Farnesiltransferaz İnhibitörü LNK-754 Farelerde Aksonal Distrofiyi Azaltır ve Amiloid Patolojisini Azaltır Bölüm 3

Sonuçlar

LNK‑754‑kronik olarak tedavi edilen 5XFAD farelerin beyinlerinde amiloid plak yükünde azalma ve tau hiperfosforilasyonunda azalma

LNK-754 ve lonafarnib, daha önce insanlarda kanser klinik deneylerinde test edilen ve kan-beyin bariyerini geçtiği bilinen küçük moleküllü FTI'lerdir [8, 9, 41, 42]. -sinüklein [8] ve tau kapanımları [9] sırasıyla LNK-754 ve lonafarnib tarafından azaltılır, ancak bunlar henüz AD'nin amiloid fenotipine karşı değerlendirilmemiştir. Bu çalışmada 5XFAD fare modelinde amiloid patolojisine etkilerini araştırdık. 5XFAD fareleri, 2 aylıktan itibaren A birikintileri geliştirir [36, 37] ve amiloid birikiminin en erken aşamalarında distrofik nöritler gözlenir [39, 43].

Kan-beyin bariyeri ve bağışıklık, insan vücudunun çok önemli iki parçasıdır ve bunlar ayrılmaz bir şekilde bağlantılıdır. Kan-beyin bariyeri, beyni dışarıdan gelebilecek zararlı maddelerden koruyan, beyin ile kan arasında koruyucu bir bariyerdir. Bağışıklık insan vücudunun hastalıklara karşı direnç göstermesi için önemli bir mekanizmadır. Peki kan-beyin bariyeri ile bağışıklık arasındaki spesifik ilişki nedir?

Birincisi, kan-beyin bariyeri bazı zararlı bakteri ve virüslerin beyne girmesini engelleyerek beyni hasardan koruyabilir. Ayrıca kan-beyin bariyeri bazı maddelerin geçirgenliğini de kontrol ederek bunların beyne yalnızca sınırlı ölçüde girmesine izin verebilir. Beyne giren bazı dahili maddelerin çok fazla olması sinir hücresi hasarına neden olabileceğinden, bu sinir sisteminin sağlığının korunması açısından kritik öneme sahiptir.

Aynı zamanda bağışıklık, beynin korunmasında da rol oynayabilir. İnsan vücudunun bağışıklık sistemi patojenleri ve zararlı maddeleri tanıyabilir ve daha sonra bunların istilasına direnmek için karşılık gelen antikorlar üretebilir, böylece vücudu hastalıklardan koruyabilir. Bununla birlikte, belirli patojenler veya maddeler kan-beyin bariyerini geçip beyne girdiğinde, bağışıklık sistemi hızla tepki verir ve bunlara saldırıp onları yok etmek için antikorlar üretir.

Bu nedenle kan-beyin bariyeri ve bağışıklık, insan sağlığının korunmasında çok önemli bir rol oynamaktadır. Kan-beyin bariyeri, zararlı maddelerin beyne girmesini önlerken, bağışıklık sistemi, kan-beyin bariyerini aşarak beyne giren patojenleri ve diğer zararlı maddeleri ortadan kaldırır. Beynin sağlıklı çalışmasını sağlamak için ikisi birlikte çalışır.

Özetle, kan-beyin bariyeri ve bağışıklık, kendi mekanizmaları aracılığıyla işbirliği yaparak insan sağlığında önemli bir rol oynar. Vücudun genel sağlığını sağlamak için onların sağlığını korumaya odaklanmalıyız. Hafızamızı geliştirmemiz gerektiği görülebilir. Cistanche Deserticola hafızayı önemli ölçüde geliştirebilir çünkü Cistanche Deserticola birçok benzersiz etkiye sahip geleneksel bir Çin tıbbi malzemesidir ve bunlardan biri hafızayı geliştirmektir. Kıymanın etkinliği asit, polisakkaritler, flavonoidler vb. dahil olmak üzere içerdiği birçok aktif bileşenden gelir. Bu bileşenler beyin sağlığını çeşitli şekillerde geliştirebilir.

