Bütünleştirici Omik Analizi Böbrek Allogreft Biyopsilerinde Mikrovasküler Enflamasyonla İlgili Yolları Çözüyor

edmund.chen@wecistanche.com

Katı organ transplantasyonunda, mikroRNA'lar (miRNA'lar), yaralanmaya yanıt olarak allogreft hücre fonksiyonunun düzenlenmesinde kilit oyuncular olarak ortaya çıkmıştır. Mikrovasküler inflamasyon tarafından histolojik olarak tanımlanan bir ret fenotipi olan antikor aracılı rette miRNA'ların rolü hakkında fikir edinmek için,böbrek allogreft biyopsileri miRNA'nın yanı sıra haberci RNA (mRNA) profiline de tabi tutuldu. BIOMARGIN çalışmasına özgü benzersiz bir çok aşamalı seçim süreci kullanılarak (keşif kohortu, N=86;seleksiyon kohortu, N=99; doğrulama kohortu, N=298), altı farklı şekilde eksprese edilmiş miRNA tutarlı bir şekilde tanımlandı: miR-139-5p (aşağı) ve miR-142-3p/150-5p/155-5p/{ {7}}p/223-3p (yukarı). Ekspresyon seviyeleri, mikrovasküler inflamasyon yoğunluğu ile kademeli olarak koreledir. miRNA'ların hedef genlerinin hücre özgüllüğü, in vivo mRNA hedeflerinin bağımsız bir allogreft biyopsi kohortundan tek hücreli RNA dizilimi ile entegre edilmesiyle araştırıldı. Endotel kaynaklı miR-139-5p ekspresyonu, MHC ile ilgili gen ekspresyonu ile negatif korelasyon gösterdi. Tersine, epitelyal türevli miR-222-3p aşırı ekspresyonu, bozulmuş renal elektrolit homeostazı ve baskılanmış bağışıklıkla ilgili yolaklar ile güçlü bir şekilde ilişkiliydi. Bağışıklık hücrelerinde miR-150-5p, T lenfositlerinde NF-kB aktivasyonunu düzenlerken, miR-155-5p, antijen sunan hücrelerde mRNA eklenmesini düzenler. Toplamda, entegre omikler, mikrovasküler inflamasyonla ilgili yeni yolları ortaya çıkarmamızı sağladı ve tübüler epitel hücrelerinde metabolizma değişikliklerinin, yakındaki endotel kompartmanının ötesinde, antikor aracılı reddin bir sonucu olarak meydana geldiğini öne sürdü.

Anahtar Kelimeler:böbrek transplantasyonu, mikroRNA, multi-omik, mikrovasküler inflamasyon, antikor aracılı rejeksiyon

CISTANCH BÖBREK/BÖBREK HASTALIĞINI İYİLEŞTİRECEK

GİRİİŞİçindeböbrek nakli(KT), alloimmün hasarı, immün infiltrasyonun uzaysal dağılımına ve donöre özgü anti-HLA antikorlarının varlığı veya yokluğuna ilişkin bilgilere göre genellikle iki tip allogreft reddi olarak ikiye ayrılır. Tanı, histolojik lezyonların Banff International Consensus sınıflamasına (1) göre derecelendirildiği allogreft biyopsisine dayanır. Tubulit ("t" lezyonu) ve interstisyel inflamasyon ("I" lezyonu), T hücre aracılı reddin (TCMR) ayırt edici histolojik özellikleridir ve tubulointerstisyel bölmeye doğrudan sitotoksisite ile ilgilidir. Antikor aracılı rejeksiyon (ABMR), çoğunlukla mikrovasküler kompartmanı hedef alan inflamasyonlu dolaşımdaki anti-HLA antikorları ile ilişkilidir. Aktif ABMR histolojik lezyonları, glomerüler kılcal damarlarda ("g" lezyonu) ve peritübüler kılcal damarlarda ("ptc" lezyonu) mononükleer hücrelerin varlığını içerir, bunlar birlikte "mikrovasküler inflamasyon" (MVI) olarak adlandırılır. Kronik aktif ABMR'de, transplant glomerülopatisi veya arteriyel intimal fibrozis gibi kronik doku hasarı bu akut lezyonlara katkıda bulunur(1). Mevcut T' hücre hedefli immünosupresif ajanları kullanarak, TCMR'nin sınırlı bir prognostik etkiye sahip olduğu kabul edilirken, ABMR, etkili terapötik yaklaşımların eksikliği ile ilgili olan greft başarısızlığının ana nedenidir (2).

