Silico'da İnsan Visseral ve Kutanöz Leishmaniasis'e Karşı Çapraz Bağışıklıktan Yararlanan Yeni Bir Çok Değerlikli Çok Alt Birimli Peptid Aşı Tasarımı: İmmünoinformatik Tabanlı Bir Yaklaşım

Soyut

Bağlam Leishmaniasis, birçok tropikal ve subtropikal ülkede endemik olan 20'den fazla patojenik Leishmania türünün neden olduğu, vektör kaynaklı bir bulaşıcı hastalık grubudur. İlaca dirençli suşların ortaya çıkması, Layşmanya karşıtı ilaçların olumsuz yan etkileri ve önleyici bir aşılama stratejisinin olmayışı, hassas popülasyonu tehdit etmektedir. Son zamanlarda birçok araştırmacı grubu, esas olarak iç organlara veya kutanöz leishmaniasis'e karşı bağışıklığın uyarılmasına odaklanarak aşı geliştirmek için ters aşı bilimi alanından yararlandı.

cistanche tubulosa — Antiinflamatuar

YöntemlerBu mevcut çalışma, UniProt veritabanından deneysel olarak doğrulanmış on iki leishmanial antijenik protein dizisinin alınmasını ve ardından bunların ANTIGENpro ve Vaxijen 2.0 sunucularını kullanarak antijenite profillemesini içermektedir. Aynısı için MHC bağlanma epitopları, hem NetCTL 1.2 hem de SYFPEITHI sunucuları kullanılarak tahmin edilirken, B hücreleri için epitoplar, ABCpred ve BepiPred 2.0 sunucuları kullanılarak hesaplandı. Önemli ölçüde daha yüksek puanlara sahip taranan epitoplar, uygun bağlayıcılar ve doğal adjuvanlarla aşı yapısının tasarlanması için kullanıldı. Sentetik peptidin ikincil ve üçüncül yapıları, sırasıyla koşullu rastgele alanlar, sığ sinir ağları ve yinelemeli yapı birleştirme simülasyonları ile profil-profil iş parçacığı hizalaması ile belirlendi. 3-D aşı modeli, CASP10-testi yapılan ayrıntılandırma ve MolProbity web sunucusu aracılığıyla doğrulandı. En iyi aşı-TLR kompleksini analiz etmek için moleküler yerleştirme ve çok ölçekli normal mod analiz simülasyonu yapıldı. Son olarak, hesaplamalı bağışıklık simülasyonu bulguları umut verici hücresel ve humoral bağışıklık tepkilerini ortaya çıkardı; bu da tasarlanmış kimerik peptidin, iç organlara ve kutanöz leishmaniasis'e karşı potansiyel bir geniş spektrumlu aşı olduğunu ortaya koydu.

erkekler için cistanche faydaları-bağışıklık sistemini güçlendirir

Anahtar Kelimeler Leishmaniasis · Ters aşı bilimi · TLR · Çok epitoplu aşı · Moleküler dinamik simülasyon · Homoloji modelleme

giriiş

Leishmaniasis, dimorfik hücre içi parazitik bir protozoon olan Leishmania cinsinin çeşitli üyelerinin neden olduğu bir grup paraziter hastalıktır. Leishmaniasis, dünya çapında tropik ve subtropikal ülkelerdeki düşük sosyo-ekonomik statüdeki popülasyonların çoğunu etkilemektedir [2]. Vektör kaynaklı bir hastalıktır ve parazitler, enfekte dişi flebotomin tatarcıklarının ısırılmasıyla bulaşır (WHO, 2019). Dünya Sağlık Örgütü'nün son raporlarına göre, yılda 700 000 ila 1 milyon yeni vaka ve yaklaşık 26,000 ila 65 000 ölüm meydana geliyor (WHO, 2019). Doğu Afrika'da visseral leishmaniasis salgınları sıklıkla görülmektedir. Doğu Akdeniz Bölgesi dünya çapında kutanöz leishmaniasis vakalarının %70'ini oluşturmaktadır (WHO, 2019). 2017 yılında DSÖ'ye bildirilen 22.145 yeni vakanın 20.792'si (%94) yedi ülkede meydana gelmiştir: Brezilya, Etiyopya, Hindistan, Kenya, Somali, Güney Sudan ve Sudan (WHO, 2017). Endişe verici senaryo nedeniyle ülkemizde de hastalığın kontrol altına alınmasına ve ortadan kaldırılmasına yönelik tedbirlerin altının çizilmesi gerekiyor. Leishmaniasis'in çeşitli klinik belirtileri vardır ve hastalığın üç ana formu vardır: visseral (aynı zamanda kala-azar olarak da bilinir ve hastalığın en şiddetli formu), kutanöz (en yaygın olanı) ve mukokutanöz (WHO, 2019) . Birkaç kutanöz leishmaniasis (CL) vakasında kendi kendine iyileşme kanıtı ve bunun sonucunda ortaya çıkan yeniden enfeksiyona karşı bağışıklık, bu süre boyunca leishmaniasis'i kontrol etmek için uygun bir yöntem olarak aşılamanın olası kapsamını ortaya koymaktadır [3]. Ancak bugüne kadar insan leishmaniasisine karşı lisanslı bir aşı mevcut değildir. Her ne kadar birkaç potansiyel aday aşı klinik deneme aşamasına geçmiş olsa da birçoğu hâlâ araştırma ve geliştirme aşamasındadır [4]. Peptit aşılarının üretilmesi bu alanda baskın ve umut verici bir araştırma alanıdır. Bütün canlı veya zayıflatılmış parazitlerin veya bunların alt birim bazlı aşılarının aksine, sentetik peptitlerin, potansiyel olarak zararlı materyallerin bulunmaması, daha düşük antijen karmaşıklığı, iyi stabilite ve düşük ölçek büyütme maliyeti gibi çeşitli avantajları vardır [1, 5]. Yeni aşıların geliştirilmesi immünoloji, moleküler biyoloji ve kimya mühendisliği konularında daha derin anlayışlar gerektirir. Bu nedenle, tüm bu alanlardaki bilim adamları güvenli, etkili aşılar tasarlamak ve üretmek için el ele çalışıyorlar [6]. Leishmaniasis'e karşı ideal bir aşı, uzun süreli bağışıklık ve dengeli bir TH-1 ve TH-2-aracılı bağışıklık tepkisi ortaya çıkarmalıdır [4, 7]. Böyle yeni bir aday aşının tasarlanması için immünoinformatiğe dayalı yaklaşım, kısa bir süre içinde yapısal olarak stabil ve immünojenik çok alt birimli bir peptid aşısının tahmin edilmesi için öncelikli olarak hesaplamalı araçların kullanıldığı daha yeni bir stratejidir. Deneysel hayvan modellerini veya diğer in silico analizlerini içeren önceki immünolojik çalışmalarda, öncelikle hastalığa karşı bağışıklık kazandırmak için gerekli immünojenik özelliklere sahip olduğu bulunan proteinler, mümkün olan en iyi epitop adaylarıydı [1, 8-10]. Araştırılan proteinler arasında LACK (Leishmania ile aktifleştirilen C-kinaz antijeni) proteini, Leishmania türleri arasında yüksek düzeyde korunmuş bir proteindir ve insan leishmaniasis'e karşı geçerli bir aşı adayı olarak kabul edilir [11]. Duyarlı BAL b/c farelerinde bağışıklık tepkisinin önemli bir hedefi olduğu kanıtlanmıştır [12]. KMP-11 (kinetoplastid membran proteini-11) tüm kinetoplastid protozoalarda mevcuttur ve aynı zamanda fare modellerinde IL-10 seviyelerini arttırdığı gösterilen potansiyel bir aşı adayı olarak kabul edilir, bu da onun immünojenik potansiyeline işaret eder [13]. Leishmanolysin veya GP63, parazitin konakçı makrofaj reseptörü ile doğrudan etkileşiminde yer alan bir virülans faktörü olarak öne sürülen bir yüzey proteinazıdır [14]. Membran proteinleri LCR1 ve GP46'nın da IFN-gama üretimini arttırdığı bulunmuştur ve bu nedenle Layşmanya enfeksiyonlarına karşı genel bir aşının geliştirilmesinde yararlı olduğu kabul edilmektedir [5, 15]. Isı şoku proteinleri (HSP'ler), adaptif immünitenin hem MHC-I hem de MHCII yollarını indükleme konusunda oldukça immünojenik olan, yüksek oranda korunmuş moleküllerdir ve enfeksiyöz leishmaniasis'e karşı aşı geliştirilmesinde uygun bir role sahip oldukları düşünülmektedir [16]. Leishmania hidrofilik açillenmiş yüzey proteini-B'nin (HASP-B) yalnızca enfektif parazitlerde eksprese edilmesi, parazit virülansında bir rol olduğunu ve dolayısıyla potansiyel bir aşı adayı olduğunu düşündürmektedir [17]. Kinetoplastid parafagellar çubuk (PFR) proteinleri, sınırlı evrimsel dağılımları, yüksek dereceli organizasyonları ve yüksek immünojeniteleri nedeniyle terapötik ve profilaktik öneme de sahiptir [18]. Benzer şekilde, sistein proteazlar ve proteofosfoglikanlar da memeli konakçılardaki parazitler için temel virülans faktörleri olarak görev yapar ve leishmaniasis için çekici ilaç hedefleridir [19-21]. Ayrıca, beta-tubulin proteini daha önce Leishmania'dan gelen bir T hücresi uyarıcı antijen olarak tanımlanmış olmasına rağmen bir aşı adayı olarak etkinliği henüz denenmemiştir [22]. L. donovani'nin beta-tubulini de visseral leishmaniasis'e karşı potansiyel bir ilaç hedefi olarak kabul edilmektedir [23]. Son olarak, L. braziliensis'ten elde edilen translasyon faktörü proteini eIF5A'nın, başka bir rekombinant protein ile kombinasyon halinde bir aşı olarak uygulandığında hayvanlarda leishmaniasis'e karşı heterolog korumayı indüklediği gösterilmiştir. Aşılanan hayvanlarda parazite özgü sitokinlerin salgılanmasını arttırır. eIF5A proteini aynı zamanda tüm ökaryotlarda da korunmuştur [24]. Daha önce Khatoon ve ark. L. donovani'nin salgı proteinlerini araştırarak visseral leishmaniasis'e (VL) karşı çok alt birimli bir peptit aşısı tasarlamak için immünoinformatik temelli bir yaklaşım tanımladı [6]. Burada parazitin çeşitli bulaşıcı türlerinden çeşitli leishmanial antijenleri seçtik. Aynı zamanda, tüm bu proteinlerin (ya in vitro hayvan çalışmaları yoluyla ya da hesaplamalı araçlar kullanılarak) bir bağışıklık tepkisini başlatarak koruyucu bağışıklığı tetiklediği zaten tanımlanmıştır. Seçilen protein dizileri Leishmania'nın beş patojenik türünden herhangi birine, yani Leishmania major, Leishmania Mexicana, Leishmania donovani, Leishmania chagasi ve Leishmania amazonlarına aitti; bunların arasında L. donovani, visseral leishmaniasis'e (VL) neden olan birincil parazittir. diğerleri öncelikle kutanöz (CL) veya mukokutanöz leishmaniasis'e (MCL) neden olmaktan sorumludur. Farklı Layşmanya türleri arasında bu kadar çeşitli korunmuş ve immünojenik proteinlerin seçilmesinin ardındaki mantık, insanları yaygın olarak etkileyen her iki leishmaniasis formuna (VL ve CL) karşı geniş spektrumlu çapraz bağışıklık kazandıracak genel bir peptid aşısı tasarlamaktı. .

