Böbreğin 3D Olarak Açıkça Görüntülenmesi ve Ölçülmesi
Feb 27, 2022
Onlarca yıldır, ölçümlerinböbrek2-boyutlu kesitleri kullanan mikroanatomi, bize böbrek Fizyolojik ve patolojik koşullar altında morfoloji. Bununla birlikte, son yıllarda doku temizleme yöntemlerinin hızlı gelişimi, yeni 3-boyutlu görüntüleme modalitelerinin gelişimi ile birlikte, bu konuda yeni anlayışlar sağlamıştır.böbrekYapı ve işlev. Bu gözden geçirme makalesi, bir dizi yeni içgörüyü açıklamaktadır.böbrekBu yeni metodolojik yaklaşımlar kullanılarak yakın zamanda elde edilen gelişme ve hastalık. Örneğin, gelişmekte olan ülkelerdeböbrekbu yaklaşımlar üreter dallanma morfogenezi, nefron progenitör hücre proliferasyonu ve bağlılığı, üreterik uç hücreler ve nefron progenitör hücreler arasındaki etkileşimler ve nefron segmentasyonunun kurulması hakkında yeni anlayışlar sağlamıştır. Bütün yetişkin faredeböbrekler, hafif tabaka mikroskobu ile birleştirilmiş doku temizleme, alanda büyük bir atılım olan toplam glomerül sayısını görüntüleyebilir ve ölçebilir. Benzer yaklaşımlar, renal vaskülatür ve innervasyonun yapısı, tubulointerstisyel yeniden şekillenme, podosit kaybı ve hipertrofisi, kist oluşumu, hücresel hilallerin evrimi ve glomerüler filtrasyon bariyerinin yapısı hakkında yeni bilgiler sağlamıştır. anlaşılmasında çok daha fazla ilerlemeböbrekBiyoloji ve patoloji, ek temizleme ve görüntüleme teknikleri geliştirilip daha fazla araştırmacı tarafından benimsendikçe beklenebilir.
Anahtar Kelimeler:3D görüntüleme; glomerül; böbrek gelişimi; nefropatoloji; doku temizleme; tübüller; böbrek
CISTANCH BÖBREK/BÖBREK FONKSİYONUNU İYİLEŞTİRECEK
Her normal insandaki toplam nefron sayısıböbrekyaklaşık 200,000 ile 2 milyonun üzerinde, 1 ortalama yaklaşık 1 milyon arasında değişmektedir. Bu nefronlar ve vücudun diğer bileşenleriböbrektoplama kanalları, kan damarları, interstisitler ve sinir lifleri dahil olmak üzere mükemmel mikroanatomik hassasiyetle düzenlenir. 2 Bu hassas desenleme, normalBöbrek fonksiyonuve glomerüler veya tübüler hipertrofi veya büzülme, nefron kaybı, konjenital anormallikler, damar seyrekliği ve interstisyel fibrozis nedeniyle doku mimarisi değiştiğinde ciddi şekilde bozulabilen sağlık. Kapsamlı anlayışımıza bir dizi görüntüleme yaklaşımı katkıda bulunmuştur.böbrekgelişim sırasında ve sağlıklı ve hastalıklı erişkinlerde mikroanatomiböbrek. Çoğunlukla, bu anlayış, ister ışık ister elektron mikroskobik fiziksel bölümler olsun, isterse konfokal optik bölümler olsun, 2-boyutlu (2B) bölümlerin analizinden elde edilmiştir. Bu mikroanatominin miktar tayini çoğunlukla sayıların, uzunlukların, yüzey alanlarının ve glomerüllerin, tübüllerin, damarların, interstisyellerin ve bunların hücresel bileşenlerinin hacimlerinin tahminlerini sağlayan bölümlerin stereolojik analizlerine dayanmıştır. 3,4 Yakın zamana kadar 3D görselleştirmeböbrekmikro yapı, büyük ölçüde, 50 ila 80 mm derinliğe kadar optik kesit ve 3D rekonstrüksiyon sağlayan konfokal mikroskopi ile sınırlıydı. Ne yazık ki, bir doku içindeki protein ve lipid bileşenlerinin kırma özellikleri ışığı dağıtır ve derinlik arttıkça görüntü kalitesini önemli ölçüde azaltır. Son yıllarda, bir dokunun lipid ve pigment içeriğini ortadan kaldırmak ve dokunun kırılma özelliklerini ve dokuyu şeffaf hale getirmek için yerleştirme ortamını eşleştirmek için bir dizi temizleme yöntemi geliştirilmiştir. 5 Temizleme yöntemleri, dokuyu çeşitli solüsyonlarda saatlerce inkübe etmekten özel elektrokimyasal ekipmanı içeren uzun prosedürlere kadar karmaşıklık içinde değişir. Mevcut yöntemlere ayrıntılı bir genel bakış için okuyucuları son incelemelere 5,6 ve belirli yöntemler ve kullanım durumları için burada belirtilen makalelere yönlendiriyoruz.
