Cilt koyulaşması, cilt pigmenti melanin birikiminin bir sonucu olarak ortaya çıkar. Bununla mücadele etmek için, çoğu melanin sentezini engelleyen cilt beyazlatma ajanlarının genliği ticari olarak mevcuttur. Melaninin renk giderimi, alternatif bir cilt aydınlatma yöntemidir. Bu çalışmada, orman toprağından izole edilen Phanerochaete chrysosporium NK-1'dan saflaştırılan hücre dışı bir enzim olan lignin peroksidazın (LiP) in vitro olarak melanin'i etkili bir şekilde parçalayabildiğini ve rengini giderebildiğini gösteriyoruz. Reaksiyon koşullarını optimize etmek için pH, sıcaklık, inkübasyon süresi, enzim konsantrasyonu ve aracı ilavesini içeren renk giderme koşulları araştırıldı. Sonuçlar, pH 3, 40 derece, 15 IU/ml ve 10 saatlik inkübasyonun melaninin renk giderimi için en uygun koşullar olduğunu göstermektedir. Arabulucu veratril alkolün kullanımının da yüzde 92'ye varan renk giderme ile melanin kolonizasyonunun etkinliğini artırmada etkili olduğu bulundu. Taramalı elektron mikroskobu sonuçları, işlenmemiş numuneye kıyasla işlenmiş melanin granülleri üzerinde melanin bozunmasını gösteren boşluklar gösterdi. Melaninin parmak izi bölgesindeki değişiklikler gözlendi. Örneğin, 1500–500 cm-1 dalga sayıları arasında, 1513, 1464 ve 1139 cm-1 CH2, CH3 bükülmesi ve C–O–C gerilmesinde işlenmiş melaninde yeni tepe noktalarının varlığı yapısal değişiklikleri temsil ediyordu. Renksizleştirilmiş melaninde 2144 cm-1'de (alkinil C≡C gerilmesi) yeni bir tepe noktası da tespit edildi. Sitotoksisite çalışması, tedavi edilen melanin ve LiP'nin düşük sitotoksik etkilere sahip olduğunu göstermiştir; bununla birlikte, veratril alkolün arabulucusu yüksek mortaliteye neden olabilir, bu da sağlık ve cilt bakım ürünlerinin formüle edilmesinde kullanımının titizlikle test edilmesi gerektiğini düşündürür. Çalışmanın bulguları, Phanerochaete chrysosporium tarafından üretilen LiP'nin medikal ve kozmetik endüstrilerinde, özellikle biyobazlı kozmetik beyazlatma ajanlarının geliştirilmesinde kullanılma potansiyeline sahip olduğunu göstermektedir.

İlgili araştırmalara göre cistanche, "ömrü uzatan mucizevi bitki" olarak bilinen yaygın bir bitkidir. Ana bileşeni, antioksidan, antienflamatuar ve bağışıklık fonksiyonunun teşviki gibi çeşitli etkilere sahip olan kistanosiddir. Cistanche ve cilt beyazlatma arasındaki mekanizma, cistanche glikozitlerinin antioksidan etkisinde yatmaktadır. İnsan derisindeki melanin, tirozinaz tarafından katalize edilen tirozinin oksidasyonu ile üretilir ve oksidasyon reaksiyonu oksijenin katılımını gerektirir, bu nedenle vücuttaki oksijensiz radikaller melanin üretimini etkileyen önemli bir faktör haline gelir. Cistanche, bir antioksidan olan ve vücuttaki serbest radikallerin oluşumunu azaltabilen ve böylece melanin üretimini engelleyen cistanoside içerir.

Beyazlatmak İçin Cistanches Herba'ya Tıklayın

Daha fazla bilgi için:

