Böbreği Görüntüleme: Işıktan Süper Çözünürlüklü Mikroskopiye

İletişim: ali.ma@wecistanche.com

Maria Lucia Angelotti^1,2, Giulia Antonelli^1,2 carolina conte^1,2ve Paola Romagnani^1,2

ÖZ

önemli başarılarböbrekfizyolojik ve patofizyolojik mekanizmalar büyük ölçüde mikroskopi teknolojisindeki ilerlemeye atfedilebilir. Mimarisi hakkında bildiklerimizin çoğuböbrekışık mikroskobu ve daha sonra elektron mikroskobu tarafından sağlanan ultrastrüktürel analiz kullanan anatomik mikroskopistlerin temel açıklamalarına dayanmaktadır. Bu iki teknik, böbrek hastalıklarının ilk sınıflandırma sistemleri ve sürekli güncellemeleri için kullanıldı. Daha yakın zamanlarda, bir dizi yeni görüntüleme tekniği, analizi zaman ve uzayın daha ileri boyutlarına ekledi. Konfokal mikroskopi, z ekseni boyunca optik bölümleri sırayla görselleştirmemize izin verdi ve özel analiz yazılımının kullanılabilirliği, daha kalın doku örneklerinin üç boyutlu bir görüntüsünü sağladı. Multiphoton mikroskobu, aynı anda araştırmamıza izin verdiböbrekgerçek zamanlı olarak işlev ve yapı. Floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobu, metabolitlerin mekansal dağılımını incelememize izin verdi. Süper çözünürlüklü mikroskopi, hassasiyeti ve çözünürlüğü nano ölçekli seviyelere kadar artırdı. Kriyo-elektron mikroskobu ile araştırmacılar, tek tek biyomolekülleri atomik seviyelerde doğrudan dokularda görselleştirebilir ve hücre altı seviyelerde etkileşimlerini anlayabilirler. Son olarak, matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon görüntüleme kütle spektrometrisi, doku kesitlerinde aynı anda yüzlerce farklı molekülün yüksek çözünürlükte ölçülmesine izin verdi. Bu inceleme, mevcut ürünlere genel bir bakış sağlar.böbrekEn son teknolojik gelişmelerin olası etkisine odaklanan görüntüleme stratejileri.

Anahtar Kelimeler:immünohistokimya,böbrekbiyopsi, podositler,yakıntübül, kök hücreler

Böbrek hastalığı için Cistanche otu, örneği almak için buraya tıklayın

GİRİİŞ

buböbrekçeşitli fizyolojik işlevlerini yerine getirmek için büyüleyici yapısal karmaşıklık gereklidir. Başlangıçta, okuyanböbrekmakroskopik gözlemlerle sınırlıydı ve böbrek hastalıklarının teşhisine katkıları inkar edilemez derecede sınırlıydı. Klinik belirtiler tanımlandı, ancak altta yatan patogenetik mekanizmalar bilinmiyordu. Böbrek fizyolojisi ve patofizyolojisini anlamadaki başarılar, büyük ölçüde mikroskopi alanında devam eden ilerlemeye atfedilebilir. Denemelerböbrekgörüntüleme uzun zaman önce başladı [1]. 1666'da anatomist Malpighi,böbrek25-30 olduğu tahmin edilen ve ilk kez glomerulusu 'idrarın kandan ayrıldığı bir bez' olarak tanımlayan ışık mikroskobu ile doku. Bu katkı, nefron yapılarının Sir William Bowman tarafından 10 kat daha güçlü bir ışık mikroskobu ile çözüldüğü 1842 yılına kadar göz ardı edildi. Bowman, periglomerüler kapsülü (daha sonra Bowman kapsülü olarak adlandırıldı) tübülün ilk kısmına anatomik olarak bağlı olarak keşfetti [3]. 1862'de Jacob Henle, kortikal tübül ve renal papillayı birbirine bağlayan, kendi adını alan ilmek benzeri tübül segmentini tanımladı.

