FAIMS Bölüm 4 ile Beyin Dokusunun Yukarıdan Aşağıya Proteomiklerinin Geliştirilmesi

Ayrıca insan beyninde eksprese edildiği bilinen tauproteinin kanonik olmayan birleşme izoformlarından türetilmiş çok sayıda fragman da belirledik.83 Kısaca, tau izoformları, ekson 2 ve/veya 3'ün alternatif birleşmesinden dolayı N-terminal eklentilerinin sayısıyla tanımlanır (bkz. 0N, 1N ve 2N) ve ekzon 10'un (3R veya 4R olarak anılır) alternatif eklenmesi nedeniyle mikrotübül bağlama tekrarlarının sayısı.84

Tau proteini, nöron hücrelerinde bulunan ve nöron hücrelerinin normal yapısının ve fonksiyonunun korunmasında çok önemli bir rol oynayan önemli bir proteindir. Çalışmalar, tau proteininin hafızayla yakından ilişkili olduğunu ve anormal ifadesinin bilişsel gerilemeye ve hatta bilişsel bozulmaya yol açabileceğini göstermiştir.

Bilim insanları tau proteini ile hafıza arasındaki ilişki üzerine pek çok araştırma yaptı. Araştırmaya göre tau proteini, sinir liflerinin stabilitesini düzenlemeye yardımcı olabilir, böylece nöron hücreleri arasında bilgi aktarımını ve hafıza oluşumunu teşvik edebilir. Ancak tau proteini protein birikimi gibi anormal hale geldiğinde sinir liflerinin kırılmasına ve çok sayıda nöron hücresinin ölümüne yol açacak, bu da hafızanın oluşumunu ve sürdürülmesini etkileyecek ve hatta hafıza bozukluklarına yol açacaktır. Bu nedenle tau proteininin normal ifadesinin ve fonksiyonunun sürdürülmesi, hafıza sağlığının korunması açısından çok önemlidir.

Son zamanlarda yapılan araştırmalar ayrıca bazı yiyecek ve içeceklerde bulunan besinlerin tau proteininin normal fonksiyonunun korunmasında da faydalı olduğunu bulmuştur. Örneğin antioksidanlar, Omega{0}} yağ asitleri ve kafein açısından zengin sebze ve meyveler, hafızayı ve bilişsel işlevi geliştirmeye yardımcı olan tau proteininin ifadesini ve işlevini düzenlemeye yardımcı olabilir.

Bu nedenle tau proteininin normal ifadesini ve işlevini sürdürmek için iyi yaşam alışkanlıklarını sürdürmeye, beslenmeyi kontrol etmeye, stresi azaltmaya vb. dikkat etmeliyiz. Aynı zamanda iyi çalışma alışkanlıklarını sürdürmek ve orta derecede egzersiz yapmak da nöron hücreleri arasında bilgi aktarımını ve hafıza oluşumunu teşvik etmeye yardımcı olabilir. Sağlıklı bir yaşam tarzı sürdürmeye dikkat ettiğimiz sürece sağlıklı bir hafızaya sahip olabileceğimize ve hayattan daha iyi keyif alabileceğimize inanıyorum. Bu da hafızamızı geliştirmemiz gerektiğini gösteriyor. Cistanche hafızayı önemli ölçüde geliştirebilir çünkü Cistanche birçok benzersiz etkiye sahip geleneksel bir Çin tıbbi malzemesidir ve bunlardan biri hafızayı geliştirmektir. Cistanche'nin etkinliği, tanik asit, polisakkaritler, flavonoid glikozitler vb. dahil olmak üzere içerdiği çeşitli aktif bileşenlerden gelir. Bu bileşenler beyin sağlığını çeşitli şekillerde geliştirebilir.

