Perflorooktanoik Asidin C57BL/6J Farelerinde Bağırsak Mikrobiyotası ve Mikrobiyal Metabolitler Üzerindeki EtkileriⅡ

2. Malzemeler ve Yöntemler

2.1. Hayvanlar

Dört haftalık spesifik patojen içermeyen C57BL/6J erkek fareler, Jackson Laboratuvarı'ndan (Bar Harbor, ME, ABD) satın alındı. Fareler, içme suyunu istedikleri kadar tükettiler. Georgia Üniversitesi'ndeki hayvan tesisi, 22 ◦C'de ve %40−70 nemde, 12:12 saat ışık: karanlık döngüsü altında tutuldu. PFOA'ya maruz kalma deneyinden önce, beş fare bir kafese yerleştirildi ve fareler, dört hafta boyunca haftada bir kez kafesleri rastgele değiştirdi. PFOA'ya maruz kalma, fareler sekiz haftalıkken başladı ve maruz kalma süresi dört hafta sürdü. Deneyin başlangıcında fareler, bir kafeste bir fare olacak şekilde rastgele olarak PFOA'ya maruz kalma grubuna veya kontrol grubuna (her grupta n=10 fare) atandı. PFOA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD) farelere içme suyu yoluyla uygulandı. İçme suyundaki son PFOA konsantrasyonu milyonda 1 kısım (ppm) idi. Doz önceki çalışmamıza göre seçilmiştir [24]. Kontrol fareleri, PFOA eklenmeden içme suyunu tüketti. Hayvan protokolü, Georgia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı (protokol kodu: A2014 10-014-Y2-A1).

Kabızlık için ev ilaçları için TIKLAYIN

2.2. Metabolit Ekstraksiyonu

Metabolitlerin ekstraksiyonu daha önce anlatıldığı gibi yapıldı [25]. Kısaca, her serum numunesinden 20 µL, 225 µL metanol ile ekstrakte edildi. Numuneler 10 saniye boyunca vortekslendi. Daha sonra faz ayrımını sağlamak için yukarıdaki numunelere 750 µL metil tert-butil eter (MTBE) ve 188 µL su ilave edildi. Numuneler 4 ◦C'de 6 dakika boyunca çalkalandı, ardından 14,000xg'de 2 dakika boyunca santrifüj uygulandı. Ekstraksiyon solventinin gazı giderildi ve önceden -20 ◦C'ye soğutuldu. Üstteki polar olmayan faz (350 uL) toplandı ve bir Labconco Centrivap soğuk tuzak konsantratörü (Labconco, Kansas, MO, ABD) kullanılarak tamamen kuruyana kadar buharlaştırıldı. Karaciğer ve dışkı numuneleri için her numunenin 10 mg'ına 225 µL metanol ve 750 µLMTBE eklendi. Numuneler aGenoGrinder 2010 (SPEX SamplePrep, Metuchen, NJ, ABD) kullanılarak 1500 rpm hızda 30 kum için homojenleştirildi, ardından vortekslendi ve 4 ◦C'de 6 dakika çalkalandı. Daha sonra numunelere 188 µL su ilave edildi ve ardından 14,000x g'de 2 dakika santrifüj edildi. Üstteki polar olmayan faz (350 uL) toplandı ve kuruluğu tamamlayana kadar buharlaştırıldı. Kurutulmuş numuneler daha sonra 60 uL 4:1 asetonitril ve su (h/h) içerisinde iç standartlarla yeniden süspanse edildi. Numuneler vortekslendi, ardından 5 dakika boyunca sonikasyon yapıldı ve 2 dakika boyunca 14,000xg'de santrifüj uygulandı. Süpernatan, LC-MS analizi için toplandı.