Işık mikroskobunun tanıtılması sayesinde, histomorfolojik bir sınıflandırmaböbrekhastalıklarmümkün hale geldi [1]. Hastalıklı böbreklerde neler olduğunu gözlemleme şansı, benzer klinik belirtileri olan hastalar arasında patolojik değişikliklerin önemli ölçüde değiştiğini anlamamıza izin verdi. Ancak böbrek dokusundaki patolojik değişikliklerle ilgili ilk çalışmaların otopsi örnekleri üzerinde yapılması, daha çok kronik hastalıkların tanımlanmasına yol açmıştır. Böbrek patolojilerinin evrimi ve otolitik fenomenlerin teknik sorunu hakkında, ölüm sonrası dokuların kullanımıyla ilişkili bilgi eksikliği, insan hastalıkları bilgisini sınırladı. 1951 yılında tanıtılanböbrekbiyopsi, yalnızca kronik değil, aynı zamanda akut böbrek hastalıklarının da doğrudan gözlemlenmesine ve incelenmesine izin verdi. Bu arada, mikroskopi, giderek artan hassasiyet ve nano ölçekli seviyelere kadar çözünürlük ile giderek daha karmaşık hale geldi. Bu derlemede, en son teknik gelişmelerden gelişen olanaklara odaklanarak, mikroskopi teknolojisindeki gelişmelerin mümkün kıldığı temel böbrek keşiflerine genel bir bakış sunacağız.

BÖBREK İMMUNOPATOLOJİSİNİN GÖRSELLEŞTİRİLMESİ

İmmün etiketleme ve floresan mikroskopisi

Temsili bir canlı doku parçası elde etme olasılığı, immünohistokimyasal yöntemler (önce floresan, sonra enzimatik) gibi maksimum doku korunmasını gerektiren ortaya çıkan tekniklerin uygulanmasına izin verdi. Aslında 1950'de Coons, doku antijenleriyle spesifik olarak reaksiyona girme kapasitesini bozmadan floresan izosiyanat, yani immünofloresan ile antikorları etiketleme yöntemini geliştirdi. O zamandan beri, donmuş böbrek biyopsi örneklerinin değerlendirilmesi için tanı prosedürüne immünofloresan dahil edilmiştir. İlk kez, bu teknikler glomerülonefritten etkilenen hastalarda intrarenal immünoglobulinlerin (Igs) ve kompleman birikimlerinin gözlemlenmesine izin vererek, örneğin kresentik glomerülonefritte belirli olmayan belirli doku lezyonlarının altında yatan farklı patofizyolojilerin ayırt edilmesine katkıda bulunmuştur [4]. Ek olarak, karakteristik bir boyama modeli gözlemleme olasılığı ve floreseinin İmmünoglobulin G (IgG) dışındaki antikorlara bağlanması, IgA nefropatisinde İmmünoglobulin A (IgA) tortularının ve ayrıca enfeksiyon sonrası glomerülonefritte kompleman tortularının tanınmasına yol açtı. ve membranoproliferatif glomerülonefrit [4].

eş odaklı mikroskopi

Floresan mikroskopi, 1980'lerin sonlarında konfokal mikroskopinin tanıtılmasıyla önemli bir teknik gelişme yaşadı. Konfokal mikroskopideki temel unsurlar, numune üzerinde odaklanan ve taranan nokta aydınlatması ve detektörün önündeki, odak düzlemi etrafındaki (optik bölüm olarak adlandırılan) sadece ince bir bölümden ışığın toplanmasına izin veren değişken bir konfokal açıklıktır (iğne deliği). Konfokal mikroskopi, deneysel modellerde böbreğin ilk in vivo çalışmalarını ve floresan moleküllerin tübüller boyunca bozulmamış halde alımının ve taşınmasının gözlemlenmesini sağladı.böbreklermikropunkturdan sonra. Bu, fizyolojik ve patolojik koşullarda tübüler fonksiyon çalışmalarına izin verdi [5].

The possibility to sequentially image optical sections along the z-axis and the availability of specific analysis software permitted a three-dimensional (3D) rendering of thicker tissue specimens, showing the frequent inconsistency and misrepresentations provided by 2D analyses [6, 7] (Figure 1A and a'). In addition, the introduction of genetically encoded fluorescent proteins in transgenic mice permitted the labeling of specific cells and tracing them directly within tissues without immunostaining (lineage tracing strategy) [6, 7, 8]. However, confocal microscopy still did not resolve details >200 nm, görünür ışığın kırınım sınırı, ışıkla ağartma ve fototoksisite nedeniyle.