MVI ve ABMR için daha iyi tedaviler bulmak için, bu yaralanma süreçlerinin altında yatan biyolojik mekanizmalar hakkında daha iyi kavrayışa ihtiyaç vardır. Yüksek verimli omik teknolojileri, binlerce gen, protein ve metabolitin tam ve aynı anda taranmasına izin verdiği için amaca uygun görünmektedir(3). Tam transkriptom sorgulamaböbrekallogreft biyopsileri, ABMR(4) sırasında yaralı yerleşik hücrelerde veya infiltre hücre popülasyonlarında derin mRNA gen ekspresyonu değişiklikleri göstermiştir. Bu arada, mikroRNA'lar (miRNA'lar), mesajcı RNA'yı (mRNA) transkripsiyon sonrası seviyede düzenleyerek hücre metabolizmasında kilit oyuncular olarak ortaya çıkmıştır. Aslında miRNA'lar, çoğalma, apoptoz, farklılaşma ve gelişme ile ilgili vücudun fizyolojik süreçlerinin ince ayarına ilişkin anlayışımızda devrim yarattı(5). Şaşırtıcı olmayan bir şekilde, düzensiz miRNA ekspresyonu, dahil olmak üzere birçok patolojinin gelişmesine neden olur.böbrek hastalığı(6). MiRNA ekspresyon profilleri hastalıklı ve sağlıklı durumlar arasında farklılık gösterdiğinden, birçok çalışma miRNA'ları tek başına veya diğer daha geleneksel belirteçlerle kombinasyon halinde, yalnızca hastalığı teşhis etmek ve hastalığın ilerlemesini tahmin etmek için değil, aynı zamanda potansiyel terapötik uygulamaları tasarlamak için analiz etmiştir (7).

Katı organ transplantasyonu bağlamında, miRNA'lar, bağışıklık hücre fonksiyonunun düzenlenmesindeki rolleri ve allogreft yerleşik hücrelerin yaralanmaya tepkisi yoluyla reddetmede rol oynayabilir (6,8). TCMR (8,9) ayarlarında biyobelirteçler ve/veya efektörler olarak allogreft miRNA'ları araştıran birkaç çalışma var, ancak şimdiye kadar hiçbiri MVI ve ABMR'ye odaklanmadı.böbrekBu zararlı reddetme fenotipinde miRNA'ların rolüne dair fikir edinmek için allogreft biyopsileri.

MATERYAL VE METOD Çalışma TasarımıBu çalışma, FP7- tarafından finanse edilen BIOMarkers'ın bir parçasıdır.böbrekGreft Yaralanmaları araştırma programı (BIOMARGIN, https://cordis.europa. eu/project/id/305499, ClinicalTrials.goy, sayı NCT02832661), allogreft immün lezyonlarının biyobelirteçlerini araştıran bir Avrupa araştırma konsorsiyumu tarafından yönetilmektedir.böbrek nakliTanısal ve/veya prognostik değeri olan alıcılar. BIOMARGIN, çok merkezli, prospektif, çok fazlı bir çalışmadır.böbrek nakliAvrupa'daki merkezler (Necker Hastanesi, Paris, Fransa; Üniversite Hastaneleri, Leuven, Belçika; Hannover Tıp Okulu, Hannover, Almanya; ve Üniversite Hastanesi, Limoges, Fransa). Numuneler, Nisan 2013 ile Haziran 2015 arasında tarama ve endikasyon biyopsileri sırasında prospektif olarak toplanmıştır(Şekil IA). Tüm transplantasyonlar, negatif kompleman bağımlı sitotoksisite çapraz eşleşmeleri ile gerçekleştirilmiştir. Bu dört klinik merkezde endikasyon biyopsilerine ek olarak yerel merkez uygulamalarına göre transplantasyondan 3,12 ve bazen 24 ayda protokol biyopsileri yapılmıştır. Her sahadaki kurumsal inceleme kurulu çalışmayı onayladı ve tüm hastalar yazılı bilgilendirilmiş onam verdi.