david.deng@wecistanche.com WhatsApp:86 13632399501

Melanin, melanositler 1,2 adı verilen özel cilt hücreleri tarafından üretilen bir grup karmaşık, inatçı ve yaygın polisiklik biyo-polimerik cilt pigmentidir. Birincil işlevi, cilt hücrelerinin DNA'sının etrafında supranükleer kapaklar oluşturarak cildi güneş ışınlarının zararlı UV ışınlarından korumaktır 3. Ayrıca sitoplazma içindeki çeşitli serbest radikalleri emerek farklı cilt renklerinden sorumludur. Doğal kaynaklardan elde edilen bu cilt rengini açıcı maddelerin çoğu, tirozinaz enzimlerini inhibe ederek, pigment biyosentezini baskılayarak ve bazı alternatif yollarla deri hücrelerinde melanin üretimini engeller. Cilt beyazlatıcı kozmetikler için ticari formülasyonda hidrokinon, hidrokinonun mono-benzil eterleri, cıva, kortikosteroidler ve arbutin gibi çeşitli bileşikler kullanılmaktadır, ancak bunların uygulamaları ciddi yan etkilerle ilişkilendirilmiştir. Örneğin cıvanın böbreklere zarar verdiği, kurşunun ise anksiyete, depresyon ve psikoza neden olduğu bildirilmiştir 4,5. Kortikosteroid kullanımı Cushing sendromu, diyabet, hipertansiyon, adrenal yetmezlik, immünsupresyon, cilt incelmesi, akne, dermatit ve hipertrikoza neden olabilir 6. Tain ve ark. (2009), cilt beyazlatıcı kozmetiklerde arbutin kullanımının yüzde 3'e kadar olan konsantrasyonlarda etkili olduğunu ancak konsantrasyonda daha fazla artışın sitotoksik etkilere neden olduğunu bildirmiştir. Bu sınırlamalar dikkate alındığında, bu inhibitörlerin cilt beyazlatıcı kozmetiklerdeki uygulamaları, sağlık ve güvenlik yetkilileri tarafından geniş çapta eleştirilmiştir. Cilt beyazlatıcı kozmetiklerin yıllık yüzde 4,9'luk büyüme oranıyla 2021 yılına kadar 155,44 milyar ABD dolarına ulaşabileceği öne sürüldü. Dünya çapında güvenli ve doğal cilt beyazlatma maddelerine yönelik artan talep nedeniyle, enzimatik melanin kolonizasyonu büyük ilgi gördü [7-9].

Lakkaz, manganez peroksidaz ve lignin peroksidaz (LiP) gibi mikrobiyal hücre dışı enzimler daha önce melanin renk giderimi için test edilmiştir ve toksik kimyasallara potansiyel çevre dostu bir alternatif olarak kabul edilmektedir 1. Bunların arasında LiP'nin renk giderimi için çok etkili olduğu bulunmuştur. veratril alkolü (VA) diğer ilgili enzimlere göre oksitleme konusunda yüksek redoks potansiyeli nedeniyle melanin. Melaninin yüksek oksidasyon potansiyeline ve verimli katalizine rağmen, hacimsel üretim ve saflaştırmadaki zorluklar, cilt beyazlatma ajanlarında LiP'nin ticari uygulamaları için başlıca sınırlamalardır. Ek olarak, LiP, melanin oksidasyonu için kritik olduğu düşünülen aşırı hidrojen peroksit altında melanin dekolonizasyonu için enzimatik aktivitesini kaybeder. H2O2, önemli rolünün yanı sıra LiP'yi inaktive ederek enzimin katalitik performansını azaltır.

Sonuçlar

Phanerochaete chrysosporium NK‑1 tarafından melaninin renk giderimi.Mantar suşları, melanin renk giderimi için test edildi. Mantarlar, LiP indükleyici olarak melanin ve VA içeren katı ortam üzerinde nokta aşılanmıştır. Yedi günlük inkübasyonun ardından, Phanerochaete chrysosporium NK-1, Şekil 1'de gösterildiği gibi, melaninin rengini açma yeteneği gösterdi.

Optimum melanin renk giderimi için koşullar.pH. Saflaştırılan enzim, sentetik melaninin in vitro renk giderimi için kullanıldı. Farklı koşulların melanin renk giderimi üzerindeki etkileri 10 gözlendi. Öncelikle LiP ile melanin renk giderimi üzerinde pH'ın etkileri incelenmiştir. Bunun için 2.{4}} ila 6.0 arasında değişen farklı pH koşullarında, 30 derecelik bir sıcaklıkta, hem VA varlığında hem de yokluğunda, 6 saatlik bir inkübasyon süresi boyunca melanin renk giderimi gerçekleştirildi. Şekil 2'deki sonuçlar, genel olarak, VA varlığında melaninin renk gideriminin tüm pH koşullarında daha yüksek olduğunu göstermektedir. Özellikle yüksek pH koşullarında daha belirgindir. VA, katyon radikallerinin oluşumuna yardımcı olabilir 11. Bu radikaller, melaninde C-C bağlarına spesifik olmayan bir şekilde saldırmak için çok daha yüksek redoks potansiyeline sahiptir ve renk giderme ile sonuçlanır 12. VA varlığında, yüzde 88'lik en yüksek melanin renk giderme elde edildi pH 3'te ardından pH 2'de yüzde 71, en düşük yüzde 39'luk melanin renk giderimi pH 6'da gözlendi. VA'nın yokluğunda, en yüksek melanin renk giderme yüzde 86 pH 3'te gözlenirken en düşük melanin renk giderme yüzde 3'te gözlendi. pH 5 ve 6'da sırasıyla yüzde 35 ve yüzde 36 oranında melanin renk giderimi gözlendi. Bu çalışmada LiP ile melanin renk giderimi, daha düşük pH koşullarında, yani 2 ve 3'te (Şekil 2) oldukça verimliydi, ancak diğer çalışmalar 4 1'da optimum bir pH koşulu gösterdi.