GLOMERÜLER FİLTRASYON BARİYERİNİ ANLAMAK: ELEKTRON MİKROSKOPİSİ

Işık ve floresan mikroskoplarının çözünürlük limitinin üstesinden gelmek için ilk girişim, 1931'de Ernst Ruska ve Max Knoll'un bir uyarı kaynağı olarak ışık demeti yerine hızlandırılmış elektron demeti kullanan elektron mikroskobunu (EM) icat etmesiydi. ve ışık mikroskoplarından daha yüksek çözme gücüne sahiptir (0.2 nm'ye kadar). Bu yenilik için, 1986'da Ernst Ruska, Nobel Fizik Ödülü'ne layık görüldü. Artan çözünürlük gücü sayesinde, glomerulusun basit bir mekanik filtre olmadığı, üç katmandan oluşan son derece karmaşık bir organ olduğu kısa sürede ortaya çıktı: endotel hücreleri, glomerüler bazal membran (GBM) ve podositler [9]. İletim EM (TEM), glomerüler hücrelerin içeriden görüntülenmesine izin verdi [10] ve endotel hücrelerinin ince pencereli hücre gövdelerine sahip olduğunu, oysa podositlerin büyük hücre gövdelerine sahip olduğunu ve GBM'ye sabitlenmiş ve birbirine bağlı olan birincil ve ikincil 'ayak' süreçlerini genişlettiğini ortaya çıkardı. lineer kavşaklar (hafif diyafram) (Şekil 1B). Ayrıca, geri saçılmış elektronları yakalayan EM (SEM) taraması, glomerüler hücrelerin dış yüzeylerinden görselleştirilmesine izin verdi [10] ve komşu podositlerin ayak işlemlerinin GBM'yi birbirine bağladığını ve kapladığını ortaya çıkardı (Şekil 1C). EM, yalnızca normal glomerüler ultrastrüktürün anlaşılması için değil, aynı zamanda anlaşılması için de güçlü bir araç olarak kalmıştır.böbrekfizyoloji ve patofizyoloji [11]. İnsan numuneleri üzerinde veya deneysel modellerde gerçekleştirilen çok sayıda çalışma, farklı hastalık süreçlerinin bir dizi ayırt edici ultrastrüktürel değişiklik modeliyle ilişkili olduğunu ortaya çıkarmıştır; bu, gelişen bir sınıflandırma sistemi üzerinde daha fazla güncelleme anlamına gelir.böbrekhastalıklar. Böbreğin üst yapısının daha da karmaşıklığını görselleştirmeye yönelik teknik yetenek, "nefro"patologların uzmanlaşmasını destekledi.

Son derece hassas bir dedektöre dayanan yeni bir SEM tekniği, yarık diyaframın en derin bölümünün çalışmasına izin verdi ve değişen boyutlarda gözeneklerle karakterize olduğunu ortaya çıkardı [12]. Sıçanlarda, proteinüri başlangıcı büyük gözeneklerle ilişkilendirildi ve yarık diyaframdaki ultrastrüktürel değişikliklerin glomerüler geçirgenlikteki değişikliklere neden olma olasılığını artırdı [12]. Daha ileri bir teknik ilerleme olarak, blok yüzlü SEM, sağlıklı farelerde, hastalıklı farelerde ve hastalıklı farelerde en ince hücresel süreçlerin nano yapısını takip etmeye yeterli bir çözünürlükle glomerüler filtrasyon bariyerinin 2B'den 3B görünümüne geçişe izin verdi.böbrekgeliştirme [13, 14].

Son olarak, EM'nin bir X-ışını mikroanaliz sistemine (X-ışını mikroskobu) bağlanması, ultrastrüktürel düzeyde hücrelerin veya hücre parçalarının temel analizine izin verdi. X-ışını mikroskobu, numuneyi uyarmak için dar bir elektron ışını ile bir tarama TEM kullanır. Numunelerdeki atomlarla demetten gelen yüksek enerjili elektronların etkisi, X-ışını fotonları şeklinde enerji üretir. Enerji dağıtıcı bir yarı iletken dedektörle toplanan bu X-ışını sinyali, numunede bulunan elementleri en iyi 30 nm çözünürlükle tanımlamak için kullanılır. İçindeböbrekalanında, X-ışını mikroanalizi, Beck ve Thurau tarafından transepitelyal tübül iyon taşınımı [15] ve tübüler hücrelerdeki hücre içi elemental konsantrasyonu [16] incelemek için başarıyla kullanıldı.