Çalışma GruplarıÇalışma üç aşamaya bölündü (Şekil 1A). İlk vaka kontrol keşif aşamasında, global miRNA ekspresyon analizi için N=88 biyopsi örnekleri kullanıldı(potansiyel normalleştirici miRNA'lar hariç N=754 miRNA'lar) . Örnekleri bulunabilirlik ve histolojik kriterlere göre seçtik (glomerülonefrit veya poliomavirüs ile ilişkili nefropati tanısı olan vakalar ve belirsiz teşhisi olan vakalar hariç). Yerel biyopsi okumalarına dayanarak, orijinal merkezden bağımsız bir grup patolog tarafından merkezi okuma yoluyla daha da rafine edilen bir ilk seçim yapıldı. İstatistiksel analiz (bkz. miRNA seçimi), daha sonra 2. fazda nicelendirilen histolojik fenotipler arasında en farklı şekilde ifade edilen miRNA'ların genişletilmiş listesini seçmek için kullanıldı.

N=99 biyopsi numunelerinde hedeflenen miRNA ekspresyon analizinin (N=143) gerçekleştirildiği ikinci (seçim) aşaması için benzer bir vaka kontrol çalışması tasarımı kullanıldı. Aynı istatistiksel ardışık düzen, daha sonra 3. aşamada nicelendirilmek üzere daha da kısıtlı bir miRNA listesi seçmek için uygulandı. Son olarak, üçüncü (doğrulama) kohortta, 24 Haziran 2014 ve 2 Temmuz 2015 tarihleri ​​arasında BIOMARGIN protokolüne göre ileriye dönük ve ardışık olarak toplanan tüm örnekler ve yeterliböbrekAllogreft biyopsi kalitesi, ikinci seçim aşaması sonucunda seçilen 38 miRNA için değerlendirildi. Bu gerçek yaşam ortamındaki kohortta, histoloji, demografi, zaman veya numune mevcudiyeti ve kalite kontrol kriterleri (biyopsi yeterliliği ve RNA verimi) dışında herhangi bir faktöre dayalı olarak seçim yapılmadı.

miRNA SeçimiBiyosignal R paketinin(1l) bir uzantısı olarak, R(R Core Team(10), sürüm 1.0.44'teki BIOMARGIN çalışması için özel olarak sağlam bir istatistiksel işlem hattı geliştirilmiştir). Kısaca keşif aşamasında, tek değişkenli ve çok değişkenli yaklaşımları içeren bir öznitelik seçme stratejisi gerçekleştirdik. Tek değişkenli seçim için parametrik olmayan bir test (Wilcoxon-Mann-Whitney testi) ve parametrik bir test (Student's t-test) ve bir Keşif kohortu (BIOS-03-0023, BIOS-06-0238) kullandık. Her çok değişkenli modeldeki her miRNA transkriptinin tahmin puanları, bir "çok değişkenli puan" verecek şekilde entegre edildi. Bu tek değişkenli ve çok değişkenli analizlerin sonuçlarını birleştirerek, bir sonraki aşamada ölçülecek genişletilmiş listenin bir parçası olmak için bir miRNA adayları alt kümesini sıralayabildik ve seçebildik.VMI yollarına odaklanan bu posthoc analiz için, her bir miRNA'nın medyan normalleştirilmiş ifadesi, her üç kohortta da Wilcoxon testi kullanılarak vakalar ve kontroller arasında karşılaştırıldı. Benjamini & Hochberg yanlış keşif oranı (FDR) yöntemini kullanarak çoklu test için kontrol ettik.