Belleği geliştirmek için ekleri bil'e tıklayın

Bu nedenle, 5XFAD farelerinde amiloid patolojisinin gelişmesiyle aynı zamana denk gelecek şekilde, fareleri 2 aylıktan başlayarak 3 ay boyunca LNK-754 aracı ve lonafarnib ile kronik olarak tedavi ettik. LNK-754 ve lonafarnib, 0.5% sodyum karboksimetilselülozdan oluşan bir araç içinde çözüldü ve günlük olarak 1 mg/kg'lık bir dozla ip enjekte edildi [8, 44].

İlk olarak kronik LNK-754 ve lonafarnib tedavisinin 5XFAD farelerinde A plak yükü üzerindeki etkilerini, hem yaygın hem de agrege amiloidi ve yalnızca fibriler plağı tespit eden Tiazin Kırmızısını (TR) tespit eden A 42 için immünofloresan mikroskobu ile belirlemeye çalıştık. çekirdekler (Şekil 1A; Şekil S1). Araçla tedavi edilen kontrollere kıyasla LNK754- ile tedavi edilen farelerin kortikal beyin bölgelerinde kaplanan alanda önemli bir azalma bulduk (Şekil 1B). Hipokampüste, kaplanan alan, lonafarnib ile tedavi edilen farelere kıyasla LNK-754- ile tedavi edilen farelerde önemli ölçüde azaldı ve araç tedavisi ile karşılaştırıldığında LNK-754 ile tedavi edilen farelerde azalma yönünde bir eğilim vardı (Şekil .1C).

Lonafarnib ile tedavi edilen farelerdeki 42 kapalı alan, korteks veya hipokampustaki araçla tedavi edilen farelerden önemli ölçüde farklı değildi (Şekil 1A, B). Araç tedavisiyle karşılaştırıldığında LNK-754 tedavisiyle kortikal ve hipokampal beyin bölgelerinde plak boyutu azaldı; bu fark hipokampusta istatistiksel olarak anlamlıydı (Şekil 1D, E; Şekil S2A, B). Lonafarnib ve LNK-754 tedavisi arasında plak boyutunda anlamlı bir fark hipokampusta da gözlendi (Şekil 1D, E; Şekil S2A, B).

Lonafarnib ile tedavi edilen farelerde plak boyutu, kortikal veya hipokampal beyin bölgelerinde araçla tedavi edilen farelere kıyasla değişmedi (Şekil 1D, E; Şekil S2A, B). Plak tohumlaması, TR boyama yoluyla plak sayısının analiz edilmesiyle ölçüldü. Araçla tedavi edilen farelerle karşılaştırıldığında LNK-754'nin korteksinde plak sayısı önemli ölçüde azaldı ancak hipokampusta azalma olmadı (Şekil S2C, D). Plak yükünün azaldığı, PBS ve guanidin-çözünür yarı beyin homojenatlarında A42'nin ELISA ile ölçülmesiyle doğrulandı (Şekil 1F, G). İmmünofloresan mikroskopi sonuçlarımıza benzer şekilde, lonafarnib ile tedavi edilen farelerde guanidin ve PBS fraksiyonlarında daha az A42'ye doğru bir eğilim vardı, oysa LNK-754 tedavisiyle guanidin fraksiyonlarında önemli ölçüde daha düşük bir A42 seviyesi elde edildi (Şekil 1). 1. F, G).

5XFAD fare modelinde kararlı durum APP seviyeleri ve plak yükü için cinsiyete dayalı etkiler bildirildiğinden [45, 46], araç, LNK-754 veya lonafarnib ile ayrı ayrı tedavi edilen erkek ve dişi farelerin immünoblotlarını gerçekleştirdik transgenik APP ekspresyonu için (Şekil S3A). Transgenik APP seviyeleri, yalnızca insan APP'sini tanıyan ve LNK-754, lonafarnib veya araçla tedavi edilen erkek veya dişi farelerde değişmeyen APP 6E10 antikoru ile immünoblot yoluyla ölçüldü (Şekil S3B-D). AD'nin ikinci tanımlayıcı özelliği beyinde hiperfosforile edilmiş tau kalıntılarının bulunması ve plak birikiminin yanı sıra endojen fare tau'nun 5XFAD farelerinde hiperfosforile olmasıdır [47, 48].