MULTİFOTON MİKROSKOPİSİ İLE BÖBREK FİZYOLOJİSİNİN GÖRSELLEŞTİRİLMESİ

Multiphoton mikroskopisi (MPM), daha ileri bir ilerleme sağladı.böbrekaraştırma, yani böbrek fonksiyonunu ve yapı ilişkilerini gerçek zamanlı olarak aynı anda araştırma olasılığı [17]. Geleneksel ışık mikroskoplarından farklı olarak, iki foton uyarma, klasik tek foton uyarmada floroforu uyarmak için gerekli olan uyarma dalga boyunun iki katı olan iki fotonun eşzamanlı absorpsiyonuna bağlıdır (Şekil 1D). Ticari olarak temin edilebilen darbeli kızılötesi, düşük enerjili uyarma lazerlerinin kullanımı, derin doku penetrasyonunu arttırdı ve fototoksisiteyi en aza indirdi (Şekil 1D). Bu, araştırmacıların daha önce başka hiçbir teknikle elde edilemeyen bir özellik olan dinamik hücresel süreçleri doğrudan canlı hayvanlarda görselleştirmesini sağladı. MPM, glomerüler geçirgenlik, vasküler kan akışı, tek nefron glomerüler filtrasyon hızı ve tübüler akış gibi temel böbrek fonksiyonlarının ve patolojik değişikliklerin miktarının belirlenmesine izin verir [17] (Şekil 1E ve F). Ek olarak MPM, hücre ölümü ve dökülmesi, lökosit yuvarlanması ve GBM'nin işe alınması ve bozulması dahil olmak üzere yaralanmaya yanıt olarak hücre içi süreçlerin çalışmasına izin verir [17]. Diğer teknik gelişmeler, günler ila haftalar boyunca uzun süreli intravital görüntülemeye izin verdi [18], bu, floresan proteinleri eksprese eden transgenik farelerle kombinasyon halinde, sağlıklı ve hasarlı böbreklerde doğrudan in vivo tek hücrelerin kaderini izlemek için kullanıldı [19] ve Renal hücre döngüsü ve rejenerasyon mekanizmalarını daha iyi anlamak.

MPM ile, yaralanmadan sonra tübüler hücrelerin redoks durumunu incelemek için nikotinamid adenin dinükleotit hidratın (NADH) doğal otofloresansından yararlanan etiketsiz görüntüleme teknikleri de mümkün olmuştur [20]. Ek olarak, renal fibrozisin bir belirteci olan kollajen birikimini ölçmek için fibriler kollajenden ikinci harmonik nesil kullanıldı [21]. İkinci harmonik nesil, aynı dalga boyuna sahip iki uyarma fotonunun, kolajen veya mikrotübüller gibi biyolojik dokulardaki sentrosimetrik olmayan yapılarla etkileşime girdiği ve dalga boyunun yarısına sahip yeni bir foton ürettiği lineer olmayan bir optik süreçtir.

İntravital mikroskopide yeni bir yenilik, canlı anestezi uygulanmış farelerde böbrekleri görüntülemek için başarıyla kullanılan minyatürleştirilmiş bir multifoton endoskopun piyasaya sürülmesiydi [22]. Bu minimal invaziv MPM, doku çıkarmadan ve çok kısa sürede gerçek zamanlı in vivo tanının önünü açabilir.

3D BÖBREK: DOKU TEMİZLEME TEKNİKLERİ VE GENİŞLEME MİKROSKOPİSİ

Teknolojik gelişmelere rağmen, daha derin hacimsel görüntüleme için temel sınırlardan biri böbrek dokusu opaklığıdır.böbrekoptik olarak en zor organlardan biridir. Doku temizleme tekniklerinin bu kadar ilgi görmesinin nedeni budur [23]. Bu yaklaşımların amacı, opak bir dokuyu şeffaf bir dokuya dönüştürmek, proteinleri ve nihayetinde floresan belirteçleri koruyarak kalın doku dilimlerini görüntülemektir. Optik temizleme ile son teknoloji mikroskopi kombinasyonu, kalın dokularda ve hatta sağlam böbrekte glomerüler hacim ve sayının nicelleştirilmesi gibi morfometrik analiz imkanı sağlar [24]. Diğer uygulamalar, farklı tübül segmentlerinin analizini [25], işlevlerini [26] ve podosit kaybının nicelleştirilmesini [27] içerir.

Büyük hacimli dokuları görüntülemek ve aynı zamanda ince yapısal detayları çözmek için, yakın zamanda yeni bir teknik yaklaşım, yani genişleme mikroskobu (ExM) tanıtıldı. Buradaki fikir, genel mimariyi ve 3D proteom içeriğini korurken, bir organı 4- fiziksel olarak 5-katlamak için genişletmektir. Doğrudan numune içinde sentezlenen genişleyen bir polimer kullanılarak, ışığın kırınım sınırından daha yakın olan moleküller, uzayda daha büyük mesafelere izotropik olarak ayrılır ve bu nedenle geleneksel bir floresan mikroskobu ile bile optik olarak çözülebilir. Ek olarak, ExM daha fazla optik şeffaflık sağlar ve ışık saçılmasını azaltarak daha büyük bir doku hacminin görselleştirilmesine olanak tanır. Bu yaklaşımı kullanarak, yarık diyaframdaki ve GBM'deki çoklu proteinlerin lokalizasyonu, normal bir konfokal mikroskopla bile diseke edilebilir [28]. Örneğin, proteinürik farelerde ayak sürecinin silinmesini hem 2D hem de 3D olarak daha önce hiç ulaşılmamış bir nanometre çözünürlükte ortaya çıkarabilir [29]. Son zamanlarda ExM, hematoksilen ve eozin ile boyanmış parafine gömülü örneklerin klinik histopatolojik değerlendirmesinde kullanılmıştır [30]. Bu teknik, daha önce sadece EM ile mümkün olan nano ölçekli bir seviyede ayak sürecinin silinmesini görselleştirebilir. Hacimsel görüntülemedeki ilerlemeler, tüm organın yüksek çözünürlüklü 3D analizine izin verir, öyle ki derin görüntülemedeki ana sınırlama artık antikorların dokuya nüfuz etme kapasitesi tarafından temsil edilir.