Hücre altı yapılar ve tüm hücre popülasyonları, temizlenmiş tüm organlar veya kalın bölümler içinde çözülebilir. Temizlenmiş dokudaki doğru görüntüleme özellikleri, yüzlerce mikrondan santimetreye kadar değişebilen numunelerden hacimsel verileri yakalamak ve yeniden oluşturmak için özel mikroskoplar ve görüntü işleme gerektirir. Nokta taramalı ve dönen disk konfokal mikroskoplar, temizlenmiş alanlardaki özellikleri görüntülemek için etkin bir şekilde kullanılmıştır.böbrekdoku ancak Z ekseninde azaltılmış çözünürlükten ve tek bir aydınlatma ve görüntüleme ekseni nedeniyle derinlikte floresan yoğunluğunda ilerleyici bir azalmadan muzdariptir. Işık levha mikroskobu teknikleri, büyük 3D hacimlerin hızlı bir şekilde elde edilmesini sağladıklarından ve çok açılı aydınlatma ve görüntülemeyi içerebildiklerinden, özellikle temizlenmiş dokuların görüntülenmesi için uygundur. Optik projeksiyon tomografisi, her bir vokselin X, Y ve Z eksenlerinin aynı çözünürlükte olduğu verileri üretmek için çok açılı görüntüleme ve dijital rekonstrüksiyonu birleştiren başka bir yaklaşımdır. Spesifik yaklaşımdan bağımsız olarak, doku temizleme ve bütün montaj görüntüleme, haritalanmamış hücresel mikro ortamları ve daha yüksek dereceli doku yapısını keşfetmek için yeni bir fırsat sağlar. Bu derlemede, bazı yeni içgörülerin altını çiziyoruz.böbrekgelişme, yetişkinböbrek3D kantitatif analizin izlediği doku temizlemesinden kaynaklanan yapı ve patoloji.
Böbrek gelişimine yeni bakış açılarıOnlarca yıllık gen ekspresyonu profilleme ve nakavt çalışmaları, memelileri kontrol eden hücre tiplerinin, gen düzenleyici ağların ve sinyal yollarının ayrıntılı bir şekilde anlaşılmasını sağlamıştır.böbrekgelişim. Bu bilgi, konjenital hastalıkların teşhisini bilgilendirdi veböbrekpluripotent kök hücrelerden hücre türleri. 7 Bununla birlikte, gelişmekte olan sistemin boyutu, opaklığı ve karmaşıklığıböbrekBu organın morfogenezini ve içindeki hücre ve proteinlerin 3 boyutlu dağılımını tam olarak ölçmek için önemli bir engel oluşturdu. Doku temizleme ve çok ölçekli görüntüleme uygulamalarıböbreküreter dallanma morfogenezinin, progenitör hücre popülasyonlarının ve sağlam organlardaki nefron donatımının görselleştirilmesini ve nicel analizini mümkün kılmıştır (Şekil 1). 8 Bu yaklaşımlar, hassas fenotipleme için yeni bir kapasiteyi destekler ve hücresel ve moleküler sürücüleri analiz etmek için açık yollar sunar.böbrekGelişim ve doğuştan hastalık.