Bir amiloid fare modelinde tau hiperfosforilasyonunun FTI tedavisinden etkilenip etkilenmediğini belirlemek için AD'li beyinlerde ve 5XFAD farelerinde hiperfosforile olduğu bilinen bir epitop olan serin 404'te (Şekil 1H; Şekil S3E) fosfo-tau için immünoblot analizi yapıldı. 47, 49]. Burada, lonafarnib ve LNK-754 ile tedavi edilen farelerin beyinlerinde fosfo-tau ser404 seviyelerinin azaldığını bulduk (Şekil 1I), toplam tau seviyesi değişmeden kaldı (Şekil 1J; Şekil S3F). Sonuçlarımızın tamamı, LNK-754 tedavisinin lonafarnib'den önemli ölçüde daha güçlü olmasına rağmen, amiloid plak yükünün ve patojenik tau fosforilasyonunun 5XFAD fare modelinde FTI'lerle farmakolojik tedavi yoluyla azaldığını ortaya koyuyor.

LNK‑754 ile kronik tedavi, 5XFAD farelerinin beyinlerinde protein farnesilasyonunu inhibe eder

FTaz'ı LNK-754 ve lonafarnib ile ip enjeksiyonuyla hedeflemenin, 5XFAD farelerinin beyinlerinde protein farnesilasyonunu inhibe ettiğini doğrulamak için, kronik olarak araç LNK ile tedavi edilen 5XFAD farelerinin yarı beyin homojenatlarında çeşitli FTaz substratlarını ve FTaz inhibisyonunun aşağı yöndeki işaretleyicilerini değerlendirdik. -754 veya lonafarnib immünoblot analiziyle. İlk önce FTase inhibe edildiğinde biriken prelamin A'yı analiz ettik [50]. Araçla karşılaştırıldığında LNK-754 ile tedavi edilen farelerin beyinlerinde prelamin A'da bir artış gözlenirken, lonafarnib ile tedavi edilen farelerde herhangi bir değişiklik meydana gelmedi (Şekil S4A, D). Daha sonra, FTI tedavisini takiben yukarı doğru hareketlilik değişimine uğrayan ve FTase inhibisyonunun bir belirteci olarak yaygın şekilde kullanılan bir şaperon proteini olan HDJ-2'ye baktık [50]. Prelamin A ile tutarlı olarak, HDJ-2'nin daha yavaş göç eden bir formu LNK-754- ile tedavi edilen farelerde mevcuttu ancak lonafarnib ile tedavi edilen farelerde mevcut değildi (Şekil S4B, E). LNK754 farelerinde, araç veya lonafarnib ile tedavi edilen farelere kıyasla daha yavaş göç eden HDJ-2 türlerinde önemli bir artış bulundu (Şekil S4E).

Ek olarak, farnesilasyon Ras'ı aktive eder, dolayısıyla aşağı akış efektör molekülü ERK1'in (P44/P42) fosforilasyonunu da ölçtük (Şekil S4C). HDJ-2 ve prelamin A, lonafarnib tedavisiyle değişmezken, pERK1'in azalmasına yönelik bir eğilim gözlendi (Şekil S4F). LNK-754 ile tedavi edilen farelerde pERK1 de azaldı (Şekil S4F). Sonuçlarımız, 1 mg/kg LNK-754'nin beyinde FTaz'ı inhibe ettiğini, ancak lonafarnibin daha az etkili olduğunu göstermektedir. Bunun nedeni, daha önce gösterildiği gibi lonafarnibin düşük potansiyeli ve IC50'si olabilir [41, 51] veya muhtemelen beyin maruziyetinin azalması olabilir.

LNK‑754 kronik olarak tedavi edilen 5XFAD farelerinde distrofik nöritlerde LAMP1 birikiminde azalma

Sağlıklı nöronlarda, lizozomal bileşenler, distal nöritlerdeki endozomlara ve otofajik organellere iletilir; bunlar, nöronal somaya doğru retrograd trafik sırasında asitlenir ve olgunlaşır [52, 53]. Amiloid plaklar bu süreci bozar ve işlevsiz otofajik ve endolizozomal organelleri hapseden distrofik nöritlere neden olur.

Distrofik nöritler, BACE1'in aksonal taşınmasını bloke ederek, distrofik nöritlerde A oluşumuna ve hücre dışı plak birikimine yol açar [16-18]. FTI'lerin lizozomal fonksiyonu ve mikrotübül stabilitesini arttırdığı bilinmektedir, bu nedenle FTI'lerin plak yükünü nasıl azalttığını daha fazla araştırmak için özellikle 5XFAD farelerindeki distrofik nöritlere odaklandık.