METABOLİK PROFİLİ ÇALIŞMAK: FREKANS-ALAN FLORESANS-ÖMÜR BOYU GÖRÜNTÜLEME MİKROSKOPİSİ

buböbrekmitokondri içeriği yüksek metabolik bir organdır. NADH ve diğer metabolitlerin indirgenmiş formu doğal olarak floresandır ve bu otofloresan redoks durumunun bir indeksi olarak kullanılabilir [20]. Bununla birlikte, bu endojen floroforların emisyon spektrumları örtüşmektedir ve bunları ayrı ayrı tanımlamak imkansızdı. Ancak floresan ömürlerinin (yani floresansın zaman bozulması) önemli ölçüde farklı olduğu bulundu. Bu nedenle floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobu (FLIM) metabolik profillerin çalışılmasına izin verir [31]. Son zamanlarda, MPM ve FLIM'in bir kombinasyonunu kullanarak, hücreye özgü metabolik imzaları karakterize etmek ve sırasında metabolik değişiklikleri in vivo izlemek mümkün hale geldi.böbrekhastalık [32]. FLIM'in daha fazla içgörü sağlaması bekleniyorböbrekSağlıkta ve hastalıkta in vivo metabolizma.

SINIRLARIN ÖTESİNDE ÇÖZÜNÜRLÜK: BÖBREKLERİN SÜPER ÇÖZÜNÜRLÜK GÖRÜNTÜLEMESİ

Standart ışık mikroskobu, 200 nm'nin ötesinde bir optik çözünürlük sınırıyla karşı karşıyadır. Süper çözünürlüklü görüntüleme olarak adlandırılan yeni teknolojiler, nanoskopi çağının bir başlangıç ​​noktası olarak artık floresan mikroskopinin kırınım sınırının ötesinde görüntü elde etmesine izin vermektedir [33]. Bu yaklaşımlar, nanoskopik çözünürlüğü çok renkli floresan etiketlemenin avantajlarıyla birleştirir. Bu yeniliklerin potansiyel etkisinin farkında olarak, 2014 Nobel Kimya Ödülü, Eric Betzig, Stefan Hell ve William Moerner'e "süper-çözülmüş floresan mikroskobunun geliştirilmesinden dolayı" verildi. Farklı biyolojik soruları ele almak için farklı süper çözünürlüklü görüntüleme stratejileri uygulanabilir. Bu yaklaşımlar, süper çözünürlüğün tek moleküller düzeyinde mi yoksa topluluklar düzeyinde mi kullanıldığına bağlı olarak iki ana kategoride gruplandırılabilir [33].

Topluluk tabanlı teknikler

Topluluk tabanlı teknikler, uyarma ışık huzmesini geçici ve uzamsal olarak modüle ederek kırınım sınırını aşar. Bunların arasında, süper çözünürlüklü uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) görüntüleme, uzakta bulunan floroforlardan floresan emisyonunu bastırmak için halka şeklinde iki lazer, bir uyarma lazeri ve üst üste bindirilmiş, kırmızı kaydırmalı tükenme lazeri (STED lazer) kullanır. heyecanın merkezi. Bu bastırma, uyarılmış emisyon yoluyla elde edilir ve yalnızca kırınım sınırının altında bir boyuta sahip bir odak noktasından kaynaklanan sinyalin toplanmasına izin verir (Şekil 2A). Optik olarak temizlenmiş yarık diyaframı görüntülemek için STED görüntüleme kullanıldı.böbrekdokular (Şekil 2B–c') ve en az 30 lm derinliğe kadar nanometre ölçeğinde podocin ve nefrin uzamsal dağılımının lokalize edilmesine izin verdi [34]. Ek olarak, deneysel bir modelde ayak süreci silinmesini gözlemleme ve nicelleştirme olasılığı, STED görüntülemesini glomerüler filtrasyon bariyeri çalışmaları için yararlı hale getirebilir [34].

