise ve HF'ye yol açabilir.35 Dolayısıyla, öyle görünüyor ki, mitokondriyal oksidatif inhibisyonu hedefleyen ilaçlar stres, miyokardiyal yeniden şekillenmenin önlenmesinde etkilidir. ECH, geleneksel Çin bitkisi Cistanche tubulosa'nın bir bileşeni olan doğal bir feniletanoid glikozittir. son yıllarda anti-tümör, anti-apoptoz, yaşlanma karşıtı, nöroprotektif etki ve benzeri gibi farmakolojik aktivitelere sahip olduğu kanıtlanmıştır. Çalışmalar, ECH'nin farmakolojik etkilerinin esas olarak antioksidan ve antiinflamatuar aktivite özelliğine bağlı olduğunu kanıtlamıştır18,21 ve ECH mitokondriyal ROS'u azaltır ve mitokondriyal fonksiyonu sinir hücrelerinde oksidatif hasara karşı korur.20,22 Burada ilk olarak şunu gösterdik: ECH, kardiyomiyositlerin mitokondriyal ROS'unu azaltır, dolayısıyla MMP'yi iyileştirir, mtDNA, protein ve lipidlerin oksidatif hasarını azaltır, mitokondriyal oksidatif hasarı etkili bir şekilde inhibe eder ve apoptozu in vitro ve in vivo olarak azaltır, böylece miyokardiyal yeniden şekillenmeyi tersine çevirir ve kalp fonksiyonunu iyileştirir. Bu, ECH'nin miyokardiyal yeniden şekillenmenin ve KY'nin önlenmesi için potansiyel yeni bir ilaç olduğu anlamına gelir.

Normal koşullarda mitokondriyal ROS, esas olarak mitokondride dağılan ve mitokondriyal oksidatif hasara karşı koruyan MnSOD tarafından temizlenir. Ang II, kardiyomiyositlerin MnSOD ekspresyonunu önemli ölçüde azaltır ve miyokardiyal hipertrofiyi indükler, ancak resveratrol, MnSOD ekspresyonunu artırabilir ve Ang II tarafından indüklenen miyokard hipertrofisini inhibe edebilir.36 HF'de MnSOD aktivitesi önemli ölçüde azalır ve mitokondriyal ROS üretimi yükselir .37,38 Kardiyak spesifik MnSOD geni nakavt farelerde, mitokondriyal ROS temizlenemedi ve kardiyomiyositlerde ROS arttı, bu da mitokondriyal disfonksiyona ve ilerleyici kardiyak genişlemeye yol açarak sonunda kalp yetmezliğine yol açtı.39 Bu çalışmada, biz bunu doğruladık. ECH tedavisi ile hafifletilen MnSOD ekspresyonunun önemli ölçüde azaldığı ve böylece mitokondriyal ROS'un azaldığı ve mitokondriyal oksidatif stresin inhibe edildiği. Bu, ECH'nin MnSOD ekspresyonunun yukarı regülasyonu yoluyla kardiyomiyositleri oksidatif hasara karşı koruduğu anlamına gelir, bu etkilerin altında yatan moleküler mekanizmaları daha da araştırıyoruz.

MnSOD ekspresyonu, bir transkripsiyon faktörü olan ve MnSOD'nin gen promotör bölgesine bağlanan ve gen transkripsiyonunun desteklenmesine yol açan FOXO3a tarafından düzenlenir.40 SIRT1, FOXO3a'nın bir upstream moleküleridir ve deasetilasyon yoluyla FOXO3a'yı aktive edebilir. SIRT1/FOXO3a/MnSOD sinyal ekseni hücre tiplerinde oksidatif strese karşı korumada önemli roller oynar, estradiol tarafından sinyalleme ekseninin aktivasyonu oksidatif stresi engeller ve kardiyak koruma sağlar24; Resveratrol tarafından sinyalleme ekseninin aktivasyonu, oksidatif stres kaynaklı hücre ölümünü 40 engeller; Aksi takdirde, anjiyotensin II, SIRT1/FoxO3a/MnSOD yolunu inhibe eder ve mitokondriyal oksidatif stresi indükler, osteoblastlarda mtDNA hasarı 41tip 5 adenilil siklaz, Sirt1/FoxO3a yoluyla MnSOD ekspresyonunu inhibe ederek oksidatif stresi artırır. SIRT1, FoxO3a ve MnSOD ekspresyonlarının tümü, HF sıçanlarında önemli ölçüde azalır ve mitokondriyal ROS yükselir ve oksidatif stres artar, ancak değişiklikler ECH ile tersine çevrilir. Yeni araştırma, ECH'nin bir ligand olarak SIRT1'i doğrudan bağladığını ve 9 kovalent bağ ile bir kompleks oluşturduğunu ve sinir hücrelerinde SIRT1 ekspresyonunu yukarı regüle ettiğini göstermektedir.26 Bu çalışma ile tutarlı olarak, mevcut çalışma ECH'nin aynı zamanda SIRT1 ekspresyonunu da yukarı regüle ettiğini göstermektedir. SIRT1, kardiyomiyositlerde, daha sonra FoxO3a yoluyla MnSOD'nin gen ekspresyonunu yukarı regüle eder ve mitokondriyal ROS ve oksidatif stresi inhibe eder.

