Fisetin, Makrofajda Lipopolisakkarit Tarafından İndüklenen İnflamatuar Tepkileri Azaltır

Daha fazla bilgi için, iletişimtina.xiang@wecistanche.com

Birkaç çalışma, polifenollerin insan sağlığı üzerindeki etkinliğini ve güvenliğini bildirmiştir; bununla birlikte, etkinliklerinin doğrulanması yetersiz kalır. Bu çalışmanın amacı meyve ve sebzelerde yaygın olarak bulunan flavonoidlerden biri olan fisetin'in lipopolisakkarit-(LPS-) indükleneniltihaplımakrofajlardaki tepkiler. LPS, proinflamatuar mRNA bolluğunu （MCP 1, IL-1ß ve iNOS） arttırdı ancak fisetin tarafından baskılandı. Oksidatif bir stres faktörü olan LPS tarafından nitrik oksit artışı fisetin tarafından azaltıldı. Ek olarak, mitojenle aktive olan protein kinazın (ERK ve JNK) LPS ile güçlendirilmiş fosforilasyonu azaltıldı. Son olarak fisetin, makrofaj alımı veya infiltrasyonu ile ilişkili faktörler olarak bilinen uPA, uP AR, MMP-2 ve MMP-9 ekspresyonunu veya aktivitesini zayıflattı. Sonuç olarak,fisetinsepsis ve ateroskleroz gibi makrofajla ilişkili inflamasyon hastalıkları için umut verici bir terapötik ajandır.

Daha fazla bilgi edinmek için buraya tıklayın.

1. Giriş

Doğal bileşenlerin terapötik kullanımı son 20 yılda daha fazla dikkat çekmiştir. Yüksek etkinlikleri ve düşük toksisitelerine dayanarak, FDA onaylı terapötik ajanların yüzde 40'ı doğal bazlı bileşenler veya bunların türevleridir [1]. Diğer ilaçlarla ilişkili toksisite, farklı doğal ürünler tarafından başarıyla önlenmiştir [2]. Bu nedenle, bitki kaynaklı doğal bileşiklerin daha fazla araştırılması çok önemli ve önemlidir.

polifenollerbitki sekonder metabolitleridir ve bitki kökenli yiyecek ve içeceklerde, meyvelerde, sebzelerde, baharatlarda, çayda ve şarapta yaygın olarak bulunurlar. Temel mikro besinler olarak kabul edilmeseler de, çeşitli literatür, özellikle meyve ve sebze tüketiminin yüksek olduğu diyetlerde insan sağlığı üzerindeki yararlı etkilerini ortaya koymaktadır [3-5]. Polifenollerin farmakolojik etkilerinin araştırılması için onlarca yıl boyunca sağlık için faydalar öneren çok sayıda çalışma yapılmıştır. Artan kanıtlar, birkaç polifenolünantienflamatuvarözellikleri

[6-8].Ayrıca, son çalışmalar, çeşitli polifenol türlerinin, inflamasyonla ilgili düzenleyici enzimleri veya transkripsiyon faktörlerini inhibe edebileceğini göstermiştir [9].

Diyet, inflamasyonun farklı aşamalarını etkiler ve çeşitli inflamatuar hastalıklar üzerinde önemli bir etki gösterir[10,11]. İnflamasyon diyabet, astım, kardiyovasküler hastalıklar ve kanser gibi hastalıkların gelişiminde anahtar rol oynar [12]. Bu nedenle inflamasyonu kontrol etmek bu hastalıkları önleyebilir. Makrofajlar inflamasyonun ana aracıları olduklarından doku homeostazında ve inflamasyonda çeşitli fonksiyonlara sahiptirler. Bu nedenle, makrofajların anormal aktivasyonu zararlı bağışıklık tepkilerine neden olabileceğinden, işlevlerini etkin bir şekilde modüle eden ajanlar büyük klinik değere sahiptir. Mevcut araştırma eğilimi, doğal ürünlerin yeni ilaçların en önemli kaynaklarından biri olduğunu açıkça göstermektedir [13].

Bir polifenol, isetin (3,3',4',7-tetrahidroksiflavon), çilek, elma, domates, soğan, portakal, şeftali, üzüm, kivi, hurma, çay ve şarapta zengin bir şekilde bulunur [14] . Şimdiye kadar fisetin, güçlü anti-inflamatuar [15-17] bildirdi,

hem hücre kültüründe hem de insan hastalıklarıyla ilgili hayvan modellerinde antioksidan [18], antitümörojenik[19,20, antianjiyogenik [21], antidiyabetik [22], nöroprotektif [23] ve kardiyoprotektif etkiler [24]. Fisetin birçok fizyolojik etkiye sahip olmasına rağmen makrofajlar üzerindeki etkisi çok fazla bildirilmemiştir.