STED mikroskopisi, numune hazırlama, özel floroforlar ve teknik eğitim için özel protokoller gerektirir. Bu nedenle, son birkaç yılda, kırınım sınırını hem yanal hem de eksenel olarak iki kat artırabilen başka bir süper çözünürlüklü tekniğe, yapılandırılmış aydınlatma mikroskopisine (SIM) daha fazla ilgi gösterildi. SIM, yüksek frekanslı bilgilerin (örnekteki ince ayrıntılara karşılık gelen) daha düşük uzamsal frekanslarda yakalanmasını sağlayan, ince çizgili bir aydınlatma modeline sahip geniş alanlı bir mikroskop kurulumu kullanır. Farklı faz ve yönlerde aydınlatma desenleri ile birden fazla görüntü elde ederek, yüksek çözünürlüklü bir görüntü yeniden oluşturulabilir (Şekil 3A). SIM, standart floroforlarla uyumludur, özel numune hazırlama gerektirmez ve 3D görselleştirmeye izin verir. Tüm bu avantajlar göz önüne alındığında, örneğin EM'den daha kısa geri dönüş süresi ile SIM'i hızlı bir teşhis aracı olarak kullanma olasılığını değerlendirmek için farklı çalışmalar yapıldı [35]. Son zamanlarda bir 3D SIM ve otomatik görüntü işleme, minimal değişiklik hastalığı olan hastaların biyopsilerinden alınan rutin parafin kesitleri kullanılarak ayak sürecinin silinmesinin hızlı bir tanı aracı olarak kullanılmıştır [36] (Şekil 3B ve C). Nano ölçekli patoloji sergilediği bilinen hastalıklardaki değişiklikleri başarılı bir şekilde tanımlama kapasitesi, SIM'in rutin teşhis için umut verici bir araç olduğunu doğruladı.

Tek moleküllü lokalizasyon tabanlı görüntüleme yöntemleri

Bu teknikler, çözümlenemeyecek kadar yakın olan bireysel floresan moleküllerini döngüsel olarak açıp kapatma olasılığına dayanır. Bu yaklaşımlarda, kırınımla sınırlı bir bölge içindeki moleküller, farklı zaman noktalarında etkinleştirilebilir, böylece ayrı ayrı görüntülenebilir ve daha sonra hesaplamalı olarak merkezlerini bularak nanometre hassasiyetinde lokalize edilebilir (Şekil 3D). Bu yaklaşımlar arasında stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (STORM) ilk olarak M.Ö.böbrek2013 yılında, moleküllerin oryantasyonu da dahil olmak üzere nanometre hassasiyetinde GBM'nin karmaşık moleküler organizasyonunu ortaya çıkaran bir çalışma ile araştırma [37]. Nadir görülen bir konjenital nefrotik sendromun bir fare modelinde, STORM, intravenöz enjeksiyonu takiben GBM içinde laminin 521'in entegrasyonunu ve doğru oryantasyonunu ortaya çıkardı ve hastalar için gelişmiş terapötik seçeneklerin yolunu açtı [38]. Başka bir çalışma, moleküler ölçekte bir çözünürlükte podositlerde aktin hücre iskeletinin organizasyonunu tanımladı [39] (Şekil 3E–I). Yeni bir bulgu olarak, podositler, ayak süreçlerinde kontraktil olmayan aktin demetleri ile bağlantılı kontraktil aktin demetleri içerir. Podosit yaralanma modellerinde, ayak süreçlerindeki aktin yapısı demonte edilerek ana gövdedeki kontraktil yapının çökmesine neden olur [39].

ATOM DÜZEYİNDE TEMEL BİYOMOLEKÜLLERİN 3B YAPILARININ GÖRÜNTÜLENMESİ: KRYO-ELEKTRON MİKROSKOPİSİ

Yakın zamana kadar, temel biyomoleküllerin yapısını inceleme imkanı, birkaç nanometre çözünürlükte elektron mikroskobu ile sınırlıydı. Yoğun elektron ışını ile numune hasarı, düşük görüntü kontrastı ve elektronlarla etkileşimden sonra molekül hareketleri veya EM odası içinde uygulanan vakumda biyolojik numunelerde suyu muhafaza etme zorlukları gibi teknik engeller, bu boyutun altındaki molekülleri çözmeyi imkansız hale getirir . Numunenin soğutulması, su buharlaşmasını ve elektron kaynaklı hasarı azaltabilir [40]. Bu fikirden, kriyo-EM 1950'lerde tanıtıldı. Birkaç yıl önce, yeni bir tek elektronlu sayma detektörünün piyasaya sürülmesi, nihayet çözünürlüğü önceki sınırların ötesine taşıdı. 2017'de Nobel Kimya Ödülü, 'çözeltideki biyomoleküllerin yüksek çözünürlüklü yapı tayini için kriyo-elektron mikroskobu geliştirmek' için Jacques Dubochet, Joachim Frank ve Richard Henderson'a verildi. Bu ilerlemeler artık çözeltideki biyomoleküllerin yapısal olarak belirlenmesine izin vermektedir [41].