Sıcaklık. LiP ile melanin renk giderimi, 6 saatlik bir inkübasyon süresinde hem VA varlığında hem de yokluğunda 20-60 derece arasında değişen farklı sıcaklıklarda incelenmiştir. VA yokluğunda, 20 ve 30 derece sıcaklıkta benzer yüzdelerde (yüzde 19) melanin renk giderimi gözlendi (Şekil 3). VA yokluğunda en yüksek ve en düşük melanin renk giderimi sırasıyla 40 ve 50 derecede gözlendi. Ancak solüsyondaki VA ile melanin renk giderimi 20 dereceden 40 dereceye çıkmış ve 60 dereceye kadar düşmüştür. VA varlığında en yüksek melanin renk giderimi 40 derecede yaklaşık yüzde 60'tır. Deney daha yumuşak bir pH koşulunda yürütüldüğü için renk giderme genellikle daha düşüktür.

Lip konsantrasyonu. Melaninin renk giderimi de enzim konsantrasyonlarındaki değişimlerle incelenmiştir. Beş farklı konsantrasyon, yani 5, 10, 15, 20 ve 25 IU/mL LiP, Şekil 4'te gösterildiği gibi VA'nın varlığında ve yokluğunda melanin renk giderimi için incelenmiştir. Şaşırtıcı bir şekilde, en etkili enzim konsantrasyonu 15'tir. VA'lı ve VA'sız solüsyonların her ikisi için IU/ml. 6 saatlik bir inkübasyon süresinden sonra, 15 IU/mL'lik bir enzim konsantrasyonu kullanılarak VA varlığında en yüksek melanin renk giderimi yüzde 92 ve aracı yokken yüzde 70 olurken, en düşük melanin renk giderimi yüzde 23 gözlendi. 5 IU/mL LiP kullanıldığında VA olmaması. Renk gidermenin yüksek enzim konsantrasyonlarında, yani 20 ve 25 IU/ml ile daha az etkili olduğu açık değildir (Şekil 4).

Kuluçka süresi. Renk giderme deneyleri 2, 4, 6, 8 ve 10 saatlik inkübasyonda gerçekleştirildi. Bu reaksiyonlar ayrıca VA'nın varlığında ve yokluğunda da gerçekleştirildi. Sonuçlar, renk giderme etkinliğinin, beklendiği gibi, inkübasyon süresiyle pozitif olarak ilişkili olduğunu gösterdi (Şekil 5). Delokalizasyon kapsamındaki artış ilk inkübasyonda daha belirgindi. En yüksek melanin renk giderimi (yüzde 68), VA varlığında ve yüzde 59, VA yokluğunda 10 saatlik bir inkübasyon süresinden sonra gözlendi. VA'sız 2 saatlik inkübasyondan sonra melanin renk giderimi yüzde 15 kadar düşüktü. Bu nedenle, test sonuçlarına dayanarak, optimum koşulların pH 3, 40 derece, 15 IU/ml ve 10 saatlik inkübasyon olduğu sonucuna vardık.

SEM (Taramalı elektron mikroskobu) ve FTIR (Fourier dönüşümü kızılötesi spektroskopisi) analizleri.Melanindeki morfolojik ve yapısal değişiklikler, sırasıyla SEM ve FTIR ile karakterize edildi. Renksizleştirilmiş melanin, herhangi bir yüzey değişikliğini morfolojik olarak gözlemlemek için SEM ile analiz edildi. Kontrol olarak herhangi bir enzim muamelesi yapılmamış sentetik melanin kullanıldı. Şekil 6'da gösterildiği gibi, işlenmemiş örneğe kıyasla işlenmiş melanin granülleri üzerinde boşluk vardı, bu da melanin parçacıklarının enzim tarafından saldırıya uğradığını düşündürür.

