Uyku Yoksunluğu Modeli Sıçanlarda Cistanche Glyeosides'in Biliş Öğrenme ve Sinaptik Plastisite Üzerindeki Etkileri

SOYUT

Amaç:Cistanche glikozitlerinin, sinaptik plastisiteyi düzenleyerek uyku yoksunluğu modeli sıçanların öğrenme ve bilişsel işlevlerini geliştirip geliştiremeyeceğini araştırmak.

Yöntemler: Elli adet erkek Wistar sıçanı rastgele olarak boş kontrol grubu (Kontrol), platform kontrol grubu (PC), model grubu (Model),cistanche grubunun glikozitleri (GC'ler)ve estazolam grubu (Est). Sıçanların uyku yoksunluğu modeli, modifiye edilmiş çok platformlu su ortamı yöntemiyle hazırlandı. Sıçanların mekansal bilişsel fonksiyonlarını ve duygusal değişikliklerini tespit etmek için Morris su labirenti ve açık alan testi kullanıldı. Sinir hücrelerinin morfolojisi ve miktarındaki değişiklikleri gözlemlemek için Nissl boyama kullanıldı.sıçanların hipokampal CAl alanı. Sinaptofizin (SY'N), postsinaptik membranda yoğun madde 95 (PSD -95) ve ekspresyon seviyelerini tespit etmek için Western blot ve R'T - PCR kullanıldı.beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF). 

Sonuçlar;Morris su labirenti sonuçları, Kontrol grubuyla karşılaştırıldığında,Farelerin öğrenme ve bilişsel yetenekleriModel grubunda önemli ölçüde azaldı ( P<0. 05 ), and the learning and memory function of rats wasgeliştirilmiş GC tedavisi ( P <0. 05). The results of the open field test showed that compared with the Control group, the movement distance and standing times of the Model group were significantly increased ( P <0. 05 ), the resting time was significantly shortened( P <0.05 ), and the anxiety was increased, while after GCs treatment, the movement distance and standing times decreased ( P <0. 05 ), the resting time increased ( P <0. 05), and the anxiety was improved. The results of Western blot and R'T - PCR showed that the BDNF'nin protein ve gen ekspresyon seviyeleriMlodel grubundaki , SYN ve PSD -95önemli ölçüde azaldı ( P<0. 05 ), while after treatment with GCs, the expression levels ofBDNF, SYN and PSD -95 were significantly up-regulated ( P <0.05). Conclusion: Glycosides of cistanche may af. feet synaptic plasticity by regulating the expression of synaptic-related markers, thereby improving the learning and cognitive function of sleep deprivation model rats.

BİTKİSEL CISTANCHE FORMÜLASYONU TAKVİYELERİÖĞRENME VE BİLİŞSEL FONKSİYONUN GELİŞTİRİLMESİ

ANAHTAR KELİMELERCistanche glikozitleri; Hipokampus; Uyku yoksunluğu; Öğrenme ve hafıza; Endişe; Sinaptik esneklik

Uyku bozukluğu (SD)birAnormal uykunun fonksiyonel bozukluğugibi bir dizi karmaşık faktörün neden olduğuuykusuzluk, hayalperestlik, Vekolay uyanış. Son yıllarda,SD görülme sıklığıgiderek artmaktadır. İlgili çalışmalar SD'nin neden olabileceğini bildirmiştir.kardiyovasküler hastalıklar,metabolik fonksiyon bozukluğu,bağışıklık hastalıkları, Vemerkezi sinir sistemiAlzheimer hastalığı gibi dejeneratif hastalıklar [1]. SD, hipokampal nöronlarda oksidatif hasara neden olabilir, bilişsel işlev bozukluğuna neden olabilir ve anksiyete ve depresyon gibi duygudurum değişikliklerine neden olabilir. Cistanche Deserticola, Çin'de hem ilaç hem de gıda olarak kullanılabilen değerli bir tıbbi malzemedir. Böbreği tonlama ve qi'yi yenileme, bağırsakları nemlendirme, bağırsak hareketlerini teşvik etme ve yang'ı güçlendirme etkileri vardır. Cistanche Deserticola'nın ana ekstraktı olan cistanche glikozitleri (GC'ler), antioksidan, anti-apoptotik, karaciğer koruyucu ve nöroprotektif etkilere sahiptir [3]. Önceki araştırmamız, GC'lerin, antioksidan ve anti-apoptotik bir rol oynayarak SAMP8 farelerinin öğrenme ve bilişsel işlevlerini iyileştirebileceğini buldu [4].