Klinikopatolojik DeğerlendirmeBireysel histolojik lezyon skorları, Banff 2019 kriterlerine(16) göre yarı kantitatif olarak değerlendirildi. "Mikrovasküler inflamasyon" (MVI) terimi, herhangi bir derecedeki glomerülit (g) ve/veya peritübüler kapillerit (ptc) kombinasyonunu belirtmek için kullanılmıştır. Tüm ABMR vakaları, Banf 2015 veya Banff 2017 sınıflandırmasının (histolojik) ilk 2 kriterini karşılamıştır. akut doku hasarı kanıtı ve vasküler endotel ile mevcut/son antikor etkileşiminin kanıtı), ancak tümü üçüncü kriteri [donöre özgü antikorların (DSA) ve/veya CAd boyamasının serolojik kanıtı] karşılamadı. DSA pozitifliği, biyopsi sırasında veya öncesinde herhangi bir zamanda ortalama floresan yoğunluğu (MFI) değeri 500 olan saptanabilir donöre özgü serum anti-HLA antikorları olarak tanımlanarak, transplantasyon sonrası DSA'lar yerel merkez uygulamasına göre belirlendi.

mRNA ve miRNA Profilleme için Biyopsi Örneklerinden RNA EkstraksiyonuHer birinde iki iğne çekirdeği alındıböbrekallogreft biyopsisi. Biri geleneksel histolojik derecelendirme için kullanıldı ve diğerinin en az yarısı hemen Allprotect Doku Reaktifinde (Qiagen Benelux BV, Venlo, Hollanda) saklandı. Allprotect tüpleri 4C'de saklandı (minimum 24 saat ila maksimum 72 saat) , ve daha sonra RNA ekstraksiyonuna kadar -20 derece derecede saklanır. Toplam RNA izole edildiböbrekbir QIAcube cihazında (Qiagen Benelux BV) Allprep DNA/RNA/miRNA Evrensel Kiti (Qiagen Benelux BV) kullanılarak allogreft biyopsi örnekleri. İzole edilen RNA'nın miktarı (26{{20}} nm'de absorbans) ve saflığı (230,260 ve 280 nm'de absorbans oranı) NanoDrop ND-1000 spektrofotometre (Thermo) kullanılarak ölçüldü. Fisher Scientific/Life Technologies Europe BV, Ghent, Belçika). RNA bütünlük sayısı (RIN), Bioanalyzer 2100 cihazında (Agilent Technologies BelgiumNV) Eukaryote nano/pico RNA Kiti (Agilent Technologies Belgium NV, Diegem, Belçika) ile değerlendirildi. Kalite kontrol endeksleri VMI ve No arasında önemli ölçüde farklı değildi. MVI grupları [RIN(ortalama±SD):5.6±1.96vs5.4±1.97,P=0.66;260/280 oranı (ortalama±SS):1.87±0.06 vs 1.87±0.1l,P{{26 }}.40]. Düşük RIN'li RNA örnekleri için(<6.5), we="" excluded="" samples="" with="" a="" 260/280=""><1.6. the="" extracted="" rna="" was="" subsequently="" split="" and="" stored="" at="" -80℃℃.half="" of="" the="" rna="" extract="" was="" used="" for="" mirna="" profiling="" and="" the="" other="" half="" for="" mrna="" transcriptomic="" analysis.="" the="" associated="" data="" are="" available="" from="" the="" gene="" expression="">