İçindeböbrekaraştırma, temel proteinlerin yapıları atomik düzeyde belirlendi [42, 43]. Bunlar arasında, mutasyonları otozomal dominant polikistikten sorumlu olan insan polikistininin yapısı-2böbrekhastalığı [44] ve mutasyonları insanlarda FSGS'ye neden olan geçici reseptör potansiyel kanonik 6 iyon kanallarının yapısı [43], birkaç angstrom çözünürlüğü ile belirlendi [44].

BÖBREK HASTALIKLARININ MOLEKÜLER TEMELİNİ ANLAMAK: ENTEGRATİF BÖBREK MİKROSKOPİSİ

Son birkaç yılda, dokulardaki moleküllerin toplam spektrumunu spesifik olarak ve aynı anda haritalayabilen etiketsiz yaklaşımlara artan ilgi görülmüştür [45]. Bunların arasında, matris olarak destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon görüntüleme kütle spektrometrisi (MALDI-IMS), yüzlerce farklı molekülün aynı anda doğrudan doku kesitlerinde yüksek çözünürlükte ölçülmesine olanak tanır. Bir MALDI-IMS deneyinde, donmuş veya parafine gömülü ince bir doku kesiti, lazer enerjisini emen ve doku analitlerinin iyonizasyonunu destekleyen bir matris ile kaplanır. Kütle spektrometresindeki analiz, her x/y koordinatı için bir spektrum oluşturur. MALDI ölçümünün ardından, moleküler modeli histolojik ayrıntılarla bütünleştirmek için aynı doku bölümü geleneksel histokimyasal ve immünohistokimyasal prosedürlerle boyanabilir. Böbrek araştırmalarında, MALDI-IMS normal ve hastalıklı dokulardaki ilaçları, metabolitleri, lipidleri, peptitleri ve proteinleri incelemek için kullanılır [45].

MALDI-IMS'nin en sık kullanılan uygulamalarından biri, renal hücreli karsinomu sınıflandırmak için moleküler belirteçlerin tanımlanması [46] ve hem moleküler düzeyde hem de histolojik düzeyde kanserli ve normal doku arasındaki gerçek sınırı belirlemektir [47]. MALDI-IMS, toksik hastalıkların erken tespitini sağlamak için renal ilaç toksisitesini incelemek için de başarıyla kullanılmıştır.böbrekfarmasötik adayların aracılık ettiği hasar mekanizmaları [48]. Ayrıca, MALDI-IMS lipidleri ve diyabetik nefropati [49], akut böbrek hasarı [50] ve polikistik gibi böbrek patolojilerindeki rollerini incelemek için kullanılır.böbrekhastalık [51] ve ayrıca hastalıkla ilgili mekanizmaların daha derinden anlaşılması için endojen metabolik profilleri ortaya çıkarmak [52]. Yeni potansiyel tanısal ve prognostik biyobelirteçler olabilecek olası biyobelirteçler için moleküler profillerin tanımlanması da tamamlandı [53, 54].

SONUÇLAR VE GELECEK PERSPEKTİFLERİ

Görüntüleme tekniklerindeki sürekli gelişmeler, birçok kritik teknik engeli aşamalı olarak çözmüştür.böbrekaraştırma yapmış ve normal ve hastalıklı böbreklerde yapı ve işlevin dinamik bir tasvirine izin vermiştir. Gerçekten de, yeni mikroskopi teknolojilerinin ortaya çıkışı, temel bilimsel keşifleri mümkün kıldı ve ardından, şimdi 3 boyutlu olarak görselleştirilebilen ve hatta zamanın dördüncü boyutu temsil ettiği videolarda filme alınabilen böbrek fizyolojisi ve patofizyolojisi hakkındaki görüşümüzü değiştirdi. Süper çözünürlüklü mikroskopinin son teknolojik yeniliği ve moleküler görüntüleme tekniklerinin ilerlemesi ile araştırmacılar artık bireysel biyomolekülleri doğrudan dokularda görselleştirebilir ve hücresel ve hücre altı seviyelerde nasıl etkileşime girdiklerini belirleyebilirler.

Bu araçları patolojik durumlara uygulama imkanıböbrekKlinik biyopsilerde moleküler ve hücre altı ayrıntılara odaklanan örnekler, hastalığın yeniden sınıflandırılmasına yardımcı olmalıdır. Bunun böbrek hastalığının teşhisi ve hatta hasta yönetimi üzerinde bir etki yaratıp yaratmayacağı ve ne zaman yaratacağı şu anda belirsizdir.

