Doğal Olarak Oluşan Bir Flavonoid olan gossypitrin, Demir Kaynaklı Nöronal ve Mitokondriyal Hasarı Azaltır Bölüm 1

Lütfen iletişime geçinoscar.xiao@wecistanche.comdaha fazla bilgi için

Soyut:Demir homeostazının bozulması, sinir hücrelerinde mitokondriyal fonksiyon kaybında önemli bir faktördür ve nörodejenerasyona yol açar. Burada, doğal olarak oluşan bir flavonoid olan gossipitrinin (Gos), fare hipokampal HT-22 hücreleri ve sıçan beyinlerinden izole edilen mitokondri kullanılarak demir kaynaklı nöronal hücre hasarı üzerindeki koruyucu etkisini değerlendirdik. Gos, HT22 hücrelerini 100 uM Fe ()-sitrat (EC50 8.6 uM) tarafından indüklenen hasardan kurtarmayı başardı. Bu koruma, hem demir kaynaklı mitokondriyal membran potansiyel dağılımının hem de ATP tükenmesinin önlenmesi ile bağlantılıydı. İzole mitokondride, Gos (50uM), demir kaynaklı mitokondriyal şişmeye, mitokondriyal transmembran potansiyelinin kaybına ve ATP tükenmesine karşı neredeyse tam koruma sağlamıştır. Gos ayrıca, tert-bütil hidroperoksit kaynaklı olandan yaklaşık dokuz kat daha düşük olan ICs0 değeri (12.45 μM) ile Fe (II.)-sitrat kaynaklı mitokondriyal lipit peroksidasyonunu önledi.oksitlenme. Ayrıca, flavonoid hem 15 hem de 1.5 mM 2-deoksiribozun bozulmasını inhibe etmede etkiliydi. Ayrıca zamanla Fe (II) konsantrasyonunu azaltırken, O2 tüketim oranını arttırdı ve Fe (II) 'nin askorbat ile azaltılmasını bozdu. Gos-Fe (I) kompleksleri, UV-VIS ve IR spektroskopileri ile tespit edildi ve belirgin bir Gos-demir stokiyometrisi 2: 1'di. Sonuçlar, Gos'un genellikle klasik bir antioksidan olarak hareket etmediğini, ancak Fe (II) oksidasyonunu uyardıktan sonra demiri ferrik formunda tutarak demiri doğrudan etkilediğini göstermektedir. Bu nedenle metal iyonları Fenton tipi bir reaksiyona ve lipit peroksidasyon yayılım aşamasına katılamaz. Bu nedenle, Gos, demir kaynaklı oksidatif stres ve mitokondriyal hasar ile ilişkili nöronal hastalıkları tedavi etmek için kullanılabilir.

Daha fazla bilgi için lütfen buraya tıklayın

Anahtar kelime -ler: gossypitrin; demir; HT-22 hücreleri; mitokondri;nörodejenerasyon; nöroproteksiyon

