Mycobacterium Tuberculosis Bölüm 1'e Karşı Rastgele Kimerik Çoklu Epitop Aşısının In Silico Tasarımı

Soyut

Tüberküloz (TB), her yıl yaklaşık 1,5 milyon insanı öldüren küresel bir sağlık tehdididir. Tüberkülozun ana nedensel ajanı olan Mycobacterium tuberculosis'in eradikasyonu, yaygın ilaca dirençli suşların ortaya çıkması nedeniyle giderek daha zorlu hale gelmektedir. Aşılama, konağı patojenlerden korumanın etkili bir yolu olarak kabul edilir, ancak klinik olarak onaylanmış tek TB aşısı olan Bacillus Calmette-Guérin (BCG), yetişkinlerde sınırlı korumaya sahiptir. Çoklu epitoplu aşıların, birkaç aday proteinden epitopları seçici bir şekilde birleştirerek hastalıklara karşı bağışıklığı arttırdığı bulunmuştur.

Tüberküloz, Mycobacterium tuberculosis bakterisinin neden olduğu, esas olarak akciğerleri etkileyen ancak diğer organları da etkileyebilen bulaşıcı bir hastalıktır. Bağışıklık, TB'nin gelişimi ve tedavisinde önemli bir rol oynar.

Yetersiz bağışıklık durumunda, Mycobacterium tuberculosis kolayca insan vücudunu işgal edebilir ve tüberküloza dönüşebilir. Örneğin, belirli hastalıklardan veya tıbbi tedavilerden kaynaklanan zayıflamış bir bağışıklık sistemi, TB enfeksiyonu riskini artırır. Ayrıca yetersiz beslenme, düşük yaşam kalitesi ve aşırı stres gibi faktörler de bağışıklığı zayıflatarak TB gelişimine yol açabilir.

Bu nedenle, sağlığın korunması ve bağışıklığın güçlendirilmesi tüberkülozdan korunmak için çok önemlidir. Bağışıklık, sağlıklı beslenme, düzenli yaşam tarzı, uygun egzersiz ve yeterli uyku ile güçlendirilebilir ve bu da tüberküloz da dahil olmak üzere çeşitli hastalıklara yakalanma riskini etkili bir şekilde azaltabilir.

Bağışıklık, TB meydana geldiğinde tedavi ve iyileşme için de önemlidir. Bağışıklık sistemi ne kadar güçlü olursa, vücut kendisini TB basilinin saldırısına karşı o kadar etkili bir şekilde savunabilir ve hastalıkla savaşmak için yeterli antikor üretebilir. Bu nedenle, yeterli beslenmeyi, uygun egzersizi ve olumlu bir tutumu sürdürmek bağışıklığı artırabilir ve iyileşmeyi hızlandırabilir.

Sonuç olarak, bağışıklık ile TB arasında güçlü bir ilişki vardır. Sağlığı korumak ve bağışıklığı güçlendirmek, tüberkülozu önlemenin ve tedavi etmenin önemli yollarından biridir. Hayata pozitif bakalım, sağlıklı yaşayalım, hastalıklardan uzak duralım. Bu açıdan bakıldığında bağışıklığımızı güçlendirmemiz gerekiyor. Cistanche bağışıklığı önemli ölçüde artırabilir, çünkü et külü polisakkaritler, iki mantar, Huang Li, vb. Gibi çeşitli biyolojik olarak aktif bileşenler içerir. Bu bileşenler bağışıklık sistemini uyarabilir Sistemdeki çeşitli hücre türleri, bağışıklık aktivitelerini artırır.

Cistanche'nin sağlığa faydalarına tıklayın

Bu çalışma, bir immüno-bilişim yaklaşımı kullanarak TB'ye karşı çoklu epitoplu bir aşı tasarlamayı amaçladı. İşlevsel zenginleştirme yoluyla, M. tuberculosis tarafından salgılanan ve patogenez için gerekli olan, hücre dışı boşluğa salgılanan veya her ikisi birden olan sekiz protein belirledik. Daha sonra bu proteinlerin epitoplarını analiz ettik ve interferon indükleyici aktiviteye sahip 16 yardımcı T lenfosit epitopu, 15 sitotoksik T lenfosit epitopu ve 10 lineer B hücre epitopu seçtik ve bunları uygun kullanarak adjuvan ve Pan HLA DR-bağlayıcı epitop (PADRE) ile konjuge ettik. bağlayıcılar.