2.3. Hedeflenmemiş Metabolomik Profil Oluşturma

Hedeflenmemiş metabolomik profilleme daha önce anlatıldığı gibi yapıldı [25]. Vanquish UHPLC sistemi (Thermo Scientific, Waltham, MA, ABD), bir Acquity VanGuard BEH Amide preparasyonuna bağlanan bir Acquity UPLC BEH Amid kolonu (150 mm x 2,1 mm x 1,7 µm) ile metabolit ayrımı için kullanıldı. sütun (5 mm × 2,1 mm × 1,7 µm, Waters, Milford, MA, ABD). 10 mM amonyum format ve 0.125% formik asit içeren LC-MS dereceli su (%100}) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) , ABD) mobil faz A olarak kullanıldı. Bu arada, mobil faz B olarak 10 mM amonyum format ve %0,125 formik asit içeren 95:5 asetonitril: su (h/h) kullanıldı. Gradyan, 0–°C'de %100 B ile başladı. 2 dakika, %70 Bat 7,7 dakika, 9,5 dakikada %40 B ve 10,25 dakikada %30 B, ardından 12,75-16,75 dakikada %100 B. Akış hızı 0,4 mL/dak'da tutuldu. Spektrumlar, Q-Exactive HF (Thermo Scientific, Waltham, MA, ABD) kullanılarak elektrosprey iyonizasyon (ESI) pozitif modunda toplandı. Kütle aralığı, MS/MS spektrumlarının elde edilmesi için veriye bağlı bir mod ile m/z 60 ila 900 arasında ayarlandı. Hedeflenmemiş metabolomik ham verileri ilk olarak ABF dönüştürücü (https://www.reifycs.com/AbfConverter/ (6 Temmuz 2022'de erişildi)) kullanılarak ABF dosyalarına dönüştürüldü. Metabolitlerin tanımlanması ve niceliğinin belirlenmesi için MSDIAL sürüm 5.1.0.1 kullanıldı [26]. Kütle Spektral Özellik Listesi Optimize Edici (MS-FLO), daha fazla veri iyileştirme için özellikleri işaretleyerek özellik listelerinin kalitesini artırmak için kullanıldı [27]. Saklama süresi m/z kitaplıklarıve MassBank of North America'daki Fiehn HILIC MS/MS spektrum veritabanları metabolitlerin tanımlanması için kullanıldı.

2.4. 16S rRNA Gen Dizilimi

Toplam DNA, üreticinin talimatları takip edilerek PowerSoil® DNA izolasyon kiti (MO BIO Laboratories, Carlsbad, CA, ABD) kullanılarak dışkı örneklerinden ekstre edildi. 515F ve 806R primerleri, 16S rRNA geninin V4 bölgesinin amplifikasyonu için kullanıldı, ardından normalleştirme ve barkodlama yoluyla. DNA, IlluminaMiSeq v2 kitinde 500 döngü ile dizilendi. 16S rRNA gen dizileme verileri, Quantitative Insights into Mikrobiyal Ekoloji (QIIME) II [28] kullanılarak analiz edildi. Kısaca, ham sıralama verileri DADA2 aracılığıyla ayrıştırıldı ve ardından operasyonel taksonomik birim (OTU) seçimi yapıldı. Veri tabanı olarak scikit-learn Naïve-Bayes tabanlı sınıflandırıcı tarafından eğitilen SILVA (versiyon 138) kullanıldı.

2.5. İstatistiksel analiz

PFOA ve kontrol grupları arasındaki farkları açıklaması en muhtemel bakteri türlerini belirlemek için doğrusal diskriminant analizi etki büyüklüğü (LEfSe) kullanıldı [29]. Metabolitlerin karşılaştırılmasında, PFOA ve kontrol grupları arasındaki p değerlerini hesaplamak için Mann-Whitney U testi kullanıldı. Çoklu karşılaştırmaları düzeltmek için yanlış keşif oranı kullanıldı. P değeri < 0.05 olan metabolitler anlamlı kabul edildi. Kısmi en küçük kareler diskriminant analizi (PLS-DA) ve yol zenginleştirme analizi MetaboAnalyst 5.0 kullanılarak yapıldı [30]. MixOmics, bağırsak mikrobiyotasının ve dışkı metabolitlerinin bütünleştirici analizi için kullanıldı; bu, omik verilerinin çok değişkenli analizi için bütünleştirici bir çerçevedir [31].