Renk giderilmiş melanin ayrıca kontrol olarak işlenmemiş melanin ile FTIR ile analiz edildi (Şekil 7). Hem rengi giderilmiş hem de işlenmemiş melaninin moleküler parmak izleri elde edildi ve işlenmiş melanin 13'teki herhangi bir yapısal değişikliği doğrulamak için karşılaştırıldı. Melanin (C18H10N2O4) FTIR spektrumları, 3272 cm-1'de karakteristik O'ya atfedilebilecek geniş bir absorpsiyon spektrumu gösterdi. Karboksilik asit ve fenolik grupların –H esneme veya N–H esneme titreşimleri. Tedavi edilen melaninin FTIR spektrumundaki değişiklikler dikkat çekiciydi. 3000–3500 cm−1 dalga sayılarındaki geniş bant, hem kontrol hem de işlenmiş numunelerde -NH ve -OH gruplarının varlığını gösterir. Bununla birlikte, işlenmiş numunenin yoğunluğu, kontrol numunesinden önemli ölçüde daha yüksektir; bu, muamelenin, bu işlevsel grupların enzimatik saldırılarla yapıya ilave edildiğini düşündürür. 2884,4 cm-1 ve 2822 cm-1'deki pikler, kontrolde alkil gruplarının varlığını gösterirken, rengi giderilmiş melaninde 2884,4 cm-1 dalga numaralı pik yoktu. 2822 cm-1'deki pik, 2835.92 cm-1 dalga boyuna saptı ve bu bölgede de işlenmiş melanindeki yapısal değişiklikleri temsil etti. Kontroldeki dalga sayısı 1710 cm-1'deki pik, karboksilik asidin varlığına bağlanmıştır. Bu pik ayrıca rengi giderilmiş melaninde yoktu veya büyük ölçüde azaldı, bu da yine işlenmiş melanindeki yapısal değişiklikleri doğruladı. Parmak izi bölgesinde de bazı değişiklikler oldu. Örneğin, 1500-500 cm-1 dalga sayıları arasında, 1513, 1464 ve 1139 cm-1'de işlenmiş melaninde yeni piklerin varlığı yapısal değişiklikleri temsil ediyordu. Renksizleştirilmiş melaninde 2144 cm-1'de yeni bir pik de tespit edildi.

Sitotoksisite etkileri.Parçalanmış melanin ve LiP'nin sitotoksisitesi, salamura karidesi sitotoksisite yöntemi 14,15 kullanılarak araştırıldı. Bu çalışmada, tedavi edilen melanin ve LiP'nin sitotoksik etkileri düşüktü ve karides larvalarının yaşama oranları yüzde 90'a eşit veya daha yüksekti (Tablo 1). LiP konsantrasyonundaki artışın karides larvalarının canlılığı üzerinde 80 ul/mL'ye (~80 IU/ml) kadar hiçbir etkisi olmadı, bu da onun düşük sitotoksik aktivitesini düşündürür. VA'lı pozitif kontrollerde mortalite oranı yüzde 100 idi, bu da tıbbi ve kozmetik alanlarda aracı olarak VA varlığında LiP uygulaması sırasında dikkatli olunması gerektiğini düşündürdü.

Tartışma

Sıcaklık durumunda, en yüksek mantar büyümesi ve enzim üretimi, P. chrysosporium'un doğal yaşam alanına karşılık gelen 40 derecede elde edilmiştir. LiP'nin melanini parçalama yeteneği, melanin ve lignin arasındaki yapısal benzerliğe dayanır 18. Melanin'in LiP tarafından in vitro bozunmasının etkinliği, pH, sıcaklık, enzim konsantrasyonu ve inkübasyon süresi gibi çeşitli faktörlerle de ilişkilendirilmiştir. VA'nın varlığı gibi. Bir liP, VA'yı katyon radikallerine (VA∙ artı ) oksitleyebilir ve Şekil 8'de gösterildiği gibi melanin rengini daha da gideren bir redoks aracısı olarak hizmet edebilir.

H2O2, melanin renk giderimi sırasında son elektron alıcısı olarak temel bir substrattır. LiP, hem yapısının yırtılmasına veya aktif olmayan bileşik III'ün oluşumuna neden olan aşırı konsantrasyonlarında kolayca etkisiz hale gelir. Bu inhibe edici etkinin, VA'nın VA katyon radikali 1'e oksidasyonu ile azaltılabileceği bildirilmektedir. LiP, melanin rengini gidermek için bir redoks aracısı görevi gören VA ila VA katyon radikallerini okside eder. VA, daha az yan etkiye sahip olması beklenen beyaz çürüklük mantarlarından üretilen doğal bir bileşiktir. Bununla birlikte, aracı VA'nın varlığı, işlenmiş melanin ve LiP'nin düşük sitotoksik etkilerine kıyasla, test edilen organizmalarda yüksek ölüm oranıyla sonuçlanmıştır. Sağlık ve cilt bakım ürünlerinin formülasyonunda dikkatle test edilmelidir.