İlgili çalışmalar SD'nin neden olduğu bilişsel işlev bozukluğunun sinaptik plastisite ile yakından ilişkili olduğunu göstermiştir [5]. Bununla birlikte, GC'lerin sinaptik plastisiteyi düzenlediği ve farelerde uyku yoksunluğunun neden olduğu öğrenme ve hafıza bozukluklarını ve bilişsel gerilemeyi iyileştirdiği mekanizma hakkında çok az rapor vardır. Bu nedenle, bu çalışma, sinaptik ile ilişkili belirteçlerin ekspresyonunu düzenleyerek GC'lerin sinaptik plastisiteyi etkileyip etkilemediğini araştırmayı, böylece uyku yoksunluğu modelleriyle sıçanların öğrenme ve bilişsel işlevlerini iyileştirmeyi ve GC'lerin öğrenme ve bilişsel bozuklukları tedavi etmesi için yeni tedavi fikirleri ve planları sağlamayı amaçlamaktadır. uyku bozukluklarının neden olduğu bozulma.

1 Malzemeler ve yöntemler

1.1 Deney hayvanları

6 ila 8 haftalık, 280 ila 300 g ağırlığındaki erkek Wistar sıçanları, hayvan üretim lisansı [SCXK (Beijing) 2019-0010] ile Pekin Sibeifu'dan satın alındı. Tüm hayvanlar, Baotou Tıp Fakültesi Hayvan Deney Merkezi'nde şu koşullar altında tutuldu: sıcaklık (24 ± 1) derece, %50 ila %55 nem, 12 saat aydınlık ve 12 saat karanlık ve yiyecek ve su kısıtlaması yok. Bu deney okul etik kurulu tarafından onaylandı [Baoyi Lunshen 2022 No. (63)].

1. 2 Ana reaktifler ve cihazlar

Cistanche Deserticola'nın toplam glikozitleri Chengdu Xiyu Cistanche Bioteknoloji Co., Ltd.'den satın alınmıştır (parti numarası: KSM20220609011); Estazolam tabletleri CSPC Pharmaceutical Group Ouyi Pharmaceutical'dan (parti numarası: 044220343) satın alınmıştır; protein yükleme tamponu (P1015), RIPA lizis tamponu (R0010), kemilüminesans solüsyon (PE0010), vb. hepsi Beijing Solebao'dan satın alınmıştır; 95 (PSD-95) antikoru (AB192757) ve sinaptofizin (SYN) antikoru (ab32127) içindeki postsinaptik yoğunluk maddesi Abcam, USA Company'den satın alınmıştır; beyinden türetilen nörotrofik faktör (BDNF) (48503-2) ve -aktin (52901), ABD'deki SAB Company'den satın alınmıştır; keçi anti-tavşan IgG ikincil antikoru (SA00001-20), ABD'deki Proteintech Company'den satın alınmıştır; sıçan melatonini (MT) ve ELISA Bilimsel Araştırma Kiti (MM-0657R1), Jiangsu Enzyme Immunoassay Industry Co., Ltd.'den satın alınmıştır. Parafin dilimleyici (Leica, Almanya); optik mikroskop (Leica, Almanya);

Morris su labirenti, açık alan test kutusu (Şanghay Xinruan); dikey elektroforez aparatı (Beijing Liuyi Company); renk giderici çalkalayıcı (Beijing Liuyi Company); protein görüntüleme analiz sistemi (Shanghai Tanon Teknolojisi); floresan kantitatif PCR cihazı (Xi'an Tianlong Technology Co., Ltd.).