CISTANCHE BÖBREK/BÖBREK DİYALİZİNİ İYİLEŞTİRECEK

miRNA ProfillemeSpecific reverse transcription of 150ngof total RNA was performed using Megaplex"RT Primers Human Pool A v2.1(Step 1)or Custom RT Primers Human Pool (Step 2 and 3)(Thermo Fisher Scientific, Les Ulis, France), on a Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific). No complementary(c)DNA preamplification was required. miRNA expression was assessed by qPCR, using TaqManArray Cards (Applied Biosystems", Thermo Fisher Scientific), where the primers and probe of each miRNA were spottedanddried in duplicate wells of a microfluidic card. We used TaqMan"Array Human MicroRNA A +B Card Sets v3.0 for the discovery cohort(a two-card set enabling quantitation of 754 unselected human miRNAs)and Custom TaqManArray MicroRNA Cards for the selection and validation cohorts. Data analysis was performed by using Expression Suite software version 1.0.3. Assays with a cycle threshold(CT) values >35 ifade edilmediği kabul edildi. RNU44 ve RNU48, tüm örneklerde tutarlı ifade gösterdi (RNU44 artı RNU48) varyasyon katsayısı Dizi Kartı A'da yüzde 3.73 ve Dizi Kartı B'de yüzde 3.79] ve tüm alt çalışmalarda veri normalizasyonu için temizlik genleri olarak kullanıldı.

mRNA Transkriptomik AnalizTranskriptomik analiz, daha önce tarif edildiği gibi mikrodizi ile gerçekleştirilmiştir(17). Kısaca, biyopsi örneklerinden ekstrakte edilen toplam RNA, ilk olarak GeneChip 39 IVT PLUS Reaktif Kiti (Affymetrix) kullanılarak tamamlayıcı RNA(cRNA)'ya amplifiye edildi ve biyotinlendi ve Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2'ye hibridize edildi.0 Diziler( Affymetrix), tüm genomu kapsayan 54.675 prob setinden oluşur. Bir Robust Multichip Average (RMA) normalizasyonu kullandık. Her mRNA'nın medyan normalize ifadesi, Wilcoxon testi kullanılarak vakalar ve kontroller arasında karşılaştırıldı. Benjamini & Hochberg yanlış keşif oranı (FDR) yöntemini uygulayarak çoklu testler nedeniyle risk alfa enflasyonunu kontrol ettik. Mikrodizi verileri, Mikrodizi Deneyi Hakkındaki Minimum Bilgi yönergelerine uygun olarak işlendi.

Siliko AnalizlerindeEnsembl ID notasyonu(18) kullanılarak transkriptomik veri diferansiyel analizi için Multiomik Deneylerin Biyolojik Yorumu(BIOMEX)yazılımı kullanıldı. Yaratıcılık Yolu Analizi (IPA, Yapı: 478438M İçerik sürümü:44691306, Qiagen) ve OMICSnet(19), seçilen miRNA'lar tarafından düzenlenen gen kümelerini belirlemek için kullanıldı. OMICSnet, tam yol (20) kullanılarak Reactome yolu veri tabanı ile Gene Ontology analizini gerçekleştirmek için kullanıldı. Gen ağları inşası tamamen denetimsizdi ve her bir genin ağdaki diğer tüm genlerle rapor edilen moleküler etkileşimlerinin sayısına dayanıyordu. En yüksek sayıda etkileşimi sunan genler otomatik olarak ağın merkezine yerleştirildi, daha az sayıda etkileşime sahip genler ise çevreye yayıldı. Seçilen miRNA'ların hücresel kökeni, insan hücreleri ve dokularında gen ekspresyonunun bir kap analizini sağlayan Fantom5 projesi(21) kullanılarak araştırıldı. miRNA ekspresyon analizi için, hepsini göz önünde bulundurduk.böbrek-ilgili yapısal hücreler ve dolaşımdaki tüm hematopoietik hücreler, başka seçim yapılmadan.