Belleği geliştirmenin 10 yolunu öğrenin'e tıklayın

Ayrıca endojen tau parçalarının insan beyin dokusunda ve beyin omurilik sıvısında yaygın bir bulgu olduğunu ve tau'nun diferansiyel parçalanmasının AD ilerlemesinde rol oynayabileceğini belirtmekte fayda var.85,86

{{0}}K ve 1K tau'yu açıkça ayırt edebilen birkaç parça gözlemledik (Şekil 10A, S7 ve S8). 0N (86 PrSM) ve 1N (91 PrSM) için yüksek spektral sayımlar gözlemlememiz, ancak 2N için herhangi bir PrSM gözlemlemememiz gerçeği, 0N ve 1N'nin baskın formlar olduğunu bulan ve ∼ yapan önceki kantitatif immünoblotlama ile uyumludur. Toplam tau'nun %91'i iken 2N yalnızca ∼%9'unu oluşturuyordu.87

Mikrotübül bağlama tekrarlarının kesin ataması hakkında, hem 3R'ye (Şekil 10A ve S9) hem de 4R tau'ya (Şekil 10A ve S10) atanabilecek spektrumları da gözlemledik.

Kısmi çıkarım, braintau'nun çoğunlukla 1N3R (Tau-B) ve ardından 0N4R (Tau-D) ek değişkenlerinin karışımıyla temsil edildiği sonucuna varmamızı sağladı; bu da önceki gözlemlerle uyumludur.87,88

Diğer ekleme izoformlarının da benzersiz parçaları olmasına rağmen, düşük sayıda spektral eşleşme (<4) did not allow us to confidently conclude about their existence.

Şaşırtıcı bir şekilde, baskın R-alanı içeren fragmanların N-terminalleri, baskın N-alanı içeren fragmanların C-terminallerinin bir devamıdır veya başka bir deyişle, olası bir proteolitik bölünme olayından üretilen bağlantılı fragmanlar gibi görünmektedirler (buna "olarak anılır"). Şekil 10A'daki site #1). Ayrıca, 3R ve 4R bölgesini içeren proteoformların C terminalleri, ekson 10'un birleşme varyasyonu nedeniyle sekansların kendileri farklı olmasına rağmen aynı bölünme bölgesini paylaşır (Şekil 10A'da bölge #2 olarak anılır).

Daha da şaşırtıcı olanı, tüm bu bölünme bölgelerinin iyi tanımlanmış üç hekzapeptid motifi içinde yer almasıdır.89-95 Şekil 10B, veri kümelerimizden tanımladığımız ve 1N3R tau izoformuyla eşlenebilecek benzersiz parçaların tümünü ve ayrıca bölünmenin konumunu göstermektedir. siteler.

1 numaralı bölünme alanı, KVAVVR heksapeptid dizisini bölen ve mikrotübüller için en güçlü bağlanma alanlarından birini sağlayan tau'nun ikinci prolince zengin bölgesinde yer alır (Şekil 10B).89-91 2 numaralı bölünme alanı, 3R ve 4R heksapeptid motifleri VQIVYK'nin içinde yer alır ve tau toplanmasını teşvik ettiği gösterilen VQIINK (Şekil 10B).92-95

İlginç bir şekilde, Şekil 10B'de gösterildiği gibi parçaların birçoğu bu iki bölünme bölgesinin yakınında başlıyor veya bitiyor. Bu hekzapeptid motiflerinin her birinin, çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda yer alan toplanmanın altında yatan, genellikle saç tokası formunda bir -yapı oluşturduğu bilinmektedir.89,93,96 Şaşırtıcı bir şekilde, bu gözlemler, tau izoformları arasında ortak bir proteolitik bozunma yolunun olasılığını vurgulamaktadır. toplanma-tohumlama bölgelerini bozabilir.25,85,86

Son olarak, yalnızca FAIMS kullanılarak gözlemlenebilen A için çok sayıda spektral eşleşme bulduk.

Hidrofobik ve toplanmaya eğilimli özellikleri nedeniyle iyileşmeyi iyileştirmek için tipik olarak özel parçalama veya işleme teknikleri gerektiren bu A proteoformları9,16,97,98, -40 ila -50 CV aralığında FAIMS kullanılarak bozulmadan gözlemlendi.