Dallanma morfogenezini 3B olarak görüntüleme ve analiz etme.Üreter ağacının kurulması, hastalığın tanımlayıcı bir özelliğidir.böbrekgeliştirme ve fare genetiği kullanılarak kapsamlı bir şekilde incelenmiştir ve düzleştirilmişböbrekeksplant kültürleri. Bununla birlikte, bireysel genlerin bu dallı epitelyal kanal yapısının in vivo büyümesine, biçimine ve modellenmesine nasıl katkıda bulunduğunu anlamak, bu karmaşık ağı çok çeşitli numune boyutlarında görüntüleme ve analiz etme kapasitesini gerektiriyordu. Kısa ve ark. 8, tüm montajlı immünofloresan, solvent bazlı temizleme (benzil alkol benzil benzoat) ve tüm organların optik projeksiyon tomografisi ile görüntülenmesini kullanarak bu sorunları ele aldı. Erkenden ortasına kadar 3B anlık görüntüleri yakalamak için bu yaklaşımı kullanmakböbrekEkip, uç sayısı, dal açıları ve uzunluğu, dal hacimleri ve sağlam üreter ağaçlarından dallanma nesillerinin sayısı dahil olmak üzere üreter ağacı hakkında benzeri görülmemiş ayrıntıları elde etmek için özel analiz yazılımı geliştirdi (Şekil 1c ve d). 8 Başlangıçta renal dallanmanın yeni yönlerini karakterize etmek ve tanımlamak için kullanılan 9,10 devam eden çabalar, in vivo dal modelini yöneten ilkeleri ve kilit düzenleyicileri tanımlamaya çalışmaktadır. 1
Progenitör dinamiklerini çok ölçekli görüntüleme ile organ morfogenezine bağlamaÜreteriktip hücreleri ve nefron progenitör hücreleri arasındaki moleküler etkileşimler, kolaylaştıran nefronların tamamlayıcısının oluşturulmasında önemli bir rol oynar.Böbrek fonksiyonuyetişkin hayatında. İndüklenmemiş nefron progenitörleri, teşvik eden faktörler üretir.böbreküreterik dallanma yoluyla büyüme, üreter ucundaki uzaysal olarak kısıtlanmış ipuçları hem nefron progenitör durumunu korur hem de bu progenitörlerin bir alt kümesini erken bir nefrona farklılaştırmak için indükler. Bu etkileşimler, kalan nefron progenitörleri farklılaştığında, doğum sırasında sona eren bir dallanma ve nefron indüksiyon döngüsünü yönlendirir. Doku temizleme yöntemlerinden önce,böbrekmorfogenez ve progenitör hücre popülasyonlarının zaman içindeki nispi bolluğu ciddi şekilde sınırlıydı. Bu, genişletilmiş immünofloresan protokolleri, doku temizleme ve nicelleştirme için görüntüleme yaklaşımlarını kullanan çok ölçekli görüntüleme yaklaşımlarının geliştirilmesiyle değişti.böbrekhücresel (konfokal) ve tüm organ düzeyinde (optik projeksiyon tomografisi, ışık levhası) gelişme. 9,10 oranlarınınböbrekbüyüme, başlangıçta hızlı dallanma ve çoğalma oranlarının nefrojenik niş içindeki progenitör hücrelerin sayısındaki azalmalarla bağıntılı fazlarda azalmasıyla çarpıcı biçimde değişir. 10 Temizlenmiş bütün insan cenininin üç boyutlu konfokal görüntülemesiböbrekler(11. hafta) veyaböbrekkorteks (11–23. haftalar), niş boyutundaki bu azalmanın türler arasında korunduğunu doğrular. 12 Temizlenmiş dokudaki insan ve fare nefrojenik nişinin daha fazla karşılaştırmalı analizi, progenitör hücrelerin aşamalı olarak erken bir nefrona eklendiği ve geldikleri sıraya göre bir segment kimliği benimsediği, yeni bir zamana dayalı işe alım modeline yol açtı. . 13 Nefron progenitör bağlılığına odaklanan başka bir çalışmada, hidrojel bazlı bir doku temizleme yöntemi (pasif Clear Lipid-exchanged Acryl-amide-hybridized Rigid Immünostaining/In situ hybridization-uyumlu Doku-hidrojel [CLARITY] 14 ) kullanıldı. endojen bir tdTomato muhabirinin flüoresansını tutma yeteneği. Temizlenmiş doku içindeki tdTomato etiketlemesinin analizi, erken işleme yapan nefron içindeki hücrelerin, önceki sonuçların taahhütün tek yönlü olduğunu öne sürdüğü bir progenitör durumuna dönebileceğini gösterdi. 15 Böylece doku temizleme, ölçekler ve türler arasında dinamik gelişim süreçleri anlayışımızı geliştirdi.