Malzemeler ve yöntemler

Mantar suşlarının izolasyonu ve tanımlanması.Mantar izolasyonu, uzun süre ahşap malzemeler için çöplük olarak kullanılan kontamine bir alandan yapılmıştır. Numune steril şişelere alındı ​​ve saflaştırılmak üzere laboratuvara aktarıldı. Saflaştırma, bir sahil dekstroz agar ortamı üzerinde yapıldı. Numuneden dört farklı mantar kolonisi izole edildi ve saflaştırıldı. En iyi suş için tarama, mineral tuz ortamında (MSM) tek karbon kaynağı olarak melanin varlığında melanin renk giderimi ve biyokütle üretimine dayalı olarak yapıldı. Taramaya dayalı olarak seçilen organizma, evrensel primerler ITS-1 ve ITS-4 10 kullanılarak 5.8S rRNA ve 18S rRNA'nın DNA'sının dizilenmesiyle tanımlandı. Genomik DNA'ları, Anderson ve arkadaşlarının yöntemine göre ekstre edildi. 19. Saflaştırmanın ardından, PCR ürünlerinin sıralaması yapıldı. Diziler, NCBI'de BLAST aracı kullanılarak hizalandı ve homologlar, Moleküler Evrimsel Genetik Analiz (MEGA) kullanılarak filogeni için analiz edildi. Maksimum olasılığa dayanarak, izole edilen mantar suşunun tanımlanması için bir komşu birleştirme ağacı oluşturulmuştur. Diziler, KX064682.1 erişim numarasıyla NCBI GenBank'a gönderildi. Filogenetik analiz, KX064682.1 izolatının bir Phanerochaete chrysosporium NK-1 türü olduğunu ortaya çıkardı.

Melanin renk giderimi için plaka deneyi.Beyaz çürüklük mantarı, Phanerochaete chrysosporium NK-1, melanin rengini gidermek için kullanıldı. Phanerochaete chrysosporium'un LiP ürettiği bilinmektedir. Tüm melanin renk giderme deneylerinde model melanin olarak sentetik melanin (B049-97–6) kullanıldı. Mantarın melanin renk giderme yeteneğini test etmek için LiP indükleyici olarak VA2 ile modifiye edilmiş bir ortam kullanıldı. Petri kapları, Phanerochaete chrysosporium NK-1'yi kültürlemek için kullanıldı. Ortam, 10 g glukoz, 2 g malt ekstraktı, 4 g MgSO4.7H2O, 1 g KH2PO4, 0.01 g FeSO4 çözülerek hazırlandı, 1-L distile suda 0,005 g ZnSO4, 0,2 g sentetik melanin ve 15 g agar. Aşılanan Petri plakaları, oda sıcaklığında karanlıkta inkübe edildi. Mantar kolonisinin altında ve çevresinde melanin renginin ne ölçüde açıldığı gözlendi. Mantarın melanin rengini giderebildiği ve ayrıca enzimatik çözeltiler hazırlamak için kullanıldığı bulundu.

Melanin renk giderimi için enzim hazırlanması.Kültürün sıvı ortamı 10 g glikoz, 0,2 g maya özütü, 0.07 g VA, 3.{13 }} g tartarik asit, 1 g tween 80, 0,2 g KH2PO4, 0,146 g CaCl2·2H2O, 0,157 g K2HPO4, 0.05 g MgSO4.7H2O, 42.5 mg ZnSO4.7H2O, 7.0 mg CoCl2·6H2O, 7.0 mg Distile suyun litresi başına CuCl2.2H2O, 0.54 mg FeCl3, 0.9 mg NaCl ve 0.2 mg sentetik melanin 20. NaOH ve HCl çözeltileri ile ortamın pH'ı 4.0'a ayarlandı. 100 ml'lik kültür ortamından alikotlar içeren 250 ml'lik şişeler otoklavlandı ve 5 ml'lik bir inokulum ile aşılandı. Şişeler daha sonra 15 gün boyunca 30 derecede bir döner çalkalayıcı üzerinde inkübe edildi. 24 saatlik bir aralıkta LiP aktivite deneyleri için çift numuneler toplandı.

Enzim tahlili.LiP tahlili için reaktifler, 250 mM sodyum tartrat tamponu pH 5.5, 10 mM VA ve 4 mM H202'yi (yüzde 30) içermiştir. Enzim tahlili, bir silika küvette gerçekleştirildi ve absorbans, UV-görünür bir spektrofotometre (Shimadzu, Kyoto, Japonya) ile 310 nm'de ölçüldü. Absorbans, ortam koşulları altında 0-30 s zamanlarda izlendi. Enzimin aktivitesi, Beer Yasası Eş. 1'e göre hesaplandı. (1) 21.

burada c, zayıflatma türlerinin konsantrasyonudur; A, optik absorpsiyondur; ε molar zayıflama katsayısıdır; d, optik yolun uzunluğudur. Enzim aktivitesinin ölçülmesi, zaman içinde konsantrasyondaki değişimin belirlenmesini içerir, Denk. (2).