Tek Hücreli RNA Dizileme Veri Analiziİki ABMR biyopsisinden ve transplant gözetim biyopsilerine karşılık gelen dört sağlıklı referanstan daha önce yayınlanmış insan tek hücreli RNA dizileme (siRNA-seq) verileri kullanıldı. İlişkili ham sayımlar veya matrisler sırasıyla GEO(GSE145927, https://www.ncbi.nlm.nihgov/geo)(22) veBöbrekHassas Tıp Projesi (KPMP, https://atlas.kpmp.org/repository). Numune başına üretilen ham gen ekspresyon matrisleri birleştirildi ve Seurat V4 paketi (23) kullanılarak analiz edildi. Seurat nesnelerini oluşturmak ve filtrelemek için uygulanan parametreler şu şekildeydi: 500 ile 10000 arasında tespit edilen gen ve yüzde 25'ten az mitokondriyal transkript ifade eden hücrelerin dahil edilmesi. Filtrelemeden sonra, tüm nesneler Seurat (24) üzerindeki SCTransform entegrasyon iş akışı kullanılarak entegre edildi. Kısaca, PrepSCTIntegration işlevi kullanılarak entegrasyon için 3000 özellik kullanıldı ve toplu efekti sınırlamak için FindIntegrationAnchors işlevi kullanıldı. DimPlot işlevi ve ilk 16 ana bileşen kullanılarak tam bir Tekdüzen Manifold Yaklaşımı ve Projeksiyonu (UMAP) veri seti oluşturuldu. Kümeler, 0,6 çözünürlükte FindNeighbors ve FindClusters işlevleri kullanılarak oluşturulmuştur. Küme tanımlaması, her kümedeki belirli işaretçilerin ifadesi değerlendirilerek FeaturePlot işlevi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. DotPlot ve FeaturePlot çizim işlevleri kullanılarak, giriş verileri olarak RNA tahlilinde normalleştirilmiş sayımlar ile nokta çizimleri oluşturulmuştur.

CISTANCH BÖBREK/BÖBREK ENFEKSİYONUNU İYİLEŞTİRECEK

İstatistiksel analizHasta ve donör özellikleri, kategorik değişkenler için sayılar, yüzdeler ve frekanslarla tanımlandı. Normal dağılmışsa ortalamalar ve standart sapmalar (SD), çarpık dağılıma sahip değişkenler için medyanlar ve çeyrekler arası aralıklar (IQR) kullanarak sürekli değişkenleri bildirdik. Uygun olduğunda Fisher veya Wilcoxon testi kullanarak özelliklerini karşılaştırdık. MVI yoğunluğuna göre medyan miRNA ekspresyonunu karşılaştırmak için Kruskal-Wallis testini ve korelasyon analizi için Spearman testini kullandık. 0'dan küçük P değerleri için istatistiksel anlamlılığı düşündük.05. İstatistiksel analiz ve veri sunumu için GraphPad Prism(sürüm 8; GraphPad Software, San Diego, CA) ve RStudio (sürüm 4.0.3) kullandık. Aşağıdaki R paketleri kullanıldı: ısı haritası analizleri için ısı haritası3 (ısı haritası3_1.1.9), radar çizimleri için fmsb(fmsb_0.7.0) ve ölçekler (ölçekler_1.1.1) paketleri, çubuk grafikler için ggplot2 (ggplot2_3.3.5) ve korelasyon matrisi analizi için complot(düzeltilmiş_0.90).

SONUÇLAR

MVI-İlişkili miRNA'ların Çok Adımlı TanımlanmasıBetween April 2013 and July 2015,646 patients enrolled in the BIOMARGIN study provided 716 indication or surveillance biopsies. Inadequate biopsies (N=49), biopsies with no paired sample for research use(N=135)or samples not passing molecular biology QC(N=49) were excluded, leaving 483 samples from 441 individuals available for this study (Figure 1A). Baseline and clinical characteristics of the study groups are provided in Supplementary Tables S1-3, and the histological characteristics of the biopsies are provided in Supplementary Tables S4-6. In the discovery cohort, a total of 27 patients met the MVI composite endpoint(MVI+), defined as clinical ABMR diagnosis and/or any level of MVI(g and/or ptc>0). Diğer 59 hasta (MVI-), T hücre aracılı rejeksiyon(TCMR, N=8), interstisyel fibrozis ve tübüler atrofi (IFIA,N=20) ve normal biyopsileri(N{{6) içeren çeşitli tanılar sundu. }}),butno MVI.754 miRNA adayından 18 miRNA, MVI plus ve MVI- grupları arasında farklı şekilde eksprese edildi (Şekil 1B). Seçim kohortunda, 99 örnekte sınırlı bir 143 miRNA listesi ölçülmüştür. Bu seçim kohortunda, (N=28) olan ve olmayan (N=71)ABMR(Şekil 1C) vakalar arasında 14 miRNA farklı şekilde ifade edildi. Son olarak, en büyük kesitsel kohortta, 298 örnekte 38 miRNA'nın miktarı belirlendi ve bunların 12'si ABMR(N=29) ile ABMR (N=269) biyopsisi olmayan biyopsiler arasında diferansiyel olarak eksprese edildi (Şekil 1D). ).