1.3 Deneysel yöntemler

1.3.1 Hayvan gruplaması ve ilaç uygulaması

50 erkek Wistar sıçanı rastgele olarak boş kontrol grubu (Kontrol grubu), platform kontrol grubu (Plat-form kontrol, PC grubu), model grubu (Model grubu), Cistanche Deserticola grubunun toplam glikozitleri (GC grubu) olarak ayrıldı. , 50 mg/kg) ve estazolin grubu (Est grubu, 0,54 mg/kg), her grupta 10 sıçan bulunmaktadır. Kontrol grubuna ve PC grubuna sondayla %0,9 salin verildi. Modelleme başladıktan sonra tüm gruplara her gün sabah saat 7'de sondayla besleme uygulandı ve sondayla besleme 21 gün sürdü.

1.3. 2. Uyku yoksunluğu hayvan modelinin hazırlanması

Uyku yoksunluğu modeli, değiştirilmiş çok platformlu su ortamı yöntemi kullanılarak oluşturulmuştur [6]. Deney ekipmanı 130 cm x 50 cm x 45 cm boyutlarında dikdörtgen polietilen reçineli su tankıydı. Su tankının içerisine 5 cm çapında ve 20 cm yüksekliğinde küçük bir platform yerleştirildi. PC grubunun platformu 10 cm çapında ve 20 cm yüksekliğindeydi. Su deposu yaklaşık 18 cm derinliğe kadar suyla dolduruldu ve su sıcaklığı (20±1) derecede tutuldu. Deneyin başlamasından bir hafta önce, sıçanlar çevreye alışmaları için her gün 60 dakika boyunca uyku yoksunluğu kutusuna yerleştirildi. Model oluşturulduktan sonra, Kontrol grubu dışındaki her gruptaki sıçanlar, birbirini izleyen 21 gün boyunca her gün sabah 8'den akşam 8'e kadar uyku yoksunluğu için küçük platforma zamanında yerleştirildi.

Tüm sıçanların yiyeceğe ve suya serbestçe erişimi vardı ve platformda serbestçe hareket ediyordu. Aydınlık ve karanlık döngüsü her gün 12 saatti.

1. 3. 3 Morris su labirenti deneyi

Morris su labirenti 4 alana bölünerek içi suyla dolduruldu ve platform 4. çeyreğe yerleştirildi. Su yüzeyi platformun yaklaşık 2 cm üzerindeydi. Suya gıdada kullanılabilir yenilebilir melanin eklendi ve su sıcaklığı (25±1) derecede tutuldu. (1) Konumlandırma navigasyon deneyi: Her alanın merkezi seçildi ve fareler yavaşça suya yerleştirildi. Özgürce keşfetmelerine izin verildi. Sıçanların 60 saniye içinde hedef platformu bulmaları için geçen süre kaydedildi. Platformu bulamayan fareler platforma yönlendirilerek 20 saniye orada kaldı. Eğitim 5 gün boyunca devam etti. (2) Uzaysal keşif testi: 6. günde platform kaldırılarak sıçanlar 2. çeyreğin ortasından duvara dayalı olarak suya yerleştirildi. Ratların 120 saniye içerisinde platformu geçme sayıları ve 4. kadranda kaldıkları süreler kaydedildi.

1. 3. 4 Açık alan deneyi

100 cm x 100 cm x 50 cm ölçülerinde deney kutusu kullanılmış olup, kutunun alt kısmı 9 kareye bölünmüştür. Her bir grup sıçan, iç ortama uyum sağlamaları için 60 dakika süreyle önceden açık alan deney odasına yerleştirildi. Deneyin başında test sıçanları açık alan deney kutusunun sabit köşelerine sırasıyla yerleştirildi ve davranış analiz yazılımı kullanılarak sıçanların 5 dakika içindeki ayakta durma süreleri, hareket mesafeleri ve statik süreleri kaydedildi. Deney sırasında ortamın sessiz olması gerekiyordu ve ilk sıçanın kokusunun bir sonraki sıçanın davranışsal kararını etkilemesini önlemek için deney cihazı iki deney arasında sırasıyla su ve alkolle silindi.