Bu çalışmada, fisetin ile aktive olan makrofajların inflamatuar yanıtı üzerindeki yararlı etkilerini araştırdık.lipopolisakkarit(LPS).

2. Malzemeler ve Yöntemler

2.1. Yerleşik Peritoneal Makrofajların İzolasyonu.

BALB/c fareleri Tokyo Üniversitesi Tıp Bilimleri Enstitüsünden alındı ​​ve Okayama Üniversitesi Hayvan Kaynakları Merkezinde muhafaza edildi. Tüm hayvan deneyleri, NIH yönergelerine (Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu) uyacak şekilde yapılmıştır. Deney protokolü, Okayama Üniversitesi Tıp, Diş Hekimliği ve Eczacılık Bilimleri Enstitüsü'nün (OKU-2018449) Hayvan Deneyleri için Etik İnceleme Komiteleri tarafından onaylandı. Tüm fareler bir bariyer tesisinde tutuldu ve normal bir laboratuvar diyeti ile beslendi. 16±4 haftalık erkek ve dişi BALB/c farelerine izofluran ile anestezi uygulandı ve servikal dislokasyon yoluyla ötenazi yapıldı. Makrofajlar, salin (5 mL) kullanılarak peritoneal lavaj yoluyla toplandı. Peritoneal lavaj solüsyonu 1500 rpm'de 5 dakika santrifüj edildi. Tortu biraz DMEM (SIGMA, Kat. No.D6046) içinde süspanse edildi. Kırmızı kan hücreleri, bir amonyum klorür çözeltisi kullanılarak parçalandı. Makrofajların sayısı bir hemositometre kullanılarak hesaplandı, ardından ısıyla inaktive edilmiş FBS(yüzde 10 vv), penisilin (10 U/mL) ve streptomisin (10mg/mL) içeren DMEM'de yeniden süspanse edildi ve 6-kuyuya kaplandı plakalar (Corning Incorporated, Kat. No.3516) [25,26].

2.2. Hücre Kültürü Koşulları.

Gece boyunca serum açlığından sonra, makrofajlar seçilen fisetin（10, 30 ve 100 uM konsantrasyonları ile inkübe edildi; SIGMA, Kat. F4043) veya aracı 3 saat süreyle inkübe edin ve uygun bir süre boyunca LPS(10ng/mL; SIGMA, Kat. No.L4391) varlığında veya yokluğunda inkübe edin. Daha sonra ortam ve hücreler toplandı. Ortam, nitrik oksit (NO) tahlili ve jelatin zimografisi için kullanıldı. Hücre lizatları, nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) ve western blotlama için kullanıldı.

2.3. Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu.

mRNA'lar, RNeasy Mini Kitleri (QIAGEN, Kat. No.74104) kullanılarak makrofajlardan ekstre edildi. Ters transkripsiyon, bir iScript cDNA Sentez Kiti (Bio-Rad, Kat. No. 1708891) kullanılarak yapıldı. qPCR, bir Fast SYBR Green Real-time PCRMixture (Applied Biosystems, Kat. No. 4385612)[27] kullanılarak bir ABI Step One Real-Time PCR Sistemi (Applied Biosystems, QuantStudio 3) ile gerçekleştirilmiştir. Monosit kemotaktik protein 1(MCP-1)(Takara Bio Inc, Kat. No. MA066003), interlökin 1 beta(IL-1)(Takara Bio Inc., Kat. No. MA025939), indüklenebilir nitrik oksit sentaz (iNOS)(Takara Bio Inc, Kat. No. MA083369), matris metalloproteinaz-(MMP-)2(Takara Bio Inc., Kat. No. MA127110), MMP-9(Takara Bio Inc. ., Kat. No.MA031311) ve 18S ribozomal RNA(18S)(Takara Bio Inc., Kat. No. MA050364) ticari olarak mevcuttu. Her numune, 18S mRNA ifadesi (AACT yöntemi) [27] için değerlere normalleştirildi.

2.4. Nitrik Oksit Deneyi.

Bireysel hücre kültürü süpernatanları toplandı ve 10 dakika 14,000rpm'de 4 derecede santrifüjlendi. Daha sonra süpernatan, nitrik oksit (NO) tahlili için kullanıldı. NO tahlili, ticari olarak temin edilebilen kitlerde (BioAssay Systems, Kat. No. D2NO-100) açıklandığı gibi yapıldı. BioAssay Systems' QuantiChrom Nitrik Oksit Test Kiti, geliştirilmiş Griess yöntemi kullanılarak nitratın nitrite indirgenmesinin ardından NO üretiminin belirlenmesi için kolorimetrik bir testtir.