Bu, kanonik A 1-42 ve A 1-40'ın (sırasıyla Şekil 11A, B) yanı sıra çeşitli N-terminal olarak kesik formları (özellikle A 2-42 ve A 4-42, Şekil 11C, D) içerir.

Çeşitli N- ve C-terminal bölünmelerine sahip A proteoformlarının, bozulmamış protein analizinin bir avantajını vurgulayan, triptik ürünlerin aşırı hidrofobikliği nedeniyle aşağıdan yukarıya analizlerde tanımlanmasının oldukça zor olduğunu belirtmekte fayda var.

FAIMS-TDP metodolojisinin, bu A proteoformlarının eksiksiz tanımlanmasını sağlamak için sağlam bir yol sunduğuna ve mevcut N ve C-terminal bölünme ürünlerinin farklı kombinasyonlarının kolay belirlenmesine olanak sağladığına inanıyoruz.

SONUÇLAR

Oldukça karmaşık bir numune içeren proteinlerin geniş bir kütle aralığında nano-LC ters faz ayrımının, yukarıdan aşağıya kütle spektrometresi bağlamında FAIMS yoluyla gaz fazı fraksiyonlamasının uygulanmasından nasıl yararlanabileceğini açıkladık.

FAIMS'in, proteoformların iletimini boyut ve/veya yüke göre etkilediği, MS1 karmaşıklığını azalttığı ve proteomun daha derin bir şekilde kapsanmasına izin verdiği gösterilmiştir.

Tek CV'deki (−50) FAIMS, ortalama 1833 ± 17 benzersiz proteoformun tanımlanmasını mümkün kıldı; bu, FAIMS'siz (754 ± 35) ile karşılaştırıldığında iki kattan fazlaydı. FAIMS'in eklenmesi, niceliksel tekrarlanabilirlikte bir bozulmaya yol açmadı ve %20 RSD'ye yakın kaldı; bu, etiketsiz aşağıdan yukarıya yaklaşımlarla karşılaştırılabilir.

FAIMS'in CV'sindeki azalmanın, cihaza iletilen iyon türlerinin moleküler kütlesini arttırdığı kaydedildi (-50 CV'de ortalama MW ∼5 kDa, −20 CV'de ∼15 kDa) ve CV modülasyonunun da iletimi etkilediği gözlendi. bir proteoformun yük durumu zarfı farklı şekilde.

Ayrıca, en büyük teorik maksimum proteoform/gen veya proteom dizisi kapsamını üretebilecek optimal CV kombinasyonlarını da tanımladık. Üç "FAIMS Yok" veri seti ile karşılaştırıldığında, -50, -40 ve -30 V'ye adım atan harici CV, benzersiz proteoformların, benzersiz genlerin ve proteom dizisi kapsamının sayısını iki katından fazla artırabilir.

Çalışmamızın yalnızca karmaşık bir örnek kullanarak TDP yaklaşımımıza en uygun olduğunu düşündüğümüz nispeten küçük bir CV aralığını araştırdığını da belirtmekte fayda var. FAIMS diğer yöntemlere kolayca uyarlanabildiğinden, Orbitrap analizörleri ile düşük çözünürlüklü MS1 analizleri, test ettiğimiz CV aralığı içindeki daha büyük proteoformların yanı sıra daha büyük proteoformların gözlenebileceği -20 V'nin ötesindeki daha büyük proteoformların tanımlanmasını geliştirebilir.

Ayrıca, daha büyük proteoformların edinilmesini geliştiren ve FAIMS ile uyumlu olan gelecekteki kütle analiz cihazı enstrümantasyonunun, pozitif voltaj aralığına uzanan -20'nin altındaki CV'leri araştırmaktan faydalanabileceği de öngörülebilir.

TDP iş akışımız, nörodejeneratif hastalıklarda bilinen rolleri olan genlerden türetilen benzersiz proteoformları tanımlamamıza ve karakterize etmemize olanak sağladı.