Hassas fenotipleme. Doku temizleme ve kantitatif analizdeki gelişmeler, hassas fenotipleme için yeni bir kapasite sağlamıştır. Ret þ/? ve Six2 þ/? daha önce "normal" olarak sınıflandırılan fareler (Şekil 2). 10,16 Temizlenmiş Wnt11 ?/?'nin yüksek çözünürlüklü konfokal görüntülemesiböbreklernefron progenitörlerinin üreter ucu ile stabil hücresel bağlantılar oluşturamaması ve zamanından önce farklılaşamaması nedeniyle düzensiz göründüğü yeni bir hücresel fenotip tanımladı. 17 Bu yöntemler ayrıca DNA metiltransferaz 1, mikroRNA'lar Lin28 ve Let7 ve TSC1 gibi nefron progenitör hücre durumunun yeni düzenleyicilerinin nasıl etkilediğini ölçmek için kullanılmıştır.böbrekgelişimi ve nefron sayısı. 18–20 Hassas fenotipleme, düşük nefron sayısına ve kronik hastalığa yatkınlığa katkıda bulunan genetik ve çevresel faktörlerin ilave etkisini anlama çabamızda önemli bir araç haline gelebilir.böbrek hastalığı.
matematiksel modellemeböbrekmorfogenez. Temizlenmiş geliştirmeden üretilen verilerböbrekBir dokunun makroskopik formunun ve fonksiyonunun progenitör hücre popülasyonları arasındaki moleküler etkileşimlerden nasıl ortaya çıktığını ayırt etmeye çalışan bir görüntü tabanlı matematiksel modelleme dalgasını körüklüyorlar. 11,21-23 Temizlenmiş dokuda tüm organ görüntülemenin daha fazla uygulanması, 3D doku modellemenin moleküler ve hücresel sürücülerini anlamak için kritik olacaktır ve dokuların kök hücre modellerinin yapısını ve doğruluğunu iyileştirmenin anahtarı olabilir.böbrek.
Yetişkin böbreğinin 3 boyutlu morfolojisi ve patolojisiYetişkinlerin karmaşık morfolojisiböbrek3B yapının eksik veya yanıltıcı algılarını iletebilecekleri için 2B morfolojik araçların kullanımını sınırlar. Burada, yetişkinlerdeki yapıların sağlam 3D analizine izin veren son yıllardaki bazı önemli metodolojik ilerlemeleri tartışıyoruz.böbrek, bozulmamış arasında değişenböbreklerglomerüler filtrasyon bariyerinin bileşenlerine kadar (Şekil 3). 2
CISTANCH BÖBREK/BÖBREK YETMEZLİĞİNİ İYİLEŞTİRECEK
Nefron sayısı ve boyutu.İnsanböbrekNefron sayısı ve hacminde, açık olmayan deneklerden alınan otopsi çalışmalarında tarif edilen, yüksek düzeyde denek içi ve arası değişkenlik gösterir.böbrek hastalıkları1,30,31 ve gelişimsel bozukluklarla ilişkilendirilmiştir. On yıllardır, deneysel ve insan numunelerinde nefron sayısını ölçmek için altın standart araç, tasarım tabanlı bir stereolojik yöntem olan disektör/fraksiyonlama yöntemi olmuştur. 3,4 Bu yaklaşım doğru ve kesin olmakla birlikte, uygulamalı, zaman alıcıdır ve önemli bir eğitim gerektirir. Bu nedenle, yüksek kaliteli uç noktalar sağlayabilen verimli yöntemler tasarlamak için alternatif yaklaşımlar önerilmiştir: 32 örneğin, hidrofobik (önceden solvent bazlı olarak biliniyordu), hidrofilik veya hidrojel bazlı, gelişmiş ile optik temizleme yöntemlerinin kombinasyonları. ışık mikroskobu (örneğin, konfokal, multifoton veya ışık levhası).