Cistanche otu ne işe yarar?-inflamatuar

Malzemeler ve yöntemler

Leishmania antijenik protein dizilerinin seçimi ve geri alınması

On iki Leishmania'ya özgü antijenik proteinin tam amino asit dizileri, Uniprot (Universal Protein Resource) veritabanından (https://www.unipr ot.org/uniprot/) FASTA formatında (21.{{16}'de erişildi) alınmıştır. }3.2022). Daha önce belirtildiği gibi, hayvan modellerini veya hesaplamalı in silico tahmin yöntemlerini içeren önceki immünolojik çalışmalarda da görüldüğü gibi, tüm bu proteinlerin immünojenik, yüksek oranda korunmuş ve potansiyel aşı adayları olduğu rapor edildi. Seçilen proteinlerin antijenitesi, bir girdi protein dizisinin antijenitesini, on katıyla doğrulanan SVM bazlı iki aşamalı sınıflandırıcıdan yararlanarak hesaplayan ANTIGENpro sunucusu (http://cratch.proteomics.ics.uci.edu/) kullanılarak hesaplandı. çapraz doğrulama yaklaşımı [25]. Proteinler daha sonra klasik salgılayıcı ve salgılayıcı olmayan (transmembran) proteinler arasında ayrım yapmak amacıyla SignalP 4.1 sunucusu (SignalP—4.1— Services—DTU Health Tech) kullanılarak sinyal peptidi analizine tabi tutuldu. Bu yöntem, bölünme bölgelerinin tahminini ve çeşitli yapay sinir ağlarının bir kombinasyonuna dayanan bir sinyal peptidi/sinyal olmayan peptid tahminini içerir [26]. Daha sonra, tüm proteinler için lokalizasyon tahminleri, yalnızca sekans bilgisinden yararlanarak protein hücre içi lokalizasyonunu tahmin etmek için derin sinir ağlarını kullanan ve iyi bir doğruluk elde eden, şablonsuz bir algoritma olan DeepLoc (DeepLoc—1.0—Services—DTU Health Tech) kullanılarak gerçekleştirildi [27]. SignalP 4.1 sunucusundan elde edilen tüm fonksiyonel protein dizileri daha sonra B ve T hücresi reseptörleri tarafından tanınacak antijenik belirleyicilerin (epitoplar) varlığının tahmin edilmesine tabi tutuldu. Bu, tasarlanan aşı yapısının yalnızca immün-baskın T hücresi ve B hücresi epitoplarını içermesini ve dolayısıyla immün mekanizmaların hem humoral hem de hücre aracılı yollarını içeren etkili bir immün tepkisini yönlendirebilmesini sağlamak için yapıldı.

Sitotoksik T lenfosit (CTL) epitop tahmini

Sitotoksik T lenfosit (CTL) epitopunun tahmini, ideal bir peptid tasarlamanın önemli bir yönüdür [28]. Seçilen tüm proteinler için CTL epitoplarını tahmin etmek amacıyla NetCTL1.2 (https://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL) adlı serbestçe erişilebilen bir web sunucusu kullanıldı. Yöntem, peptid MHC sınıf I bağlanmasının, proteazomal C terminal bölünmesinin ve TAP taşıma etkinliğinin [29] öngörüsünü birleştirir; bunların tümü bir CTL bağlayıcı epitop dizisinin sahip olması gereken temel özelliklerdir. Sunucu, mevcut çalışma için yalnızca A1 süper tipinin kullanıldığı 12 MHC sınıf I süper tipiyle sınırlı CTL epitoplarının tahminlerine izin verir. MHC sınıf I bağlanması ve proteazomal bölünme, yapay sinir ağları kullanılarak gerçekleştirilir. TAP taşıma verimliliği bir ağırlık matrisi kullanılarak tahmin edilir [29]. Daha yüksek bağlanma puanlarına sahip diziler, güçlü CTL epitopları olarak kabul edilir. NetCTL 1.2'ye ek olarak, halka açık başka bir web sunucusu tabanlı yaklaşım olan SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm), CTL epitoplarının tahmini için de kullanıldı. seçilen tüm Leishmania proteinleri. Tahmin, yayınlanmış motiflere dayanmaktadır ve çapa ve yardımcı çapa pozisyonlarındaki amino asitleri ve diğer sık ​​görülen amino asitleri dikkate almaktadır [30]. Bu sunucuda sağlanan MHC türleri listesinden tahmin için HLA-A*01, HLA-A*02:01 ve HLA-A*03 seçildi. Epitop araması, NetCTL 1.2 sunucusu tarafından verilen sonuçlarla tekdüze karşılaştırma amacıyla isimsiz diziler için belirlendi. Nihai aşı yapısı için yalnızca hem NetCTL 1.2 hem de SYFPEITHI sunucuları tarafından uyumlu daha yüksek puanlarla tahmin edilen her proteinden (varsa) ortak epitoplar seçildi.

Yardımcı T lenfosit (HTL) epitop tahmini

Yardımcı T lenfositleri, her türlü adaptif bağışıklık tepkisinde gerekli olduklarından en önemli bağışıklık hücreleridir. Bu nedenle, HTL epitoplarının (esas olarak Th-1 tipi) tahmini, etkili bir peptit aşısının tasarlanması için temel bir unsur haline gelir. Mevcut çalışmada, 15-mer HTL tahmini için IEDB (İmmuno Epitope Datan base and Analysis) sunucusundaki (http://tools.iedb.org/mhcii/) MHC-II bağlanma analiz aracı kullanıldı. HLA-DRB1*01:01, HLADRB1*01:02 ve HLA-DRB1*01:03 olmak üzere üç insan alelinden oluşan bir set için epitoplar. Aşı insan leishmaniasis'e karşı tasarlandığından epitopların MHC-II bağlanma afinitesinin daha gerçekçi tahmini için insan HLA alelleri seçildi. Tahmin edilen çıktı, kombinatoryal kütüphane ve SMM hizalaması için IC50nM birimlerinde verilmiştir. Bu nedenle, daha düşük bir sayı daha yüksek afiniteyi gösterir. Düşük ayarlanmış sıralamanın uygun MHC-II bağlayıcıların göstergesi olduğu ve dolayısıyla güçlü HTL epitopları olarak tanımlanabileceği bu yaklaşımda IEDB tarafından önerilen tahmin yöntemi kullanıldı.

Sitokin indükleyen HT epitoplarının tanımlanması ve seçimi

Sitokinler, bağışıklık sisteminin düzgün çalışması için büyük öneme sahiptir. IL-2, IL-4, IL-6 ve interferon gibi bir dizi sitokin, hem CTL aracılı hem de humoral bağışıklık yanıtlarını indükleyebilir [31]. Bu nedenle, sitokin üretimini tetikleyebilen HTL epitopları, immün profilaktik bir aşının tasarlanması için tercih edilir. Bu görüşle, sitokin indükleme yeteneklerine sahip HTL epitoplarının tanımlanması için IFNepitope sunucusu (http://crdd.osdd.net/raghava/ ifnepitope/) kullanıldı. IFNepitope, CD4+ T hücrelerinden salınan IFN-gamayı indükleyebilen protein dizilerinden peptitleri tahmin etmeyi amaçlayan çevrimiçi bir tahmin sunucusudur. Web sunucusu, IFN-gamayı indükleyen ve indüklemeyen MHC sınıf II bağlayıcıları içeren bir veri seti temelinde geliştirilmiştir [32]. Daha yüksek MHC-II bağlanma afinitelerine (daha düşük ayarlanmış sıralara) sahip IEDB sunucusu tarafından tahmin edilen HTL epitopları, IFNepitope sunucusu tarafından sitokin üretme yeteneklerini kontrol etmek için girdi olarak sağlandı. Bu şekilde tanımlanan epitoplar daha sonra IL4pred sunucusu (IFNepitope(iiitd.edu.in) ve ayrıca IL10Pred sunucusu (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/il10pred/predict3) tarafından bir sonraki analiz düzeyine tabi tutuldu. Seçilen HTL epitoplarının sırasıyla IL-4 ve IL-10 salgılanmasını da tetiklemesini sağlamak için .php).Ayrıca amino asit kalıntılarının konumsal korunmasını ve amino asit bileşimini de dikkate alırlar. daha doğru tahmin için peptitler [33, 34] Üç sunucunun tümü tarafından pozitif olduğu tahmin edilen MHC-II bağlayıcı HTL epitopları, nihai aşı yapısına dahil edilmek üzere seçildi. Bu strateji, aşının etkinliğini arttırmak için benimsendi çünkü aşının etkinliğini tetikleyebilir çok çeşitli sitokinleri (IFN-gamma, IL-4 ve IL-10) içeren, hızlandırılmış ve uzun süreli bağışıklığa yol açan yoğun bir yanıt.

Epitop koruma analizi

Epitope conservation analysis becomes essential to check whether the chosen epitope(s) is conserved across different species of Leishmania proteins. Designing a subunit vaccine consisting of conserved epitopes offers a promising scope for broad-spectrum protective immunity against leishmaniasis. Conservation analysis for each of the selected CTL and HTL epitopes was done by using the IEDB "Epitope Conservation Analysis" tool available within the IEDB portal (http://tools.iedb.org/conservancy/). This tool calculates the degree of conservation of the target epitope (e) within a set of homologous protein sequences (P) as the fraction of {p} that matched the aligned e above the chosen identity level while considering that the target epitope is sequential [35]. Firstly, the corresponding source proteins from which the CTL and HTL epitopes were finally selected were subjected to a BLAST search, for which we used the Uniprot BLAST tool (https://www.uniprot.org/blast/). From the BLAST result, the aligned protein sequences (belonging to the genus Leishmania) that showed significantly high similarity with the query sequence (>40%) were selected. Such sequences were compiled to constitute an epitope-specific dataset, and the same was provided as the input set of proteins (P) to be used for conservation analysis by the tool. Next, the sequences for selected CTL and HTL epitopes were screened individually against their respective datasets that revealed the relative conservation of the epitopes across a set of related Leishmania proteins. The threshold identity level was set at>%100 (varsayılan).

Çok epitoplu aşı dizisinin tasarlanması

İmmünoinformatik analize dayanarak, seçilen CTL ve HTL epitop dizilerinin dahil edilmesiyle alt birim aşının birincil dizisi oluşturuldu. Bu epitoplar sırasıyla AAY ve GPGPG bağlayıcıları ile birbirine bağlanmıştır [28, 31]. Bağlayıcılar, aşı yapısının verimli çalışması için gerekli olan bireysel epitopların uygun şekilde ayrılması için eklenir [28, 36]. İkinci olarak, bağışıklık tepkisini artırmak için bir alt birim aşıya uygun bir adjuvanın eklenmesi çok önemlidir [31]. Uygun bir adjuvanın seçimi, insanlar üzerinde denenecek aşıların tasarlanmasında çok önemlidir. Çeşitli bağışıklık hücreleri tarafından üretilen IL-12, leishmaniasis'e karşı hücre aracılı immünitenin geliştirilmesinde esastır ve IL-12'nin leishmaniasis'e karşı aşılarda bir adjuvan olarak potansiyeli fare modellerinde rapor edilmiştir [3, 37, 38]. Bu IL-12, aşının tasarlanması için bir adjuvan olarak seçildi ve bunun dizisi, EAAK bağlayıcı kullanılarak aşı yapısının N terminaline dahil edildi [28, 31]. İnsan IL-12 alfa zincirinin dizisi Uniprot veritabanından (www.uniprot.org; Erişim No. P29459) alındı. Son olarak, N terminalinden C terminaline hareket eden bir dizide adjuvan, bağlayıcı, CTL epitopları ve HTL epitoplarına (intra-epitopik AAY ve GPGPG bağlayıcıları ile) sahip olan peptit aşı yapısı elde edildi.