Bu, -sinüklein ve aynı zamanda sinüklein içindeki potansiyel demir bağlama alanlarının konumlarını belirlemek için kullanılan -sinükleinin demir bağlama alanı yakınında mevcut olan bilinmeyen bir kütle kaymasının bileşiminin belirlenmesini içeriyordu. PARK7'nin ayrıca aktif bölgesi Cys kalıntısı üzerindeki bir süksinil grubu ile modifiye edildiği de bulundu.

0N, 1N, 3R ve 4R ekleme varyantı izoformlarına karşılık gelen tau parçalarını ayrı ayrı net bir şekilde ayırt edebildik ve birkaç toplanma-tohumlama heksapeptide tekrarının içinde veya yakınında yer alan yeni proteolitik bölünme bölgelerini tanımlayabildik.

Son olarak FAIMS, karmaşık fraksiyonlama veya saflaştırma tekniklerine gerek kalmadan, toplanmaya yatkın A 1-42 dahil olmak üzere birçok sağlam A proteoformunun tanımlanmasını mümkün kıldı.

Özetle, TDP'yi keşfetmek için FAIMS'in eklenmesinin, tespit ve karakterizasyon için mevcut proteomun arttırılması için sağlam ve tekrarlanabilir bir yöntem sağlayacağına inanıyoruz.

Ek Malzeme

Ek materyal için PubMed Central'daki Web sürümüne bakın.

TEŞEKKÜRLER

Yazarlar tavsiyeleri ve yararlı tartışmaları için Tao Liu ve Richard Smith'e teşekkür eder.

Bu çalışma U01 AG061356 (PLDJ) ve R01 AG015819 (DAB) tarafından desteklenmiştir. Araştırmanın bir kısmı, Biyolojik ve Çevresel Araştırma programının sponsor olduğu bir DOE Bilim Ofisi Kullanıcı Tesisi olan EMSL (grid.436923.9) kullanılarak gerçekleştirildi. Şekil 1'deki grafiksel özet ve resim varlıkları Biorender.com kullanılarak oluşturulmuştur.

REFERANSLAR

(1). Nichols E; Szoeke CEI; Vollset SE; Abbasi N; Abdullah F; Abdela J; Aichour MTE; AkinyemiRO; Alahdab F; Asgedom SW; Awasthi A; Barker-Collo SL; Baune BT; Bejot Y; BelachewAB; Bennett DA; Biadgo B; Bijani A; Bin Sayeed MS; Brayne C; Marangoz DO; Carvalho F;Catalá-López F; Cerin E; Choi J-YJ; Dang AK; Degefa MG; Djalalinia S; Dubey M; Duken EE;Edvardsson D; Endres M; Eskandarieh S; Faro A; Farzadfar F; Fereshtehnejad SM; FernandesE; Filip I; Fischer F; Gebre AK; Geremew D; Ghasemi-Kasman M; Gnedovskaya EV; GuptaR; Hachinski V; Hagos TB; Hamidi S; Hankey GJ; Haro JM; Hay SI; İrvani SSN; Jha RP;Jonas JB; Kalani R; Karç A; Kasaeian A; Kadir YS; Halil IA; Han EA; Khanna T; Hoca TAM; Khubchandani J; Kisa A; Kissimova-Skarbek K; Kivimäki M; Koyanagi A; KrohnKJ; Logroscino G; Lorkowski S; Majdan M; Malekzadeh R; März W; Massano J; MengistuG; Meretoja A; Muhammed M; Mohammadi-Khanaposhtani M; Mokdad AH; Mondello S; Moradi G; Nagel G; Naghavi M; Naik G; Nguyen LH; Nguyen TH; Nirayo YL; Nixon MR;Ofori-Asenso R; Ogbo FA; Olagunju AT; Owolabi MO; Panda-Jonas S; Passos VM d. A.;Pereira DM; Pinilla-Monsalve GD; Piradov MA; Gölet CD'si; Poustchi H; Kurbani M; Radfar A;Reiner RC; Robinson SR; Roshandel G; Rostami A; Russ TC; Sachdev PS; Safari H; SafiriS; Sahathevan R; Salimi Y; Satpati M; Sawhney M; Saylan M; Sepanlou SG; ShafieesabetA; Şeyh MA; Sahraian MA; Şigematsu M; Shiri R; Shiue I; Silva JP; Smith M; SobhaniS; Stein DJ; Tabarés-Seisdedos R; Tovani-Palone MR; Tran BX; Tran TT; Tsegay AT; Allahım; Venketasubramanian N; Vlassov V; Wang YP; Weiss J; Westerman R; Wijeratne T; WyperGMA; Yano Y; Yimer EM; Yonemoto N; Yousefard M; Zaidi Z; Zare Z; Vos T; Feigin VL;Murray CJL Alzheimer hastalığı ve diğer demansların küresel, bölgesel ve ulusal yükü,1990–2016: Küresel Hastalık Yükü Çalışması 2016 için sistematik bir analiz. Lancet Neurol.2019, 18, 88–106. [PubMed: 30497964]

