Farnesiltransferaz İnhibitörü LNK-754 Farelerde Aksonal Distrofiyi Azaltır ve Amiloid Patolojisini Azaltır Bölüm 2

Nöronların canlı görüntülenmesi

Canlı görüntüleme deneyleri için, nöronlar yukarıdaki gibi hazırlandı ve kültürde 7 gün boyunca 35 mm'lik cam tabanlı tabaklara (MatTek # P35G-1.5-14C) kaplandı. Daha sonra şartlandırılmış ortama 10nM LNK-754 veya lonafarnib eklendi, kontrol kültürleri araç olarak DMSO ile işleme tabi tutuldu. 48 saatlik tedaviden sonra ortam, işlenmemiş paralel nöron plakalarından alınan koşullandırılmış ortamla değiştirildi. Koşullu ortama 25nM LysoTracker-Green DND-26 (#L7526, Invitrogen) eklendi ve nöronlar 37 derecede 30 dakika boyunca inkübe edildi.

Nöronlar sinir sisteminin önemli bir parçasıdır; bilgiyi alma, işleme ve iletme yeteneğine sahiptir ve insan zekasının ve davranışının maddi temelini oluşturur. Bağışıklık, insan vücudunun hastalıklara direnmesinin önemli bir garantisidir. Patojenleri ve anormal hücreleri tanımlayıp yok edebilir ve vücudun sağlığını koruyabilir.

Araştırmalar nöronlarla bağışıklık sistemi arasında güçlü bir bağlantı olduğunu gösteriyor. Nöronlar, norepinefrin, epinefrin vb. gibi çeşitli nörotransmitterleri serbest bırakarak bağışıklık sistemini etkileyebilir. Bu nörotransmiterler, bağışıklık hücrelerinin aktivitesini değiştirebilir, bağışıklık hücrelerinin çoğalmasını ve işlevini geliştirebilir ve vücudun bağışıklığını geliştirebilir. Aynı zamanda bağışıklık sistemi de çeşitli yollardan nöronların fonksiyonlarını etkileyebilir. Bağışıklık hücreleri, bağışıklık yolları yoluyla nöronların büyümesini, gelişmesini ve işlevini etkileyen çeşitli sitokinler ve hormonlar salgılayabilir.

Ayrıca psikolojik ve sosyal faktörler de bağışıklığı ve nöron fonksiyonlarını etkileyebilir. Stres, kaygı ve depresyon gibi olumsuz duygular bağışıklık sistemini ve nöronları olumsuz etkileyerek vücudun bağışıklığını azaltabilir. Olumlu duygular, olumlu sosyal ilişkiler ve sağlıklı bir yaşam tarzı, bağışıklık sisteminin ve nöronların sağlıklı gelişimini destekleyebilir.

Özetlemek gerekirse, nöronlar ve bağışıklık arasında etkileşimli ve birbirini destekleyen bir ilişki vardır. Akıl sağlığını korumak, hayata olumlu bakmak ve iyi yaşam alışkanlıklarını benimsemek vücudun bağışıklığını ve nöronların sağlıklı gelişimini destekleyebilir. Hafızamızı geliştirmemiz gerektiği görülebilir. Cistanche Deserticola hafızayı önemli ölçüde geliştirebilir çünkü Cistanche Deserticola aynı zamanda asetilkolin ve büyüme faktörleri düzeylerini artırmak gibi nörotransmitterlerin dengesini de düzenleyebilir. Bu maddeler hafıza ve öğrenme için çok önemlidir. Ayrıca et, kan akışını iyileştirebilir ve oksijen dağıtımını destekleyebilir, bu da beynin yeterli besin ve enerji almasını sağlayarak beynin canlılığını ve dayanıklılığını artırır.

Beyin fonksiyonunu iyileştirmenin yollarını bilin'e tıklayın

Nöronların hızlandırılmış görüntülemesi, Ti2 geniş alan mikroskobu kullanılarak gerçekleştirildi. Görüntüleme 30. dakikada hemen başladı ve 30 dakikayı geçmeyecek şekilde devam etti. 1-'in pozları dakikada bir alındı ​​ve tabak başına 20-30 ayrı alan 30 dakika içinde görüntülendi. LysoTracker parçacıklarının mesafe ve hız ölçümleri ve kymograph analizleri, NIS Elements yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiş ve aşağıda ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Ayrı deneylerde, şartlandırılmış ortama 1μM Lizosensör-Yeşil DND-189 (#L7535, Invitrogen) eklendi ve canlı nöronların yakalanan görüntüleri, 60X objektifli bir Nikon A1 eş odaklı mikroskop kullanılarak 15 dakikadan uzun olmayacak şekilde çekildi (NA 1.4) ve NIS Elements yazılımı.