6 MVI-İlişkili MiRNA'nın Tutarlı Tanımlanması ve Histolojiyle KorelasyonDaha sonra, farklı şekilde ifade edilen 3 miRNA listesini kesiştirdik ve 3 bağımsız kohortta MVI veya ABMR ile tutarlı bir şekilde ilişkilendirilen 6 miRNA belirledik(Şekil 2A).miR-142-3p,miR-150-5p,miR -155-5p, miR-222-3p ve miR-223-3p, MVI/ABMR'de aşırı ifade edilirken miR-139-5p ifadesi azaldı. Radar grafikleri (Şekil 2B), her adım için 6 miRNA'nın vaka ve kontrolleri arasındaki farklı ifadeyi gösterir ve üç bağımsız kohortta miRNA profillerinin sağlamlığını destekler. Daha sonra, birlikte alınan 483 allogreft biyopsisinin tamamında 6 miRNA ifadesinin bireysel histolojik lezyonlarla nasıl ilişkili olduğunu inceledik. Yukarı regüle edilmiş 5 miRNA'nın ifadesi, MVI lezyonlarının yoğunluğu ile kademeli olarak artarken, miR-139-5p ifadesi negatif korelasyon gösterdi (Şekil 2C).MiR-139-5p/142-3p/ 150-5p/155-5p/223-3p yalnızca ABMR ile ilgili özelliklerle (g, ptc, C4d birikimi) değil, aynı zamanda TCMR ile ilgili lezyonlarla da (i, t ) ve IFTA lezyonları(ct, ci), bunların ortak, ABMR'ye özgü olmayan, inflamatuar ve skarlı süreçlere dahil olduklarını düşündürür. Alternatif olarak, lezyonlar arasında doğası gereği bir miktar içsel bağlantı olabilir ve bu da bir lezyon için gerçek özgünlüğü belirleyemememize neden olabilir. MiR-222-3p, TCMR veya IFTA'nın histolojik lezyonları ile korele değildi (Şekil 2D).

Çoklu Omics Entegrasyonu: MV'de mRNA-miRNA EtkileşimiDaha sonra, daha önce yayınlanmış keşif setinde (25) MVI plus ve MVI- vakaları arasındaki diferansiyel olarak eksprese edilen genleri değerlendirdik.

1085 aşağı regüle ve 1670 yukarı regüle gen içeren gruplar (Şekil 3A). MVI artı numunelerinde en farklı şekilde eksprese edilen mRNA'lar, bu genlerin ABMR'de en fazla aşırı eksprese edildiğine dair önceki raporlara (17,26) paralel olarak CXCL9 ve CXCL10'du. Daha sonra, her bir miRNA için varsayılan hedef genleri siliko olarak tanımlamak için IPA ve OMICSnet'i kullandık. Toplam 4504 mRNA'nın 6 miRNA'dan en az biri tarafından hedeflendiği tahmin edilmiştir. Ardından, bu 4504 öngörülen hedefleri, allogreft biyopsilerinde DEG'lerle entegre ettik. Entegre miRNA/mRNA analizi, MVI artı biyopsilerde önemli ölçüde artan miR-139-5p tarafından hedeflenen 61°'yi tanımladı. Ayrıca, sırasıyla miR-142-3p, miR-150-5p, miR-155-5p, miR{ tarafından hedeflenen MVI artı biyopsilerde 28, 58,52,43 ve 27°'nin önemli ölçüde azaldığını tespit etti. {22}}p ve miR-223-3p (Şekil 3B).