2.5. Western Blot.

Tam hücre proteinleri, bir lizis tamponu (Cell Signaling, Kat. No.9803) kullanılarak makrofajlardan ekstre edildi. Her numune, yüzde 10 SDS-PAGE'ye uygulandı ve bir poliviniliden florür membranına aktarıldı, birincil antikorlarla immünoblotlandı (hücre dışı sinyalle düzenlenen kinazın (p-ERK) fosforilasyonu); Hücre Sinyali, Kat. No.9101, fosforilasyonu c-Jun N-terminal kinaz(p-JINK);Cell Signaling, Kat.No.9251, ürokinaz plazminojen aktivatörü(uPA);Abcam, Kat.No.

ab20789, ürokinaz plazminojen aktivatörü ve reseptör (uPAR); R&D, Kat.No.AF534 ve -aktin; Sigma Kedi. A5441)[28]. Zarlar daha sonra uygun ikincil antikorlarla inkübe edildi ve immün kompleksler kemilüminesans (Merck Millipore, Kat. no. WBLUF0100, Kat.no. WBLUC0100) üzerinde görselleştirildi ve bir General Electric Imager (GE Healthcare, LAS4000 mini)[29] kullanılarak ölçüldü.

2.6. Jelatin Zimografisi.

Hücre kültürü süpernatanları, MMP'nin aktivitelerini değerlendirmek için jelatin (0yüzde ağırlık/ağırlık %1) mevcudiyetinde polimerize edilen SDS-PAGE (yüzde 10 ağırlık/hacim) ile indirgeyici olmayan koşullar altında çözülmüştür{ {4}}. Jeller iki kez Triton X-100(yüzde 2.5 hacim/hacim) ile 60 dakika ve damıtılmış su ile 15 dakika yıkandı. Jeller daha sonra kalsiyum klorür (5mM)pH8.0 içeren 37 derece Cin 50mM Tris tamponunda gece boyunca inkübe edildi. İnkübasyondan sonra jeller Coomassie Brilliant Blue R-250(Bio-Rad, Kat. No.{ ile boyandı. {18}}) oda sıcaklığında 30 dakika, ardından Coomassie Brilliant Blue R-250 Destaining Solution (Bio-Rad, Kat. No.161-0438) ile berrak bantlar görünene kadar lekeyi giderin. Jel görüntüleri bir General Electric Imager (GE Healthcare, LAS 4000 mini) kullanılarak ölçülmüştür; boyanmamış, yarı saydam sindirilmiş bölgeler, MMP aktivitesinin alanlarını temsil ediyordu [30].

2.7. İstatistik.

Tüm istatistiksel analizler Sigma Plot v14.0(Systat Software Inc, California, ABD) kullanılarak yapıldı. Veriler, ortalamanın ortalama ± standart hatası olarak sunulur. Birden fazla grup arasındaki istatistiksel anlamlılık, tek yönlü veya iki yönlü varyans analizi ve ardından Holm-Sidak post hoc testi veya Student-Newman-Keuls post hoc testi ile değerlendirildi. değer<0.05 was="" considered="" statistically="">

3. Sonuçlar

3.1. LPS ile Uyarılan Makrofajlarda Fisetin Zayıflatılmış Enflamatuar Aracılar.

Aktive makrofajlar, proinflamatuar sitokinler ve NO[8] gibi inflamatuar mediatörler ürettiğinden, LPS ile uyarılan makrofajlarda fisetin'in inflamatuar mediatörler üzerindeki etkilerini inceledik. İlk olarak, fisetin'in transkripsiyonel seviyede anti-inflamatuar etki gösterip göstermediğini incelemek için, MCP-1, IL-1 ve iNOS gibi inflamatuar genlerin mRNA A ekspresyon seviyelerini belirledik (Şekil 1(a) ). Beklendiği gibi, bu inflamatuar genlerin ekspresyonları fisetin tarafından doza bağlı bir şekilde baskılanmıştır. Daha sonra, fisetin'in makrofajlarda inflamatuar yanıtı baskılayıp baskılamadığını doğrulamak için, LPS ile tedavi edilen makrofajlarda NO üretimini baskılama kabiliyetini değerlendirdik(Şekil 1(b)). Beklendiği gibi fisetin, NO üretimini doza bağlı bir şekilde azalttı.