Beyin dokularının canlı görüntülenmesi

{{0}}aylık 5XFAD farelerine 3 hafta boyunca günlük olarak ip enjeksiyonu yapıldı ve tedavi tamamlandıktan sonra farelere anestezi uygulandı ve 1M KCl, 1M MgCl2, 0.1mM kinurenat içeren bir çözelti perfüze edildi , 0,01 mM DL-2-Amino-5-fosfonopentanoik asit, 5 mM glutatyon, 25 mM glikoz, 125 mM NaCl, 1,4 mM NaH2PO4 ve 25 mM NaHCO3.

Beyinler daha sonra 2,5 mM KCl, 85 mM NaCl, 1,25 mM NaH2PO4, 25 mM NaHC03, {{10}},5 mM CaCl2, 4 mM 4 MgCl2, 75 mM sakaroz, 25 mM glikoz içeren buz gibi soğuk oksijenli ACSF'de hızla parçalara ayrıldı, 50uM C6H7NaO6, 0.1mM kinurenat, 0.01mM DL-2-Amino-5-fosfonopentanoik asit ve 5mM glutatyon. Compresstome VF-200 titreşimli mikrotom (Precision Instruments) kullanılarak 300μm koronal dilimler elde edildi ve aşağıdaki 2,5 mM KCl, 85 mM NaCl, 1,25 mM NaH2PO4 içeren oksijenli ACSF çözeltisi içinde 32 derecede iyileşme için 30 dakika dinlenmeye bırakıldı, 25 mM NaHC03, 0,5 mM CaCl2, 4 mM 4 MgCl2, 75 mM sakaroz, 25 mM glukoz, 50uM C6H7NaO6, 0,1 mM kinurenat, 0,01 mM DL2-Amino-5-fosfonopentanoik asit ve 5 mM glutatyon.

Dilimler daha sonra 25nM LysoTracker-Green ve 1 mg/1:10,000 seyreltme içeren oksijenli ACSF içeren 35 mm'lik cam tabanlı tabaklara (MatTek # P35G-1.5-14C) aktarıldı. mL Tiazine Red (#S570435, Sigma Aldrich), diğer açılardan iyileşme döneminde kullanılan ACSF ile aynıydı. Dilim canlılığı, dokuların hızlandırılmış görüntülemesi kullanılarak doğrulandı. Dilimler oda sıcaklığında 15 dakika boyunca LysoTracker-Green ve Tiazine Red ile inkübe edildi ve daha sonra kortikal beyin bölgeleri aynı çözelti içinde 32 derecede bir Nikon A1 konfokal mikroskopta 60X objektifli (NA 1.4) ve NIS Elements yazılımında hemen görüntülendi. 30 dakikadan fazla değil.

Beyin ekstraksiyonu ve immünoblotlama

Farelere, fenilmetilsülfonil florür (20ug/ml) ile fosfat tamponlu salin (1XPBS) ile perfüze edilen ksilazin (15mg/kg) ve ketaminin (100mg/kg) intraperitoneal enjeksiyonu yoluyla anestezi uygulandı, leupeptin (0,5ug/ ml), sodyum ortovanadat (20μM) ve ditiyotreitol (0,1 mM) ve ardından beyin çıkarıldı. Protein ekstraksiyonu için kullanılan tüm tamponlar, proteaz inhibitör kokteyli III (#535140, Millipore) ve Halt fosfataz inhibitörü (#78420, Thermo Fisher Scientific) içeriyordu. Yarı beyin dokuları tartıldı ve 1XPBS'de 1:10 (ağırlık/hacim) bir dounce homojenleştirici kullanılarak manuel olarak homojenleştirildi.

Homojenizasyondan sonra lizatlar 20,8{{10}}0g'de 4 derecede 30 dakika süreyle santrifüjlendi. Çözünebilir fraksiyon (süpernatan) çıkarıldı ve topak, radyoimmünopresipitasyon tahlili (RIPA) tamponunda [50 mM Tris, 0.15M NaCl, %1 oktilfenoksipolietoksietanol (IGEPAL), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, %0.1 SDS ve 0.5) pipetlenerek yeniden süspanse edildi. pH8'de % sodyum deoksikolat] buz üzerinde 30 dakika boyunca inkübe edildi.

Numuneler buz üzerinde 20 saniye boyunca sonikasyona tabi tutuldu (Misonix XL{{0}}) ve ardından 4 derecede 30 dakika boyunca 20.800 g'de santrifüjlendi. RIPA'da çözünen fraksiyon (süpernatan) çıkarıldı ve pelet, çözünmeyen proteinlerin analizi için 5M guanidin (pH 8.0) içerisinde yeniden süspanse edildi. Her numune 20 saniye boyunca buz üzerinde sonikasyona tabi tutuldu, 1 saat boyunca oda sıcaklığında döndürüldü ve ardından 20,800 g'de 30 dakika boyunca 4 derecede santrifüjlendi. Her numunenin protein konsantrasyonunu ölçmek için bisinkoninik asit (BCA) tahlili (#23225, Thermo Fisher Scientific) kullanıldı.