Konformasyonel ve doğrusal B hücresi epitop tahmini

Humoral bağışıklık, aktifleştirilmiş B hücreleri tarafından spesifik antikorların sentezini ve salgılanmasını içerir; bu, B lenfositlerinin yüzeyinde bulunan B hücresi reseptörleri tarafından tanınan antijenik belirleyicilerin varlığını gerektirir. İdeal bir bağışıklık koruyucu peptit aşısının, B hücreleriyle etkileşime girebilmesi ve dolayısıyla onları uyarabilmesi için bu tür bileşenlere sahip olması gerekir. Bu nedenle, tasarlanan aşının birincil dizisindeki B hücresi epitoplarının kesin tahmini için ABCpred ve BepiPred 2.0 adlı iki sunucu uygulandı. ABCpred sunucusu (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/ abcpred/ABC_submission.html), belirli bir antijen dizisindeki B hücresi epitoplarını aşağıdakileri kullanarak tahmin eden yapay sinir ağı (YSA) tabanlı bir yaklaşımdır: sabit uzunluk parametreleri. Bu yöntemde kullanılan eğitim veri seti, B hücresi epitop veri tabanından (BCIPEP) B hücresi epitoplarını içerir. Sunucu, tekrarlayan bir sinir ağı kullanarak epitopları %65,93 doğrulukla tahmin edebilmektedir [39]. Nihai aşı yapısının birincil dizisi, düz formatta girdi olarak sağlandı ve 16 amino asit kalıntısı pencere uzunluğu ile 0.51 eşik değerini içeren ABCpred sunucusu varsayılan parametreleri kullanıldı. Tahmini. Öte yandan BepiPred 2.0 sunucusu (BepiPred—2.0—Services—DTU Health Tech), epitoplar üzerinde eğitilmiş rastgele bir orman algoritması tarafından bir giriş dizisinden sıralı B hücresi epitoplarını tahmin eder ve epitop olmayan amino asitler kristal yapılardan belirlenir ve ardından sıralı bir tahmin düzeltmesi yapılır [40]. Aşının birincil dizisi girdi olarak FASTA formatında sağlandı. B hücresi epitoplarını iki farklı algoritmaya dayalı olarak tahmin eden iki farklı sunucunun uygulanması, tahmini daha gerçekçi hale getirir. B hücresi reseptörü ve antikorlar tarafından tanınan antijenik determinantların çoğu süreksizdir; yani bunlar, immünojenin birincil yapısında uzak bir yerde bulunan ancak proteinin katlanması sırasında birbirine bitişik hale getirilen amino asit kalıntılarını içerirler [41]. Aşının doğrulanmış üçüncül yapısındaki bu tür süreksiz B hücresi epitoplarının tahmini, IEDB portalına dahil edilen ElliPro sunucusu (http://tools.iedb.org/ellip ro/) kullanılarak gerçekleştirildi. ElliPro, değiştirilmiş Thronton yöntemini uygulayan ve C atomları yerine her bir kalıntının kütle merkezini hesaba katan, serbestçe erişilebilen bir web aracıdır. Bunu yapmak, epitopların her birini, epitop kalıntıları üzerinden ortalaması alınan PI (çıkıntı indeksi) olarak tanımlanan atanmış bir puanla ilişkilendirir. Süreksiz epitoplar ilgili PI değerlerine göre belirlenir ve kalıntının kütle merkezleri (R) arasındaki mesafeye göre kümelenir. R'nin daha büyük değerleri, tahmin edilen daha anlamlı süreksiz epitoplarla ilişkilidir [42]. Aynı zamanda giriş protein modelindeki doğrusal B hücresi epitopları da ElliPro kullanılarak tahmin edilebilir ve görselleştirilebilir. Aşının rafine 3 boyutlu modelinde hem doğrusal hem de süreksiz B hücresi epitoplarının tespiti, başarılı bir aşı tasarlama stratejisi sağlar.

Aşı yapısının antijenitesi, alerjenitesi ve toksisitesinin profilinin çıkarılması

Antijenite, immün profilaktik bir aşı için temel bir kriterdir. Tasarlanan aşı yapısının B ve T hücresi reseptörleri ile etkileşime girerek uzun süreli bir bağışıklık tepkisi ortaya çıkarmasını sağlamak için bunun antijenitesi ANTIGENpro ve VaxiJen 2.0 sunucuları kullanılarak değerlendirildi. ANTIGENpro (http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/) sunucusu, yalnızca protein mikrodizi veri kümeleri kullanılarak eğitildiğinde bilinen koruyucu antijenlerin %82'sini doğru şekilde sınıflandırır. Birleştirilmiş veri setinin doğruluğunun, antijenik peptitlerin önemli ölçüde daha iyi tanınmasına olanak tanıyan on kat çapraz doğrulama deneyleriyle %76 olduğu tahmin edilmektedir. SVM tabanlı ikinci aşama sınıflandırıcıyı da içeren iki aşamalı bir mimari üzerinde çalışır. Yeni bir girdi protein dizisi için, ikinci aşama SVM öngörücüsü tarafından hesaplanan olasılık, nihai ANTIGENpro tahmin puanıdır [25]. VaxiJen2.0 (http://www.dog-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html), bir protein dizisinin antijenitesini, hizalama gerektirmeyen bir yaklaşımla değerlendiren, kamuya açık başka bir web sunucusudur. protein dizilerinin temel amino asit özelliklerine sahip tek biçimli vektörlere otomatik çapraz kovaryans (ACC) dönüşümüne dayanır ve dizi hizalamasına atıfta bulunmaksızın yalnızca proteinin çeşitli fizikokimyasal özelliklerine dayalı olarak antijen sınıflandırmasına izin verir [43]. İkinci olarak, aşı yapısının bir bireyde alerjik yanıtı tetikleme olasılığını ortadan kaldırmak için AlgPred (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/algpr ed/submission.html) sunucusu kullanıldı. alerjenitesini belirleyin. Sunucu aracı, IgE epitoplarının haritalanması, MEME/MAST motifi, dipeptit kompozisyonuna dayalı SVM yöntemi ve BLAST ARP'ler dahil olmak üzere çeşitli yaklaşımlar sağlar ve bunların tamamı doğru bir tahmin için kullanılır. Daha yüksek tahmin doğruluğu için eşik 0,4 (varsayılan) olarak ayarlandı. Ayrıca, ücretsiz olarak erişilebilen web sunucusu tabanlı bir araç olan AllerTop v.2.{{20}} (https://www.dog-pharmfac.net/AllerTOP/index.html) da uygulandı. aşı yapısının alerjik olmayan yapısını doğrulamak için. Bu yöntem, protein dizilerinin tek tip eşit uzunlukta vektörlere otomatik kovaryans (ACC) dönüşümüne dayanmaktadır. Farklı uzunluklardaki peptitlerin kantitatif yapı-aktivite ilişkileri (QSAR) çalışmalarına uygulanmıştır ve proteinler k-en yakın komşu algoritması ile sınıflandırılmıştır [44]. Varsa toksisite, ToxinPred (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/prote in.php) sunucusu kullanılarak tahmin edildi. Bu tahmin aracı, hem makine öğrenimi tekniğine hem de SwissProt ve TrEMBL'den elde edilen çeşitli toksik ve toksik olmayan peptidlerden oluşan bir veri seti üzerinde eğitilen niceliksel yönteme dayalı olarak çalışır [45]. Toksisite profili, aşının ve insanlar üzerinde denenmesi amaçlanan diğer immünoterapötik peptidlerin güvenliğini değerlendirmek için çok önemlidir. Analiz, motif tabanlı yöntem için 10,0 E değeri eşiğinde ve 0,1 SVM eşiğinde SVM (TrEMBL)+motif tabanlı yaklaşım seçilerek gerçekleştirildi.

Fizikokimyasal özelliklerin değerlendirilmesi

Kimerik bir peptidin fiziksel ve kimyasal özelliklerinin tanımlanması, aşı olarak uygulandığında uygun bir bağışıklık tepkisi oluşturabilmesi gerektiğinden hayati öneme sahiptir. ExPASY (Uzman Protein Analiz Sistemi) portalında (https://web.expasy.org/ program/) bulunan ProtParam sunucusu, birincil aşı yapısının moleküler ağırlık, teorik pI, teorik pI gibi özellikleri içeren çeşitli fizikokimyasal parametrelerini hesaplamak için kullanıldı. kararsızlık indeksi, alifatik indeks, in vivo ve in vitro yarı ömür, hidrofobisitenin genel ortalaması (GRAVY) ve diğerleri.

Aşı peptidinin ikincil yapı tahmini

Tasarlanan aşı yapısının ikincil yapısal elemanları, PSIPRED sunucusu (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/) ve RaptorX özellik sunucusu (http://raptorx.uchicago.edu/StructurePropertyPred/) uygulanarak tahmin edildi. tahmin/) her ikisi de serbestçe erişilebilen çevrimiçi protein yapısı analiz sunucularıdır. Aşı peptidinin birincil dizisi girdi olarak sağlandı. PSIPRED, PSI-BLAST tarafından oluşturulan pozisyona özgü puanlama matrislerine (PSSM) dayalı olarak çalışan iki ileri beslemeli sinir ağından yararlanarak girdi protein dizisinin ikincil yapısını tahmin eder [46]. Aşı yapımıza homolog olan dizilerin PSI-BLAST ile tanımlanmasını ve ardından PSSM'nin oluşturulmasını içerir. PSIPRED 3.2 ve daha yüksek sürümlerin, bu yaklaşımı önemli ölçüde hassas ve doğru kılan sıkı bir üç katlı çapraz doğrulama yöntemiyle değerlendirildiğinde ortalama %81,6'lık bir üçüncü çeyrek puanı elde ettiği bulundu. RaptorX özellikli web sunucusu, ikincil yapı, çözücü erişilebilirliği ve düzensiz bölgeler gibi çeşitli özellikleri aynı anda tahmin etmek için DeepCNF (derin evrişimli sinir alanları) adı verilen çok yeni bir makine öğrenme tekniğini kullanır. DeepCNF, hem koşullu rastgele alanları (CRF'ler) hem de sığ sinir ağlarını birleştiren, karmaşık dizi-yapı ilişkilerini derin bir hiyerarşik mimari ile modelleyen ve bir 3-sınıf ikincil yapı için yaklaşık %84 üçüncü çeyrek doğruluğu elde edebilen entegre bir yaklaşımdır [47] .

Üçüncül yapı tahmini

Nihai aşı peptidinin üçüncül yapısı, çevrimiçi web sunucusu I-TASSER (https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/) kullanılarak tahmin edildi. I-TASSER, profil-profil iş parçacığı hizalamasına (PPA) ve yinelemeli yapı birleştirme simülasyonlarına ve ardından atom düzeyinde yapı iyileştirmesine dayanan hiyerarşik bir protein yapısı modelleme yaklaşımıdır. Üç aşamada çalışır: yapısal şablon tanımlama, yinelemeli yapı derlemesi ve yapıya dayalı işlev açıklaması. Küresel ve yerel doğruluk tahminlerine sahip en üst sıradaki yapı modelleri, tahmin edilen modelin kalitesiyle ilişkilendirilen temsili C puanları ve TM puanlarıyla birlikte döndürülür. I-TASSER programı, protein yapısı ve fonksiyonunun otomatik tahminleri için CASP'de gösterilen en başarılı yöntemlerden birini temsil etmektedir [48, 49].

Aşının üçüncül yapısının iyileştirilmesi

Bir protein yapısının geleneksel hesaplamalı modellemesi tek başına tahmin edilen modelin gerçekliğini ve doğruluğunu garanti etmez, çünkü bu tür modelleme stratejileri büyük ölçüde girdinin (hedefin) mevcut şablon yapılarıyla benzerlik derecesine bağlıdır. Bu nedenle şablona dayalı modelin kalitesinin doğruluğun ötesinde arttırılmasının gerekli olduğu düşünüldü ve bu, tüm protein yapısının iyileştirilmesiyle başarılabilir. Bu bakış açısıyla, en iyi C-puanı ile I-TASSER sunucusundan alınan üç boyutlu model çıktısı, GalaxyRefne sunucusu (http://galaxy.seoklab.org/cgi-bin/submit.cgi?type{) tarafından daha da iyileştirmeye tabi tutuldu. {4}} İNCELEME). Bu, önce protein yan zincirlerinin yeniden oluşturulduğu, ardından yan zincir yeniden paketlenmesinin ve genel yapı gevşemesinin moleküler dinamik simülasyonu ile gerçekleştirildiği, CASP10-test edilmiş bir iyileştirme yaklaşımıdır. Bu, hedef proteinlerin hem yerel hem de küresel üçüncül yapılarının kesin olarak iyileştirilmesine yol açar [50].

Cistanche takviyesinin faydaları—Anti-iltihaplı

Aşının üçüncül yapısının validasyonu

Öngörülen 3D modelde meydana gelebilecek potansiyel hataları tespit etmek için aşının rafine edilmiş üçüncül yapısının doğrulanması gerekiyordu. GalaxyRefne sunucusundan elde edilen rafine model, giriş yapısı olarak a.pdb formatında sağlanmıştır. Ayrıca Ramachandran grafiği, bir protein yapısının doğrulanması için çok önemli bileşenler olarak kabul edilen amino asit yan zincirlerinin phi (ϕ) ve psi (ψ) dihedral açılarının enerjik olarak izin verilen ve izin verilmeyen bölgelerini görselleştirmek için çok yararlı bir başka yaklaşımdır. Bu nedenle, Python tabanlı MolProbity tarzı Phenix doğrulamasına dayalı olarak verilen aşı modeli için bir Ramachandran grafiği oluşturan MolProbity sunucusu [Ana sayfa—MolProbity (duke.edu)] kullanıldı [51]. Ayrıca, modeldeki farklı atomlar arasındaki bağlı olmayan etkileşimlerin istatistiklerini analiz eden ve hata fonksiyonunun değerini bir {{'ye karşı çizen ERRAT sunucusunu [SAVESv6.0—Yapı Doğrulama Sunucusu (UCLA.edu)] kullandık. 6}}kayma kalıntısı [52]. Bu amaçla standart ProSA programını temel alan etkileşimli web tabanlı bir platform olan ProSA web sunucusu (https://prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php) kullanıldı [53]. Bu adım, modellenen yapının daha karmaşık ve kesin bir şekilde doğrulanmasını sağlamak için gerçekleştirildi.