1. 3. 5 Enzime bağlı immünosorbent tahlili (ELISA)

Sıçanlarda serum MT düzeylerinin tespiti Sıçanlara intraperitoneal enjeksiyonla anestezi uygulandı ve abdominal aorttan 5 mL kan toplandı. Oda sıcaklığında 30 dakika bekletildikten sonra kan santrifüj edilerek serum elde edildi. Her kuyucuğa 40 μL örnek seyreltici eklendi ve ardından test edilecek örnekten 10 μL eklendi. Bir sızdırmazlık filmi ile kapatıldıktan sonra plaka, 30 dakika boyunca 37 derecede inkübe edildi. 5 kez yıkandıktan sonra 50 μL enzim etiketleme solüsyonu ilave edildi ve plaka sızdırmazlık filmi ile kapatıldı ve 37 derecede 30 dakika inkübe edildi. 5 kez yıkandı ve ardından sırasıyla renk geliştirici çözelti ve reaksiyon sonlandırma çözeltisi ilave edildi. Her kuyucuğun OD değeri, 450 nm dalga boyunda bir enzim etiketleyici ile ölçüldü.

1. 3. 6 Nissl boyama

Her gruptan üç sıçan seçildi ve beyin dokusu dekapitasyon yoluyla çıkarıldı ve %4'lük polioksietilen solüsyonu ile sabitlendi. Doku dehidre edildi, balmumu çözeltisine daldırıldı, gömüldü ve geleneksel yöntemlerle dilimlendi. Dilimler 5 µm kalınlığında tutuldu, PBS ile durulandı, 0.1% toluidin mavisi ile 0.5 saat boyunca boyandı, %95 alkol ile farklılaştırıldı, %100 alkol ile dehidre edildi, şeffaflaştırıldı ksilen ile kaplanmış ve nötr sakız ile kapatılmıştır. Sıçan hipokampusunun CA1 bölgesindeki nöronların morfolojisi ve sayısındaki değişiklikler mikroskop altında gözlemlendi ve görüntüler toplandı.

1. 3. 7 Western leke deneyi

Her gruptan dört sıçan seçildi ve hipokampus, başları kesilerek izole edildi. Hipokampus dokusu bir buz banyosu ortamında RIP A lizis tamponu ile karıştırıldı ve süpernatantı elde etmek için doku santrifüjlendi. Protein konsantrasyonu BCA yöntemiyle tespit edildi. Elektroforez için protein yükleme tamponu ile birlikte 20 ug protein ilave edildi. Protein elektroforezi tamamlandıktan sonra membran 300 mA sabit akışta aktarıldı, %5 yağsız süt tozu ile bloklandı, primer antikor 4 derecede gece boyunca inkübe edildi ve sekonder antikor oda sıcaklığında 2 saat inkübe edildi. Renk geliştirme çözeltisi kullanıldıktan sonra protein bantları, bir kemilüminesans görüntüleme analiz sistemi kullanılarak istatistiksel olarak analiz edildi.

1. 3. 8 RT-PCR deneyi

Hipokampal doku homojenatını hazırlamak için her gruptan üç sıçan seçildi. Doku sıvısındaki toplam RNA, Trizol yöntemiyle ekstre edildi ve konsantrasyon ölçüldü. Ters transkripsiyon için bir fastking cDNA sentez kiti kullanıldı ve sinaptikle ilişkili protein mRNA'nın nispi ekspresyon seviyesini tespit etmek için bir floresans kantitatif kiti kullanılarak bir floresans kantitatif amplifikasyon reaksiyonu gerçekleştirildi. Sonuçlar 2-ΔΔCt kullanılarak analiz edildi. Astar dizileri Tablo 1'de gösterilmektedir.

Tablo 1 RT-PCR primer dizileri

1.4 İstatistiksel yöntemler

Normal dağılıma uyan veri sonuçları ortalama ± standart sapma (x ± s) olarak ifade edildi ve istatistiksel analiz GraphPad Prism 9.5 yazılımı kullanılarak yapıldı. Birden fazla örnek arasındaki karşılaştırma için tek yönlü varyans analizi kullanıldı ve P < 0.05, farkın istatistiksel olarak anlamlı olduğunu gösterdi.