1. Giriş

Demir, DNA sentezi ve restorasyonu, oksijen taşınması, hücresel solunum, ksenobiyotik metabolizma ve hormon sentezi gibi birçok önemli biyolojik süreçte önemli bir kofaktördür [1]. Bununla birlikte, yüksek hücre içi seviyelerde, hücresel redoks potansiyellerinde bir değişiklikle hücresel reaktif oksijen türlerini artırabilir [2,3]. Parkinson hastalığı (PD), Alzheimer hastalığı (AD), Huntington hastalığı (HD), multipl skleroz, Friedreich ataksisi, epilepsi, huzursuz bacak sendromu ve inme gibi hemen hemen her nörolojik durumda demir dishomeostazı görülür [4,5]. Özellikle, mikrovaskülatürlerin yırtılmasının olduğu ve salınan kanın nöral hücrelerin kan kaynaklı demir maruziyetine neden olduğu intraserebral kanamada, nörodejenerasyonun ana mekanizmaları demir ve heme kaynaklı ROS üretimi, inflamasyon ve eksitotoksisitedir [6,7]. Beyin kanamasının in vitro ve in vivo deneysel modelleri, düzenlenmiş nekrozun demire bağımlı bir formu olan ferroptozun varlığını göstermiştir [8]. Ayrıca, artan kanıtlar, demir homeostazının bozulmasının, sinir hücrelerinde mitokondriyal fonksiyon kaybında gerekli olduğunu göstermektedir [9,10], bu da nörodejenerasyona yol açabilir [11-14]. Son zamanlarda Parkinson hastalığının erken başlangıçlı formu ile demir metabolizması disregülasyonu ve mitokondriyal bozukluk arasında bir ilişki bildirilmiştir [15]. Mitokondriyal bölmelerde nispeten yüksek miktarda demir ve ROS'un bir arada bulunması, bu organeli hidroksil radikal aracılı hasara duyarlı hale getirir. Bu nedenle, beyin demir regülasyonu ve demir aracılı mitokondriyal bozukluğu hedef alan farmakolojik ajanlar, nörodejenerasyona karşı terapötik olarak yararlı olabilir. Çeşitli demir şelatlama ajanlarının farklı deneysel modellerde nöroprotektif etkiler sergilediği bulunmuştur [16-19]. Öte yandan, demir şelasyonu ve serbest radikal süpürme aktivitelerinin bir kombinasyonuna dayanan antioksidan etkileri nedeniyle doğal olarak oluşan polifenollerin nöroprotektif potansiyeli hakkında birçok rapor bulunmaktadır [20,21]. Grubumuz, mangiferin, guttiferon-A ve rapanon gibi katekol içeren polifenollerin hem in vitro hem de in vivo olarak demir ile etkileşime girdiğini ve böylece ROS'u teşvik etmedeki katalitik rolünü iptal ettiğini gözlemlemiştir [22-28]. Ayrıca yakın zamanda, doğal olarak oluşan bir flavonoid (Şekil 1) olan gossipitrinin (Gos) güçlü antioksidan etkilerini bildirmiş ve nöroprotektif bir ajan olarak potansiyel kullanımını göstermiştir [29]. Bununla birlikte, bu antioksidan etkilerde yer alan mekanizmalar hakkında çok az şey bilinmektedir. Elektron delokalizasyonu, bir katekol köstebek ve üç aromatik hidroksil grubu (ikisi bir karbonil grubuna bitişik) ile düzlemsel altı üyeli bir siklik sistemin varlığı, bu molekülün bir demir şelatlama maddesi olarak hareket edebileceğini kuvvetle düşündürmektedir, çünkü bunlar flavonoidler tarafından demir şelasyonunu destekleyen yapısal özelliklerdir 30]. Bu nedenle, bu çalışmanın amacı, Gos'un HT-22'yi koruma yeteneğini değerlendirmektir.nöronal hücrelerve demir aracılı sıçan beyin mitokondrisinden izole edildioksidatif hasar. Gos-demir etkileşiminin doğasını daha da karakterize etmek için hücre / mitokondri içermeyen sistemlerdeki diğer çalışmalar yapılmıştır.

2. Sonuçlar

2.1. Gos, HT-22 Hücrelerini Fe (I) Kaynaklı Hücre Ölümünden Kurtarıyor

Fe (II) (100 μM), MTT testi tarafından tahmin edildiği gibi, HT-22 hücre sağkalımını 24 saatlik maruziyetten sonra% 17.4'e düşürdü. Gos, hipokampal hücre ölümünü doza bağımlı bir şekilde önledi. EC50 8.64± 1.58 μM idi (Şekil 2A, giriş). 100 μM Gos ile tam hücre koruması, hücre ölümünü % 74 oranında önleyen iyi bilinen hidroçözünür antioksidan olan Trolox'tan (500 uM) daha etkili olduğu gözlendi.

HT-22'nin 2 saat boyunca demire maruz kalması (hücre ölümü infazından önce), rodamin 123'ün organeller içinde tutulması (Şekil 2B) ve ATP tükenmesi (Şekil 2C) ile tahmin edildiği gibi, mitokondriyal membran potansiyelinin dağılmasına neden olmuştur. Bu, mitokondri üzerindeki toksik demir aracılı etkiler ile hücre canlılığı arasında olası bir ilişki olduğunu göstermektedir. Gos, mitokondriyal koruma yoluyla demir kaynaklı HT-22 hücre ölümünü önleyebileceğini gösteren nöron canlılığı modellerini izleyerek, mitokondrinin demire bağlı doza bağımlı bozulmasını önledi.

Şekil 2.Demir kaynaklı nöronal hücre hasarına karşı koruma sağlar. Gos'un HT-22 fare hipokampal nöron sağkalımı (A), hücresel mitokondriyal membran potansiyeli (B) ve hücresel ATP seviyeleri (C) üzerindeki etkileri. Gos (0-100 μM) veya Trolox (500 μM), 100 μM FeCl2 / 1 mM sitrat ile 24 saat (canlılık) veya 2 saat (mitokondriyal membran potansiyeli ve ATP seviyeleri) için birlikte inkübe edildi. Tahlil koşulları Bölüm 4'te açıklanmıştır. Hasarlı kontrol hücreleri (Go'suz) DMSO (% 0.001) artı demir-sitrat karışımını içeriyordu. Sonuçlar, hasarsız kontrole göre hücre ölümünün yüzdesi olarak ifade edilir (araç olarak% 0.001 DMSO0.001 içerir). Değerler, üç farklı deneyin S.D. ± aracıdır. Farklı semboller p'deki istatistiksel farklılıkları gösterir<0.05 when="" comparing="" all="" pairs="" of="" experimental="" groups="" according="" to="" the="" anova="" and="" post="" hoc="" newman-keuls="" tests.="" (if="" the="" symbols="" are="" different="" among="" groups="" indicate="" statistical="" differences,="" when="" they="" are="" equal,="" there="" is="">