Uzun süreli kronik iskemi miyokardiyal hibernasyona neden olabilir, bu kış uykusuna yatan miyokardiyal hücreler tipik olarak kasılma filamentlerinde bir kayıp gösterir, sitozolde aşırı glikojen granülleri vardır, sarkoplazmik retikulum ve enine tübüller kaybolur,43 ayrıca mitokondriyal boyut ve şekilde anormallikler vardır. , miyosit kaybına sekonder reaktif miyokardiyal hipertrofi ve interstisyel fibrozis.44 Çalışmamızda HF sıçanlarında yukarıdaki değişiklikleri gözlemledik, oysa ECH bu değişiklikleri önemli ölçüde hafifletir, çünkü en son çalışma iskemik stres sonrası kardiyak fonksiyonun iyileşmesini bildirmiştir. miyokardiyal hibernasyonun özelliği45, miyokardiyal glikojen seviyesi de ölçülür, sonuçlar Şekil 7J'de gösterildiği gibi üç grup arasında önemli bir fark olmadığını gösterir.

Önceki çalışma aynı zamanda iskemik olmayan kalp yetmezliği domuz modelinde LV serbest duvarını yüksek frekansla pacing yaparak miyokardiyal hibernasyonu saptamıştır, çünkü mikrovasküler obstrüksiyon miyokardiyal hibernasyonda ve bunun sonucunda oluşan kontraktil disfonksiyonda önemli bir rol oynar ve bu, mikrovasküler obstrüksiyon bir ilaçla tersine çevrilir.47 Halihazırda bazı çalışmalar, HE ve Masson boyamasını kullanarak revaskülarizasyon tedavisinin miyokardı hibernasyonda 43 etkili olduğu sonucuna varmaktadır. Şekil 7A-H'de gösterildiği gibi ECH ile. Önceki çalışmalar, arpa beta-glukan gibi diğer doğal bileşiklerin, MnSOD,48,49 ekspresyonunu artırarak kardiyoprotektif etkiler sergilediğini ve MnSOD'nin yükselmesinin, artan miyokardiyal kapiler yoğunluğu ve VEGF ekspresyonu ile ilişkili olduğunu göstermiştir. VEGF ekspresyonunu saptamak için RT-PCR gerçekleştirdik, veriler histolojik boyama bulgusu ile tutarlıdır, bu da ECH'nin anjiyogenezi destekleyebileceği ve VEGF ekspresyonunu düzenleyerek miyokardiyal kapiler yoğunluğunu artırabileceği anlamına gelir, Şekil 7I'de gösterildiği gibi. Bu çalışma, ECH'nin SIRTI/FOXO3a/MnSOD yolunu ve VEGF ekspresyonunu yukarı regüle ederek miyokardiyal kapiller ve arterioları koruyup artırabildiğini ve böylece kış uykusuna yatan miyokardı baskıladığını ve kalp fonksiyonunun iyileştirilmesine katkıda bulunabildiğini bulmuştur.

Cistanche katkıda bulunurilekalp fonksiyonunu iyileştirmek.

Daha fazla bilgi için lütfen buraya tıklayın.

Not olarak, kardiyomiyosit apoptozunun kalp yetmezliğinde önemli bir patolojik değişiklik olduğu iyi bilinmektedir ve bu çalışma gerçekten de HF sıçanlarında ve ECH'de büyük miktarda apoptotik hücrenin SIRTI/FOXO3a/MnSOD yolunu düzenleyerek ve inhibe ederek apoptozu önemli ölçüde azalttığını doğrulamaktadır. yukarıda belirtildiği gibi mitokondriyal oksidatif stres.

Her şeyden önce, ECH miyokardiyal yeniden şekillenmeyi tersine çevirir ve SIRT1/FoxO3a/MnSOD sinyal eksenini yukarı doğru düzenleyerek kalp fonksiyonunu iyileştirir, böylece mitokondriyal oksidatif stresi inhibe eder ve kış uykusuna yatan miyokardı azaltır. Bu nedenle, ECH'nin miyokardiyal yeniden şekillenme ve KY'nin önlenmesi veya tedavisi için potansiyel bir ilaç olduğu ileri sürülmektedir.