Geliştirilmiş LiP üretimi ve in vitro melaninin renk giderimi için optimizasyon.Substrat olarak melanin kullanılarak Phanerochaete chrysosporium NK-1'dan gelişmiş LiP üretimi için optimizasyon, bir Placket Burman tasarımı kullanılarak gerçekleştirildi. Tam uzunlukta bir Placket, farklı değişkenler arasındaki etkileşimli etkileri baltaladığı gerçeğine dayanıyordu, halbuki sadece lineer eğilimleri dikkate alıyor, Denklem. (3) 22.

burada Y yanıtı temsil eder ve semboller regresyon katsayısını gösterir ve k çalışılan faktörlerin sayısıdır. Ortamda bulunan melaninin renk giderimi için Phanerochaete chrysosporium NK-1'dan en yüksek LiP konsantrasyonunu elde etmek için toplam 9 faktör üzerinde çalışıldı. Placket-Burman tasarımı, Tablo 2'de gösterildiği gibi toplam 12 deney çalışması ile oluşturulmuştur. Deneyler toplam 35 gün boyunca yürütülmüştür ve tepki ölçülmüştür (LiP aktivitesi IU/mL). Deneysel veriler istatistiksel yazılım 'Design Expert 9' kullanılarak analiz edildi. Optimize edilmiş ortam, geliştirilmiş LiP üretimi için kullanıldı ve amonyum çökeltmesi ile saflaştırıldı.

Enzim üretiminin ve saflaştırılmasının optimizasyonu.LiP aktiviteleri açısından en uygun inkübasyon süresini belirlemek için batık bir ortam kullanıldı. İlave Şekil 1'de gösterildiği gibi, kültür solüsyonu 8. günde 140 IU/ml olan maksimum enzimatik aktiviteye sahiptir. Bu nedenle, enzim çözeltisinin üretilmesi için 8 günlük bir inkübasyon süresi kullanılmıştır.

LiP faaliyetleri üzerinde etkisi olan faktörleri (9) belirlemek için toplam 12 deney yapılmıştır. Testler arasında, Ekteki Şekil 2'de gösterildiği gibi, LiP aktivitesinin yanıt değerleri 171 IU/ml ila 576 IU/ml arasında değişmektedir. 10 (547 IU/ml). Regresyon analizine göre, sıcaklık, zaman, glikoz konsantrasyonu, substrat konsantrasyonu ve aracı maddenin LiP aktivitesi üzerinde olumlu etkileri vardır. Maya ekstraktının etkisinin önemsiz olduğu bulundu. Diğer faktörlerin olumsuz etkileri vardır. Lip üretimi için en uygun koşullar süre: 35 gün, sıcaklık: 40 derece, glikoz (litre başına): 20 g, fruktoz: 10 g, maya ekstraktı: 2 g, pepton: 2 g, inokulum: 10 ml, substrat mediatör: 0.1 ml. Bu koşullar daha sonra, amonyum çökeltmesi ve jel kromatografisi (Sephadex G-75) yöntemleriyle saflaştırılan LiP'nin geliştirilmiş üretimi için kullanıldı.

Optimize edilmiş pH, sıcaklık ve inkübasyon süresinde enzim ekstraksiyonu gerçekleştirildi. Sephadex G75 jel filtrasyon kolonu, üreticinin talimatlarına göre yoğunluk gradyanına göre hücre lizatından protein içeriğinin fraksiyonunu ayırmak için kullanıldı. Ham ekstrakttaki proteinlerin bolluğu, bir sodyum dodesil poliakrilamid jel (SDS-PAGE) analizinde görünen bant sayısıyla da gösterildi. Saflaştırılmış enzimin moleküler ağırlığı, SDS-PAGE analizinden hesaplandığı üzere 46.0 kDa idi (İlave Şekil 3). Amonyum çökeltmesinden ve jel kromatografisiyle saflaştırmadan sonraki enzimatik aktiviteler sırasıyla 684.{7}} ve 957.6 IU/ml'dir.

Saflaştırılan enzim, pH, sıcaklık, inkübasyon süresi ve enzim konsantrasyonu dahil olmak üzere farklı fizyokimyasal koşullarda melaninin renk giderimi için kullanıldı. 23'e göre tüm melanin renk giderme deneylerinde model melanin olarak sentetik melanin (B049-97-6) kullanıldı.

Renk giderme deneyleri.PH'ın melanin renk giderimi üzerindeki etkileri. LiP tarafından melanin renk giderimi üzerinde pH'ın etkilerini gözlemlemek için, melanin renk giderme reaksiyonları 2.0– 6.0 arasında değişen pH'ta gerçekleştirildi. Reaksiyon karışımı, bir TE tamponu içinde çözülmüş 10 ul ham enzim ve 1990 ul yüzde 0.02 w/v melanin içeriyordu. Bu reaksiyonlar, VA'nın hem varlığında hem de yokluğunda gerçekleştirildi. Reaksiyon karışımları 30 derece sıcaklıkta 6 saat inkübe edildi. Aktif LiP 95 derecede kaynatılmış denatüre enzim ile değiştirilerek paralel olarak kontrol deneyleri yürütülmüştür. Reaksiyon karışımları, inkübasyondan önce ve sonra 540 nm dalga boyunda bir spektrofotometre kullanılarak melanin renk giderimi açısından izlendi. Enzimin renk giderme etkinliği yüzde (yüzde) olarak ifade edildi. Melanin renk giderimi Denklem ile hesaplandı. (4) 11.