Ayrıca, bu aşının üçüncül yapısını, Toll-Benzeri Reseptör-4 (TLR4) ile potansiyel etkileşimini ve ortaya çıkarabileceği bağışıklık tepkisini tahmin ettik. Sonuçlar, bu aşının TLR4 için güçlü bir afiniteye sahip olduğunu gösterdi; bu, iyi hümoral ve hücresel bağışıklık elde etmek için CD4 plus ve CD8 plus hücrelerini immün faktörleri salgılamak üzere ve B lenfositlerini immünoglobülinleri salgılamak üzere önemli ölçüde uyarabilir. Genel olarak, bu çoklu epitop proteinin, TB'ye karşı küresel bir aşı görevi görme potansiyeline sahip, kararlı, güvenli, oldukça antijenik ve yüksek derecede immünojenik olduğu tahmin edilmiştir.

1. Giriş

Mycobacterium tuberculosis'in neden olduğu oldukça bulaşıcı bir hastalık olan tüberküloz (TB), Dünya Sağlık Örgütü (WHO) tarafından tek bir enfeksiyöz ajandan kaynaklanan ölümlerin en önemli nedeni olarak sıralanmıştır [1-3]. 2021'de tahmini TB ölümleri ve yeni vaka sayısı sırasıyla 1,6 milyon ve 10,6 milyona ulaştı [4]. Şu anda, TB'nin klinik tedavisi nispeten azdır ve çoğunlukla çoklu antimikrobiyal ilaçların kombinasyonu kullanılmaktadır.
Bu kemoterapi döngüsü çok uzundur, genellikle dokuz ila on iki ay veya hatta daha uzun sürer [5], bu da M. tuberculosis'te ilaca dirençli mutasyon riskini artırır [6,7]. Son yıllarda, çoklu ilaç ve yaygın olarak ilaca dirençli M. tuberculosis'in ortaya çıkması ve artan oranı nedeniyle kemoterapi daha az etkili hale gelmiştir [6]. Tüberküloz gelişimini önlemek, tedavi etmekten daha etkili olabilir. Aşılamanın, konakçıyı patojenik bakterilerden korumanın etkili bir yolu olduğu iyi bilinmektedir [8].

Şu anda, 100 yılı aşkın bir süre önce geliştirilen Bacillus Calmette-Guérin (BCG), klinik olarak onaylanmış tek TB aşısıdır [9]. Ne yazık ki, BCG yalnızca yenidoğanları ve bebekleri korur ve ergenlere ve yetişkinlere karşı büyük ölçüde etkisizdir [2,10], ancak DSÖ 2021'de TB vakalarının yüzde 89'unun yetişkinler olduğunu bildirmektedir [4]. Bu nedenle, özellikle ergenler ve yetişkinler için yeni ve etkili bir anti-TB aşısının geliştirilmesine acil bir ihtiyaç vardır.

TB aşısı geliştirme, mikobakterilerin latent enfeksiyon, kalıcılık ve immün kaçış gibi birçok özelliği nedeniyle karmaşıktır [11-13]. İdeal bir TB aşısı, M. tuberculosis'te bu özelliklerden sorumlu olan proteinleri/yolları hedef alacak ve CD4 plus ve CD8 plus T hücresi aracılı immün yanıtları etkili bir şekilde indükleyebilecek şekilde tasarlanmalıdır [14].

Ayrıca, etkili bir aşı, konağın oldukça polimorfik olan majör histokompatibilite komplekslerini (MHC) de hedeflemelidir [15]. Bu özellikler, aşının çok yönlülüğü için tek bir doğal protein tarafından elde edilemeyeceği açık olan çok yüksek gereksinimler ortaya koymaktadır. Bir seri örtüşen epitoplardan (peptitler) [16] oluşan rekombinant bir protein olan çoklu epitop aşısı, yukarıdaki sorunları ele alabilecek yeni bir aşı adayı türüdür.

Son yıllarda, çoklu epitoplu aşılar, konvansiyonel aşılara göre daha yüksek bağışıklık ve daha düşük alerjenite avantajları nedeniyle çok dikkat çekmiştir [17,18]. Şu anda, Shigella spp. dahil olmak üzere birçok patojenik mikroorganizmaya karşı çoklu epitoplu aşılar tasarlanmıştır. [19], şap hastalığı virüsü [20], Helicobacter pylori [21,22], hepatit B virüsü [23], Toxoplasma gondii [24], Leishmania infantum [25], Nipah virüsü [26], Onchocerca volvulus [27], Pseudomonas aeruginosa [28] ve lökoz virüsü [29].

