Mycobacterium Tuberculosis Bölüm 2'ye Karşı Rastgele Kimerik Çok Epitoplu Bir Aşının In Silico Tasarımı

 2.15. Çoklu epitop aşı tasarımına genel bakış

Şekil 1, bu çok epitoplu aşı tasarımının genel konseptini özetlemektedir. Kısaca, IEDB'den elde edilen M. tuberculosis proteinlerinin antijenitesini analiz ettik ve çoklu epitop aşı yapımı için sekiz antijenik aday seçtik, fonksiyonel sınıflandırmalarını ve hücre altı lokalizasyonlarını göz önünde bulundurduk. Daha sonra, bu sekiz proteinin antijenik epitoplarını tahmin ettik ve ayrıca uygun bağlayıcılar aracılığıyla HBHA adjuvanı ve PADRE'ye bağlanan 15 CTL epitopu, 16 HTL epitopu ve 10 B hücresi epitopu seçtik. Ayrıca, tasarlanan çoklu epitop aşının antijenitesini, alerjenitesini, fizikokimyasal özelliklerini ve immünojenik profilini tahmin ettik. Bu arada aşının ikincil ve üçüncül yapılarını da tahmin ettik ve TLR4 bağışıklık reseptörü ile potansiyel etkileşimini analiz ettik.

Mycobacterium tuberculosis, tüberküloza neden olan yaygın bir patojendir. Mycobacterium tuberculosis proteini, insan bağışıklık sisteminin işlevi için çok kritik olan Mycobacterium tuberculosis'in ana bileşenlerinden biridir.

Mycobacterium tuberculosis proteini, insan bağışıklık sistemini aktive edebilir ve vücudun bağışıklığını artırabilir. Vücuda Mycobacterium tuberculosis bulaştığında, insan bağışıklık sistemi, spesifik T hücrelerinin ve B hücrelerinin aktivasyonu ve çoğalması dahil olmak üzere bir dizi bağışıklık tepkisi üretecektir. Bu hücreler, vücudun istilacı Mycobacterium tuberculosis'e direnmesine yardımcı olmak için antikorların yanı sıra interferon, interlökin vb. gibi çeşitli bağışıklık faktörlerini serbest bırakabilir.

Ek olarak, Mycobacterium tuberculosis proteini ayrıca bağışıklık sisteminin dengesini düzenleyebilir ve vücudun bağışıklık yanıtının aşırı aktivasyonunun neden olduğu bağışıklık hasarını önleyebilir. Son yıllarda, tüberküloz aşılarının araştırılması ve geliştirilmesi, aşılama yoluyla insan bağışıklık sisteminin bağışıklığını artırabilen ve tüberkülozun ortaya çıkmasını ve yayılmasını etkili bir şekilde önleyebilen Mycobacterium tuberculosis proteininin uygulanmasına da odaklanmıştır.

Bu nedenle, Mycobacterium tuberculosis proteini, insan bağışıklığının etkisi için çok önemlidir. Uygun egzersiz ve makul beslenme yoluyla bağışıklık sistemini aktif olarak güçlendirerek, tüberkülozu ve diğer bulaşıcı hastalıkları daha iyi önleyebilir ve sağlığınızı koruyabilirsiniz. Bu açıdan bağışıklığımızı güçlendirmemiz gerekiyor. Cistanche bağışıklığı önemli ölçüde artırabilir çünkü etteki polisakkaritler insan bağışıklık sisteminin bağışıklık yanıtını düzenleyebilir, bağışıklık hücrelerinin stres yeteneğini geliştirebilir ve bağışıklık hücrelerinin bağışıklığını artırabilir. Bakterisidal etki.

Cistanche Deserticola takviyesine tıklayın

3. Sonuçlar

3.1. Çok epitoplu aşı yapımı için M. tuberculosis proteinlerinin alınması

TB'ye karşı çoklu epitoplu bir aşı oluşturmak için önce M. tuberculosis H37Rv'deki proteinlerin antijenisitesini analiz ettik. IEDB veri tabanından, onaylanmış immünolojik özelliklere sahip toplam 492 protein elde edildi ve bunlardan 402 proteinin (yüzde 81,70) antijenik olduğu tahmin edildi. Bu 492 proteinin işlevsel karakterizasyonu için, 353'ü DAVID veritabanında zenginleştirilirken, 139'u zenginleştirilmedi. Lokalizasyon analizi, zenginleştirilmiş 353 proteinin 97'sinin, hücre dışı bölmede, hücre yüzeyinin dışındaki boşlukta lokalize olduğunu gösterdi. Hücre dışı bölmede lokalize olan proteinler, dış zar proteinlerini ve salgılanan proteinleri içerir.

97 proteinin 49'u salgı proteinidir. Salgılanan 49 proteinin daha fazla zenginleştirilmesi, beş proteinin hücre dışı boşluğa salgılandığını ve beşinin patogenez için gerekli olduğunu ortaya çıkardı (deneysel olarak BioCyc tarafından doğrulanmıştır) [48]. Ayrıca, bu on protein, H. sapiens'in toplam proteinleri ile hizalandığında, iki protein (Mpt83 ve Mpt70), H. sapiens proteinlerine oldukça benzerdi. Bu nedenle, H. sapiens proteinlerine benzer olmayan kalan sekiz protein (Tablo 1), çoklu epitoplu bir aşının yapımı için nihai adaylar olarak kabul edildi.