Kuluçka süresinin melanin renk giderimi üzerindeki etkileri. Kuluçka süresinin optimizasyonu için melanin renk giderimi reaksiyonları, 2–10 saat arasında değişen kuluçka sürelerinde gerçekleştirildi. Reaksiyon karışımı, VA'nın varlığında ve yokluğunda pH 4'te bir tampon içinde çözülmüş 10 ul ham enzim ve 1990 ul yüzde 0.02 w/v melanin içeriyordu. Reaksiyon karışımları daha sonra 30 derecelik bir sıcaklıkta inkübe edildi ve melanin renk giderme yüzdesi elde edildi.

Bozulmuş melaninin SEM analizi. Melaninin yüzey morfolojik değişiklikleri, taramalı elektron mikroskobu (JEOL JSM-5910, Peabody, MA, ABD) 24 ile analiz edildi. Kontrol olarak işlenmemiş melanin kullanıldı. Numuneler kurutuldu ve çift taraflı karbon bantla (her iki tarafı yapışkan) bakır çubuklara (10x10mm2) sabitlendi. Saplamalar deterjanla yıkandı ve numune fiksasyonundan önce 2 dakika boyunca 200 derecede bir ısı tabancalı kurutucu (KADA 85U/SMD) ile kurutuldu. Elektron ışını iletimini sağlamak için gümüş pasta iletimi (SPI-CHEM, West Chester, PA, ABD) kullanıldı. Altın, yüksek voltaj (50 s için 25 mA akım) ve vakum (10−2 ATM) koşulları ile oluşturulan plazma ile numune üzerine biriktirildi. Örneklerin yüzey morfolojisi 3000 büyütme gücünde incelenmiştir.

Renksizleştirilmiş melaninin FTIR analizi.Optimizasyon deneyinde en yüksek melanin renk giderimi gösteren reaksiyonlar veya numuneler, FTIR (Model No 56, Merlin, Almanya) spektroskopisi ile ayrıca analiz edildi. Numuneler santrifüjlendi (1 dakika boyunca 10,{2}} rpm) ve FTIR analizi 20 için bir hazırlık adımı olarak havada kurutuldu. UV–Vis yakın kızılötesi (NIR) spektrometre kullanılarak melanin numunelerinin niteliksel bir analizi yapıldı. Lambda 900/Perkin Elmer Aletleri. Spektrumlar 1000 ile 3500 cm-1 aralığında kaydedildi. Numuneler, toz dispersiyonlu KBr peletlerinde hazırlandı. Bu analizde kontrol olarak işlenmemiş sentetik melanin kullanıldı.

Bozulmuş melanin ve Lip'in sitotoksisitesi.Bozulmuş melanin 14,15'in sitotoksisitesini kontrol etmek için salamura karidesi ölüm testleri yapıldı. Tuzlu su karidesinin yumurtaları, yapay deniz suyuna sahip dikdörtgen bir tabakta yumurtadan çıktı. Çanak, küçük delikleri olan plastik bir ayırıcı içeriyordu ve tabağı iki eşit olmayan bölmeye ayırdı. Büyük bölmede yumurtalar beneklendi ve herhangi bir ışık girmesini önlemek için kapatıldı, küçük bölme ise üstünde bir lamba ile aydınlatıldı. Yumurtadan çıkan larvalar ışık tarafından küçük bölmeye doğru çekildi. 48 saatlik inkübasyonun ardından olgun nauplii, pastörize bir pipet kullanılarak aydınlatılmış bölmeden toplandı.

İstatistiksel analiz.Deneysel veriler istatistiksel yazılım 'Design Expert 9' kullanılarak analiz edildi. Hesaplanan standart sapma ile üç deneysel deneme kullanılarak grafik görüntüler çizildi. Deneysel çalışmanın istatistiksel önemi ANOVA ile hesaplandı.

Veri kullanılabilirliği

Referanslar

4. Clarkson, TW, Magos, L. & Myers, GJ Te cıva toksikolojisi—mevcut maruziyetler ve klinik belirtiler. İngilizce J.Med. 349, 1731–1737 (2003).

5. Lynde, C., Kraf, J. & Lynde, C. Melazma ve iltihap sonrası hiperpigmentasyon için topikal tedaviler. Cilt Tedavisi Lett. 11, 1–6 (2006).

6. Hughes, J. & Rustin, M. Kortikosteroidler. klinik Dermatol. 15, 715–721 (1997).

7. Płonka, P. & Grabacka, M. Mikroorganizmalarda melanin sentezi: biyoteknolojik ve tıbbi yönler. Açta Biokim. Pol. 53, 423–443 (2006).