Özellikle, COVID-19 salgınının ortaya çıkışı bu teknolojinin uygulanmasını güçlendirmiştir [16,30–32]. TB'ye gelince, doğal olarak aktif TB'yi [33-39] ve latent TB'yi [40,41] hedeflemek için çeşitli çoklu epitoplu aşılar tasarlanmıştır. Bunların arasında, üç aşı adayı DNA şeklinde tasarlandı [34,36,40] ve bunlardan ikisi, rekombinant aşılar oluşturmak için protein omurgalarına epitopları dahil etti [34,36].

Yukarıdaki çoklu epitoplu aşıların bazıları için aday proteinlerin rastgele seçildiğine ve bu aşıların popülasyon kapsamının daha fazla araştırma gerektirdiğine dikkat edilmelidir.

Ayrıca, geniş popülasyon kapsamına sahip iki çok epitoplu TB aşısı adayı tasarlandı, bir epitop, patojenik özelliklere sahip immünojenik eksozomlar vezikül proteinlerinden seçildi [39] ve diğeri aday proteinlere odaklanmadı, ancak doğrudan yüksek oranda korunmuş ve deneysel olarak doğrulanmış olanı seçti Bağışıklık Epitop Veritabanından (IEDB) [38] epitoplar. Bununla birlikte, bu aday proteinler fonksiyonel zenginleştirmeden yoksundur ve aşı adaylarının interferon- (IFN-) sekresyonunu indükleme yeteneği geliştirilmeyi beklemektedir.

Önceki bir çalışma, epitopların rasyonel optimizasyonunun, MHC bağlama kapasitesi ve epitopun T hücresi reseptörleri ile reaksiyona girme yeteneğinin bir kombinasyonu ile elde edilebileceği sonucuna varmıştır [42]. Ayrıca, sitotoksik T lenfosit (CTL) A1, A2, A3, A24 ve B7 bağlayıcı epitoplara sahip aşıların, ana etnik gruplarda (Siyahlar, Asyalılar, Hispanikler ve Kafkasyalılar) yaklaşık yüzde 100'lük bir kapsama sahip olacağını tahmin ettiler.

Bununla birlikte, şimdiye kadar bir TB aşısı tasarlamak için benzer bir yaklaşım olmamıştır. Bu çalışmada, sekiz fonksiyon açısından zenginleştirilmiş proteinin çeşitli antijenik özelliklerini kullanarak oldukça karışık bir çoklu epitop TB aşısı tasarladık. Kimerik aşı adayı, 15 CTL epitopuna, IFN- -indükleme özelliklerine sahip 16 yardımcı T lenfosit (HTL) epitopuna ve 10 lineer B hücresi epitopuna sahiptir. İmmuno-bilişim analizi, bu aşı adayının "her şeyi kapsayan" olduğunu gösterdi ve bu da onu "Verem Sonu stratejisi"ne ulaşmak için potansiyel bir mihenk taşı haline getirdi.

2. Malzemeler ve yöntem

2.1. Protein seçimi ve dizi alma

TB'ye karşı çoklu epitoplu bir aşı oluşturmak için, önce IEDB veri tabanında [43] saklanan ve MHC sınıf I ve II bağlayıcı epitoplar olarak doğrulanmış olan M. tuberculosis kompleksinin proteinlerini seçtik. M. tuberculosis H37Rv suşundan proteinlerin amino asit sekansları (birincil yapı), UniProt veritabanından elde edilmiştir [44]. Fizikokimyasal özelliklere dayalı prospektif antijenlerin hizalamadan bağımsız tahminleri, protein dizilerinin tekdüze bir ana amino asit vektörüne otomatik ve çapraz kovaryans (ACC) dönüşümü uygulanan VaxiJen 2.0 sunucusundan [45] elde edildi. özellikleri, antijenite eşiği her bakteri proteini için 0.4 olarak ayarlanmıştır [45,46].