Bildiğimiz kadarıyla, nefron sayısı ve boyutunun analizi için optik temizleme ve hafif tabaka mikroskopisini birleştiren ilk rapor Klingberg ve ark. 24, birçok önemli ilerlemeyi içeren bir dönüm noktası makalesinde. İlk olarak, bu rapor, o zamana kadar hidrofobik temizleme protokollerinde düzenli olarak kullanılan benzil alkol-benzil benzoat gibi toksik kimyasalların yerini alabilecek tehlikeli olmayan bir çözücü olan etil sinamat'ı tanıttı. İkincisi, araştırmacılar sağlam farede nefron sayımı gerçekleştirdiler.böbrekler benn agresif ve ilerleyici bir bağışıklık aracılı modelböbrek hastalığı, hastalık seyri sırasında nefron kaybının belirlenmesi. Ek olarak, önemli verimlilik iyileştirmelerine giden bir yol sağlayan görüntü segmentasyon algoritmalarının bilgisayarlı otomasyonuna yönelik önemli adımlar atıldı. Son zamanlarda, Østergaard ve ark. 25, diyabetik nefropatinin bir fare modelinde hem toplam nefron sayısı hem de tek glomerüler hacim sağlayan ışık levha mikroskopisi ve otomatik görüntü bölütleme ile birleştirilmiş benzer bir hidrofobik temizleme yöntemi sunmuştur. Ayrıca, bu çalışma, aynı optik olarak temizlenmiş örneklerde glomerulartübüler birleşme yerini görselleştirmek için in vivo albümin enjeksiyonu yoluyla proksimal tübüllerin zarif işlevsel etiketlemesini ve korelasyonlu histopatoloji için basit bir protokol gösterdi. Bu rapor, kapsamlı doku profillemesi için çok katmanlı boru hatları haline gelen bu protokollerin esnekliğini göstermektedir.
Renal damarlanma ve innervasyon.Erişkinlerde dallanma vaskülatür veya sinir liflerinin izlerini takip etmekböbrekorganın boyutu ve yapısal dağılımın karmaşıklığı, kapsamlı ve uzman seri kesitler gerektirdiğinden, 2D geleneksel histolojide neredeyse imkansızdır. Son zamanlarda, Huang ve ark. 33, doku işleme süresini kısaltmak için etil sinnamata dayalı modifiye ve hızlandırılmış bir temizleme protokolü ile birleştirilebilen kan damarlarını spesifik olarak etiketlemek için katyonik yakın kızılötesi floresan boya (MHI148-PEI) bildirdi. Bu yaklaşım, vasküler araştırmalar için yeni yollar açar.böbrek,özellikle 3D'de yüksek çözünürlüklü görüntüleme gerektiğinde. Benzer şekilde, Hasegawa ve ark. 26, sağlam fare böbreğinde sempatik innervasyonun dağılımını belirlemek için özel olarak oluşturulmuş bir ışık levha mikroskopi sistemi ile birlikte Temizle Engelsiz Beyin/Vücut Görüntüleme Kokteylleri ve Hesaplamalı Analizi (CUBIC) kullandı. Sempatik sinirler esas olarak arterlerin etrafına dağılmıştı. 10 günlük iskemi veya reperfüzyon hasarından sonra, sempatik innervasyon yoğunluğu önemli ölçüde azaldı, bu da azalmış norepinefrin seviyeleri ile ilişkiliydi.böbrek dokusu. Bu değişiklikler, ilk yaralanmadan 28 gün sonra kısmen devam etti, bu da kronik hastalığın ilerlemesi sırasında sürekli sempatik değişikliklerin bulunabileceğini düşündürdü.böbrek hastalığı.