Cistanche bağışıklığı artırabilir

2.2. Gos, Sıçan-Beyin Mitokondrisini Demir Kaynaklı Mitokondriyal Lipoperoksidasyondan Kurtarır Fe ()-sitrat (50 μM) ile inkübe edilen beyin mitokondrisi, tiyobarbitürik asit reaktif maddenin oluşumunda bir artışla ifade edilen belirgin bir lipoperoksidasyona maruz kalmıştır (Şekil 3A). Gos, demir aracılı mitokondriyal lipid peroksidasyonunu konsantrasyona bağlı bir şekilde inhibe etti (IC50 değeri 12.45±1.24 μM) (Şekil 3A, giriş). Gos'un tert-bütil hidroperoksit (300 μM) ile indüklenen mitokondriyal lipid peroksidasyonu (IC50 değeri>100 μM) üzerindeki etkileri, demir kaynaklı lipid peroksidasyonunu önlemede peroksil kaynaklı lipid peroksidasyonundan daha etkili olduğunu ve doğrudan demir üzerinde hareket etme yeteneğini düşündürdüğünü göstermektedir (Şekil 3B).

Şekil 3. Gos, 50 uM Fe () -sitrat (A) veya 300μM tert-bütil hidroperoksit (B) tarafından indüklenen mitokondride malondialdehit oluşumunu inhibe eder. Ratbrain mitokondrisi (1 mg / mL), 125 mM sakaroz, 65 mM KCl, 10mM HEPES tamponu (pH 7.4), 2 mM süksinat ve 2.5 uM rotenon içeren bir reaksiyon ortamında inkübe edildi. Deneyler, hasarsız Kontrol (gri çubuklar) hariç, 50μM Fe (II) veya 300 μM tert-bütil hidroperoksit ilavesiyle başladı. Kuluçka süresi 28 ° CC'de 20 dakika idi. Değerler, ±S.D. (n=6) araçlarıdır. Farklı semboller p'deki istatistiksel farklılıkları gösterir<0.05 when="" comparing="" all="" experimental="" groups="" according="" to="" the="" anova="" and="" posthoc="" newman-keuls="" tests.="" (if="" the="" symbols="" are="" different="" among="" groups="" indicate="" statistical="" differences,="" when="" they="" are="" equal,="" there="" is="">

2.3.Gos, Demir Aracılı Mitokondriyal Şişlik Dağılımını ve ATP Tükenmesini Önler

Şekil 4A, 50μM Fe (I) sitrat kompleksinin, 540nm'de (f hattına karşı a çizgisi) absorbanstaki bir azalma ile ifade edildiği gibi mitokondriyal şişmeyi indüklediğini göstermektedir. Spontan ve tam △Y depolarizasyonu (Şekil 4B, linef ve line a) ve ATP tükenmesi (Şekil 4C, Fe()/sitrat kolonu) ile ilişkiliydi. Gos, demir kaynaklı şişlik sürecini ve AY yayılımını konsantrasyona bağlı bir şekilde inhibe etmiştir (Şekil 4A, B hatları b-e). Panel A'dan absorbans değerleri (7 dakikada ortalama SD ±) şunlardı: 0.482±0.013 (a satırı), 0.459± 0.011 (b satırı),0.445± 0.007 (c hattı),0.435± 0.015 (d çizgisi), 0.360±0.011 (e satırı) ve 0.338±0.012 (f satırı). Panel B'den (7 dakikada ortalama SD ±) floresan değerleri 15.03±1.71 (a satırı),19.41±2.07 (b satırı),22.29±2.58 (c satırı),45.505±4.47 (d çizgisi), 118.468±5.76 (e satırı) ve 146.201±5.83 (f çizgisi) idi. p<0.05. the="" naturally="" occurring="" flavonoids="" also="" prevented="" iron-mediated="" atp="" depletion="" in="" a="" concentration-dependent="" manner(figure="" 4c).="" a="" strong="" interaction="" of="" gos="" with="" iron="" is="" suggested="" as="" the="" key="" mechanism="" for="" neuroprotection="" against="" iron-induced="" damage,="" both="" in="" ht-22="" neuronal="" cells="" and="" in="" brain="" mitochondria.="" to="" further="" characterize="" this="" gos-iron="" interaction,="" different="" experiments="" on="" a="" cell/mitochondria-free="" system="" were="">