Proteinlerin fonksiyonel ek açıklamaları, Database for Annotation, Visualization ve Integrated Discovery (DAVID) 6.8 [47] kullanılarak değerlendirildi. Salgılanan proteinler iki kategori kullanılarak daha da zenginleştirildi: sırasıyla DAVID ve BioCyc [48] veritabanları aracılığıyla hücre dışı alan ve patogenez. Homo sapiens GRCh38.p13'ün proteomu, Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi (NCBI) veri tabanından FASTA formatında indirilmiştir [49]. BLASTp, salgılanan proteinler ve H. sapiens proteinleri arasındaki homolojiyi (E-değeri =1e-5) tahmin etmek için kullanıldı.

2.2. T-hücresi epitop tahmini

Epitopların tahmini ve seçimi, çok epitoplu aşıların yapımında çok önemli adımlardır. MHC I molekülleri kısa peptitleri (9-11 amino asit) bağlar çünkü MHC I moleküllerinin tek bir zincirden oluşan peptit bağlayıcı yarıkları kapalıdır [50]. Serbestçe erişilebilen NetMHCpan-4.1 [51], MHC I bağlanma afiniteleri ve ayrıştırılan ligandların bir kombinasyonuna dayalı olarak yüzde sıraları (yüzde sıra) oluşturmak için NAlign_MA kullanan CTL epitopları tahmini için kullanıldı. .

Bir sorgu dizisinin "yüzde Sıralaması", tahmin puanının, rastgele seçilen bir doğal peptit seti kullanılarak hesaplanan ilgili MHC için tahmin puanlarının dağılımıyla karşılaştırılmasıyla belirlendi. Yüzde sıralaması <0,5 olan epitoplar güçlü bağlayıcılar olarak kabul edilirken, yüzde sıralaması < yüzde 2 olan epitoplar zayıf bağlayıcılar olarak kabul edildi [51].

Sunucuda en fazla 12 süper tip MHC sınıf I epitopu tahmin edilebilse de, yalnızca A1, A2, A3, A24 ve B7'yi kullandık çünkü bu beş süper tip başlıca insan ırklarının yüzde 100'ını kapsıyor [42] . Güçlü bağlayıcılar seçtik ve VaxiJen2.0'ı [45] kullanarak antijenikliklerini tahmin ettik, ardından 3-katlı çapraz doğrulamayı kullanan Uluslararası Epitop Veritabanını (IEDB) [52] kullanarak sınıf I immünojenisiteyi tahmin ettik.

Son olarak, yüzde sıralamasına göre hem antijenik hem de immünojenik olan epitopları düzenledik ve güçlü bir CTL bağlama epitopuna sahip olamayan bir aday protein dışında, her süper tip için üç ve her aday protein için en az bir tane olmak üzere 15 düşük skorlu epitop seçtik. yani antijenik ve immünojenik. Son olarak, her bir CTL epitopu için IC50 değerleri NetMHC-4.0'dan tahmin edildi [53].
Sınıf II MHC molekülleri, antijenik peptitlere bağlanır ve ortaya çıkan kompleks, HTL tarafından tanınabilir. Tipik olarak, antijenik peptitlerin uzunluğu 12 ila 20 amino asit kalıntısı arasında değişir, ancak uzunluk olarak 13 ila 16 kalıntı arasındaki peptitler sıklıkla gözlenir [54].

{{0}}merler, M. tuberculosis için en bol bulunan MHC II epitoplarıydı ve IEDB'de birikti. Sonuç olarak, 15-mer peptidlerinin İnsan Lökosit Antijen-DR (HLA-DR), HLADQ, HLA-DP'ye bağlanmasını tahmin etmek için NetMHCIIpan-4.0 [51,55] kullandık, ve H-2–1 aleli. Tahmin ayrıca, sırasıyla < yüzde 2 ve < yüzde 10'luk bir yüzde sıralaması ile güçlü ve zayıf bağlayıcılar olarak kabul edilen NNAlign_MA'ya dayanıyordu [51].

Ayrıca, bir peptidde IFN- -indükleyen peptidin/epitopun sanal olarak taranmasına izin veren bir destek vektör makinesi hibrit yaklaşımı kullanan IFNepitope sunucusunu [56] kullanarak 15-mer IFN'yi tetikleyen epitopları aday proteinler için tahmin ettik. T-yardımcı hücreleri aktive eden IFN- -uyarılabilir ve uyarılamaz MHC II bağlayıcılarından oluşan kitaplık. Daha sonra, IFN'yi indükleyen epitopların [45] antijenisitesini tahmin ettik ve son olarak, güçlü MHC-II bağlayıcı, IFN'yi indükleyen ve antijenik olan en karışık 16 epitopu seçtik.