3.2. Aday proteinlerin T hücresi ve B hücresi epitoplarının tahmini

Epitop tahmininden önce, sinyal peptitleri tanımlandı ve aday proteinlerden silindi. 135 güçlü bağlayıcıya (16'sı A1, 40'ı A2, 22'si A3, 19'u A24 ve 38'i MHC sınıf I) sahip sekiz aday proteinden toplam 623 CTL epitopu NetMHCpan tarafından tahmin edildi{12} }.1 sunucu (Şekil 2A, B). 135 güçlü bağlayıcı arasından 36'sı hem antijenik hem de immünojenikti. Son olarak, aşağıdaki kriterlere göre 36 CTL epitopundan 15'ini seçtik: süper tip başına üç epitop ve aday protein başına en az bir epitop (Not: EsxA'nın hem antijenik hem de immünojenik güçlü bağlayıcısı yoktu) (Tablo 2).

Ayrıca, HTL epitoplarını (MHC sınıf II epitopları) tahmin ettik. dört alelden (HLA_DRB, HLA_DP, HLA_DQ ve H-2-I) {{0}}mer epitopları yüzde sıralaması 2'den küçük veya ona eşit.0 güçlü bağlayıcılar olarak kabul edildi ve en düşükten en yükseğe doğru sıralandı. HLA-DR alelleri en yüksek MHC II bağlayıcı sayısına sahipken (2990), HLA-DP en az sayıdaydı (601) (Şekil 2C, D). Tüberküloz, cüzzam ve sarkoidoz gibi granülomatöz hastalıklarda bağışıklık yanıtının, IFN üreten T-helper-1 (Th1) hücrelerinin baskın olduğu belirtilmelidir [97]. Ek olarak önceki raporlar, tüberküloz hastalarında Th1 sitokinlerinin (IFN- ve IL2) ekspresyonunun azaldığını ortaya koydu [98]. Bu nedenle, Th1 hücrelerini uyarmak için, bu proteinlerin 15-mer IFN- -indükleyici peptitlerini tahmin ettik. IFN-indükleyici aktiviteye sahip toplam 534 epitop, NetMHCIIpan 4.0 kullanılarak tahmin edildi ve bunların 315'i antijeniktir. Bu 315 epitoptan 103'ü, en az bir HLA aleline güçlü bağlanma aktivitesi gösterdi.

Ayrıca, HLA alellerindeki polimorfizm, alelik varyasyonla sonuçlanarak, geniş ölçüde farklı peptit bağlama özgüllüklerine yol açar [55]. Sonuç olarak, sekiz aday proteinin her birinden en güçlü bağlanma aktivitesine (en karışık epitop) sahip bir epitop seçtik. Ek olarak, geri kalan 95 epitop, bağlanma kuvvetine göre sıralandı ve daha sonra aday protein başına maksimum iki epitop olacak şekilde ek sekiz epitop seçildi. Son olarak, aşağıdaki kriterlere göre 103 HTL epitopundan 16'sını seçtik: aday protein başına en az bir epitop ve maksimum üç epitop, aday protein başına en güçlü bağlanma aktivitesi ve çoğu antijenik ve IFN-indükleyici. Daha sonra bunları bu çoklu epitop aşısını oluşturmak için kullandık (Tablo 2).

Doğrusal B-hücresi epitop tahmini için iki sunucu (BepiPred2.0 ve ABCpred) kullanıldı ve 166 epitop elde edildi. Her protein için ilk beş epitopun antijenitesini tahmin ettik ve sonra on antijenik epitop seçtik (16-mer, her aday proteinden en az bir tane) (Tablo 2).

3.3. Çok epitoplu aşı yapısı

Çoklu epitoplu aşı yapımı için, HBHA, PADRE, 16 HTL (15-mer), 15 CTL ve 10 lineer B-hücresi (16-mer) epitopu, uygun bağlayıcılar yoluyla bağlandı ve bir His tarafından takip edildi. × 6 etiket (Şek. 3). Adjuvanlar, doğal ve kazanılmış bağışıklık tepkilerini artırabilen aşıların önemli bileşenleridir [99]. M. tuberculosis'ten elde edilen birçok protein adjuvan özelliklere sahiptir ve aşı tasarlamak için kullanılmıştır [17,27,87,100–105]. En yaygın kullanılanlardan biri, TLR4 işleme [105,106] yoluyla dendritik hücre (DC'ler) olgunlaşmasını indükleyen güçlü bir immüno-uyarıcı olan HBHA'dır [100-105]. HBHA ile tedavi edilen DC'lerin saf T hücrelerini aktive ettiği, CD4 plus ve CD8 plus T hücrelerini polarize ederek IFN- salgıladığı ve T hücresi aracılı sitotoksisiteyi indüklediği bulunmuştur [47].

Bu çalışmada, doğal olarak oluşan bir protein olan HBHA'dan aşı yapısının sentezini başlatmak için uygun olduğundan, HBHA'yı bir protein adjuvanı olarak N-terminaline yerleştirdik. HBHA daha önce bazı multiepitop aşıların N-terminaline bir adjuvan olarak yerleştirilmiştir [105,107]. Adjuvanlara ek olarak, insanlar için güvenli olan PADRE, Th hücresi aracılı tepkileri indüklemek için yüksek afinite ile çoklu fare ve insan MHC-II allellerine yüksek afinite ile bağlandığı için aşı immünojenisitesini önemli ölçüde artırabilir [47,62]. HBHA ve PADRE, verimliliği artırmak ve girişimi azaltmak için iki protein bileşenini ayırırken sertlik sağlayan sarmal bir PEAK bağlayıcı ile bağlandı. Ayrıca, segmentler içinde oluşan bir Glu-Lys tuz köprüsü bağlayıcıyı stabilize etti.