Plakların etrafında distrofik nöritlerin birikimini ölçmek için, heterojen endolizozomal ve otofajik organellerin bir belirteci olan lizozomal ilişkili membran proteini 1'i (LAMP1) değerlendirdik. Araç, LNK-754 ve lonafarnib ile tedavi edilen 5XFAD farelerinden alınan hipokampal ve kortikal beyin dokuları, LAMP1 ve A 42 için birlikte boyandı ve konfokal immünofloresan mikroskopisi yapıldı (Şekil 2A, B).
Distrofik nöritleri spesifik olarak analiz etmek için sağlıklı nöritlerdeki ve somalardaki veziküllerden LAMP1 floresans sinyallerini ortadan kaldırmak için bir eşik belirlendi. LAMP1 kaplı alan, LNK-754 ile tedavi edilen farelerin kortikal ve hipokampal beyin bölgelerinde önemli ölçüde azaldı (Şekil 2C, D), oysa lonafarnib ile tedavi edilen farelerde araç tedavisiyle karşılaştırıldığında hiçbir fark gözlenmedi (Şekil 2C, D). . Amiloid plakların birikmesi, başta aksonlar ve presinaptik terminaller olmak üzere yakındaki nöritlerde distrofilerin gelişimini başlatır.

Buna paralel olarak LNK-754 ve lonafarnibin distrofik nöritler üzerindeki etkileri plak yükü üzerindeki etkileriyle tutarlıdır (Şekil 1). FTI tedavisinin distrofik nöritler üzerindeki etkisinin ek analizi, FTI'lerin plakların etrafındaki distrofi boyutunu sınırlayıp kısıtlamadığını belirlemek için LAMP1 kaplı alanın A42 alanına oranının ölçülmesiyle gerçekleştirildi. Araç fareleri ile karşılaştırıldığında LNK-754 ile tedavi edilen farelerde LAMP1:A42 oranında bir azalma gözlendi ve LNK-754 ve lonafarnib tedavileri önemli ölçüde farklıydı (Şekil 2E, F), bu da LNK'nin -754 fare daha az distrofik nöritle ilişkilendirildi.
LNK-754 veya lonafarnib (Şekil S5A, B) ile tedavi edilen farelerin yarı beyin homojenatlarında yüksek LAMP1 seviyeleri bulundu; bu, lonafarnib ve LNK-754'nin otoizozom sayısını arttırdığını ve daha önce yapılan çalışmalarla tutarlı olduğunu gösterdi. lizozomal membran proteinleri ve hidrolaz seviyeleri [8, 9]. LAMP1 için immünoblot analizi sonuçlarıyla uyumlu olarak (Şekil S5A, B), toplam LAMP1 immün boyamasının ortalama floresan yoğunluğu, LNK-754 ve lonafarnib ile tedavi edilen farelerin beyinlerinde, araçla tedavi edilen farelere kıyasla önemli ölçüde arttı (Şekil S5A, B) .S5C, D).

Toplam LAMP1 floresans seviyesinin aksine, distrofik nöritlerdeki ortalama LAMP1 floresans yoğunluğu araç, LNK-754 ve lonafarnib ile tedavi edilen fareler arasında değişmedi (Şekil S5E, F). LNK-754 ile tedavi edilen farelerin korteksinde, distrofilerdeki LAMP1 floresans yoğunluğu ve plak yükü arasında yüksek düzeyde korelasyon bulunurken, lonafarnib veya araçla tedavi edilen farelerde distrofilerdeki LAMP1 yoğunluğu ile plak yükü arasında herhangi bir korelasyon bulunamadı (Şekil 2G, H), LNK-754 farelerinde distrofik nörit LAMP1 birikimi ile plak yükü arasındaki bağlantıyı ortaya koyuyor. Hipokampusta distrofilerdeki LAMP1 yoğunluğu ile plak yükü arasında bir korelasyona doğru bir eğilim gözlendi. Sonuçlarımız birlikte, LNK-754 tedavisinin toplam LAMP1 seviyesini arttırdığını, ancak genellikle 5XFAD farelerinde bulunan distrofik nöritlerde LAMP1'in patolojik birikimini hafiflettiğini göstermektedir.