Sinyal peptitlerinin, epitop tahmininden önce aday proteinlerden çıkarıldığını not etmek önemlidir. Bu çalışmada, sinyal peptitleri SignalP 5.0 [57] ve TargetP2.0 [58] kullanılarak tarandı.

2.3. Doğrusal B hücresi epitop tahmini

Lineer B-hücre epitopları (16-mers), 0.51 varsayılan eşiğiyle ABCpred [59,60] kullanılarak tahmin edildi. Ayrıca, tahmin sonuçlarının güvenilirliğini artırmak için, doğrusal B-hücresi epitoplarını tahmin etmek için BepiPred 2.0 [61] kullandık. Bu iki yazılımdan elde edilen epitoplar ayrıca VaxiJen2.0 [45] kullanılarak antijenite tahminine tabi tutuldu. Son olarak, her aday protein için seçilen en az bir epitop ile yüksek ABCpred skorları ve antijeniteye dayalı olarak on lineer B hücresi epitopu seçtik.

2.4. Kimerik özelliklere sahip çok epitoplu aşı adayının oluşturulması

Tasarlanan çok epitoplu aşı, bir HBHA (heparin bağlayıcı hemaglutinin) adjuvanı, bir Pan HLA DR bağlayıcı epitop (PADRE), 15 CTL, 16 HTL, 10 lineer B hücresi epitopu ve bir His× 6 etiketi içerir (Şekil 1). 3). Bağlayıcılar, epitopları birleştirmek, bağlantı epitoplarının üretimini önlemek ve kimerik aşılarda bireysel epitopların işlenmesini ve rejenerasyonunu arttırmak için kullanıldı [62].

Bu aşı adayının yapımı için, HBHA adjuvanı (UniProt ID: P9WIP9) N-terminusa yerleştirilmiştir ve bir EAAAK bağlayıcı yoluyla aşağı akış PADRE'ye bağlanmıştır. Ardından, GPGPG bağlayıcıları tarafından birleştirilen HTL epitopları, PADRE'ye bağlandı. Ayrıca, AAY bağlayıcı tarafından birleştirilen CTL epitopları, CTL epitop birimini KK bağlayıcılar kullanılarak bağlanan doğrusal B-hücresi epitoplarına da birleştiren HEYGAEALERAG bağlayıcı aracılığıyla HTL epitoplarına bağlandı. Son olarak, kimerik proteinin C terminaline bir Hisx 6 etiketi iliştirildi.

2.5. Antijenite, alerjenite ve fizikokimyasal özellikler

Çoklu epitop aşısının ve sekiz bileşenli proteinin antijenliği VaxiJen 2.0 sunucusu [45] tarafından tahmin edilirken, bu proteinlerin alerjenliği AllerTOP 2.0 sunucusu [ 63]. AllerTOP 2.0, alerjen sınıflandırması için amino asit E tanımlayıcılarını, protein dizilerinin ACC dönüşümünü ve k-en yakın komşuları (kNN) kullanır.

Yöntem, 5-katlı çapraz doğrulamayla yüzde 85,3 doğruluk elde etti. Bu çoklu epitop aşının yarı ömrü, izoelektrik noktası, instabilite indeksi, alifatik indeksi ve genel hidropatik ortalama (GRAVY) gibi fizikokimyasal özelliklerinin tahmini için ExPASy ProtParam sunucusu [64] kullanıldı.
Ayrıca, çok epitoplu aşı peptidinin çözünürlüğü, TargetDB'den iyi bilinen çözünmeyen proteinler ile hem TargetDB hem de PDB'den [ 66]. 10-Katlamalı çapraz doğrulama kullanılarak değerlendirildiğinde, yüzde 71,0 doğruluk elde etti (ROC eğrisi altındaki alan=0,785).

2.6. Bağışıklık simülasyonu

Aşının immün yanıt profilini ve immünojenisitesini karakterize etmek için, C-ImmSim sunucusu kullanılarak in silico immün simülasyonları yapıldı [67]. C-ImmSim, peptit tahmini için makine öğrenimi tekniklerinden türetilen konuma özgü puanlama matrislerini kullanarak bağışıklık etkileşimlerini tahmin eder.
Aynı anda memelilerde bulunan üç ayrı anatomik bölgeyi temsil eden üç bölmeyi simüle eder: (i) yeni lenfositler ve miyeloid hücreler üretmek için hematopoietik kök hücrelerin simüle edildiği kemik iliği; (ii) naif T hücrelerinin otoimmüniteden kaçınmak için seçildiği timus; ve (iii) lenf düğümleri gibi lenfatik organ.