Tubulointerstisyel yeniden şekillenme.Renal tübüler sistemin 3 boyutlu olarak analiz edilmesi özellikle zordur. Kıvrımlı ve karmaşık morfoloji, seri kesitlere ve standart ışık mikroskobuna dayalı geleneksel yöntemler için birçok zorluk yaratır. Bununla birlikte, optik temizleme, bozulmamış tübüllerin ve onları çevreleyen mikro ortamın analizine izin verir. Sarıtaş et al. 34, diyet potasyum yoksunluğu nedeniyle distal tübüler yeniden şekillenmeyi karakterize etmek için hidrojel bazlı ve hidrofobik optik temizlemenin bir kombinasyonunu, ardından gelişmiş ışık mikroskobu ve yarı otomatik 3D analizi gerçekleştirdi. Araştırmacılar tübüler hiperplaziyi ölçtüler ve tübülointerstitium içinde çoğalan hücrelerde bir artış tespit ettiler. Bu çalışma, hem optik temizlemenin çok yönlülüğünü hem de
Şekil 3| Yetişkin böbreğinde üç boyutlu (3D) morfometri. (a) Endotel hücrelerinin CD31 etiketlemesini kullanarak tüm böbreklerdeki nefronları saymak. Panel, bir 3D yeniden yapılandırmayı (solda), iki boyutlu (2D) görünümde (ortada) bir optik bölümü ve ışık levha mikroskobu (LSFM) ile konfokal ve 2- arasındaki bir karşılaştırmada tek glomerülleri gösteren özel alanları gösterir. foton (2P) mikroskopisi. American Society of Nephrology'nin izniyle, Journal of the American Society of Nephrology, Full Automated Assessment of Total Glomerular Number and Capiller Tuft Size in Nefritic Böbreklerde Lightsheet Microscopy, Klingberg A, Hasenberg A, Ludwig-Portugall I, et al. ., cilt 28, sayı 2, 2017; Telif Hakkı Gümrükleme Merkezi, Inc. aracılığıyla iletilen izin. 24 (b) Glomerülleri uzaysal kayıtla boyutlandırma—renk kodlaması glomerüler boyutu temsil eder, burada kırmızı en büyük nesne ve pembe en küçüğüdür. American Society of Nephrology'nin izniyle, Kidney360'den uyarlanmıştır, Automated Image Analyzes of Glomerular Hypertrophy in a Mouse Model of Diabetic Nephropathy, Østergaard MV, Sembach FE, Skytte JL, et al., cilt 6, sayı 6 , 2020; 25 (c) Sempatik sinirlerin (yeşil), vaskülatür (eflatun) ve birleştirilmiş (solda) immünoetiketleme ile sağlam bir böbreğin 3D rekonstrüksiyonunu içeren damar sistemi ve innervasyonu izleme. Kidney International, cilt 96, sayı 1, Hasegawa S, Susaki EA, Tanaka T, et al., Kapsamlı üç boyutlu analiz (CUBIC-böbrek), iskemi/reperfüzyon hasarından sonra anormal renal sempatik sinirleri görselleştirir, sayfa 129-138, Telif hakkı ª 2019, Uluslararası Nefroloji Derneği'nin izniyle. 26 (d) Podosit spesifik markör p57 (yeşil) ve DNA markörü 4 0 ,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) için immüno-etiketleme kullanılarak bireysel glomerüllerde podosit morfometrisi. Paneller (solda) bir 3B rekonstrüksiyonu ve (sağda) işlenmiş yüzeyleri gösterir. Journal of the American Society of Nephrology, Validation of a Three-Dimensional Method for Counting and Sizeing Podocytes in Whole Glomeruli, Puelles VG, van der Wolde JW, Schulze KE, et al., American Society of Nephrology'nin izniyle uyarlanmıştır., cilt 27, sayı 10, 2016; 27 (e) Soy izleme kullanılarak hücresel dinamikler, podositleri (en solda), parietal epitel hücrelerini (PEC'ler) hücresel hilaller oluşturan 3B (orta sol), istilacı PEC'lerin 2B görünümü vasküler yaralanmalı glomerüler taraf (orta-sağ) ve tübüler çıkışın 2D görselleştirmesi (en sağda). Kidney International, cilt 96, sayı 2, Puelles VG, Fleck D, Ortz L, ve diğerleri, Optik doku temizleme kullanan Novel 3D analizi, farelerde hızla ilerleyen glomerülonefritin evrimini belgeliyor, sayfa 505–516, Telif Hakkı ª 2019, Uluslararası Nefroloji Derneği, CC BY-NC-ND lisansı altında (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/). 28 (f) Soldan sağa artan büyütmelerde yarık diyaframın görselleştirilmesi. Kidney International, cilt 99, sayı 4, Unnersjö-Jess D, Butt L, Höhne M, ve diğerleri. , Telif Hakkı ª 2021, Uluslararası Nefroloji Derneği, CC BY-NC-ND lisansı altında (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/). 29 Bu resmin görüntülenmesini optimize etmek için lütfen bu makalenin çevrimiçi versiyonuna bakın.www.kidney-international.org.