Aşı peptidinin disülfür mühendisliği

Disülfür bağları, konformasyonel entropiyi azaltarak ve ayrıca denatüre durumun serbest enerjisini artırarak protein stabilitesine katkıda bulunur. Yeni disülfit bağlarının tanıtılması, doğal, katlanmış proteinlerin termostabilitesini geliştirmek için kritik bir biyoteknolojik araç olarak kabul edildi. Disülfür bağlantıları ekleyerek tasarlanan aşının genel yapısal stabilitesini arttırmak için Disülfid by Design 2 (DbD 2) v 2.12 sunucusu kullanıldı. Bu yöntem doğal geometriyi kullanır ve her potansiyel disülfür için bir enerji değeri hesaplar, böylece aday disülfür bağlarını sıralamak için bir araç sağlar. Maksimum stabilite sağlayan disülfit bağları yüksek chi3 değeri, bağ enerjisi ve B faktörüne sahip adaylardır [54]. Peptitin esnek bölgeleri, daha önce bahsedilen parametrelere dayalı olarak seçildi ve karşılık gelen stabilize edici mutasyonlar, seçilen kalıntı çiftleri arasında disülfid bağları oluşturularak yaratıldı.

Aşı yapısının immün reseptörlerle moleküler kenetlenmesi (İnsan TLR'leri‑2, 4, 5, 8 ve fare TLR‑9)

Ücret benzeri reseptörler (TLR), patojenle ilişkili moleküler modelleri (PAMP'ler) tanıyan ve enfeksiyonlara karşı doğuştan gelen bağışıklık tepkilerini uyandıran hücresel bağışıklık tepkilerinin ana özellikleridir. TLR-2'nin Leishmania bileşenleriyle doğrudan aktivasyonu daha sonra rapor edildi [55]. İlgili diğer deneysel çalışmalarda, TLR-4'nin yokluğu, parazitik büyümenin artmasına ve L. major enfeksiyonlarının neden olduğu kutanöz lezyonların iyileşmesinin gecikmesine neden olmuştur; bu da TLR-4'nin Layşmanya'ya karşı bağışıklığın uyarılmasında makul rolünü göstermektedir [56 ] Öte yandan TLR-2, 4 ve 9'un, L. braziliensis ve L. amazonensis'in neden olduğu CL'nin immünopatolojik spektrumunda yer aldığı bulunmuştur [57]. TLR-9 aynı zamanda insanlarda VL'nin patogenezinde dendritik hücrelerin aktivasyonunda da önemli bir oyuncu olarak değerlendirilmiştir [58]. Bu alanda yürütülen çalışmaların çoğunda Leishmania'dan türetilmiş bileşenlerden bazılarının TLR-2, 4 ve 9'u etkinleştirdiği gösterilmiştir. Bu gözlemler, çeşitli TLR'lerin Leishmania'ya karşı koruyucu bağışıklığın tetiklenmesinde rol oynadığını vurgulamaktadır. Bu nedenle TLR'ler ile tasarlanan aşı yapısı arasındaki etkileşimin Layşmanya enfeksiyonlarına karşı etkili bağışıklık sağlamak için gerekli olduğu düşünülmüştür. Bu, PatchDock sunucusunu [PatchDock Sunucusu (tau.ac.il) kullanarak çoklu epitopik aşı peptidinin insan TLR'leri-2, 4, 5, 8 ve fare TLR'si-9 ile moleküler kenetlenmesi gerçekleştirilerek kontrol edildi. )]. PatchDock algoritmasının üç ana aşaması vardır: moleküler şekil gösterimi, yüzey yama eşleştirmesi ve filtreleme ve puanlama. Esas olarak reseptör ve ligand arasındaki moleküler şekil tamamlayıcılığı üzerinde çalışan geometri tabanlı bir moleküler yerleştirme algoritmasıdır. Tamamlayıcı yamalar eşleştirilir ve aday dönüşümler oluşturulur. Bu dönüşümlerin her biri, hem atomik desolvasyon enerjisini hem de geometrik ft'yi [59, 60] dikkate alan bir puanlama fonksiyonu atanarak daha da sıralanır. Çalışmamızda insan TLR-2 (PDB id: 6NIG), TLR-4 (PDB id: 4G8A), TLR-5 (PDB id: 3J0A), ve TLR-8 (PDB id: 4QC0) ve fare TLR-9 (PDB id: 3WPF) reseptörler olarak seçildi ve bunların ayrı PDB dosyaları Protein DataBank'ten alındı ​​(www .rcsb.org). Aşı peptidinin rafine edilmiş 3 boyutlu modeli, tüm yerleştirme simülasyonları için ligand olarak kullanıldı. PatchDock sunucusu varsayılan parametrelere ayarlandı (kümeleme RMSD: 4.0). Olası bir bağ rotasyon algoritmasına dayalı olarak Cluspro sunucusunu kullanarak en iyi yerleştirme modelini daha da analiz ettik ve bağlar PyMOL yazılımı kullanılarak değerlendirildi [61].

Aşı proteininin ekspresyonu için kodon optimizasyonu, mRNA yapısı tahmini ve in silico klonlama

Konakçı tarafından bir kodonun kullanımı, nihai aşı yapısı için orijinal sekansların çıkarıldığı yerli konağınkinden önemli ölçüde farklı olduğunda, konakçı organizmada yabancı genlerin maksimum ekspresyonunu elde etmek için kodonun optimizasyonu gereklidir. (http://www.jcat.de/) adresinde halka açık olan JCat (Java Codon Adaptasyon Aracı), girdi olarak nihai aşı yapısının birincil dizisini sağlayarak ters çeviri ve kodon optimizasyonu için kullanıldı. Kodon kullanımı, en fazla sekanslanan prokaryotik organizma olan E. coli K12'ye göre optimize edilmiştir [6]. Araç tarafından sağlanan üç ek seçenek, rho'dan bağımsız transkripsiyon sonlandırıcılarını, prokaryotik ribozom bağlanma bölgelerini ve istenmeyen kısıtlama bölünme bölgelerini önlemek için seçildi. JCat aracı tarafından hesaplanan kodon adaptasyon indeksi (CAI) ve GC içeriği, optimizasyonun ne kadar iyi olduğunu gösterir. Daha iyi optimizasyon, aşı proteininin daha yüksek ekspresyonunu sağlar. Ayrıca XhoI ve NdeI enzimlerine yönelik kısıtlama bölgeleri, klonlamayı kolaylaştırmak için JCat aracı tarafından sağlanan optimize edilmiş cDNA dizisine dahil edildi. Değiştirilen sekans (kısıtlama bölgeleriyle birlikte) daha sonra SnapGene aracının kısıtlama klonlama modülü kullanılarak E. coli pET 28-a(+) plazmit vektörüne yerleştirildi [6, 31, 62, 63]. SnapGene yazılımı web üzerinde (https://www.snapgene.com/) mevcuttur. Ayrıca, mRNA'nın kodladığı ikincil yapının tahmini için mfold web sunucusunu (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Foldi ng-Form) da kullandık. kimerik peptidin genleri. Giriş olarak JCat aracından elde edilen ters çevrilmiş optimize edilmiş dizi sağlandı. Mfold programı, herhangi bir belirli baz çiftini içeren katlanmalar için minimum serbest enerjiyi, ∆ G'yi ve minimum serbest enerjileri tahmin eden bir çekirdek algoritmaya dayanmaktadır. Katlanma enerjilerinin doğru tahmini için çeşitli katlanma kısıtlamaları da uygulanır. RNA katlanması için katlanma enerjisi 37 derecede sabitlenirken iyonik koşullar [Na+]=1 M ve [Mg++]=0'de sabitlenir [64].

C‑immsim‑tabanlı bağışıklık simülasyonu

C-immsim (https://kraken.iac.rm.cnr.it/C-IMMSIM/index.php?page=1), aracı tabanlı sınıfı kullanan sunucu tabanlı bir bağışıklık yanıtı tahmin aracıdır ve tahmini sinir ağlarına dayanıyor. Hem humoral hem de hücre aracılı bağışıklık tepkilerini tahmin edebilir. C-immsim, aktif, dinlenme ve hafıza hücrelerinin ve bunların ömrünün tahminini karakterize etmek için Celda Seiden modelini, bit dizisi poliklonal kafes modelini ve Simpson indeksini kullanır. İnflamatuar yanıtları değerlendirmek için belirli bir reaksiyonun sitokin profilini tahmin etmeye yardımcı olur [65].

Cistanche özü tozu

Moleküler dinamik simülasyon

Moleküler dinamik simülasyon, iMOD (iMod Sunucusu ana sayfa (csic.es) sunucusu) kullanılarak önerilen aşı ile en iyi kompleksimiz olan TLR'nin stabilitesini değerlendirmek için gerçekleştirildi. Bu web tabanlı sunucu, geliştirilmiş normal mod analizini (NMA) kullanır. Biyomoleküllerin protein esnekliği ve stabilitesi gibi çeşitli dinamik özelliklerinin atom içi kuvvet alanı aracılığıyla karakterizasyonu için Bu mevcut çalışmada ana zincir deformasyonlarını, B faktörünü, özdeğerleri, kovaryans faktörünü ve elastik ağ modelini analiz ettik. in silico yaklaşımlarla elde edilen protein-protein komplekslerinin değerlendirilmesi için standart NMA parametreleri olarak kullanılır [66-69].

Sonuçlar

Leishmania antijenik protein dizilerinin seçimi ve geri alınması

The amino acid sequences of twelve Leishmania proteins were retrieved from the Uniprot database in FASTA format and subjected to further analysis for the purpose of designing a multi-subunit peptide vaccine against leishmaniasis. These proteins were selected based on previous studies that reported them as potential vaccine candidates as evaluated in experimental animal models or in silico prediction tools. Antigenicity analysis by the ANTIGENpro server showed all the chosen proteins as potential antigens with varying degrees of antigenicity, keeping with the information obtained from literature mining. However, ten among the twelve proteins were presented with relatively higher prediction scores (>0.51, aşı tasarımı açısından daha yüksek potansiyellerini yansıtıyor (Tablo 1). Proteinler, SignalP 1.4 sunucusu tarafından sinyal peptidi bölünme bölgelerinin tahminine dayalı olarak salgılayıcı ve salgılayıcı olmayan olarak ayırt edildi. Seçilen Leishmania proteinlerinden ikisi yani. L. mexicana sistein proteinaz A'nın (Uniprot kimliği: P25775) ve L. amazoensis yüzey glikoproteini GP-46/M2'nin (Uniprot kimliği: P21978) sinyal peptidleri içerdiği bulundu ve dolayısıyla salgı proteinleri olarak tahmin edildi. On Layşmanya antijeninin geri kalanının, salgılayıcı olmayan doğasını gösteren herhangi bir sinyal peptidine sahip olduğu bulunamadı. Lokalizasyon analizi, L. mexicana'nın protein sistein proteinaz A'sının (Uniprot kimliği: P25775) lizozom/vakuolde lokalize olacağını, L. mexicana'nın leishmanolysin C1 proteinleri ve proteofosfoglikanının (sırasıyla Uniprot kimlikleri: P43150 ve Q9TW13) membran proteinleri olacağını öngördü , LACK koruyucu antijeninin L. donovani'nin (Uniprot id: Q9BIJ5) çekirdeğinde olması ve L. major'un (Uniprot id: P12076) ısı şoku 70 ile ilgili protein 1'inin mitokondride lokalize olması. Diğer tüm proteinlerin sitoplazmik olduğu tahmin edildi (Tablo 1). Buna ek olarak insan IL-12'nin alfa zincirinin amino asit dizisi de nihai aşı yapısında bir adjuvan olarak kullanılmak üzere Uniprot veri tabanından (Uniprot id: P29459) elde edildi.

CTL ve HTL epitoplarının tahmini

Araştırılan tüm proteinlerden toplam 59 ortak amerik olmayan CTL epitopu NetCTL 1.2 ve SYFPEITHI sunucuları tarafından ortaklaşa tanımlandı. Tahmin edilen CTL epitoplarının her birine, ilgili sunucular tarafından hesaplanan belirli bir puan atandı. Bu yaygın 9-mer CTL motiflerinden yalnızca 26'sı, yüksek puanları nedeniyle seçilmiştir (daha yüksek MHC I-bağlanma afinitesini gösterir). Uyumlu daha yüksek puanlara sahip her iki sunucu tarafından ortak olarak tanımlanan bu yirmi altı CTL epitopu, nihai aşı yapısına dahil edildi (ek Tablo S1). Benzer şekilde, IEDB MHCII bağlanma analiz aracı, üç insan HLA aleline (HLA-DRB1*01:01, HLA-DRB1*01:02 ve HLADRB1*) karşı seçilen tüm proteinlerden 15-mer HTL epitoplarını tahmin etti 01:03). Bu alellerin her biri için en düşük ayarlanmış dereceye sahip öngörülen HTL epitopları, ek Tablo S2'de olduğu gibi belgelenmiştir. Bu havuzdan, bu HTL epitoplarını üç HLA alelinden herhangi biri için en güçlü MHC-II bağlayıcıları yapan, düşük ayarlanmış sıralarına (Tablo 2) dayalı olarak toplam dokuz dizi seçilmiştir. Seçilen HTL epitopları daha sonra sitokin üretme yeteneklerini tahmin etmek amacıyla daha fazla hesaplamalı analize tabi tutuldu.