PADRE, aşı HTL epitoplarının aktivitesini artırabildiğinden [54], 16 HTL epitopunu PADRE'den sonra yerleştirdik. GPGPG bağlayıcısı, immün hücre ilerlemesini ve epitop sunumunu kolaylaştırdığından, HTL epitoplarını birbirine ve PADRE'ye bağlamak için kullanıldı [108,109]. Ayrıca GPGPG, kavşak immünojenisitesini bozabilen ve işlendikten sonra bireysel epitopların immünojenisitesini eski haline getirebilen HTL immün yanıtını indükler [108].

15 CTL epitopu için, bireysel epitop, epitopun TAP taşıyıcıya bağlanmak ve epitop sunumunu geliştirmek için uygun bölgeler üretmesine yardımcı olan bir AAY bağlayıcı ile birleştirildi [47]. Ayrıca, tüm CTL epitop alt birimi, beş uygun bölünme bölgesine (A7-L8, A5-E6, Y3-G4, R) sahip olan HEYGAEALERAG bağlayıcı aracılığıyla yukarı akış HTL epitoplarına bağlandı. 10-A11 ve L8-E9) ökaryotik proteazomal ve lizozomal bozunma sistemleri için gereklidir. Ökaryotlarda, proteazomlar ve lizozomlar, sırasıyla ubikuitin-proteazom sistemini (UPS) ve otofaji yolunu kullanan en önemli proteolitik makinelerdir [110].

HEYGAEALERAG bağlayıcısı, CTL epitop alt birimini, KK bağlayıcıları ile birbirine bağlanan 10 akış aşağı doğrusal B-hücresi epitopuna bağlamak için de kullanıldı. Daha önceki çalışmalara göre, KK bağlayıcı, iki peptidin kombinasyonundan kaynaklanan amino asit dizisine antikorların indüklenmesini önler, böylece her bir peptidin antikora spesifik gösterimini kolaylaştırır [111]. Son olarak, aşının müteakip saflaştırılması ve karakterizasyonu için son lineer B hücresi epitopunun C terminaline bir Hisx 6 etiketi iliştirildi (Şekil 3).

Nihai kimerik protein, HBHA adjuvanı ile başlayan, ardından 41 epitop ile başlayan ve bir His× 6 etiketi ile biten 933 amino asit kalıntısından oluşur (Şekil 3). Bu kimerik protein, sekiz proteinden çoklu epitop antijenlerinden oluştuğu için, onu 8 aday proteinden türetilen Çoklu epitop TB Aşısı olan MTBV8 olarak adlandırdık.

3.4. MTBV8'in antijenitesi, alerjenitesi ve fizyokimyasal parametrelerinin analizi

Önceki çalışmalar, insan aşılarının, enfeksiyöz ajanların epitoplarına karşı yönlendirilmiş hafıza hücrelerinin oluşumuna yol açan hümoral immün yanıtları ortaya çıkarması için antijenitenin gerekli olduğunu göstermiştir [112]. Bu nedenle, VaxiJen 2.0 sunucusunu kullanarak çok epitoplu aşı MTBV8'in antijenitesini tahmin ettik ve eşik değerinden ({{7}) önemli ölçüde yüksek olan 0.97'lik bir antijenite elde ettik. }.4) [45,46] bir bakteriyel proteinin antijenik olarak kabul edilmesi için. Özellikle, MTBV8, tüm bileşen proteinlerden daha antijenikti (Şekil 4), bu, konakçı bağışıklık tepkilerini etkili bir şekilde uyarabileceğini düşündürdü.

Ayrıca, birçok mikrobiyal makromolekülün insanlarda aşırı duyarlılık reaksiyonlarını indükleme potansiyeline sahip olduğu bildirilmiştir [113]. MTBV8'in ve onu oluşturan sekiz proteinin aşırı duyarlılık sorununu analiz etmek için, AllerTOP 2.0 sunucusunu kullanarak bunların alerjenliğini tahmin ettik. Sekiz bileşenli proteinden ikisinin (LprA ve EspC) alerjen olduğu tahmin edilmiştir (Tablo 1). Tasarlanan multi-epitop aşısının (MTBV8) bu iki proteinden elde edilen on epitop içermesine rağmen, bu aşının güvenli olduğunu gösteren, alerjik olmadığı tahmin edildi.

MTBV8'i daha fazla karakterize etmek için fizikokimyasal özelliklerini ExPASy ProtParam sunucusu aracılığıyla analiz ettik. Rekombinant proteinin moleküler ağırlığı 94.84 kDa ve izoelektrik noktası 8.91'dir. Ayrıca protein, 26.44'lük hesaplanmış bir kararsızlık indeksi (II) ile kararlı kabul edildi (kararsızlık endeksi > 40 olan proteinler kararsız olarak kabul edildi) [64]. Tahmini in vitro yarı ömür memeli retikülositlerinde 30 saattir, mayada in vivo 2{21}} saatten ve E. coli'de in vivo 10 saatten daha uzundur. Ek olarak, MTBV8'in alifatik indeksi 71.91 idi ve genel ortalama hidrofiliklik değeri (GRAVY) - 0.32 idi, bu da rekombinant proteinin hidrofilik olduğunu gösterir. Son olarak, MTBV8 için orantılı çözünürlük değeri (0.54), popülasyon veri seti ortalamasından (0.45) daha büyüktü, bu da aşı adayının E. coli proteinlerinin yarısından daha fazla çözünür olduğunu gösterir [114]. Yukarıdaki sonuçlar, MTBV8'in iyi fiziksel ve kimyasal özelliklere sahip olduğunu ve bir aşı olarak kullanılmaya uygun olduğunu gösterdi.