LNK‑754 ile kronik olarak tedavi edilen 5XFAD farelerinde distrofik nöritlerde BACE1 birikiminde azalma

LAMP1, aksonal BACE1'i bozunma için olgun lizozomlara hedefleyen endolizozomal organellerin zarlarında bulunur. Bu nedenle FTI'ler, aksonal distrofi oluşumunu ve plakların çevresinde BACE1 birikimini azaltarak A oluşumunu ve hücre dışı plak birikimini engelleyebilir. Bu hipotezi destekler şekilde, LNK-754 farelerinde distrofik nörit LAMP1 düzeyi ve plak yükü kortikal beyin bölgelerinde yüksek düzeyde korelasyon gösterdi.

LAMP1 immün boyama analizimiz, araç veya lonafarnib tedavisiyle karşılaştırıldığında, LNK-754 ile tedavi edilen 5XFAD farelerindeki plakların daha az distrofik nörit ile ilişkili olduğunu ortaya çıkardı (Şekil 2). Distrofik nöritlerdeki BACE1 seviyesinin plak başına benzer şekilde azalıp azalmadığını belirlemek için, LAMP1 ve A42'ye ek olarak BACE1 için araç, LNK-754 ve lonafarnib ile tedavi edilen farelerin kortikal ve hipokampal beyin dokularının konfokal immünofloresan mikroskopisini gerçekleştirdik. (Şekil 3A, B).

Burada, LNK-754 ile tedavi edilen farelerin kortikal beyin bölgelerinde BACE1 ile kaplı alan önemli ölçüde azaldı ve lonafarnib ile tedavi edilen farelerde bir eğilim gözlendi (Şekil 3C). Hipokampustaki distrofik nöritlerde BACE1'in kapladığı alanın analizi, CA3 hipokampal yosunlu lif yolunun presinaptik terminallerindeki yüksek BACE1 ekspresyon düzeyi nedeniyle engellenmiştir [17]. Ayrıca distrofilerde BACE1 ve LAMP1 için Pearson korelasyon katsayısını ölçerek distrofik nöritlerde endolizozomlara daha az BACE1 lokalize olup olmadığını analiz ettik. Araç tedavisiyle karşılaştırıldığında LNK{14}} ile tedavi edilen farelerde kortikal beyin bölgelerinde plak başına BACE1 ve LAMP1 ortak lokalizasyonunda önemli bir azalma bulundu (Şekil 3D).

Hipokampusta, lonafarnib ile karşılaştırıldığında LNK-754 için plak başına BACE1 ve LAMP1 ortak lokalizasyonunda önemli bir azalma bulundu ve araçla karşılaştırıldığında LNK-754 tedavisi için bir azalmaya doğru bir eğilim gözlendi (Şekil .3E). Bu sonuçlar, plak yükü ve LAMP1'in kapsadığı alana ilişkin bulgularımız ile tutarlıdır ve ayrıca LNK-754 tedavisinin distrofik nöritlerin oluşumunu zayıflattığı, bozunma için BACE1'i hedef alan bozulmuş endolizozomal organellerin oluşumunu azalttığı fikrini desteklemektedir.

LNK‑754 ile akut tedavi, 5XFAD farelerin canlı beyin dilimlerinde distrofik nöritlerdeki geç endozom ve lizozom birikimini azaltır

Daha sonra canlı beyin dokularının eş odaklı görüntülemesini gerçekleştirerek LNK-754 ve lonafarnibin distrofik nöritler üzerindeki akut etkilerini test ettik. Bu deneyde, 5-aylık 5XFAD farelerine 3 hafta boyunca günlük olarak araç, LNK-754 veya lonafarnib enjekte edildi. Dokuları, canlı hücrelerdeki asitlenmiş geç endozomları ve lizozomları izlemek ve seçici olarak tanımlamak için yaygın olarak kullanılan bir prob olan LysoTracker-Green (LT) ile boyadık [53]. LT ve tiyazin kırmızısı boyama modeli, 5XFAD farelerinde distrofik nörit belirteçlerine yönelik immün boyama sonuçlarımızla tutarlıydı (Şekil 2A, B; Şekil 3A, B); LT-pozitif geç endozomlar ve lizozomlar, canlı beyin dokularındaki amiloid plaklarla yakından ilişkili distrofik nöritlerde oldukça konsantreydi (Şekil 4A).