Tablo 1 Farklı Leishmania türlerinden on iki potansiyel antijenik peptit, aşı yapımı için kullanılmış ve ANTIGENpro sunucusu tarafından tahmin edildiği gibi yüksek antijen skorlarına göre seçilmiştir.

Sitokin indükleyici yeteneklere sahip HTL epitoplarının taranması

Seçilen dokuz HTL epitopunun tümü (Tablo 2), bir IFNepitope sunucusu kullanılarak interferon üretme yetenekleri açısından değerlendirildi. Sunucu, L. major'un parafagellar çubuk proteini 2C'den FRRLYKTLGQLVYKK, L. mexicana'nın proteofosfoglikanından DNGAYLGMEPSSVAA ve tübülin beta zincirinden RLHFFMMGFAPLTSR gibi yalnızca üç peptidi tahmin etti (IFN- vs. nonIFN, SVM ve motif bazlı hibrit analizi kullanılarak). L. mexicana, 1.0'den düşük puanlarla "pozitif" olarak değerlendirildi (Tablo 3). Bu üç peptid, sırasıyla IL4pred sunucusu ve IL10pred sunucusu kullanılarak IL-4 ve IL-10-üretme yetenekleri açısından ayrıca kontrol edildi. Her iki sunucu da bir SVM sınıflandırıcı kullanır ve tahmin için amino asit bileşimi, dipeptit bileşimi, amino asit eğilimi ve fizikokimyasal özellikler gibi çeşitli SVM giriş parametrelerini dikkate alır [32, 33]. İlgili sunucular, bu üç 15-mer IFN- -üreten epitopun aynı zamanda IL-4 ve IL-10 için de indükleyiciler olduğunu öngördü (Ek Tablo S3). Dolayısıyla, bu üç MHC-II bağlayıcı 15-mer HTL epitopu, IFN-, IL-4 ve IL{{24} sitokinlerinin üretimini ortaya çıkarma yetenekleri dikkate alınarak aşının yapımı için nihayet seçildi. }} böylece artan bir bağışıklık tepkisine aracılık eder.

Epitop koruma analizi

IEDB sunucusu içinde mevcut olan "antijen boyunca koruma" IEDB modülünden, nihai aşı yapısına dahil edilecek seçilen CTL ve HTL epitoplarının korunma derecesinin bulunmasında yararlanıldı. Yirmi altı CTL epitopunun ve üç HTL epitopunun her biri, Uniprot BLAST tarafından elde edilen spesifik bir homolog protein sekansları setine karşı ayrı ayrı tarandı. BLAST sonuçları, seçilen proteinlerin çeşitli Leishmania türlerinde ve ayrıca diğer ilgili parazitik protozoalarda, çoğunlukla Trypanosoma'da yüksek derecede korunduğunu gösterdi. Analizde kullanılan ilgili Layşmanya proteinleri seti genelinde tüm HTL epitoplarının yüksek düzeyde korunmuş (%100) olduğu bulunurken, seçilen CTL epitopları için koruma aralığı %0 ila %100 arasında değişmektedir (Ek Tablo) S4). Bu tür korunmuş CTL ve HTL epitoplarının nihai aşı yapısına dahil edilmesi, insanları yaygın olarak enfekte eden birçok patojenik Leishmania türüne karşı geniş spektrumlu çapraz bağışıklık sağlayacaktır.

Tablo 2 Seçilen HTL epitoplarının (15 mer) kaynak proteinleri, karşılık gelen bağlanma alelleri ve IEDB MHC-II bağlama aracı tarafından tahmin edilen ayarlanmış sıralarıyla birlikte ayrıntıları

Tablo 3 IFNepitop sunucusu, interferon üretimi yapabilen MHC II'yi indükleyen epitopları tahmin etti

Çok epitoplu aşı dizisinin oluşturulması

Çoklu alt üniteli peptit aşısının birincil sekansı, antijenisite, MHC bağlama afinitesi ve sitokin indükleme yetenekleri temel alınarak seçilen yirmi altı CTL epitopu ve üç HTL epitopunun sekanslarının birleştirilmesiyle oluşturuldu. Bireysel CTL ve HTL epitopları, sırasıyla AAY ve GPGPG bağlayıcıları kullanılarak birleştirildi ve elde edilen aşı peptidinin toplam uzunluğu 369 amino asitti. İnsan IL-12'nin (Uniprot kimliği: P29459) 219 amino asit uzunluğundaki alfa zincirinden oluşan adjuvan, EAAK bağlayıcı tarafından tasarlanan peptidin N terminaline eklendi. Doğal bir adjuvan olarak IL-12'nin eklenmesinin, hayvan çalışmalarında zaten doğrulandığı gibi, bağışıklık tepkisini hızlandırarak aşının etkinliğini arttırması bekleniyordu [3, 37]. Ek olarak, proteinin rekombinant DNA teknolojisi ile üretilmesinin ardından tanımlanmasını ve saflaştırılmasını kolaylaştırmak için peptidin C terminaline bir 6XHis etiketi de eklendi. Bağlayıcılar, adjuvan ve histidin etiketinin eklenmesinden sonra nihai aşı peptidinin uzunluğunun 598 amino asit kalıntısı olduğu bulundu (Şekil 1).

Doğrusal, sürekli ve süreksiz B hücresi epitopunun tahmini

Tasarlanan aşının birincil dizisinde antijenik belirleyicilerin varlığı, daha etkili tahmin için ABCpred ve BepiPred 2.0 olmak üzere iki farklı sunucu kullanılarak belirlendi. ABCpred sunucusu, eğitimli bir tekrarlayan sinir ağı kullanarak B hücresi epitoplarını tahmin eder ve aday dizileri, bağlanma puanlarına göre sıralanan 16-mer peptidleri olarak temsil eder (Ek Tablo S5). Peptitin daha yüksek puanı, bir epitop olma olasılığının daha yüksek olduğu anlamına gelir. Tasarlanan aşı peptidinin, 0,51 varsayılan eşik değerinde tahmin edilen puanları 0,90 ve üzerinde olan yedi adet örtüşmeyen 16-mer peptidine sahip olduğu bulunmuştur. , B hücrelerini bağlama ve uyarma konusundaki çok yüksek potansiyellerini yansıtır. Diğer sunucu BepiPred 2.0, girdi dizisindeki her bir amino asit kalıntısının B hücresi epitopunun bir parçası olma olasılığını tahmin eder ve çıktıyı, B hücresi epitopunun bir parçası olma derecesini gösteren turuncu renk tonlaması ile bir örnek olarak gösterir. olasılık. B hücresi epitoplarına ait olduğu tahmin edilen kalıntılar "E" olarak işaretlenmiştir. Sunucu, peptidin 380–53{{20}} pozisyonundaki bir kalıntı uzantısı içinde yüksek olasılıkla doğrusal B hücresi epitopları olan çok sayıda kalıntı tanımladı (Şekil 2). epitop eşiği 0,5 (varsayılan) olarak ayarlandı. Dolayısıyla, B hücresi reseptörleri için antijenik belirleyicilerin iki bağımsız sunucu tarafından tanımlanması, peptidin bir aşı olarak uygulandığında bireyleri Layşmanya enfeksiyonlarından korumak için B hücreleri tarafından antikor üretimini uyarabileceği gerçeğini ortaya koydu. Ellipro takımı (IEDB portalında mevcut), peptit aşısının rafine üçüncül yapısında sekiz süreksiz B hücresi epitopunda yer alan toplam 323 amino asit kalıntısını, 0.509 ila 0.802 arasında değişen puanlarla tahmin etti. Bunların arasında en büyük konformasyonel epitop, tahmin edilen skoru 0,772 olan 107 amino asit kalıntısı içeriyordu. Analiz için sunucunun varsayılan parametreleri kullanıldı. Ellipro ayrıca 0,535-0,885 puan aralığında toplam 324 kalıntı içeren on iki doğrusal B hücresi epitopunu da öngördü (Ek Tablo S6 ve ek görüntü M1).

Aşı yapısının antijenitesi, alerjenitesi ve toksisite profili

Nihai aşı dizisinin (adjuvanlı) antijenitesi ANTIGENpro ve VaxiJen 2.0 sunucuları tarafından değerlendirildi. ANTIGENpro sunucusu aynı antijenin 0.745396 antijenite puanıyla olası bir antijen olduğunu tahmin etti. VaxiJen 2.0 sunucusu, aşı peptidini hedef organizma belirlendiğinde {{10}}.5 eşiğinde 0.5325 puanla olası bir antijen olarak değerlendirdi. parazit olarak seçilmiştir (Tablo 4). Ancak adjuvan içermeyen orijinal aşı dizisi VaxiJen 2.0 tarafından analiz edildiğinde parazit modellerinde 0.5768 puanla olası bir antijen olarak tahmin edildi. Orijinal sekans için ANTIGENpro tahmin puanı 0.714582 idi. Bu nedenle, oluşturulan her iki aşı dizisinin (adjuvanlı ve adjuvansız) doğası gereği antijenik olduğu bulundu; bu, aşının peptid bileşenlerinin, eklenen adjuvan yokluğunda bile kendi başlarına antijenik olduğu gerçeğini desteklemektedir (Tablo 4). Alerjenite söz konusu olduğunda, son aşı dizisinin, AlgPred tarafından, 0,4 eşiğinde 0,4018 tahmin puanıyla alerjen olmadığı bulundu. Ek olarak, protein dizisinin deneysel olarak kanıtlanmış herhangi bir IgE epitopu içerdiği bulunmadı ve alerjeni temsil eden peptitler (ARP'ler) için BLAST sonuçlarında hiçbir isabet bulunamadı; bu, aşının alerjen olmayan doğasını gösterir. AllerTOP v.2.0 sunucusu ayrıca proteini olası alerjen olmayan bir madde olarak tanımladı. ToxinPred sunucusu tarafından yapılan toksisite analizi, SVM (TrEMBL)+motif bazlı yaklaşım 0,1'lik bir SVM eşiğinde benimsendiğinde ve motif bazlı için E değeri kesme noktası 10,0 olarak ayarlandığında peptidin toksik olmayacağını öngördü. Dolayısıyla oluşturulan aşı dizisinin olası bir antijen, alerjen olmayan ve toksik olmayan olduğu tahmin edildi; bunların hepsi ideal bir çok alt birimli peptit aşısı için önemli kriterlerdir.