hidrojel gömme ve ışık levha mikroskopisi kullanılarak sağlam böbreklerde tübüler analiz yapmak için ışık mikroskobu ve ayrıca hidrofobik temizleme ve konfokal mikroskopi kullanılarak böbrek dilimlerinde tek hücreli niceleme, çünkü her kombinasyon belirli araştırma sorusu için daha uygundu. Optik temizleme ve gelişmiş ışık mikroskobu kombinasyonları Tahaei ve diğerleri tarafından kullanılmıştır. Fizyolojik strese uyum kapasitesini belirleyebilen distal kıvrımlı tübülün uzunluğunda cinsel dimorfizmi karakterize eden 35 ve Schuh ve ark. Proksimal tübül ligand alımı ve endolizozomal fonksiyonda eksenel farklılıkları ortaya koyan 36, S1 segmentinin reseptör aracılı endositoz yoluyla proteinleri yeniden emmek için oldukça özel olduğunu vurgulamıştır. Yakın tarihli bir çalışmada, Blanc ve ark. 2, kist oluşumunun bir modelini analiz ederek, kistlerin sadece şekillerini belirleyen ve normal dilate olmayan tübüllere bitişik konumlanan spesifik nefron segmentlerinde geliştiğini gösterdi. Genel olarak, artık tübülointerstisyel bölmenin sistematik analizi için optik temizlemenin doğrudan uygulanmasına ilişkin birden fazla örneğe sahibiz.
Podosit kaybı ve hipertrofisi.Glomerulus, bir organ içindeki bozulmamış fonksiyonel birimlerin analizi için benzersiz bir örnek sağlar. Altın standart tasarım tabanlı metodolojiler önemli ölçüde zaman ve kaynak yatırımı gerektirdiğinden, özellikle, podosit tükenmesi çalışması bu teknolojik ilerlemelerden doğrudan yararlanmıştır. 37 Bozulmamış fare glomerüllerinin birleştirilmiş immüno-etiketlemesinin 3D podosit morfometrik analizi için ilk araçböbrekDolaylı immünofloresans, hidrofobik optik temizleme ve konfokal mikroskopiden oluşan değiştirilmiş bir protokol kullanılarak dilimler, bilinen hacimdeki tüm bireysel glomerüllerde toplam podosit sayısının ölçülmesini kolaylaştırdı. Bu yaklaşımın, belirli bir yapı alt kümesini etkileyen süreçlerin incelenmesi için ideal olduğuna inanıyoruz (örneğin, fokal ve segmental glomerüloskleroza yol açan podosit kaybı). 27 Aynı teknik daha sonra, rapamisin sinyal yolunun memeli hedefinin aracılık ettiği bir mekanizma olan podosit kaybını takiben telafi edici bir yanıt olarak podosit hipertrofisinin rolünü karakterize etmek için uygulandı. 38 Bu 2 çalışma glomerüler podositlerin analizine odaklanırken, geleneksel immün etiketlemeye dayalı bu boru hattı, yüksek uzaysal çözünürlükte herhangi bir hücre tipindeki morfolojik değişiklikleri karakterize etmek için kullanılabilir.
Hücresel hilallerin evrimi.3D için araç kutusuna başarıyla entegre edilmesi gereken bir diğer önemli araçböbrekmorfometri, genetik soy izlemedir. Optik temizleme yöntemlerinin çoğu, belirli bir derecede floresan söndürmeye neden olma eğilimindedir (hafif ila şiddetli arasında değişir). 6 Yakın zamanda, podosit kaybı ve parietal epitel hücre aktivasyonunun kapsamlı analizi için soy izleme, optik temizleme ve multifoton mikroskopisini birleştiren bir protokol sunduk. 28 Bu çalışmada, podositlerin gelişmiş yeşil flüoresan proteini ile metabolik etiketlemesi kullanılarak deneysel kresentik nefritin bir özelliği olarak podosit kaybı tanımlandı. Hücresel hilallerin evrimi, aynı zamanda güçlendirilmiş yeşil flüoresan proteini ile işaretlenmiş ve deneysel bir kresentik nefrit modeli sırasında izlenen parietal epitel hücrelerinin proliferasyonu ve göçüne dayalı olarak görselleştirildi ve nicelendirildi. Sağlam glomerüllerin analizi, fokal podosit kaybının ve parietal epitel hücreleri tarafından tübüler tıkanıklıklara ilerleyen lezyon oluşumunun tanımlanmasına izin verdi, bu da atubüler glomerül oluşumuna yol açtı. Bu çalışma, bozulmamış dokulardaki karmaşık immün-epitelyal etkileşimlerin gelecekteki çalışmalarının önünü açmaktadır.böbrekler.