3.5. MTBV8'in immünojenik profili

MTBV8'in immünojenisite profilini değerlendirmek için, C-IMMSIM immün sunucusu yoluyla silico'daki immün yanıtları analiz ettik. Şekil 5A'da gösterildiği gibi, IgM ve IgGl titreleri, MTBV8 tarafından ikincil bağışıklık uyarımından sonra büyük ölçüde arttı. Ayrıca, aktif B hücrelerinin seviyesi her aşılamadan sonra arttı ve yüksek bir seviyede kaldı (Şekil 5B). Plazmadaki B hücreleri için bile, B izotipleri IgM ve IgG1, aşılamadan sonra yüksek kaldı (Ek Şekil 1A, B). T hücreleri üzerindeki etkiye gelince, Th bellek hücrelerinin (y2) (Ek Şekil 1C) ve aktif Th hücrelerinin (Şekil 5C) seviyeleri, birincil aşılamadan sonra hızla arttı ve ikincil aşılamadan sonra önemli ölçüde arttı. Düzenleyici T hücreleri (öncelikle aktif hücreler), ilk aşılama üzerine uyarıldı ve ardından hızla azaldı (Ek Şekil İD). İlginç bir şekilde, aktif sitotoksik T (Tc) hücrelerinin seviyesi, birincil aşılamadan sonra hızla arttı, ikinci aşılamada yüksek kaldı ve daha sonra istikrarlı bir şekilde düştü, oysa dinlenme Tc hücreleri, aktif Tc hücrelerine ters eğilim gösterdi (Şekil 5D). Buna karşılık, anerjik (y2) Tc hücrelerinin (Şekil 5D) ve bellek Tc hücrelerinin (Ek Şekil 1E) seviyeleri, bağışıklama üzerine değişmeden kaldı. Ek olarak, M. tuberculosis'e [115] karşı bağışıklık tepkisi için kritik olan T hücreleri tarafından salgılanan bağışıklık faktörleri IFN- ve IL-2 düzeylerinin de MTBV8 bağışıklaştırmasından sonra önemli ölçüde arttığı belirtilmelidir (Şekil 4). 5E).

Ayrıca, MTBV8 aşılamasının doğuştan gelen immün hücre popülasyonları üzerindeki etkisini tahmin ettik (Şekil 5F ve Ek Şekil 1FH). DC'lerde ve makrofajlarda -2 hücrelerin sunulması, birinci bağışıklaştırmada hızla artarken, ikinci bağışıklaştırmadan sonra yalnızca küçük bir artış gözlendi (Şekil 5F ve Tamamlayıcı Şekil 1G). Ek olarak, makrofajlarda ilk bağışıklama, aktif ve dinlenme halindeki makrofajlarda eş zamanlı bir artış veya düşüşle sonuçlandı. İkinci aşılamadan birkaç hafta sonra, aktif makrofajlar hızla azalırken, istirahat halindeki makrofajlar hızla arttı. (Ek Şekil 1G). Özellikle, doğal öldürücü hücreler ve aktif epitel hücre popülasyonları, bağışıklama üzerine oldukça sabit bir model sergiledi. (Ek Şekil 1F, H). Birlikte ele alındığında, bu tahminler, MTBV8'in hem doğal hem de adaptif bağışıklık tepkilerini güçlü bir şekilde uyarabildiğini ve potansiyel olarak etkili bir aşı adayı haline getirdiğini öne sürdü.

3.6. MTBV8'in tahmini ikincil ve üçüncül yapıları

MTBV8'i daha iyi karakterize etmek için ikincil ve üçüncül yapılarını tahmin ettik, ardından üçüncül yapısını iyileştirdik. MTBV8'in ikincil yapısı yüzde 42,12 sarmal, yüzde 11,79 şerit ve yüzde 46,09 sarmaldan oluşuyordu (Ek Şekil 2). DISOPRED3 tahminlerine göre, amino asit kalıntılarının yüzde 27,11'i düzensizdi.

MTBV8'in üçüncül yapısı, I-TASSER sunucusu tarafından tahmin edildi ve iyi C-skoru olan 5 model elde edildi. C-skoru -5.0 ile 2.0 arasındadır ve tahminin güvenilirliği ile orantılıdır. Bu modeller ProSA-web analizine tabi tutulmuş ve aşağıdaki özellikler nedeniyle model 4 seçilmiştir; C puanı=-3.8, Z puanı=-4.4. Bu üçüncül yapının Ramachandran arsa analizi, kalıntıların yüzde 7{18}},0'dan daha azının tercih edilen bölgelerde olduğunu gösterdi, bu nedenle üçüncül yapının daha fazla rafine edilmesi gerekiyor.