Western blotlar için, her numunenin 20ug proteini %4-12 NuPAGE (Invitrogen) jellerine yüklendi ve indirgenmiş ve denatüre koşullar altında MOPS tamponu kullanılarak ayrıldı. Proteinler poliviniliden diflorür membran üzerine aktarıldı ve Pierce ECL (geliştirilmiş kemilüminesans; Thermo Fisher Scientific) kullanılarak geliştirildi. Geliştirilen sinyaller, ProteinSimple FCR (FluorChem R) kullanılarak görselleştirildi ve sonraki kemilüminesan sinyaller, AlphaView yazılımı (ProteinSimple) kullanılarak ölçüldü. Çok Bölgeli Arka Plan Düzeltme (AlphaView yazılımı) ile birlikte Arka Plan Bağlantısı aracı kullanılarak analiz edilen HDJ-2 lekesi dışında tüm lekeler, Yerel Arka Plan Düzeltme aracı kullanılarak analiz edildi.

42 ELISA

5XFAD farelerden elde edilen yarı beyin homojenatlarında A42'yi ölçmek için, ticari olarak temin edilebilen bir Enzim-Bağlantılı İmmünosorbent Testi (ELISA) (Thermo Fisher Scientific, KHB3441), hemibrainlerdeki guanidin ve PBS'de çözünebilir A42'yi analiz etmek üzere üreticinin talimatları izlenerek kullanıldı. hAPP/PS1 farelerinin beyinlerinde A42'yi ölçmek için ticari olarak temin edilebilen bir ELISA kullanıldı (h amiloid 42 ELISA yüksek duyarlı, Te Genetics Company, Zürih, İsviçre). ELISA, üreticinin protokolüne göre gerçekleştirildi.

Fare beyin dokusu immünofloresansı

Perfüzyondan sonra beyinler çıkarıldı ve yarı beyinler %10 formalinde sabitlendi, ardından 1XPBS'deki %30 sakaroz çözeltisinde kriyoprezervasyon yapıldı. 30-μm koronal veya sagittal kesitleri toplamak için dondurucu kayan bir mikrotom kullanıldı. Kesitler seri olarak bir kriyokoruyucu çözelti (1xPBS, %30 sakaroz ve %30 etilen glikol) içindeki bir 12-kuyu plakasına yerleştirildi ve kullanılıncaya kadar -20 derecede saklandı. İmmünofloresan boyama, ilk önce bölümlerin 1XTBS'de üç kez yıkanması ve ardından bölümlerin 1XTBS'de 16 mM glisin içinde oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edilmesiyle gerçekleştirildi. 1XTBS'de 3 ek yıkamanın ardından kesitler, oda sıcaklığında 2 saat boyunca 1XTBS'de %0,25 Triton X-100'de %5 keçi serumunda bloke edildi.

Kesitler daha sonra gece boyunca, 0.25% Triton X-100, %1 sığır serum albümini ve 1XTBS'den oluşan bir çözelti içindeki birincil antikorlar içerisinde 4 derecede inkübe edildi. Daha sonra eşek AlexaFluor etiketli ikincil antikorlarla 1:1000 konsantrasyonunda (Thermo Fisher Scientific) ikincil immün boyama yapıldı. ProLong Gold (#P36934, Thermo Fisher Scientific), satın alma için Nikon NIS Elements yazılımını kullanarak görüntü ölçümü için bir Ti2 geniş alan mikroskobu veya bir Nikon A1 lazer taramalı konfokal mikroskobu üzerinde görüntülenmeden önce bölümleri monte etmek için kullanıldı.

Tüm satın alma ayarları genotipler arasında aynı kaldı ve tüm görüntüler, bireysel deneyler için aynı görüntüleme süresi içinde elde edildi (Northwestern Üniversitesi Gelişmiş Mikroskopi Merkezi ve Nikon Görüntüleme Merkezi).

Görüntü ölçümü

Fare beyinleri

Fare beyin dokusu immün boyamasının immünofloresan ölçümü, Ti2 geniş alan mikroskobunda 10X objektif kullanılarak görüntülenen yaklaşık -0.94 ila −2.55 mm Bregma koordinatlarından hayvan başına 3-5 kesitte gerçekleştirildi. Boyut ve yoğunluk eşikleri de dahil olmak üzere nicelik analizleri, Nikon NIS-Elements Yazılımı (Northwestern Üniversitesi Nikon Görüntüleme Merkezi) kullanılarak yapıldı.