Aşıyı etkili bir şekilde hazırlamak ve güçlendirmek için [68]'deki yaklaşımı izledik; burada dört hafta arayla iki enjeksiyon uygulandı. Tüm simülasyon parametreleri, zaman adımları 10 ve 94 olarak ayarlanarak (her zaman adımı sekiz saattir) varsayılan değerlere ayarlanmıştır.

2.7. Düzensiz bölge tahmini

Kendinden düzensiz bölgeler (IDR'ler) birçok proteinde bulunur. Düzensiz bölge, düzensiz kalıntıları belirlemek için büyük IDR'ler üzerinde eğitilmiş DISOPRED2 ve diğer iki makine öğrenimi tabanlı modülü kullanan DISOPRED3 [69] kullanılarak tahmin edilmiştir. O zamanlar annoydular

2.8. İkincil ve üçüncül yapı tahmini

Tasarlanan aşının ikincil yapısı, sorgu proteiniyle yakından ilişkili dizileri tanımlamak için ilk olarak PSI-BLAST'ı kullanan PSIPRED 4.0 sunucusu [70] tarafından tahmin edildi. Bu aşının üçüncül yapısı, Iterative Threading Assembly Refinement (I-TASSER) sunucusu [71] kullanılarak tahmin edilmiştir.

ITASSER modellemesinde dört temel adım vardır; a) diş açma şablonu tanımlaması; b) yinelemeli yapı montaj simülasyonu; c) model seçimi ve iyileştirme; ve d) yapı tabanlı işlevsel açıklama [72,73].

I-TASSER, ProSA-web [74] kullanılarak taranan beş model oluşturdu ve en düşük Z skoruna sahip model, daha fazla iyileştirme için seçildi. ProSA-web, PDB'de saklanan deneysel olarak doğrulanmış yapılardan elde edilen model puanlarını karşılaştırır. Yerel bir kalite puanı grafiği, modeldeki sorunlu alanların belirlenmesine yardımcı olur ve aynı puanlar, 3B yapının sunumunda bir renk kodu kullanılarak temsil edilir. Bu, erken yapısal belirleme ve iyileştirme için yararlıdır.

2.9. Üçüncül yapı iyileştirme

ITASSER tarafından elde edilen aşı adayının "kaba" 3B modeli, iki sunucu kullanılarak iki adımda rafine edildi; önce ModRefiner [75] ve ardından GalaxyRefine [76] ile. ModRefiner, iki adımlı atomik düzeyde enerji minimizasyonuyla elde edilen proteinlerin yapısını ve rafine edilmesini etkilemek için C izlerini kullanır.

İlk olarak, ana zinciri oluşturmak için C izleri kullanıldı, ardından fizik ve bilgiye dayalı bileşik kuvvet alanları kullanılarak yan zincir rotamerleri ve omurga atomları geliştirildi. GalaxyRefine, güvenilir çekirdek yapılar oluşturmak için birden fazla şablon kullanırken, optimizasyona dayalı modelleme ile güvenilmez döngüler veya terminaller oluşturulmuştur.

2.10. Üçüncül yapı doğrulama

Aşı adayının rafine edilmiş yapısı, PROCHECK [77] ve MolProbity [78] veri tabanlarından oluşturulan Ramachandran çizimleri ile doğrulanmıştır. Ramachandran grafikleri, amino asit kalıntılarını iki bölgeye ayırarak proteinlerin omurga konformasyonunu değerlendirir: izin verilen ve izin verilmeyen. PROCHECK, protein yapılarının net kalitesini aynı çözünürlükteki rafine yapılarla karşılaştırarak ve ardından daha fazla analiz gerektiren bölgeleri sunarak değerlendirmek için stereokimyadan yararlanır.

Molprobity, yerel ve küresel makromolekül (proteinler ve nükleik asitler) modellerini X-ışını, NMR, hesaplamalı ve kriyoEM kriterlerinin bir karışımıyla doğrular [79]. Hidrojen yerleşimini ve tüm atom temas analizini optimize etmeye yönelik güç ve hassasiyet, kovalent geometri ve burulma açısı kriterlerinin [80] güncellenmiş bir versiyonunda yaygın olarak kullanılmaktadır.