Şekil 1 AAY (mavi) bağlayıcı kullanılarak 26 CTL (turuncu) ile EAAK (mor) ile bağlanmış N terminali doğal adjuvanı (yeşil) ile olası aşı yapısını temsil eden toplam 598 amino asit dizisini içeren tasarlanmış çok epitoplu peptid aşısının şematik gösterimi ve 3HTL (sarı), GPGPG (kırmızı) bağlayıcıyla bağlanır. Saflaştırma amacıyla C terminalinde 6-Hi tag'ı ile biter

Şekil 2 Bepipred 2.0 sunucusu tarafından tahmin edilen B hücresi epitopu. 1 ila 590 amino asit dizisinin farklı noktalarındaki gerilmeler, varsayılan eşik seviyesinin üzerindeki potansiyel epitop ile tahmin edildi. E olarak işaretlenen ilk satır, tahmin edilen epitop konumunu gösterir

Fizikokimyasal parametrelerin değerlendirilmesi

Nihai aşı yapısının fizikokimyasal parametreleri, verilen dizide mevcut amino asit kalıntıları esas alınarak Protparam sunucusu tarafından hesaplandı. Tasarlanan peptidin moleküler ağırlığı (MW), 65.68 kDa olarak hesaplandı ve bu da onu bir immünojenik tepkinin indüklenmesi için uygun kılıyor. Teorik pl (izoelektrik nokta) 5,98 olarak hesaplandı; bu, peptidin doğası gereği hafif asidik olduğunu belirtir. Peptitteki pozitif yüklü ve negatif yüklü kalıntıların toplam sayısı sırasıyla 48 ve 55 idi. Yarılanma ömrü in vitro olarak memeli retikülositlerinde 30 saat, mayalarda 20 saatten fazla, in vivo E. coli'de 10 saatten fazla olarak hesaplandı. Proteinin memeli hücrelerinde (insanlar dahil) 30 saat boyunca kalıcılığı, arzu edilen bir bağışıklık tepkisinin ortaya çıkarılması için yeterliydi çünkü mekanizma, proteinin bağışıklık hücreleri tarafından işlenmesini ve sunulmasını gerektiriyor. Alifatik indeksin (alifatik yan zincirler tarafından kaplanan bağıl hacim) 78.34 olacağı tahmin edilmiştir; bu, alifatik indeksin küresel proteinlerin termostabilitesindeki artışa katkıda bulunan pozitif bir faktör olarak kabul edilebilmesi nedeniyle proteinin doğası gereği termostabil olduğunu gösterir. Kararsızlık endeksi 47,10 olarak hesaplandı. Aşı yapısının öngörülen genel ortalama hidropati (GRAVY) değerinin -0,140 olduğu tahmin edildi; negatif değer onun doğası gereği hidrofilik olduğunu ve su molekülleri ile etkileşime gireceğini tanımlar [28, 70-72]. Sonuç olarak, immünoinformatik analiz, tasarlanan peptit yapısının antijenik, termostabil, memeli hücrelerinde kalıcı ve hidrofilik olduğunu öngördü. Tüm bu faktörler yapının olası bir aşı adayı olarak etkinliğini etkilemektedir.

İkincil yapının tahmini

PSIPRED sunucusu tarafından 592 kalıntı uzunluğundaki kimerik peptit için ikincil yapının tahmini, aşağıdaki Şekil 3'te gösterildiği gibi %45,77 alfa sarmalı, %4,89 beta-tabaka ve %49,32 sarmalların varlığını ortaya çıkarır. Ek olarak RaptorX yapısı tahmin sunucusu, kalıntıların %36'sının açığa çıkacağının, %28'inin orta gömülü olarak tahmin edildiği ve kalıntıların %35'inin gömülü olarak tahmin edildiği peptit için ilgili solvent erişilebilirliğini analiz etti; bu, proteinin genel olarak adil bir temasa sahip olacağını gösterir su (çözücü) ile. RaptorX sunucusu tarafından proteinin düzensiz alanında yalnızca 32 kalıntının (peptidin %5'i) olduğu tahmin edildi.

Üçüncül yapı tahmini

I-TASSER web server was utilized for the prediction of the 3-D structure of the designed vaccine. The server predicted five models for the said peptide on the basis of multiple threading alignments using ten different templates, among which the template with PDB id 7e2cl showed the best alignment with an TM score of 0.931 and an RMSD value of 2.75. The top-ranked model exhibiting the highest confidence score (C-score) of−1.11 and an estimated RMSD of 10.3±4.6 Å (Fig. 4a) was selected for further refinement. A higher C-score indicates a higher level of confidence with which the server predicts the tertiary structure of the target protein based on the predictions obtained from modeling simulations [46, 66]. The C-score has a strong correlation with the overall quality of the tertiary structure, and it has been used widely for quantitative estimation of the RMSD and TM scores of predicted models in comparison with the native models; further, the estimated TM score of the chosen model was found to be 0.58±0.14 which is another strong indicator of good modeling strategy since a TM score of>0.5, doğru katlamaya sahip bir modeli belirtir. TM skoru, tahmin edilen modelin aynı SCOP/CATH katlama ailesindeki diğer özdeş proteinlerle yapısal benzerliğini ölçmek için dizi uzunluğundan bağımsız bir parametredir [47].

Tablo 4 ANTIGENpro sunucusundan ve antijenli ve antijensiz Vaxijen2.0 sunucusundan hesaplanan antijenite sonuçları

Şekil 3 PSIPRED sunucusu tarafından doğrusal aşı dizisine ikincil yapı tahmini

Şekil 4 Üçüncül yapı tahmini ve iyileştirme 3-I-TASSER sunucusu tarafından tahmin edilen aşı yapısının D modellemesi. b GalaxyRefne sunucusu tarafından ham 3-D modelinin iyileştirilmesi

Aşı 3 boyutlu modelinin iyileştirilmesi ve doğrulanması

Peptit aşısının "ham" üçüncül modeli, GalaxyReone sunucusu aracılığıyla işlenerek alt sırayla rafine edildi. GalaxyRefne beş model ortaya çıkardı; GDT-HA (0.8826); RMSD (0.608); MolProbity (2.398); çatışma skoru (21.1); zayıf rotamerler (0.6); ve Rama'nın tercih ettiği bölge (88.8) diğer modellerle birlikte (Şekil 4b). MolProbity sunucusu tarafından oluşturulan Ramachandran grafiği, rafine edilmiş 3-D modelinin tercih edilen bölgede %88,8 kalıntıya, izin verilen bölgede %98,6 kalıntıya ve yalnızca %0,013 aykırı değerlere sahip olduğunu gösterdi. Buna karşılık, ilk ham modelin tercih edilen, izin verilen ve aykırı bölgelerde sırasıyla %77,1, %94,2 ve %0,057 kalıntıya sahip olduğu bulundu. Bu sonuçlar, geliştirilmiş üçüncül modelin kalitesinin önemli ölçüde arttığını açıkça göstermektedir. Geliştirilen modelin ek doğrulaması için ERRATA sunucusundan da yararlanıldı. ERRATA sunucusu, modeli 43.542 genel kalite faktörüyle analiz etti; bu aslında girdi proteini modelinin %95 reddetme sınırının altına düşen yüzdesini temsil ediyor. Böylece aşı yapısı için kayda değer ölçüde rafine edilmiş ve doğrulanmış bir üçüncül yapıyı başarıyla elde ettik. Aşının rafine edilmiş üçüncül yapısı, MolProbity sunucusu ve ERRAT sunucusundan elde edilen grafiklerle birlikte Şekil 5'te gösterilmektedir. ProSA web sunucusu -1,08'lik bir Z puanı (ek görüntü M2) göstermiştir; burada negatif değeri, modelin, yapıları X-ışını kırınımı veya NMR ile belirlenmiş benzer boyutlara sahip benzer proteinlerin skor aralığının dışında kaldığını gösterir [51].

Aşı peptidinin disülfür mühendisliği

Disülfid by Design 2.12 sunucusu, disülfit bağı oluşumu için muhtemel yerler olan 45 çift amino asit kalıntısı döndürdü. Yüksek bağ enerjisine ve Chi3 değerlerine dayanarak aşı proteininin esnek döngü bölgesinde bulunabilecek en önemli dört aday kalıntı çiftini belirledik (Ek Tablo S7). Bu kalıntılar, THR58-PHE61 (chi3:+126.18), LEU216-ALA234 (chi3:+125.92), THR323-GLU359 (chi3) :+121.54) ve TYR472-ARG504 (chi3: + 125.75), son aşı proteininin rafine üçüncül modelinde sistein ile değiştirildi, böylece termal stabilite iyileştirildi. peptid (Şekil 6). Ancak B faktörünün doğruluğu, protein kristalografisinde moleküllerin termal hareketi nedeniyle nötron saçılımının veya X ışınının zayıflamasıyla sınırlıdır. Bu nedenle, bu bilgisayar destekli rafine aşı modeli için B faktörü yerine yüksek bağ enerjisi ve Chi3 değerlerini titizlikle seçtik [73, 74].

Aşı peptidinin TLR'lerle kenetlenme etkileşimlerinin analizi

Kimerik peptidin bağışıklık reseptörleri (insan TLR'leri{{0}}, 4, 5, 8 ve fare TLR-9) ile etkileşimleri, bağlanmanın gerçekleştiği PatchDock sunucusu kullanılarak yerleştirme analizi gerçekleştirilerek incelenmiştir. aşının (ligand) çeşitli TLR'ler (reseptörler) ile afiniteleri değerlendirildi. Her bir yerleştirme için PatchDock tarafından oluşturulan ilk on model dikkate alındı; bunların arasından en yüksek yerleştirme puanlarına sahip en iyi sıralamadaki modeller her durum için seçildi. Skorlar, reseptörler ve ligandlar arasındaki şekli ve elektrostatik tamamlayıcı faydalarını temsil ediyordu. En iyi tamamlayıcılık, 18.714 puan, yüzey alanı 3963,10 ve atom temas enerjisi (ACE) 217,99 ile insan TLR-2 (PDB kimliği: 6NIG) durumunda bulundu (Şekil 7a) . Aşı ayrıca 18.258 yerleştirme puanıyla TLR-5 (PDB id: 3J0A) ve TLR-9 (PDB id: 3WPF) ile etkili bağlanma sergiledi; yüzey alanı 2879,80 ve ACE −666,94 ve kenetlenme puanı 18.164; ve yüzey alanı sırasıyla 4090,70 ve ACE 495,74'tür. Diğer TLR'lerle bağlantı kurma, PatchDock tarafından oluşturulan daha düşük yerleştirme puanlarının da yansıttığı gibi, TLR-4 için 16.708 (PDB kimliği: 4G8A) ve TLR-8 (PDB kimliği: 4QC0) için 17.800 ile yansıtılan daha zayıf bağlanma benzerlikleri gösterdi. Böylece aşı yapımız, değişen bağlanma afiniteleriyle farklı bağışıklık reseptörlerine bağlanabildi. Bu, Leishmania enfeksiyonlarını önlemek için uygun ve yüksek bir bağışıklığın tetiklenmesi açısından etkili bir aşı için son derece arzu edilen bir durumdur. Ayrıca, en iyi kompleksin (TLR-2 aşı kompleksi) iyileştirilmesi ve yeniden puanlanması için FireDock web aracı kullanıldı; bu, aynısını minimum küresel enerji -19,01, Van Der Waals ilişkileri (−25,74), atomik temas ile rafine etti enerji (−0,03) ve bağlanma serbest enerjisi (−24,26). Bu sonuçlar, aşı peptidinin insan TLR{51}} ile en verimli şekilde etkileşime girdiği ve dolayısıyla Leishmania parazitlerine karşı belirgin bir bağışıklık tepkisi oluşturabilecek oldukça stabil bir kompleks oluşturduğu gerçeğini desteklemektedir. Buna ek olarak TLR-2 ile aşı arasındaki kenetlenmeyi daha ayrıntılı olarak araştırıyoruz; Cluspro web sunucusunu kullanarak, en üst model (Şekil 7b), 42 üyeden oluşan en büyük küme boyutuna sahip dengeli ağırlıklı puan -1192.5 ile 5D rotasyonel FFT ve CAPRI'ye (öngörülen etkileşimlerin kritik değerlendirmesi) dayalı olarak seçilir. Tablo 5, stabil bir reseptör-ligand kompleksi oluşturan, Şekil 7b'deki etkileşimli 10 amino asit kalıntısının bir listesini içerir.