Sinyale bağlı olarak, nesne boyutu, şekli ve kontrastına dayalı olarak Genel Analiz aracı kullanılarak eşikler belirlendi ve ardından her kanal ve ilgilenilen bölge için ikili maskeler oluşturuldu. Sinyal-gürültü oranını optimize ederek ve spesifik olmayan arka plan sinyallerini ortadan kaldırarak ilgilenilen sinyalleri izole etmek için her kanalda ayrı ayrı eşikleme gerçekleştirildi. LAMP1, BACE1 veya LysoTracker-Green kaplı alanın yanı sıra birincil nöronlardaki LAMP1 ve Lysosensor floresans yoğunluğu ölçümlerinin hesaplanması için ilgi alanları NIS-Elements kullanılarak manuel olarak izlendi ve her ilgi alanı için bir ikili katman oluşturuldu.

LAMP1'in A42'ye oranını hesaplamak için distrofik nöritlerdeki LAMP1 alanı, bireysel plak bazında A42 alanına normalleştirildi ve tedavi grupları arasında fare başına ortalama oranlar ölçüldü. Pearson'un BACE1 ve LAMP1 için korelasyon katsayısı analizi, 1μm adım boyutuna sahip bir Nikon A1 lazer taramalı konfokal mikroskop kullanılarak alınan 30μm Z-yığın görüntülerinin maksimum yoğunluk projeksiyonları üzerinde plak başına NIS-Elements kullanılarak gerçekleştirildi.

LysoTrackerGreen'in Tiazine kırmızısına oranını hesaplamak için, distrofik nöritlerdeki LysoTracker-Green alanı, bireysel plak temelinde Tiazine Red alanına normalleştirildi ve tedavi grupları arasında fare başına ortalama oran ölçüldü. Bregma koordinatlarından yaklaşık -1,70 ila -2,55 mm'lik dört koronal kesit, her fare için ilgili beyin bölgelerindeki her sinyalin alanını veya yoğunluğunu hesaplamak için kullanıldı. Plakla kaplı alanın ve plak boyutunun analizi, yaklaşık -0,94 ila -2,55 mm Bregma koordinatlarından fare başına beş bölümün ortalaması kullanılarak yapıldı. Bölüm seçimi, görüntü edinimi, görüntü izleme ve ölçümler, tedavi grupları ve genotipler konusunda kör bir kişi tarafından gerçekleştirildi.

Birincil nöronlar

Sabit fare birincil nöronlarında LAMP1 immün boyamasının miktarının belirlenmesi için somalar, NIS-Elements kullanılarak morfolojiye dayalı olarak manuel olarak izlendi ve ilgi konusu her bölge ve kanal için ikili bir maske oluşturuldu. Eşik, LAMP1 sinyallerini optimize etmek ve hem dendritler hem de aksonlar dahil olmak üzere nöritlerdeki LAMP1'i, tübülin pikselleri için pozitif LAMP1 piksellerini izole ederek ayırt etmek için kullanıldı.

Hücre soma LAMP1 sinyalleri, nöritlerdeki LAMP1 keseciklerini analiz etmek için toplam LAMP1 alanından çıkarıldı. Nöronlarda LysoTracker-Green hareketliliğinin analizi için görüntüler NISElements kullanılarak ölçüldü. Her karedeki toplam LysoTrackerGreen parçacıklarının hızı ve mesafesi, NIS-Elements'teki otomatik hareket izleme özelliği kullanılarak izlendi. Arka plandaki gürültüyü ortadan kaldırmak için LysoTracker-Green parçacıklarının boyutuna ve floresans yoğunluğuna dayalı olarak tüm filmlere bir eşik belirlendi ve uygulandı.

Kymograph üretimi için, tek nöronların hızlandırılmış görüntülemesi 60X eş odaklı bir mikroskopta gerçekleştirildi ve aksonlar morfolojik olarak tanımlandı. İleriye veya geriye doğru yönde veya sabit olarak hareket eden parçacıkların frekans yüzdesi, her grup için parçacık sayısının toplam parçacık sayısına bölünmesiyle ölçüldü. Kymograph analizleri için hareketli parçacıkların 0,1μM/sn'nin üzerinde bir hıza sahip olduğu tanımlandı.

istatistiksel analiz

GraphPad Prism yazılımı v8, ikiden fazla örnek karşılaştırıldığında posthoc testlerle varyans analizi (ANOVA) ve yalnızca iki örnek karşılaştırıldığında eşleştirilmemiş t-testleri de dahil olmak üzere istatistiksel analizler gerçekleştirmek için kullanıldı. Tekrar sayısı, sonradan yapılan testlerin türü ve P değerleri dahil olmak üzere özel test ayrıntıları şekil açıklamalarında belirtilmiştir. Tüm ölçümler ortalama±SEM'de çizilmiştir. P değeri *P ile gösterilen 0.05'ten küçük olduğunda anlamlılık sonucuna varılmıştır.<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.

For more information:1950477648nn@gmail.com