2.11. Süreksiz B hücresi epitopları

Doğal protein yapısındaki süreksiz B hücresi epitopları, ElliPro [81] kullanılarak tahmin edildi. ElliPro, protein şekline bir elipsoid olarak yaklaşmak için üç algoritma uygular, kalıntı çıkıntı indeksini (PI) hesaplar ve PI değerlerine göre komşu kalıntıları kümeler. ElliPro, epitop kalıntısı için ortalama PI değeri olarak tanımlanan bir skorla her çıktı epitopunu sağlar. 0.9 PI değerine sahip bir elipsoid, içerdiği protein kalıntılarının yüzde 90'ını oluştururken, kalıntıların kalan yüzde 10'u elipsoidin dışında yer alır. Her bir epitop kalıntısı için, PI değeri, mümkün olan en büyük elipsoidin dışında kalan kalıntının kütle merkezinden hesaplanır.

2.12. Kimerik proteinlerin moleküler kenetlenmesi

Tasarlanan aşının (ligand) Toll-Benzeri Reseptör-4 (TLR4) (PDB ID: 3FXI) immün reseptörü ile moleküler kenetlenmesi Patchdock [82] kullanılarak gerçekleştirildi. İlk 10 model daha sonra FireDock [83] kullanılarak rafine edildi. PatchDock, moleküllerin Connolly noktalı yüzey temsilini içbükey, dışbükey ve düz yamalarla değiştirir.

Modeller daha sonra geometrik uyum ve atomik çözülmeye dayalı olarak puanlandı. [82]. FireDock, rijit gövdenin yan zincir biçimlerini ve yönünü optimize eder ve bağlanma enerjisine [83] dayalı olarak 3B rafine edilmiş bir kompleksin çıktısını üretir. Firedock'un küresel enerjiyi temel alan ilk modelini yanaşma kompleksi olarak seçtik. Son olarak, yerleştirme kompleksi içindeki bağlanma enerjisi ve ayrışma içeriği PRODIGY sunucusu [84] kullanılarak tahmin edildi.

2.13. Moleküler dinamik simülasyonu

Hızlı ve serbestçe erişilebilen web sunucusu, dahili koordinatlar normal mod analiz sunucusu (iMODS) [85] kullanılarak proteinler üzerinde moleküler dinamik simülasyonlar yapıldı ve PatchDock-FireDock sunucusundan tutarlı ve optimal yerleştirme sonuçları elde edildi. Dahili koordinatlarda, Normal Mod Analizi (NMA), makromoleküler fonksiyon için kritik olan toplu hareketler üretir. iMODS, farklı çözünürlüklerde neredeyse etkileşimli olarak gerçekleştirilen titreşim analizi, hareket animasyonları ve geçiş yörüngeleri gibi bu modları keşfetmek için mekanizmalar sunar [85].

2.14. Ters çeviri, kodon optimizasyonu ve aşının in silico klonlanması

Aşı adayını Escherichia coli hücrelerinde etkili bir şekilde ifade etmek için cDNA, Java Codon Adaptation Tool (JCAT) [86] kullanılarak kodon optimizasyonu ve ters çeviri yoluyla in silico olarak üretildi.

Optimizasyon, (i) rho-bağımsız transkripsiyonel sonlandırıcılardan kaçınmayı, ii) prokaryotik ribozom bağlama bölgelerinden kaçınmayı, (iii) cDNA'nın eklenmesi için N-terminali ve C-terminali kısıtlama bölgeleri olarak hizmet eden kısıtlama enzimleri Ncol ve XhoI'nin bölünme bölgesinden kaçınmayı içeriyordu. aşı şablonu ve (iv) sahaya yönelik mutagenezin uygulanması için sadece kısmi optimizasyon. Kodon Adaptasyon İndeksi (CAI) ve GC içeriği, His× 6 etiketinden sonra eklenen bir opal durdurma kodonu (TGA) ile cDNA'nın kalitesini tahmin etti. Ardından, kimerik aşı adayının optimize edilmiş DNA fragmanı, SnapGene aracı [87] kullanılarak pET-28a( plus )'nın ters sarmalına entegre edildi.

For more information:1950477648nn@gmail.com