I-TASSER tarafından elde edilen üçüncül yapı, beş model oluşturmak için ModRefiner sunucusu ve ardından GalaxyRefine sunucusu tarafından rafine edildi. Geliştirilmiş beş model arasında, model 2, aşağıdaki parametreler dikkate alındığında en iyi yapıya sahipti: Küresel mesafe testi yüksek doğruluk (0,89), RMSD (0,58), MolProbity (2,31), çakışma puan (14.8), zayıf rotamer puanı ({{10}}.80) ve Ramachandran çizim puanı (86.5 yüzde) (Şekil 6A). PROCHECK kullanılarak bu yapının Ramachandran arsa analizi, glisin olmayan, prolin olmayan ve terminal olmayan 753 tortunun yüzde 78,9'unun en uygun bölgede [A, B, L], yüzde 17,3'ünün ise en uygun bölgede olduğunu ortaya çıkardı. ek olarak izin verilen bölge [a, b, l, p] ve genel olarak izin verilen bölgede [∼a, ∼b, ∼l, ∼p] yüzde 1,5, izin verilmeyen bölgede yalnızca yüzde 2,4 (Şekil 6B). Rafine yapının Ramachandran grafiğini Molprobity kullanarak analiz ederken, amino asit kalıntılarının yüzde 86,5'inin uygun bölgede bulunduğunu bulduk; bu, GalaxyRefine sunucusu tarafından elde edilenle aynıydı (Şekil 6C) . Ayrıca kalıntıların yüzde 98,0'i izin verilen bölgedeyken, 19 kalıntı aykırı değerdeydi (phi, psi) (Şekil 6C). İyileştirilmiş model, I-TASSER tarafından oluşturulan modele kıyasla tercih edilen bölgede daha fazla tortuya sahip olsa da, daha fazla doğrulamaya ihtiyaç duyar.

Model doğrulama, tahmin edilen 3B modellerdeki potansiyel hataları tanımlayabildiği için model oluşturma sürecinde önemli bir adımdır [116]. İyileştirilmiş MTBV8 modelini doğrulamak için ProSA-web ve ERRAT analizleri yapıldı. ProSA-web analizi, benzer boyuttaki proteinler için deneysel olarak belirlenmiş puan aralığının biraz dışında olan MTBV8 (Şekil 6D) için -5.76'lık bir Z puanı gösterdi. Ancak, ERRAT analizi rafine MTBV8 için 70.94'lük bir genel kalite faktörü gösterdi. 50'den büyük bir ERRAT puanı, iyi kalitede bir modeli temsil ettiğinden [117], 70.94'lük bir puan, sonraki analizler için modellenen yapıya yüksek güven duyduğumuzu gösterdi.

3.7. MTBV8'in immün hücre reseptörleri ile moleküler kenetlenmesi

Aşıların immün hücre reseptörlerine olan güçlü afinitesi, stabil bir immün yanıt üretir [118]. MTBV8 ve immün hücre reseptörleri arasındaki potansiyel etkileşimler hakkında fikir edinmek için, MTBV8 ile immün reseptörü TLR4 arasında moleküler yerleştirme gerçekleştirdik (Şekil 7A ve B). Önceki çalışmalar, TLR4 ligandlarının DC'leri aktive edebildiğini, bunun da naif T hücrelerini aktive edebildiğini, IFN- salgılamak ve T hücresi aracılı sitotoksisiteyi indüklemek için T hücrelerini (CD4 plus ve CD8 plus hücreleri) etkili bir şekilde polarize ettiğini göstermiştir [106]. Bu işlemler, efektör bellek hücrelerinin havuzunda bir artışa yol açacaktır [119]. TLR4'ün antijenik peptidlerle etkileşimi, TB enfeksiyonuna karşı yanıtlara yol açtığından, MTBV8 ve TLR4 arasındaki etkileşimlere odaklandık (Şekil 7A). Firedock'tan moleküler yerleştirme sonuçları, en çok tercih edilen rafine modelin - 40,28 küresel enerjiye, çekici bir van der Waals enerjisi (aVdW) - 19.86'ye, itme enerjisi (kırmızı) 2,19'a, bir atomik temas enerjisine sahip olduğunu gösterdi. 4,70 ve hidrojen bağı (HB) katkısı - 1,03 (Şekil 7B). Ek olarak Prodigy, TLR4 ve MTBV8 arasındaki bağlanma enerjisinin - 8,6 kcal/mol olduğunu tahmin etti. Yukarıdaki sonuçlar, MTBV8'in TLR4'e güçlü bir afiniteye sahip olduğunu ve bunun stabil bir bağışıklık tepkisi oluşturmasını sağladığını gösterdi.

3.8. Moleküler dinamik simülasyonu

Aşıdaki atomların hareketini analiz etmek için moleküler dinamik simülasyon kullanıldı [120]. Ana zincir deforme olabilirliği, bir molekülün her bir kurucu kalıntıda ne ölçüde deforme olabileceğini gösterir. Yüksek deformasyon bölgeleri, "menteşe" zincirinin konumunu gösterdi (Şekil 7C) ve deneysel B faktörü, karşılık gelen PDB veri bankasından elde edilirken, hesaplama NMA hareketliliğini 8pi^2 ile çarparak yapıldı (Şekil 7D) ). Her normal moda atanan özdeğer, tüm yapının deformasyon enerjisiyle doğrudan ilişkili olan hareket sertliğinin bir ölçüsüdür. Özdeğer, deformasyon kolaylığı ile doğru orantılıdır (Şekil 7E). Her normal modun varyansı, özdeğer ile ters orantılıdır. Bireysel varyanslar kahverengi, kümülatif varyanslar yeşil renklidir) (Şekil 7F). Kovaryans matrisinde, kalıntı çiftleri arasında bağlantı vardır ve ilişkili (kırmızı), ilişkisiz (beyaz) ve ilişkili olmayan (mavi) hareketler görüntülenmiştir (Şekil 7G). Esneklik ağı, yaylarla birbirine bağlanan atom çiftlerini temsil ediyordu ve her nokta, karşılık gelen atom çiftleri arasındaki bir yayı temsil ediyordu. Noktaların rengi sertliklerini gösteriyordu; koyu gri noktalar daha sert yayları ve bunun tersini göstermektedir (Şekil 7H). iMODS sunucusunu kullanan moleküler dinamik simülasyonları, MTBV8 ve TLR4 arasındaki kenetlenme kompleksinin kararlı olduğunu öne sürdü.