FİNANSMAN

Finansman, Avrupa Birliği'nin Ufuk 2020 araştırma ve yenilik programı (hibe sözleşmesi 648274) kapsamında Avrupa Araştırma Konseyi tarafından sağlandı.

REFERANSLAR

1. Weening JJ, Jennette JC. Renal patolojide tarihi kilometre taşları. Virchows Arch 2012; 461: 3–11

2. Malpighi M. De Viscerum Structura exercitatio anatomica. Bolonya1666

3. Bowman W. Malpighian cisimlerinin yapısı ve kullanımı hakkındaböbrek, o bez yoluyla dolaşım üzerine gözlemlerle. Philos Trans R Soc A 1842;132:57–80

4. D'Agati VD, Mengel M. Nefrolojide renal patolojinin yükselişi: yapı işlevi aydınlatır. J miyimBöbrekDış 2013; 61: 1016–1025

5. Ohno Y, Birn H, Christensen EI. Sağlam sıçanlarda in vivo konfokal lazer tarama mikroskobu ve mikropunktur. Nephron Exp Nephrol 2005; 99: e17–e25

6. Romoli S, Angelotti ML, Antonelli G. CXCL12 blokajı, içsel bir podosit-progenitör geri besleme mekanizmasını hedefleyerek kortikal nefronlardaki kayıp podositleri tercihen yeniden oluşturur.BöbrekInt 2018; 94:1111–1126

7. Lazzeri E, Angelotti ML, Paired A ve ark. Endosikl ile ilişkili tübüler hücre hipertrofisi ve progenitör proliferasyonu, akut sonrası böbrek fonksiyonunu iyileştirirböbrekincinme. Nat Commun 2018; 9: 1344

8. LeHir M, Kriz W. Glomerülosklerozda karşılaşılan yapısal paternlere ilişkin yeni görüşler. Curr Opin Nephrol Hypertens 2007; 16: 184–191 9. Tisher CC. Fonksiyonel anatomiböbrek. Hastane Uygulaması 1978; 13

10. Liapis H. Elektron mikroskobuböbrekaraştırma: görmek inanmaktır. Ultrastruct Pathol 2013; 37: 340–345

11. Strong ML, Evers P. Renal tanıda üçüncü boyut. Normal ve anormal böbreklerin taramalı elektron mikroskobu. S Afr Med J 1979; 55:174–177

12. Gagliardini E, Conti S, Benigni A ve ark. Glomerüler epitelyal filtrasyon yarığının gözenekli ultra yapısının görüntülenmesi. J Am Soc Nephrol 2010; 21:2081–2089

13. Lausecker F, Tian X, Inoue K ve diğerleri. Glomerüler bariyer bütünlüğünü korumak için Vinculin gereklidir.BöbrekInt 2018; 93: 643–655

14. Ichimura K, Kakuta S, Kawasaki Y et al. Blok yüz taramalı elektron mikroskobu ile ortaya çıkan podosit gelişiminin morfolojik süreci. J Hücre Bilimi 2017; 130: 132–142

15. Rick R, Dorge A, Beck FX ve diğerleri. Transepitelyal iyon taşınımının elektron probu X-ışını mikroanalizi.Ann N Yacad Sci 1986; 483: 245–259

16. Thurau K, Dorge A, Mason J et al. Renal tübüler hücrelerde hücre içi element konsantrasyonları. Bir elektron mikroprob analizi. Klin Wochenschr 1979;57: 993–999

17. Peti-Peterdi J, Kidokoro K, Riquier-Brison A. Görselleştirmek için yeni in vivo tekniklerböbrekanatomi ve fonksiyon. Böbrek Uluslararası 2015; 88: 44-51

18. Schuh CD, Haenni D, Craigie E, et al. Uzun dalga boylu multifoton uyarımı, intravital için avantajlıdır.böbrekgörüntüleme.BöbrekUluslararası 2016; 89: 712–719

19. Hackl MJ, Burford JL, Villanueva K ve ark. Floresan soy etiketleri olan yeni fare modellerinde seri multifoton görüntüleme kullanarak glomerüler epitel hücrelerinin in vivo kaderini izlemek. Nat Med 2013; 19: 1661-1666

20. Salon AM, Unwin RJ, Parker N, et al. Multifoton görüntüleme, nefron segmentleri arasındaki mitokondriyal fonksiyondaki farklılıkları ortaya çıkarır. J Am Soc Nephrol 2009; 20: 1293-1302