5-aylık 5XFAD farelerin LNK-754 veya lonafarnib ile akut 3-haftalık tedavisi, LNK-754 tedavisinin neden olmasına rağmen plak boyutunu azaltmak için yetersizdi (Şekil 4B). plak başına LT:TR oranında ve distrofik nörit boyutunda önemli bir azalma (Şekil 4C, D). İlginç bir şekilde, LAMP1 veya BACE1 bulgularımızın aksine, akut lonafarnib tedavisi ayrıca distrofi boyutunu ve plak başına LT: TR oranını da azalttı (Şekil 4C, D). Distrofik nörit boyutu ve plak boyutu, LNK-754 ile tedavi edilen 5XFAD farelerinde yüksek oranda korelasyon içindeydi (Şekil 4F) ve lonafarnib ile tedavi edilen farelerde de önemli bir korelasyon gözlendi (Şekil 4G). Araçla tedavi edilen farelerde hiçbir korelasyon mevcut değildi (Şekil 4E). Sonuçlarımız LNK-754'nin aksonal distrofiyi azalttığını doğruluyor ve FTI'lerin, yoğun plak birikimi ve akson dejenerasyonundan sonra bile plakların etrafındaki geç endozom ve lizozom birikimini azaltabildiğini öne sürüyor.

LNK‑754 ile kısa süreli tedaviden sonra hAPP/PS1 farelerinde öğrenme ve hafıza eksikliklerinin iyileştirilmesi

LNK-754, 5XFAD farelerinde distrofik nöritlerde LAMP1, BACE1 ve LT'nin birikmesini önledi, bu da LNK-754 tedavisinin A ile ilişkili sinaptik işlev bozukluğuna karşı koruduğunu öne sürdü. LNK-754 tedavisinin bilişsel işlev üzerinde faydalı bir etkisinin olup olmadığını değerlendirmek için, hAPP/PS1 AD fare modelinde oral LNK-754 tedavisinin uzaysal öğrenme ve hafıza üzerindeki kısa vadeli etkinliğini değerlendirdik [40] . hAPP/PS1 farelerinin uzamsal hafızası, Morris Su Labirenti (MWM) tarafından değerlendirildiği üzere, LNK-754 ile 12 günlük oral tedavi sonrasında iyileştirildi.

Gizli platform eğitim oturumları sırasında, LNK-754 ile tedavi edilen hAPP/PS1 fareleri, platformun yerini araçla tedavi edilen hAPP/PS1 farelerine göre daha hızlı bulmayı öğrendi; bu, araçla tedavi edilen hAPP'den önemli ölçüde farklı bir öğrenme eğrisi ile sonuçlandı. /PS1 kontrol fareleri (Şekil 5A). Araçla tedavi edilen hAPP/PS1 farelerinin, eğitim denemelerinin 4. ve 7. günlerinde, araçla tedavi edilen vahşi tip kontrollerle karşılaştırıldığında platformu bulmak önemli ölçüde daha fazla zaman aldı, ancak LNK-754 ile tedavi edilen hAPP/ arasında önemli bir fark bulunamadı. PS1 fareleri ve araçla tedavi edilen vahşi tip fareler (Şekil 5A-C).

Prob testi sırasında, LNK-754- ile tedavi edilen hAPP/PS1 hayvanları, araçla tedavi edilen vahşi tip hayvanlarla karşılaştırılabilir şekilde, hedef çeyrekte geçirilen sürenin arttığını (Şekil 5D) ve platform geçişlerinin sıklığının arttığını (Şekil 5E) gösterdi. . A42 seviyeleri ELISA ile ölçüldü ve araçla tedavi edilen veya LNK-754- ile tedavi edilen hAPP/PS1 farelerinden elde edilen çözünür ve çözünmeyen beyin homojenatlarında değişmedi (Şekil 5F, G), bu da gelişmiş hafıza ve uzamsal öğrenmenin bir sorun olmadığını düşündürmektedir. LNK-754 ile tedavi edilen hAPP/PS1 farelerinde amiloid yükünün azalmasının bir sonucu.

For more information:1950477648nn@gmail.com