(2). Beyreuther K; Alzheimer hastalığının etiyolojisinde Masters CL Amiloid öncü proteini (APP) ve beta A4 amiloid: nöronal fonksiyonun bozulmasında öncü-ürün ilişkileri. Beyin Patol. 1991, 1, 241–251. [PubMed: 1669714]

(3). Hardy J; Higgins G. Alzheimer hastalığı: amiloid kaskadı hipotezi. Bilim 1992, 256,184–185. [PubMed: 1566067]

(4). Goedert M. Tau proteini ve Alzheimer hastalığının nörofibriler patolojisi. Trendler Neurosci.1993, 16, 460–465. [PubMed: 7507619]

(5). İkbal K; Liu F; Gong CX Tau ve nörodejeneratif hastalık: şu ana kadarki hikaye. Nat. Rev. Neurol.2016, 12, 15–27. [PubMed: 26635213]

(6). Musiek ES; Holtzman DM Amiloid hipotezinin üç boyutu: zaman, uzay ve 'kanat adamlar'. Nat. Nörobilim. 2015, 18, 800–806. [PubMed: 26007213]

(7). Takeda S. Tau Demans İçin Teşhis ve Tedavi Hedefi Olarak Yayılım: Potansiyeller ve Cevaplanmamış Sorular. Ön. Nörobilim. 2019, 13, 1274. [PubMed: 31920473]

(8). Gregorich ZR; Ge Y. Sağlıkta ve hastalıkta yukarıdan aşağıya proteomik: zorluklar ve fırsatlar.Proteomik 2014, 14, 1195–1210. [PubMed: 24723472]

(9). Zakharova NV; Bugrova AE; Kononikhin AS; Indeykina, Yazarlar herhangi bir rakip mali çıkar beyan etmemektedir. Mİ; Popov IA; Nikolaev EN Abeta peptidlerinin çeşitliliğinin kütle spektrometresi analizi: AD biyobelirteç keşfi için zorluklar ve gelecekteki perspektifler. Uzman Rev.Proteomics 2018, 15, 773–775. [PubMed: 30253669]

(10). Grasso G. Kütle spektrometrisi, Alzheimer hastalığına karşı savaşta kullanılacak çok yönlü bir silahtır: Amiloid beta peptidleri ve ötesi. Kütle Spektromu. Rev. 2019, 38, 34–48.[PubMed: 29905953]

(11). Andreev Başkan Yardımcısı; Petyuk VA; Bira HM; Karpievitch YV; Xie F; Clark J; Kamp D; Smith RD; Lieberman AP; Albin RL; Navaz Z; El Hokayem J; Myers AJ Alzheimer hastalığının ve normal yaşlanmış insan beyinlerinin etiketsiz kantitatif LC-MS proteomikleri. J. Proteome Res. 2012, 11,3053–3067. [PubMed: 22559202]

(12). Zhang Q; Ma C; Dişli M; Wang PG; Çene LS; Li L. Entegre proteomik ve ağ analizi, Alzheimer hastalığında protein merkezlerini ve ağ değişikliklerini tanımlar. ActaNeuropathol. İletişim 2018, 6, 19. [PubMed: 29490708]

For more information:1950477648nn@gmail.com