3.2. LPS ile Uyarılmış Makrofajlarda Fisetin İndirgenmiş Mitojenle Aktive Edilmiş Protein Kinaz.

Fisetin'in çeşitli hücre tiplerinde mitojenle aktive olan protein kinaz(MAPK)yollarını inhibe ettiği bildirildiğinden [31, 32], fisetin'in makrofajlardaki MAPK'ler üzerindeki etkilerini inceledik. İlk olarak, makrofajlarda LPS tarafından indüklenen MAPK'lerin aktivasyonu gözlendi (Şekil 2(a)). LPS ile p-ERK'deki artış, stimülasyondan 15 dakika sonra zirveye ulaşırken, LPS ile p-JNK artışı 30 dakikada zirve yaptı. Böylece sonraki deneylerde makrofajlar 30 dakika boyunca LPS ile uyarıldı. Fisetin ile birlikte tedavi, p-ERK ve p-JNK'nin LPS kaynaklı artışını önemli ölçüde azalttı(Şekil 2(b) ve 2(c)).

3.3. LPS ile Uyarılan Makrofajlarda Fisetin Azaltılmış uPA ve uPAR.

Makrofaj aktivasyonu, hücrelerin istilası ile yakından ilişkilidir. Ek olarak, makrofajlardaki uPA ve uPAR, hücrelerin infiltrasyonuna katkıda bulunur. Böylece fisetin'in uPA ve uPAR ekspresyonu üzerindeki etkisi araştırıldı. LPS, uPA (Şekil 3(a)) ve uPAR(Şekil 3(b)) protein bolluğunu indüklemiştir. Fisetin ile birlikte tedavi, uPA(Şekil 3(a)) ve uPAR'ın LPS ile artışını azalttı (Şekil 3(b)).

3.4. LPS ile Uyarılmış Makrofajlarda Fisetin Azaltılmış MMP-2 ve MMP-9.

Ayrıca, fise-tin'in MMP'ler üzerindeki etkisini aydınlatmak için, uPA/uPAR'ın aşağı akış aracıları olan MMP-2 ve MMP-9 ifadelerini inceledik. MRNA seviyesi ile ilgili olarak, LPS, araç tedavisine kıyasla MMP-2 ve MMP-9 mRNA ifadesini önemli ölçüde arttırdı (Şekil 4(a)). Fisetin, LPS tarafından indüklenen MMP-2 veya MMP9'un bu gen ekspresyonlarının artışını doza bağlı bir şekilde azalttı(Şekil 4(a)). Ayrıca MMP-9'nin protein aktiviteleri zimografi ile değerlendirildi (Şekil 4(b)). MMP-9(92kDa)'nın protein aktiviteleri, fisetin tarafından azaltılan LPS stimülasyonu ile arttırıldı (Şekil 4(b)).

4. Tartışma

Makrofajlarda inflamasyona karşı fisetin'in önemli bir etkisi olduğunu bulduk. Mevcut çalışma fisetin'in makrofajlarda LPS tarafından indüklenen MCP-1, IL-1 , iNOS ve NO gibi inflamatuar bileşenlerin indüksiyonunu azalttığını göstermiştir. Ek olarak fisetin, MAPK aktivasyonunu bastırdı ve LPS ile indüklenen uPA ve uPAR ekspresyonu artışını hafifletti. Ayrıca fisetin, MMP-2 ve MMP-9 mRNA bolluğundaki artışı ve MMP-9 aktivitesini zayıflattı.

Gram negatif enfeksiyonun neden olduğu sepsiste, LPS yaygın olarak sepsisin etken maddesi olarak kabul edilir. Birçok çalışmada LPS, inflamasyonun yanı sıra sepsis modeli olarak kullanılmıştır. Ayrıca, kronik inflamasyon, inflamatuar hücrelerin aktivasyonu ve iNOS gibi bir proinflamatuar mediatör ve nükleer transkripsiyon faktörü kappa B (NF-xB) gibi transkripsiyon faktörlerinin uygunsuz üretimi yoluyla erken kanseri indükler [33]. Ayrıca iNOS ekspresyonunu azaltarak oksidatif stresin azaldığı da bildirilmiştir [34]. Çalışmamız, proinflamatuar genlerin mRNA bolluğu ve NO üretimi üzerindeki baskılayıcı etkisinden dolayı fisetin'in sepsis ve septik şokun önlenmesinde ve tedavisinde etkili olabileceğini göstermiştir. Bu çalışmada fisetin, proinflamatuar genin (iNOS) mRNA'sının ekspresyonunu azaltarak NO üretimini baskılamıştır; bu nedenle, fisetin'in oksidatif stresi azaltması muhtemeldi. Sonuç olarak, bu sonuçlar fisetin'in antiinflamatuar, antitümörojenik ve antioksidan etkilerini destekledi.