Şekil 5 GalaxyRefne modeli için bir Ramachandran grafiği. b ERRAT sunucusu, protein yapısının kalite değerlendirmesini öngördü

Şekil 6 Tasarıma göre disülfid 2.0, nihai aşı yapısının termal stabilitesini iyileştirmek için dört (okla gösterilen) potansiyel disülfid bağı oluşumunu öngördü

Aşı proteininin ekspresyonu için kodon optimizasyonu ve in silico klonlama

Kodon yanlılığı sorununun üstesinden gelmek amacıyla, aşı peptidinin giriş amino asit dizisini, optimize edilmiş CAI değeri 1 olan ters çevrilmiş bir cDNA dizisi biçiminde döndüren kodon optimizasyonu için JCat aracı kullanıldı. Bu değer, kabul edilen CAI değeri aralığı olan 0.8–1.0 [28] dahilinde olup, konakçı organizma E. coli K12'de genin yüksek oranda ekspresyonunu sağlar. CAI değeri ne kadar yüksek olursa yabancı genin ekspresyon oranı da o kadar iyi olacaktır. Ek olarak, geliştirilmiş dizinin GC içeriğinin %51,85 olduğu bulunmuştur, bu da iyi bir kodon optimizasyonuna işaret etmektedir. Daha iyi gen ekspresyonu için %35-70 GC içeriği gereklidir [63]. Dizinin 5/ ve 3/ uçlarında XhoI ve NdeI enzimleri için kısıtlama bölgeleri oluşturuldu, ardından değiştirilmiş dizi pET28 a(+) vektörüne yerleştirildi. Kırmızı renkle temsil edilen klonlanmış ek, vektörde belirtilen kısıtlama bölgeleri arasında yer alır. Rekombinant aşı proteininin üretiminden sonra saflaştırma sürecini kolaylaştırmak için klonlanmış dizinin her iki ucunda da altı histidin kalıntısı bulunur [6, 31]. Eklenen gen fragmanıyla birlikte nihai plazmit vektör yapısının boyutu yaklaşık 7 kb idi (Şekil 8). Mfold web sunucusu, mRNA'nın toplam elli katlanma konformasyonunu tahmin etti; bunların arasında en düşük enerji puanı (ΔG= −492,50) nedeniyle en üstteki yapı seçildi. Bu özel katlanmış konformasyonun, tek bir dış döngü ve konformasyonun stabilitesini gösteren minimum serbest enerjiye sahip dört yığın içerdiği tahmin edildi. Döngü, 21 tek sarmallı baz ve iki kapatma sarmalından oluşturuldu. Enerji nokta grafiği optimal enerjiyi (δG) 494,4 kcal/mol olarak hesapladı. Alandaki farklı renkli noktalar, sunucu tarafından hesaplanan δG dikkate alınarak mRNA'da bulunan belirli bir baz çiftinin farklı enerji derecelerine karşılık gelir [64]. Grafiğe göre baz çiftlerinin çoğunun serbest enerjileri -487,5 aralığındadır.<δg <="−485.8" kcal/mol="" range="" (supplementary="" image="" m3).="" conclusively,="" a="" thermodynamically="" favored="" and="" energetically="" stable="" secondary="" structure="" of="" the="" mrna="" was="" predicted="" (supplementary="" image="" m4).="" all="" the="" folding="" constraints="" were="" set="" at="" their="" default="" values,="" and="" the="" rna="" was="" considered="" to="" be="" linear="" in="">

Tablo 5 PyMOL, Şekil 7b'deki reseptör ve ligandın on etkileşimli amino asit kalıntısını üretti ve () içindeki sayı, amino asitlerin reseptör ve liganddaki ilgili konumunu gösterir.

Bağışıklık simülasyonu

C-immsim web sunucusunu kullanan silico bağışıklık simülasyonunda, antijen sayımının, enjeksiyonun başlangıç ​​dozundan sonraki 2 gün içinde 6,9× 105 /ml'ye ulaşacağı tahmin edildi ve antijen seviyesi, dördüncü günden itibaren 0'a düştü. Antijen sayısındaki bu artış, erken enfeksiyon döneminde hem IgM IgG seviyesinin hem de tek başına IgM seviyesinin konsantrasyonundaki kayda değer bir artışla ve keyfi bir ölçekte enfeksiyon döngüsünden sonraki yaklaşık 12 gün içinde zirve seviyeye ulaşmasıyla ilişkilidir. IgG1+IgG2 seviyesinin ve IgG1'in diğer alt tipleri, ikincil bağışıklık tepkisinin bir sonucu olarak belirgin şekilde artar (Şekil 9a). Sitokin profilleri, INF- gibi inflamatuar aracıların 12. günde 4x106 ng/ml'ye kadar ulaştığını, diğer sitokin seviyelerinin ise oldukça düşük kaldığını göstermektedir (Şekil 9b). Aktif ve dinlenme halindeki sitotoksik T lenfositlerin varlığının önerdiği hücre aracılı immünolojik tepkiler, ilk enjeksiyondan 2-3 gün sonra artar ve proliferatif hafıza yardımcı T hücresinin varlığı da belirgindir (Şekil 9c ve d). Toplam B hücresi popülasyonu da, birincil dozun uygulanmasından 1 hafta sonra bellek B hücrelerinin oluşmasıyla birlikte 2-3 gün içinde artar (Şekil 9e).

Şekil 8 pET28 a(+) vektörünü kullanan Leishmania aşı ekspresyon sistemi, kırmızı bölge, NdeI ve XhoI sınırlama bölgeleri tarafından kuşatılmış aşının yerleştirilmiş nükleik asit dizisini gösterir

Moleküler dinamik simülasyonun yorumlanması

TLR2-aşı kompleksi tarafından elde edilen en iyi kenetlenme puanı, NMA destekli moleküler dinamik simülasyonla daha ayrıntılı olarak analiz edildi. Ana zincirin deforme olabilirliği yüksek menteşelerle temsil edilir (Şekil 10a), bu da yüksek deforme olabilirlik anlamına gelir. B faktörü (Şekil 10b), atomik yer değiştirme parametrelerine dayanan protein esnekliğini ifade eden NMA tarafından hesaplandı [73]. Özdeğer (Şekil 10c), yapıyı deforme etmek için gereken enerjiyi yaklaşık olarak tanımlar. TLR-2 aşı kompleksi yaklaşık 7,778× 10−7'lik bir özdeğer gösterir. Varyans (Şekil 10d) özdeğer ile ters ilişkilidir. Kovaryans matrisi (Şekil 10e), kalıntı çiftlerinin ilişkili (kırmızı), ilişkisiz (beyaz) veya anti-korelasyonlu (mavi) olup olmadığını gösterir. Elastik ağ modeli (Şekil 10f), ilgili atom çiftleri arasındaki yayları hesaplar; grafikteki noktalar, yayın sertliğini veya esnekliğini gösteren renk gradyanı ile temsil edilir ve daha koyu renk, daha sert yayı yansıtır. Dolayısıyla moleküler dinamik simülasyonun sonuçları, önerdiğimiz peptid aşısının stabil olduğunu gösterdi.

Tartışma

Leishmaniasis, öncelikle Hindistan da dahil olmak üzere gelişmekte olan ülkelerin yoksullukla mücadele eden bölgelerinde yaşayan insanları etkileyen, en çok ihmal edilen tropik hastalıklardan biri olarak kabul edilmektedir [2]. Dünya Sağlık Örgütü raporlarına göre Hindistan, hastalığın CL ve VL olmak üzere her iki formu için de endemiktir. L. tropica ve L. major'un neden olduğu CL, odak noktası olarak Hindistan'ın kuzeybatı eyaletleri, Pencap ve Racastan'da görülür (https://www.who.int/leishmaniasis/ load/Leishmaniasis_Hindistan/en/ ). Ayrıca, insan immün yetmezlik virüsü (HIV) salgınının dünya çapında artmasıyla birlikte, leishmaniasis, AIDS hastalarında yeniden ortaya çıkan fırsatçı bir patojen olarak ortaya çıkmış ve durumu daha da korkunç hale getirmiştir [22, 38]. Bu çalışmada, leishmaniasis için yaygın patojenik parazit türlerine karşı heterolog koruma sağlayabilecek yeni bir çok değerlikli genel aşı tasarlamayı amaçladık. İnsanlarda VL ve CL enfeksiyonlarına neden olan parazitin beş patojenik suşunu kapsayan on iki Leishmania'ya özgü protein seçtik. Bu proteinler, çeşitli immünolojik çalışmalarda[1, 8–10, 75] virülans ve immünojenitedeki rolleri ve aşı adayları olarak potansiyelleri açısından zaten değerlendirilmişti. Bu nedenle, Layşmanya'nın farklı patojenik türlerinden elde edilen bu tür iyi karakterize edilmiş ve yüksek oranda korunmuş immünojenik proteinlerin dahil edilmesiyle in silico olarak tasarlanan bir aşı yapısı, insan leishmaniasisinin tüm formlarına (temel olarak VL ve CL) karşı çapraz bağışıklık sağlayabilir ve dolayısıyla, İnsanlarda Leishmania enfeksiyonlarını önlemek için genel bir aşılama programı. Seçilen proteinler öncelikle potansiyel CTL ve HTL epitoplarının varlığı açısından tarandı. T hücresi epitoplarının tespiti önemlidir, çünkü T hücreleri antijenleri yalnızca endojen veya eksojen yolla işlendiğinde, MHC sınıf I veya MHC sınıf II molekülleriyle komplekslendiğinde tanıyabilir ve daha sonra antijen sunan hücreler tarafından T hücresi reseptörlerine sunulur. APC'ler). MHC-I, CD8+CTL'lere spesifiktir, MHC-II ise spesifik olarak CD4+HTL reseptörlerine bağlanır. CTL epitoplarının tanımlanması, iki bağımsız sunucunun aynı anda kullanılmasıyla sıkı bir şekilde gerçekleştirildi. Yalnızca her iki sunucu tarafından tahmin edilen ve önemli ölçüde daha yüksek MHC bağlama afinitelerine sahip olan epitoplar nihayet aşı peptidine dahil edildi. Tanımlanan HTL epitopları, üç web sunucusu kullanılarak sitokin indükleme yetenekleri açısından ayrıca değerlendirildi. Çok çeşitli sitokinlerin üretimini uyarabilenler, yani IFN-, IL{{20}} ve IL-10, kimerik peptid aşısının tasarlanması için seçildi. konakçıda tüm bu parazite özgü sitokinlerin üretimini teşvik edecektir. Bu son derece önemlidir, çünkü Kedzierski ve meslektaşları, bir aşının koruyucu bir bağışıklık tepkisi oluşturup oluşturamayacağını ve IL durumunda uygun bağışıklığın oluşturulup oluşturulamayacağını belirlemek için IL{23}} salgılanmasının IFN- salgılanması kadar önemli olduğunu öne sürdüler. -10 seviyeleri orantılı olarak yükselmez [8, 75]. Özel CTL ve HTL epitopları daha sonra kimerik peptidi oluşturmak için AAY ve GPGPG bağlayıcıları kullanılarak birleştirildi. AAY ve GPGPG bağlayıcılarının, minimum bağlantısal immünojeniteye izin vermeleri ve seçilen epitopların MHC-II tarafından işlenmesini ve sunulmasını kolaylaştırmalarından dolayı çoklu epitoplu aşı tasarımı için yararlı olduğu daha önce bildirilmişti [6, 28, 71]. İnsan IL-12'nin adjuvan alfa zinciri, EAAK bağlayıcı yoluyla elde edilen peptidin N terminaline bağlandı. IL-12, önceki immünojenik çalışmalarda belgelendiği gibi, hayvan modellerinde Layşmanya aşısı için en etkili adjuvanlardan biri olduğundan, bir adjuvan olarak seçilmiştir [3, 37, 71]. Aşının insanlara uygulanması amaçlandığından, herhangi bir sentetik TLR agonisti yerine doğal bir adjuvan olarak insan IL{38}}'nin dahil edilmesinin, olumsuz yan etkilere neden olmadan bağışıklığı artırması bekleniyor. IL-12'nin aşılar için genel bir adjuvan olarak rolü, hem protein hem de polisakkarit aşı antikor tepkilerini artırma ve yüksek bir bağışıklık tepkisine yol açan IgG eksüdasyonuna izin veren yeterli lokal enflamasyonu indükleme potansiyeli nedeniyle de vurgulanmaktadır [72]. Daha yüksek bir ekspresyon hızı elde etmek ve aşı alanları arasındaki etkileşimi kısıtlayarak füzyon peptidinin biyolojik fonksiyonunu desteklemek için EAAK bağlayıcı eklenmiştir [76, 77]. İmmünoinformatik analiz, aşı yapımızın, immünprofilaktik kullanım için yapılmış bir aşı için oldukça arzu edilen birçok doğrusal B hücresi epitopuna sahip olduğunu gösterdi. Daha doğru tahminler için yine iki farklı araç kullandık. Her iki sunucu da aşı dizisinde yeterli B hücresi epitopu öngördü. Tasarlanan aşının alerjen olmadığı, toksik olmadığı ve uygun bir bağışıklık reaksiyonunu tetikleyecek kadar immünojenik olduğu tahmin edildi. Daha sonraki fizikokimyasal analiz, aşı peptidinin hafif asidik (pI 5.98) olduğunu ve oldukça yüksek bir alifatik indekse (78.34) sahip olduğunu ortaya çıkardı; bu da onun termostabil doğasını akla getiriyor. Negatif bir GRAVY değeri (-0,14), peptidin hidrofilik olduğunu gösterir ve bu da aşı olarak gücüne daha da katkıda bulunur. Aşının ikincil yapısal elemanları, protein ikincil yapı tahmini için en doğru ve yaygın olarak kullanılan hesaplamalı yöntemlerden biri olan PSIPRED v 4.0 sunucusu tarafından belirlendi. Ayrıca tasarlanan peptidin 3 boyutlu yapısı, aşının dinamiklerini, biyoaktivitesini ve etkileşimini incelemek için büyük önem taşıyan proteinin önemli kalıntılarının koordinatları hakkında ayrıntılı bilgi sağlayan I-TASSER sunucusu kullanılarak da tahmin edildi. diğer ligandlarla. Başlangıçtaki üçüncül yapı, tahmin edilen modelin yan zincirindeki veya omurgasındaki potansiyel hataları bulmak ve düzeltmek için protein yapısı doğrulama araçları kullanılarak geliştirildi ve doğrulandı. Ramachandran grafiği analizi, rafine edilmiş modelin kalıntılarının %90'ından fazlasının, küçük bir aykırı değer yüzdesi ile izin verilen bölge dahilinde olduğunu gösterirken, ERRAT sunucusu, tümü tatmin edici model kalitesinin göstergesi olan 43.542'lik bir kalite faktörü gösterdi. Doğrulanmış 3D modelin, ElliPro sunucusu tarafından yeterli sayıda konformasyonel B hücresi epitopuna sahip olduğu bulundu; bu, arzu edilen bir B hücresi tepkisi oluşturabileceğini ve konakçıda spesifik antikorların üretimini uyarabileceğini ima ediyor. B hücresi aktivasyonu aynı zamanda immünolojik hafızada da çok önemlidir ve aşılanmış bireylerde uzun süreli bağışıklıktan sorumludur. Aşının bağışıklık reseptörleri (TLR'ler) ile etkileşimi de yerleştirme analizi yapılarak değerlendirildi. Aşı peptidinin TLR-2 için en yüksek afiniteye sahip olduğu, ardından TLR-5'nin geldiği, ancak diğer TLR'lere daha az ölçüde bağlanabildiği bulundu. Hayvan modellerini içeren önceki çalışmalar, farklı Layşmanya türlerinin veya bunların antijenik bileşenlerinin, çeşitli TLR'ler ile etkileşime girerek, tehdit altındaki konakçılarda yoğun bir bağışıklık tepkisine yol açtığını belgelediğinden, TLR'lerle etkileşim, koruyucu bağışıklığın ortaya çıkarılması için gereklidir. E. coli (K12) konakçı sisteminde rekombinant aşı proteininin tatmin edici ekspresyonuna yönelik gereklilikleri karşılamak amacıyla, sekansın CAI ve GC içeriğini ayarlayan ve sekansı ekspresyona uygun hale getiren JCat aracı uygulanarak kodon optimizasyonu gerçekleştirildi. E. coli. In silico klonlama ayrıca rekombinant aşı proteininin arttırılmış üretimini elde etmek amacıyla sekansın klonlama ve aşırı ekspresyon için fizibilitesini göstermek amacıyla plazmid bazlı ekspresyon vektörü pET28a(+) kullanılarak da gerçekleştirildi. Kimerik gen dizisi tarafından kodlanan mRNA'nın ikincil yapısının tahmini, bakteriyel konakçıdaki verimli translasyon sürecini etkileyecek mRNA'nın katlanmış konformasyonunun stabilitesini göstermek için yapılmıştır. Aşı proteinine yeni disülfit bağları eklenerek stabilize edici mutasyonlar oluşturuldu; çünkü bu, doğal proteinin gücüne katkıda bulunarak onu ek biyokimyasal, immünolojik ve biyoteknolojik araştırmalara uygun hale getirecekti.