Kabızlığı Gidermek İçin Doğal Bitkisel İlaç-Cistanche

Cistanche, Oobanchaceae familyasına ait parazitik bitkilerin bir cinsidir. Bu bitkiler tıbbi özellikleriyle bilinir ve yüzyıllardır Geleneksel Çin Tıbbında (TCM) kullanılmaktadır. Cistanche türleri ağırlıklı olarak Çin'in kurak ve çöl bölgelerinde, Moğolistan'da ve Orta Asya'nın diğer bölgelerinde bulunur. Cistanche bitkileri etli, sarımsı gövdeleriyle karakterize edilir ve potansiyel sağlık yararları nedeniyle oldukça değerlidir. TCM'de Cistanche'nin tonik özelliklere sahip olduğuna inanılıyor ve böbreği beslemek, canlılığı arttırmak ve cinsel işlevi desteklemek için yaygın olarak kullanılıyor. Aynı zamanda yaşlanma, yorgunluk ve genel refahla ilgili sorunları çözmek için de kullanılır. Cistanche'nin geleneksel tıpta uzun bir kullanım geçmişi olmasına rağmen etkinliği ve güvenliğine ilişkin bilimsel araştırmalar devam etmekte ve sınırlıdır. Ancak tıbbi etkilerine katkıda bulunabilecek feniletanoid glikozitler, iridoidler, lignanlar ve polisakkaritler gibi çeşitli biyoaktif bileşikler içerdiği bilinmektedir.

Wecistanche'nincistanche tozu, cistanche tabletleri, cistanche kapsüllerive diğer ürünler kullanılarak geliştirildiçölcistancheHammadde olarak hepsi kabızlığın giderilmesinde iyi bir etkiye sahiptir. Spesifik mekanizma şu şekildedir: Cistanche'nin geleneksel kullanımına ve içerdiği bazı bileşiklere dayanarak kabızlığı gidermede potansiyel faydalara sahip olduğuna inanılmaktadır. Cistanche'nin özellikle kabızlık üzerindeki etkisine ilişkin bilimsel araştırmalar sınırlı olsa da, kabızlığı hafifletme potansiyeline katkıda bulunabilecek birden fazla mekanizmaya sahip olduğu düşünülmektedir. Laksatif etkisi:CistancheGeleneksel Çin Tıbbında uzun süredir kabızlığa çare olarak kullanılmaktadır. Bağırsak hareketlerini teşvik etmeye ve kabızlığı tetiklemeye yardımcı olabilecek hafif bir müshil etkisine sahip olduğuna inanılmaktadır. Bu etki, Cistanche'deki feniletanoid glikozitler ve polisakkaritler gibi çeşitli bileşiklere atfedilebilir. Bağırsakları Nemlendirir: Geleneksel kullanıma göre Cistanche'nin özellikle bağırsakları hedef alan nemlendirici özelliklere sahip olduğu kabul edilir. Bağırsakların hidrasyonunu ve yağlanmasını teşvik etmek, aletlerin yumuşamasına ve geçişi kolaylaştırmaya yardımcı olabilir, böylece kabızlığı hafifletebilir. Anti-inflamatuar Etki: Kabızlık bazen sindirim sistemindeki iltihaplanma ile ilişkilendirilebilir. Cistanche, antiinflamatuar özelliklere sahip olduğuna inanılan feniletanoid glikozitler ve lignanlar dahil olmak üzere belirli bileşikler içerir. Bağırsaklardaki iltihabı azaltarak bağırsak hareketinin düzenliliğini artırmaya ve kabızlığı hafifletmeye yardımcı olabilir.