CISTANCHE BÖBREK/BÖBREK DİYALİZİNİ İYİLEŞTİRECEK
Glomerüler filtrasyon bariyeri.Glomerüler hastalıkların rutin değerlendirmesi için önemli bir tanı aracı, elektron mikroskobu ile renal biyopsilerin ultra yapısal analizidir. Elektron mikroskobuna bir alternatif, tanımı gereği doku boyutlarını artırarak optik çözünürlüğü arttırmayı amaçlayan genişleme mikroskobu alanında bulunabilir. Yıllar içinde, Unnersjo-Jess ve ark. 39,40, nano ölçekli yapıların görselleştirilmesi için çoklu protokoller sağlamıştır.böbrek.Son zamanlarda, bu araştırmacılar, 3D görselleştirme için hızlı ve basit bir prosedür bildirdiler.böbrekmorfoloji, geleneksel konfokal mikroskopi kullanarak nano ölçekli yapıları çözmek için optik temizleme ve doku genişletme kavramlarını birleştiriyor. 29 Bu protokol, fare ve insandaki çoklu patolojik özellikleri görselleştirmek ve ölçmek için uygulandı.böbrekayak prosesi silinmesi, glomerüler bazal membran değişiklikleri, yarık diyafram uzunluğu, IgG birikintileri ve klasik patoloji özellikleri (örneğin, glomerülo-skleroz, tübülointerstisyel fibroz ve tübüler atrofi) dahil biyopsiler. Özetle, bu yöntem basit bir yöntem ve erişilebilir görüntü analiz araçları kullanılarak böbrek patolojisinin çok ölçekli görselleştirilmesine ve nicelenmesine olanak tanır. Bu yaklaşımın klinik uygulamada ölçeklenebilirliği ve uygulanması, muhtemelen gelişmiş ışık mikroskobu ekipmanı ihtiyacı ve otomatik görüntü analiz araçlarının geliştirilmesi ile belirlenecektir.
Çözüm
Mevcut doku temizleme yöntemleri yelpazesi, yaygın olarak bulunan mikroskoplarda 3D görüntülemeyi geliştirmek için çoğu laboratuvarda uygulanabilen basit teknikleri içerir. Bu yeni yaklaşımların sağladığı fırsatlar ortaya çıktıkça, temizlenmiş dokuyu yüksek çözünürlükte etkin bir şekilde görüntülemek için özel mikroskopi sistemlerinin daha geniş bir şekilde kullanılmasını ve belirli soruları ele almak için özel araştırma ve klinik iş akışlarının geliştirilmesini bekliyoruz. Sinirbilim alanı, temizlenmiş doku görüntüleme yöntemleri ve uygulamaları için bir test alanı olarak hizmet etmiştir. Otomatik görüntü analizi, hücresel bağlantı çalışmasına yönelik yeni yaklaşımlar ve doku çapında gen ve protein ekspresyonu atlası projeleri bu bağlamda geliştirilmiştir. Benzer yaklaşımların, gelişmekte olan ve yetişkinlerde hücre anatomisi ve hücre popülasyonlarının birbirine bağımlılığı hakkında yeni bilgiler vermesi muhtemeldir.böbrek.
Bu ilerlemelerin pratik sınırlamaları arasında görüntüleme donanımının maliyeti ve büyük veri kümelerinin işlenmesi, depolanması ve analiz edilmesindeki zorluklar yer alır. Diğer sınırlamalar, fiksasyon koşullarından ve antikor etiketlemesinden değişken şekilde etkilenen dokularla boyamanın tekrarlanabilirlik eksikliğinden kaynaklanmaktadır. Sonuç olarak, yeni 3B analizlerin eleştirel olarak değerlendirilmesi ve yerleşik yöntemlerle karşılaştırılmasına ihtiyaç vardır. değerlendirmedeki etkileyici ilerlemelere rağmenböbrekgelişim ve yetişkinböbrekBu derlemede vurgulanan yapı ve hastalık, doku temizleme ve 3D görüntülemenin en iyisinin henüz gelmediğine ve büyük olasılıkla heyecan verici bir büyüme alanı olacağına inanıyoruz.böbrekgelecek on yıllar boyunca araştırma.