3.9. Silico optimizasyonu ve MTBV8'in klonlanması

Protein sentezi, aktivitesi için bir ön koşuldur [121]. Buna paralel olarak, kendi kendini kopyalayan bir plazmit pET28a( plus ) [103] yoluyla E. coli hücrelerinde aşırı ekspresyonu için aşının artan transkripsiyonel ve translasyonel etkinlikleri gereklidir. Bunun optimizasyonu, 0.99'luk Kodon Adaptasyon İndeksi (CAI) ve genellikle konakçıda protein ekspresyonu için uygun kabul edilen yüzde 30 ile yüzde 70 arasındaki bir GC içeriği (yüzde 54.81) ile sağlandı. Mtbv8'in DNA fragmanı, bir pET-28a ( artı )-mtbv8 rekombinant plazmidi (Ek Şekil) oluşturmak için SnapGene kullanılarak NcoI ve XhoI kısıtlama bölgeleri arasında bir pET-28a( plus ) vektörüne klonlanabilir (Ek Şekil .3).

4. Tartışma

4.1. Tüberküloza karşı çok epitoplu aşıların ortaya çıkışı

Aşılama, tüberküloz enfeksiyonuyla savaşmanın en güvenilir yoludur. Uzun yıllar boyunca bilim adamları, onaylanmış tek TB aşısı olan BCG'nin yerini alabilecek çok sayıda ümit vaat eden aşı adayı belirlediler [8100,122-125]. Son zamanlarda, rekombinant TB aşıları artan bir ilgi görmüştür. Dört aşı adayı Rv2608 (PE/PPE ailesi), Rv1813 (stres/hipoksi altında ifade edilir), ESXV ve ESXW'den oluşan ID93/GLA-SE dahil olmak üzere birçok rekombinant aşı klinik öncesi ve klinik deneylerde etkinlik göstermiştir. fareler klinik öncesi deneme [122]. Klinik deneylerde, Ag85a ve ESAT6-CFP10'u birleştirerek elde edilen GamTBvac, faz I denemelerinde başarılı olurken [125] iki adaydan [Mtb39A (PPE18) ve Mtb32A] oluşan M72, fazda önemli bir güç sağladı II denemeleri [123].

Bu rekombinant aşıların başarılı denemeleri, farklı aday proteinlerin immünolojik özelliklerini basitçe sentetik bir proteine ​​dahil eden epitop bazlı aşıların daha büyük potansiyeline işaret etmektedir [124]. Özellikle, birkaç TB alt birim aşısı, çok sayıda aşı adayından türetilmiştir ve hayvan modeli çalışmalarında potansiyel olarak çekici adaylar olarak ortaya çıkmışlardır [100]. Örneğin, altı immünojenik HTL peptidinden oluşan bir multiepitop peptit TB aşısı adayı olan MP3RT, insanlaştırılmış farelerin akciğerinde ve dalağında önemli ölçüde daha yüksek seviyelerde IFN- ve CD3 artı IFN- artı T lenfositleri ve daha düşük koloni oluşturan birimler (CFU'lar) indüklemiştir. vahşi tip fareler [8]. İleriye dönük olarak, bu aşılarda daha fazla etki için yapılan araştırmalar, potansiyel protein adaylarının zenginleşmesine yol açmıştır.

Ayrıca M. tuberculosis tarafından salgılanan proteinler de TB patogenezi ve virülansı için önemli olduklarından MTBV8'in tasarımında dikkate alınmıştır (Tablo 1). Ek olarak, M. tuberculosis hücrelerinin dış katmanlarından salgılanan bazı proteinler, yararlı antijenler olarak görev yapabilir. Örneğin, EsxA ve EsxB, M. tuberculosis'in kapsülünden saflaştırılmıştır [127] ve EsxA'nın kapsülde tutulması, sitotoksisite ile ilişkilendirilmiştir [128]. Ek olarak, bakteri hücre duvarı bütünlüğü için EsxA gereklidir [129]. Genel olarak, salgılanan proteinler, konak immün yanıtlarının hedefleri olacak şekilde yeterince açık yüzeylere sahiptir [130,131].

4.2. Doğuştan gelen bağışıklık sisteminin MTBV8 tarafından potansiyel olarak uyarılması

Aday proteinlerde bir epitop için tarama, doğuştan gelen bağışıklık sisteminin aktivasyonunu ve ardından lenfositler tarafından antijen tanınmasını içerir, çünkü her iki faktör de adaptif bağışıklık sisteminin müteakip aktivasyonu için gereklidir [50]. Doğuştan gelen yanıt için, MTBV8 (adjuvan olarak TLR4 stimülatörü HBHA'nın yardımıyla) ile DC'lerin TLR4'ü (Şekil 5F) arasında kararlı bir kompleksin oluşumu önemlidir çünkü TLR4 ligandları DC'leri aktive edebilir ve aktive edilmiş DC'ler sırayla aktive olabilir. naif T hücreleri, IFN- salgılamak için CD4 plus ve CD8 plus T hücrelerini etkili bir şekilde polarize eder ve T hücresi aracılı sitotoksisiteyi [106] ve ardından artan efektör bellek hücreleri havuzunu [119] indükler.