Birkaç çalışma, LPS'nin, ERK ve JNK dahil olmak üzere MAPK'ların fosforilasyonunu indüklediğini bildirmiştir [35]. Ayrıca, fisetin'in, MAPK'yı baskılayarak uPA ekspresyonunu aşağı regüle ederek insan servikal hücrelerinin göçünü ve istilasını engellediği bildirilmiştir[36]. -fajlar, fisetin'in uPA ve uPAR'ın ekspresyonu ve aktivitesi üzerindeki etkisine ilişkin birkaç rapor mevcuttur. Çalışmamız, fisetin'in, daha önce kanser hücrelerinde bildirildiği gibi, makrofajlarda MAPK sinyalini baskılayarak LPS tarafından indüklenen uPA ve uPAR ekspresyonunu ilk kez bastırdığını gösterdi.

MMP'ler, ekspresyonu gelişim, fizyoloji ve patoloji gibi belirli süreçlerle ilgili olan bir proteaz ailesidir. Ortak olarak, MMP-9, ateroskleroz, artrit ve sistemik lupus eritematozus gibi çeşitli inflamatuar hastalıkların bir belirteci olarak kabul edilmiştir [37]. Ek olarak, MMP-9 hücre göçü ile yakından ilişkiliydi [38,39]. Birkaç çalışma özellikle MMP-2 ve MMP-9'nin aterogenezde yer aldığını ve aterosklerotik plakların stabilizasyonunda önemli bir rol oynadığını bildirmiştir 40-42. Bu noktada, sonuçlarımız inhibitörlerin MMP-9, hassas plakların stabilizasyonu için terapötik bir yaklaşım olarak umut verebilir. Ayrıca, son araştırmalar derideki yara iyileşmesinin MMP'nin aşırı aktivasyonu ile bozulduğunu göstermiştir-9 [43]. Bu nedenle fisetin'in ciltte iyileşme için terapötik bir yaklaşım olarak da potansiyele sahip olduğu öne sürülmüştür. Moleküler mekanizmalarla ilgili ayrıntılarını aydınlatmak için gelecekteki çalışmalara ihtiyaç duyulacaktır.

Farmasötik endüstrisindeki yeni bir eğilim, doğal bitkinin kendisini yeni ilaç olarak geliştirmek için stratejiler keşfetmektir. Gerçekten de, yakın zamanda yapılan iki hayvan çalışması, LPS ile indüklenen akut pulmoner inflamasyon ve kollajen ile indüklenen artritin fisetin tedavisi |32,44 ile iyileştirildiğini göstermiştir. Başka bir ex vivo çalışma da fisetin'in kronik obstrüktif akciğer hastalığı veya tip 2 diyabeti olan hastaların lökositlerinden LPS ile indüklenen sitokin salınımını azaltabildiğini göstermiştir[45]. İnflamatuar ve otoimmün hastalıkları hafifletmek için birçok immünosupresif ilaç geliştirilmiştir[46-50]; yine de, çoğu bileşik önemli yan etkiler sergiler. Polifenoller diyet meyve ve sebzelerde yaygın olarak bulunduğundan, muhtemelen daha güvenli immünosupresif ajanlar olabilirler [51, 52]. Meyve ve sebzeler, seskiterpen laktonlar, terpenoidler, polisakkaritler ve fenolik bileşikler dahil olmak üzere çok çeşitli fitokimyasallar içerir. Fisetin'in antiinflamatuar, antitümörojenik ve antioksidan etkilerini gösteren sonuçlarımız, yeni bir ilaç olarak geliştirilebileceğini kuvvetle göstermektedir. Fisetin, immünoterapi için umut verici bir aday olmasına rağmen, belirli bir hastalık için terapötik bir ajan olarak fisetin içeren doğal ürünlerin potansiyelinin klinik ortamda daha fazla doğrulanması gerekmektedir.

5. Sonuçlar

Bu çalışma, fisetin'in artışları azalttığını göstermiştir.iltihaplıgenler (MCP-1, IL-1b ve iNOS), NO üretimi ve makrofajlarda LPS tarafından indüklenen MAPK, uPA, uPAR ve MMP'lerin fosforilasyonu. Bu sonuçlar fisetin'in makrofajla ilişkili birkaç hastalık için terapötik bir ajan olabileceğini düşündürdü.