8. Lim, Y.-J. et al. Arbutinin, kültürlenmiş kahverengimsi kobay derisi dokularında -melanosit uyarıcı hormon kaynaklı hiperpigmentasyonun melanin biyosentezi üzerindeki inhibe edici etkileri. Ark. İlaç Arş. 32, 367–373 (2009).

9. Petit, L. & Pierard, G. Cilt aydınlatma ürünleri tekrar ziyaret edildi. Int. J. Kozmetik. bilim 25, 169–181 (2003).

10. Rättö, M., Chatani, M., Ritschkof, A.-C. & Viikari, L. Mavi leke mantarları tarafından üretilen melaninlerin renk giderimi için mikroorganizmaların taranması. Uygulama Mikrobiyol. Biyoteknoloji 55, 210–213 (2001).

11. Nagasaki, K. ve diğerleri. Ceriporiopsis sp.'nin saflaştırılması, karakterizasyonu ve gen klonlaması. insan saçı melanininin rengini açan MD-1 peroksidazları suşu. Uygulama çevre. Mikrobiyol. 74, 5106–5112 (2008).

12. Ruiz-Dueñas, FJ & Martínez, Á. T. Ligninin mikrobiyal bozunması: hacimli inatçı bir polimerin doğada verimli bir şekilde nasıl geri dönüştürüldüğü ve bundan nasıl yararlanabileceğimiz. Mikrob. Biyoteknoloji 2, 164–177 (2009).

13. Holmes, EW & Tompson, KD (Google Patentleri, 2014).

14. Baravalia, Y., Vaghasiya, Y. & Chanda, S. Woodfordia fruticosa Kurz çiçeklerinin tuzlu su karidesi sitotoksisitesi, antienflamatuar ve analjezik özellikleri. İran. J. Ecz. Res.: IJPR 11, 851 (2012).

15. Milhem, MM, Al-Hiyasat, AS & Darmani, H. Tuzlu su karidesi larvaları (Artemia salina) kullanılarak restoratif diş malzemelerinin toksisite testi. J. Uygulama Sözlü Bilim

16, 297–301 (2008). 16. Falade, AO ve ark. Lignin peroksidaz işlevleri ve ileriye dönük uygulamaları. Mikrobiyolojiaçık 6, e00394.

17. Sung, HJ Beyazlatıcı kozmetik uygulaması için yerinde üretilen H2O2 ile lignin peroksidaz ile melaninin renk giderimi (2020).

18. Pérez, J., Munoz-Dorado, J., De la Rubia, T. & Martinez, J. Selüloz, hemiselüloz ve ligninin biyolojik bozunması ve biyolojik tedavileri: genel bir bakış. Int. Mikrobiyol. 5, 53–63 (2002).

19. Anderson, MJ, Gull, K. & Denning, DW Polimorfik DNA'nın rastgele amplifikasyonu ve Aspergillus fumigatus'un ilgili eşleştirilmiş izolatlarının M13 güney hibridizasyonu yoluyla moleküler tipleme. J. Clin. Mikrobiyol. 34, 87–93 (1996).

20. Sabar, MA ve ark. Pakistan'daki bir kömür madeninden izole edilen Rhizopus oryzae tarafından düşük dereceli kömürün bozunması ve gelişmiş organik madde salınımı. Yakıt 253, 257–265 (2019).

21. Yadav, M., Singh, S. & Yadava, S. Lenzitus betulina MTCC'den lignin peroksidazın saflaştırılması, karakterizasyonu ve kömür depolimerizasyon aktivitesi-1183. Uygulama biyokimya Mikrobiyol. 48, 583–589 (2012).

22. Mohan, S., Viruthagiri, T. & Arunkumar, C. Batık fermantasyon kullanılarak program kabuğundan tanaz üretimi için ortam bileşenlerinin taranması için Plackett-Burman tasarımının uygulanması. Int. J. Ecz. Res. Rev. 2, 24–29 (2013).

23. Woo, SH, Cho, JS, Lee, BS & Kim, EK Phanerochaete chrysosporium'dan lignin peroksidaz ile melaninin renk giderimi. Biyoteknoloji Biyoproses. Müh. 9, 256 (2004).

24. Karp, JM ve ark. İnsan embriyonik kök hücrelerinin embriyoid vücut aşaması olmadan yetiştirilmesi, in vitro olarak osteogenezi arttırır. Kök Hücreler 24, 835–843 (2006).

Teşekkür

Yazar Katkıları

Rekabet eden çıkarlar

yayıncınınNotSpringer Nature, yayınlanan haritalardaki ve kurumsal bağlantılardaki yetki iddiaları konusunda tarafsız kalır.

Daha fazla bilgi için: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501