Bu kompleks, bellek dışı hücrelere kıyasla B lenfositlerinde (Ek Şekil 1A) ve Th lenfositlerinde (Ek Şekil 1C) bellek hücresi (y2) popülasyonundaki artışa büyük olasılıkla katkıda bulunmuştur. MTBV8 ile bağışıklık stimülasyonu, TB [33,37,39] ve diğer hastalıklara [27,62,107,124,132] karşı diğer multiepitop aşılarla elde edilenle karşılaştırılabilir. Bu, çoklu epitop aşı mekanizmasının tutarlılığına işaret etti.

4.3. Adaptif bağışıklık sisteminin MTBV8 tarafından potansiyel olarak uyarılması

B ve T lenfositleri, antijenler olarak adlandırılan istilacı patojenlerin parçalarını tanıyarak hümoral veya hücre aracılı bağışıklık yoluyla adaptif immün yanıtları koordine eden birincil efektör hücrelerdir [50]. Hümoral adaptif bir immün yanıtı indüklemek için, B lenfositleri tarafından eksprese edilen ve salgılanan antikorların tanınması ve yok edilmesi için yüksek skorlu B hücresi epitoplarını (Tablo 2) dahil ettik [50,133]. Çoğunlukla IgM- ve IgG1-salgılayan B hücreleri (Ek Şekil 1A) olan aktif B lenfositlerinin (Şekil 5B) aşıyla uyarılması, aşırı IgM ve IgGl salgılanmasına neden olabilir (Şekil 5A).

Aşının yüksek antijenikliği (Şekil 4), antikor tepkilerini artırmada önemli etkilere sahip olabilir (Şekil 5A). Aslında, hücre aracılı immün yanıtlar, T hücrelerinin antijenleri tanıma yeteneğine büyük ölçüde bağlıdır [134]. Bunu başarmak için, MHC peptid immünojenisitesini [135] kontrol eden anahtar faktör olan peptit: MHC kompleksi (pMHC) stabilitesini geliştiren güçlü antijenik ve güçlü MHC bağlayıcı CTL ve HTL epitopları seçtik (Tablo 2) ve CD8 plus ve CD4 plus T hücrelerinin DC'ler tarafından hazırlanması, T lenfosit tepkilerine yol açar (Şekil 5C, Ek Şekil 1C) [136].

Uygun bağlayıcıların ve sentetik oligopeptitlerin (PADRE ve HEYGAEALERAG) dahil edilmesi ve her bir bileşenin kesin olarak konumlandırılması, epitop işlenmesini ve sunumunu kolaylaştırabilir (Şekil 3). İnsanlar arasındaki alel varyasyonu nedeniyle, başlıca insan ırklarının MHC-I alellerinin tanınmasına dayalı olarak CTL epitoplarını seçtik Ek Tablo 1(Tablo 2) ve karışık HTL epitopları, IFN'yi indükleyen özellikler ve antijenisite taramasından sonra seçildi.

4.4. MTBV8'in geliştirme beklentileri

Bu in silico aşı tasarımı, aday aşıların sentezi ve etkinliği açısından tarama aşamalarında ilgili bir göstergedir. Sentez için, tahminlerimiz bunun E. coli sisteminde sentezlenebileceğini ortaya çıkardı, ancak E. coli tabanlı sistemlerde zorluklar varsa böcek ve memeli hücreleri gibi diğer sistemler de düşünülebilir. Islak laboratuvar doğrulaması, in silico çalışmalardan sonra aşı adaylarının onaylanmasındaki bir sonraki aşamadır. Bu yöntem aslında ilk önce in silico olarak tasarlanan ve daha sonra deneysel aşamada etkinliği kanıtlanan bazı aşı adaylarında etkili bir şekilde kullanılmıştır [137].

5. Sonuç

DSÖ'nün TB'nin tamamen ortadan kaldırılmasına yönelik Sürdürülebilir Kalkınma Hedefi'nin temel desteği, M. tuberculosis enfeksiyonunu önleyecek güçlü bir aşıya erişimdir. Önceki çalışmalar, kimerik çoklu epitop aşılarının, bağışıklık etkinliğini artırmak için belirli proteinlerin bağışıklık/antijenik özelliklerinden yararlanabileceğini göstermiştir. Bu çalışmada, M. tuberculosis H37Rv tarafından salgılanan sekiz antijenik proteinden türetilen 41 karışık epitopu entegre ederek kimerik bir aşı (MTBV8) tasarlamak için in silico bir yaklaşım kullandık. MTBV8'in kararlı, çözünür, güvenli, yüksek oranda antijenik ve immünojenik olduğu tahmin edilmiştir.

İmmüno-bilişim analizi, MTBV8'in ana bağışıklık hücresi reseptörü TLR4 için iyi bir afinite sergilediğini gösterdi. Daha da önemlisi, MTBV8'in aşılama uyarımı, B hücrelerinin, T hücrelerinin ve doğuştan gelen bağışıklık hücresi popülasyonlarının seviyelerini önemli ölçüde artırabilir ve immünoglobülinlerin (IgG1, IgM, vb.) yanı sıra bağışıklık faktörlerinin (IFN- , IL{{6) üretimini uyarabilir. }}, vesaire). Birlikte ele alındığında, çoklu epitop aşısı MTBV8, TB'ye karşı aşıların tasarım aşamasında ilgili bir göstergedir ve 'TB'yi Bitirme stratejisinin' gerçekleştirilmesinde potansiyel bir mihenk taşı olabilir.