Şekil 9 C-immsim sunucu tabanlı bağışıklık simülasyonu. a Toplam antijen ve ilgili antikor üretimi, b sitokin üretim profili, yardımcı T hücresinin c ve d üretimi ve toplam (aktif ve dinlenme) sitotoksik T lenfosit sayısı, e aşı uygulamasından sonra B hücresi tepkisi

Şekil 10 Moleküler dinamik simülasyon. a Menteşelerle gösterilen ana zincir deforme olabilirliği, b protein stabilitesini gösteren NMA tarafından üretilen B faktörü, c kenetlenme kompleksinin yapısını deforme eden öz değer, d yapının varyansının bireysel (mor) yüzdesi ve kümülatif (yeşil), e kovaryans matrisi korelasyonlu Atom çiftleri arasında (kırmızı), korelasyonsuz (beyaz) veya anti-korelasyonlu (mavi), atom çiftleri arasındaki bağlı yayları gösteren elastik ağ modeli, daha koyu gri, sert yayları gösterir ve bunun tersi de geçerlidir.

cistanche takviyesi faydaları-bağışıklığı artırır

Cistanche Enhance Immunity ürünlerini görüntülemek için buraya tıklayın

【Daha fazlasını isteyin】 E-posta:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Çözüm

Bu çalışmada, insanları enfekte eden yaygın Leishmania parazitlerine karşı heterolog koruma sağlayabilecek, insan leishmaniasis'e (hem iç organ hem de kutanöz) karşı çok değerlikli çok alt birimli bir peptid aşısının in silico tasarımı için ters bir aşı bilimi yaklaşımından yararlandık. dolayısıyla doğası gereği geniş spektrumlu olduğu düşünülebilir. Aynısı, şu anda mevcut kemoterapötik ajanlarla birlikte tamamlayıcı bir strateji olarak hastalığı kontrol etmek ve yok etmek için genel bir aşılama programı için de kullanılabilir. Ek olarak, hümanize olmayan herhangi bir sentetik peptit yerine doğal bir yardımcı madde olarak IL-12'yi kullandık. IL-12'nin adjuvan olarak kullanılması, konakçının vücudunda herhangi bir olumsuz yan etkiye neden olmadan aşının immünojenitesini artıracaktır. Aşı peptidinin beş patojenik Leishmania türünden elde edilen çeşitli yüksek oranda korunmuş ve potansiyel olarak immünojenik peptidlerden oluşması koşuluyla, aşılanmış bireylerde bir çapraz bağışıklık ortaya çıkarmak yararlı olur, dolayısıyla aynı zamanda terapötik ve profilaktik avantajlara da sahip olur. Çeşitli hesaplama araçlarını kullanan çeşitli sıkı immünoinformatik analizler, önerilen aşının immünojenik, stabil ve rekombinant bir protein olarak tekrar üretilebilir ve insan denemeleri için güvenli olduğunu ortaya çıkardı. Bununla birlikte, koruyucu ve uzun süreli bağışıklığın uygun şekilde ortaya çıkmasını garanti etmek ve toksisiteyi dışlamak için deneysel doğrulamanın yapılması gerekmektedir.

Referanslar

1. De-Brito RCF, Cardoso JMO, Reis LES, Vieira JF, Mathias FAS, Roatt BM, Agiuar-Soares RDDO, Ruiz JC, Resende DM ve diğerleri. (2018) Leishmaniasis için peptid aşıları. Ön İmmünol 9:1043

2. Okwor I, Uzonna J (2016) İnsan leishmaniasisinin sosyal ve ekonomik yükü. Am J Trop Med Hyg 94(3):489–493. https://doi. org/10.4269/ajtmh.15-0408

3. Mutiso JM, Macharia JC, Gicheru MMJ (2010) Biomed Res 24(1):16–25. https://doi.org/10.1016/S1674-8301(10)60004-8

4. Gillespie PM, Beaumier CM, Strych U, Hayward T, Hotez PJ, Bottazzi ME (2016) Leishmaniasis için aşı araştırması ve aşı geliştirme durumu. Aşı 34(26):2992–2995. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2015.12.071

5. Joshi S, Rawat K, Yadav NK, Kumar V (2014) Siddiqi MI ve Dube A (2014) Viseral leishmaniasis: klasik ve moleküler yaklaşımlarla aşı geliştirmedeki ilerlemeler. Ön İmmunol 5:380. https://doi.org/10.3389/fmmu.2014.00380

6. Khatoon N, Pandey RK, Prajapati VK (2017) İmmünoinformatik yaklaşım kullanılarak B ve T hücresi çoklu epitop alt birim aşısının tasarlanması için Leishmania salgı proteinlerinin araştırılması. Bilim Temsilcisi 7:8285

7. Goto Y, Bhatia A, Raman VS, Liang H, Mohammad R, Picone AF, Vidal SEZ, Vedvick TS ve diğerleri (2011) KSAC, visseral leishmaniasis için tanımlanmış ilk poliprotein aşı adayı. Clin Vaccine Immunol 18(7):1118–1124. https://doi.org/10.1128/CVI. 05024-11

8. Kedzierski L (2010) Leishmaniasis aşısı: bugün neredeyiz? J Glob Infect Dis 2(2):177–185. https://doi.org/10.4103/0974- 777X.62881

9. Nagill R, Kaur S (2011) Leishmaniasis için aşı adayları: bir inceleme. Int Immunopharmacol 11(10):1464–1488. https://doi.org/ 10.1016/j.intimp.2011.05.008

10. Coler RN, Reed SG (2005) Leishmaniasis'e karşı ikinci nesil aşılar. Trendler Parasitol 21(5):244–249

11. Fernández L, Carrillo E, Sánchez-Sampedro L, Sanchez C, Ibarra Meneses AV, Jimenez MA, Almeida VDA, Esteban M ve diğerleri (2018) İnsan periferik kan mononükleerinde Leishmania ile aktifleştirilen c-kinaz antijeninin (LACK) antijenitesi hamsterlerde pCI-neo-LACK artı zayıflatılmış LACK eksprese eden aşı virüsleri ile prime-boost aşılamanın koruyucu etkisi. Ön İmmunol 9:843. https://doi.org/10.3389/fmmu.2018.00843

12. Kelly BL, Stetson DB, Locksley RM (2003) Leishmania majör LACK antijeni, etkili omurgalı parazitlenmesi için gereklidir. J Exp Med 198(11):1689–1698. https://doi.org/10.1084/jem.20031 162

13. De Mendonça SC, Cysne-Finkelstein L, Matos DC (2015) Leishmania'da bir aşı adayı ve virülans faktörü olarak Kinetoplastid membran proteini-11. Ön İmmünol 6:524. https://doi.org/ 10.3389/fmmu.2015.00524

14. Joshi PB, Kelly BL, Kamhawi S, Sacks DL, McMaster WR (2002) Leishmania major'da hedeflenen gen silinmesi, leishmanolysini (GP63) bir virülans faktörü olarak tanımlar. Mol Biochem Parasitol 120(1):33–40. https://doi.org/10.1016/s0166-6851(01)00432-7

15. McMahon-Pratt D, Rodriguez D, Rodriguez JR, Zhang Y, Manson K, Bergman C, Rivas L, Rodriguez JL ve diğerleri (1993) GP46/M-2'yi eksprese eden rekombinant aşı virüsleri Layşmanya enfeksiyonuna karşı koruma sağlar. Enfeksiyon Bağışıklığı 61(8):3351–3359

16. Holakuyee M, Mahdavi M, Zuhair MH, Abolhasani M (2012) BALB/c farelerinde Th2 immün tepkisini indükleyen Leishmania major'un ısı şok proteini ile zenginleştirilmiş promastigotları. İran Biomed J 16(4):209–217. https://doi.org/10.6091/ibj.1098.2012

17. MacLean L, Price H, O'Toole P (2016) Canlı hücre görüntüleme yöntemleriyle Leishmania hidrofilik asile edilmiş yüzey proteini B (HASPB) ihracat yolunun araştırılması. Yöntemler Mol Biol 1459:191–203. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-3804-9_13

18. Maharana BR, Tewari AK, Singh V (2015) Kinetoplastid parafagellar çubuklara genel bakış. J Parasit Dis 39(4):589–595. https://doi.org/10.1007/s12639-014-0422-x

19. Mahmoudzadeh NH, McKerrow JH (2004) Leishmania tropica: sistein proteazları büyüme ve patojenite için gereklidir. Exp Parasitol 106(3–4):158–163. https://doi.org/10.1016/j.exppara. 2004.03.005

20. Mundodi V, Kucknoor AS, Gedamu L (2005) Seyahat parazitlerinin hayatta kalmasında Leishmania (Leishmania) chagasi amastigote sistein proteazının rolü: gen bozulması ve antisens mRNA inhibisyonu ile yapılan çalışmalar. BMC Mol Biol 6:3. https://doi.org/10.1186/ 1471-2199-6-3

21. Rogers ME (2012) Leishmania proteo fosfoglikanlarının tatarcık bulaşmasında ve Memeli konakçının enfeksiyonunda rolü. Ön Mikrobiyol 3:223. https://doi.org/10.3389/fmicb.2012.00223

22. Bhowmick S, Ali N (2009) Visseral leishmaniasiste aşı aracılı korumanın korelasyonlarını tanımlamaya yardımcı olan yeni Leishmania donovani antijenlerinin tanımlanması. PLoS One 4(6):e5820. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005820

23. Assis TM, Mancini DT, Ramalho TC, da Cunha EFF (2014) Leishmania donovani - tubulin ve inhibitörlerinin silico çalışması. J Kimya. https://doi.org/10.1155/2014/492579