Şekil 4. (A) Mitokondriyal geçirgenlik geçiş indüksiyonu, (B)mitokondriyal membran potansiyeli (AH)kaybı ve (C) 50 μM Fe(II)-sitrat tarafından indüklenen ATP seviyelerinin azaltılması. A, floresan probu safranin (5 uM) kullanılarak tahmin edildi. Gos 50,25, 10 ve 1μM'nin inhibitör etkileri sırasıyla (b), (c), (d) ve (e) satırlarında gösterilmiştir. Sırasıyla (a) ve (f) çizgileri hasarsız kontrolleri (demirsiz) ve hasarlı kontrolleri (Go'lar olmadan) temsil eder. Oklarla belirtilen yerlere sıçan beyin mitokondrisi (RBM-0.5 mg / mL), Fe (II) ve 1 μM CCCP eklendi. Grafikteki farklı semboller (C) istatistiksel farklılıkları gösterir atp<0.05 when="" comparing="" all="" pairs="" of="" experimental="" groups="" according="" to="" the="" anova="" and="" post="" hoc="" newman-keuls="" tests.(if="" the="" symbols="" are="" different="" among="" groups="" indicate="" statistical="" differences,="" when="" they="" are="" equal,="" there="" is="">

2.4. Gos, Fe(II)-Sitrat Otoksidasyonunu ve O, Tüketimini İndükler

Gos, doza bağımlı bir şekilde 2 mM sitrat (mitokondri olmadan) içeren bir reaksiyon ortamında Fe () konsantrasyonunu (1 dakikalık preinkübasyon) azaltmıştır (Şekil 5A, siyah daireler). 5 dakikalık bir ön kuluçka süresi (Şekil 5A, kırmızı kutular) Fe (II) konsantrasyonunu daha da azaltmıştır. Gos ayrıca, muhtemelen Fe (ll) 'nin Fe (II.II) 'ye oksidasyonu nedeniyle O2 tüketim oranını arttırmıştır (Şekil 5B, C). Bu sonuçlar, Gos'un sitrat kompleksinden Fe (II) 'yi çıkarabileceğini ve elektron alıcısı olarak O2 gerektiren bir işlemde ferrik forma oksitleyebileceğini düşündürmektedir. Buna göre, Gos, mitokondriyal membranın lipit peroksidasyonunu başlatabilen Fenton-Haber-Weiss tipi reaksiyon için gerekli olan Fe (Il) 'i inaktive ederek "OH radikallerinin" oluşumunu engelliyor olabilir.

Şekil 5. (A) Gos, 1 mM sitrat ve 5 mM1,10-fenantropin ile desteklenmiş standart bir ortamda sıçan beyin mitokondrisinin yokluğunda Fe (III.l) otoksidasyonunu uyarır.1,10-fenantropin, Gos-Fe (II) kuluçka döneminden 1 veya 5 dakika sonra eklenmiştir ve absorbanslar 510nm'de okunmuştur. Değerler üç belirlemenin ortalamasıdır. * p'de istatistiksel fark<0.05 when="" comparing="" 1="" vs.="" 5min="" incubation.="" (b)effects="" of="" gos="" on="" o,="" consumption="" mediated="" fe(il)="" autoxidation="" in="" a="" standard="" medium="" supplemented="" with="" 1="" mm="" citrate="" under="" the="" following="" conditions:(a)="" no="" gos,(b)10="" um="" gos，="" （c）="" 30μm="" gos，="" （d）50="" μm="" gos，and="" （e）100μm="" gos.="" fe（ii）="" （50μm）="" was="" added="" where="" indicated="" by="" the="" arrow.="" results="" are="" representative="" of="" three="" experiments.="" (c)="" oxygen="" consumption="" rate="" (nmol="" o2/min/ml)1="" min="" after="" fe()="" addition.legends="" are="" the="" same="" as="" in(b).="" different="" symbols="" indicate="" statistical="" differences="" at=""><0.05 when="" comparing="" all="" pairs="" of="" experimental="" groups="" (in="" the="" same="" cell="" type)="" according="" to="" the="" anova="" and="" post="" hoc="" newman-keuls="" tests.="" (if="" the="" symbols="" are="" different="" among="" groups="" indicate="" statistical="" differences,="" when="" they="" are="" equal,="" there="" is="">

Bu makale Moleküller 2021, 26, 3364'ten alınmıştır. https://doi.org/10.3390/molecules26113364 https://www.mdpi.com/journal/molecules