Kredi yazarlık katkı beyanı

Binda T. Andongma: Kavramsallaştırma, Metodoloji, Yazılım, Yazma - orijinal taslak. Yazheng Huang: Veri iyileştirme, Yazılım. Fang Chen: Yazılım, Görselleştirme. Qing Tang: Veri iyileştirme, Biçimsel analiz. Min Yang: Yazılım, Görselleştirme. Shan-Ho Chou: Yazma - inceleme ve düzenleme. Xinfeng Li: Kavramsallaştırma, Metodoloji, Yazılım, Finansman Edinimi. Jin He: Denetleme, Yazma - inceleme ve düzenleme, Finansman sağlama.

Rekabetçi Menfaat Beyanı

Yazarlar, bu makalede bildirilen çalışmayı etkiliyor gibi görünebilecek bilinen hiçbir rakip mali çıkarları veya kişisel ilişkileri olmadığını beyan ederler.

teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32200026, 31900057), Tarımsal Mikrobiyoloji Devlet Anahtar Laboratuvarı'nın (AMLKF202108) açık fonları ve Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (2019M662654) tarafından desteklenmiştir.

Ek A. Destekleyici bilgiler

Bu makaleyle ilişkili ek veriler, doi:10.1016/j.csbj.2023.01.019 adresindeki çevrimiçi sürümde bulunabilir.

Referanslar

[1] Boineau R, Domanski M, Troutman C, Anderson J, Johnson G, Mcnulty SE, Clappchanning N, Davidson-ray LD, Fraulo ES, Fishbein DP, et al. Konjestif kalp yetmezliği için amiodaron veya implante edilebilir bir kardiyoverter-defibrilatör. New Engl J Med 2005;352(3):225–37.

[2] Khoshnood S, Heidary M, Haeili M, Drancourt M, Darban-sarokhalil D, Nasiri MJ, Lohrasbi V. Mycobacterium tuberculosis'e karşı yeni aşı adayları. Int J Biol Macromol 2018;120(Pt A):180–8.

[3] Kyu HH, Maddison ER, Henry NJ, Ledesma JR, Wiens KE, Reiner R, et al. Küresel, bölgesel ve ulusal tüberküloz yükü, 1990-2016: küresel hastalık yükü, yaralanmalar ve risk faktörleri 2016 çalışmasından elde edilir. Lancet Infect Dis 2018;18(12):1329–49.

[4] Dünya Sağlık Örgütü (2022). Küresel Tüberküloz Raporu. 〈https://www. DSÖ. int/yayınlar/i/item/9789240061729〉.

[5] Mirzayev F, Viney K, Linh NN, Gonzalez-Angulo L, Gegia M, Jaramillo E, Zignol M, Kasaeva T. İlaca dirençli tüberküloz tedavisine ilişkin Dünya Sağlık Örgütü tavsiyeleri, 2020 güncellemesi. Eur Respir J 2021;57(6):2003300.

[6] Ahmad Khan F, Fox G, Menzies D. İlaca dirençli tüberküloz. New York: Antimikrobiyal Direnç El Kitabı Springer; 2017.s. 263–86.

[7] Mitchison D, Davies G. Tüberkülozun kemoterapisi: geçmiş, bugün ve gelecek. Int J Tube Lung Dis 2012;16(6):724–32.

[8] Gong W, Liang Y, Mi J, Jia Z, Xue Y, Wang J, Wang L, Zhou Y, Sun S, Wu X. Peptid bazlı aşı MP3RT, insanlaştırılmış bir fare modelinde Mycobacterium tuberculosis enfeksiyonuna karşı koruyucu bağışıklığı indükledi . Ön İmmünol 2021;12:1–19.

[9] Lange C, Aaby P, Behr MA, Donald PR, Kaufmann SHE, Netea MG, Mandalakas AM. 100 yıllık Mycobacterium bovis basili Calmette-Guérin. Lancet Infect Dis 2022;22(1):e2–12.

[10] Glaziou P, Floyd K, Raviglione MC. Küresel tüberküloz epidemiyolojisi. Semin Respir Crit Care Med 2018;39(3):271–85.

[11] Ernst JD. Tüberküloz aşı tasarımına meydan okuyan M. tuberculosis bağışıklığı kaçırma mekanizmaları. Hücre Konağı Mikrop 2018;24(1):34–42.

[12] Li X, Chen F, Liu X, Xiao J, Andongma BT, Tang Q, Cao X, Chou SH, Galperin MY, He J. Clp proteaz ve antisens RNA, mikobakteriyel açlık tepkisine aracılık etmek için küresel düzenleyici CarD'yi birlikte düzenler. eLife 2022;11:1–22.

[13] Liu CH, Liu H, Ge B. Tüberkülozda doğuştan gelen bağışıklık: konak savunmasına karşı patojen kaçırma. Hücre Mol İmmünol 2017;14(12):963–75.

[14] Elvang T, Christensen JP, Billeskov R, Hoang TTKT, Holst P, Thomsen AR, Andersen P, Dietrich J. M. tuberculosis Ag85B-TB10.4'e adjuvanlanmış alt birim, adenovektör tarafından desteklenen CD4 ve CD8 T hücre yanıtları veya heterolog prime-boost aşılama. PLoS BİR 2009;4(4):e5139.

[15] Rossjohn J, Gras S, Miles JJ, Turner SJ, Godfrey DI, McCluskey J. Antijen sunan moleküllerin T hücre antijen reseptörü tanıması. Annu Rev Immunol 2015;33:169–200.

For more information:1950477648nn@gmail.com