MV ile İlişkili miRNA'ların Hücresel KökeniAltı miRNA'nın hücresel kökeni, çeşitli şekillerde karakterize edildi.böbrekçevrimiçi olarak mevcut miRNA atlası kullanan hücre ve hematopoietik hücre alt tipleri [Fantom veritabanı (27)]. Denetimsiz kümeleme ayrımcılığa uğradıböbrekimmün hücre kaynaklı miRNA'lardan hücre kaynaklı miRNA'lar (Şekil 4A). Ayrıca her miRNA için bir veya iki baskın hücre tipini ortaya çıkardı. MiR-139-5p'nin esas olarak glomerüler endotel hücreleri (EC) tarafından ifade edildiği görülmüştür. MiR-222-3p, ekspresyonu tübüler inflamasyon ile ilişkili olmasa da (Banff lezyonları"t", Şekil 2D), öncelikleböbrekepitel hücreleri. Kalan dört miRNA birincil olarak periferal kan mononükleer hücrelerinde (PBMC) veya granülositlerde ifade edildi, miR-142-3p NK hücreleri ve monositlerde zenginleştirildi, miR-150-5p CD4 plus ve CD8 plus T hücreleri, miR CD19'da -155-5p artı B hücreleri ve makrofajlar ve nötrofillerde miR-223-3p.

Tek Hücreli RNA Dizilimi Tüm Böbrek Hücrelerini ve İnfiltre Edici Bağışıklık Hücrelerini Tanımladı Her MVI ile ilişkili miRNA'nın potansiyel rolünü karakterize etmek için, iki kaynaktan halka açık sc-RNAseq verilerini analiz ettik.böbrekABMR ve yüksek MVI skorları (g2, ptc3)(22) olan allogreft biyopsiler. Bu veri setleri, MVI içermeyen 4 sağlıklı referans biyopsi ile entegre edilmiştir. Kalite kontrol ve filtrelemeden sonra 31545 hücre tespit edildi ve denetimsiz kümeleme 12 küme ortaya çıkardı (Şekil 4B). Tüm ana yerleşik ve sızan hücre alt tiplerini tanımlamak ve bunları etiketlemek için yerleşik belirteçler (28) kullandık (Ek Şekil S2). Daha sonra, altı miRNA'mızın kaynaklandığı düşünülen hücre popülasyonlarına odaklandık. Bu amaçla, hücreleri endotel, epitel, lenfositler ve APC'lere karşılık gelen 4 ana kümeye ayırdık (Şekil 4C). Bu verilerin önceki analizine uygun olarak (22) sc-RNASeg veri setlerinde ne nötrofilik ne de NK hücre popülasyonları tespit edilmedi.

miR-139-5p, MVI Sırasında EC Aktivasyonunu ve Antijen Sunum Yolunu Kontrol EderMiR-139-5p, MVI/ABMR'li vakalarda çalışmamızdaki tek aşağı regüle edilmiş miRNA idi (Şekil 2A) ve esas olarak glomerüler EC'den kaynaklandığı bulundu(Şekil4A). Hedef genlerinden altmış birinin, MVI plus vakalarından toplu mikrodizide yukarı doğru düzenlendiği doğrulandı (Şekil 3B) ve ekspresyonları, daha önce tanımlanmış 3 EC alt kümesinde (Şekil 4B,C) tek hücreli çözünürlükte ayrıca araştırıldı. Şekil 5A'da gösterildiği gibi, etkinleştirilmiş ECcluster yalnızca MVI artı numunelerde saptanabilirdi. Ayrıca, üç EC alt kümesinden bağımsız olarak sc-RNAseq MVI artı biyopsilerde 61 genin (N=30) yarısı tutarlı bir şekilde arttırıldı. Bunlar arasında GBP5 en fazla artan gendi. Daha sonra, bu 30 endotel kaynaklı transkript kullanılarak yapılan gen ontoloji analizi, UBE2D1 ve YWHAG'ı gen ağındaki merkezi oyuncular olarak tanımladı(Şekil 5B). Daha spesifik olarak, bağışıklıkla ilgili yollar ve majör histo-uyumluluk kompleksi (MHC) aracılı antijen işleme ve sunum yolları zenginleştirildi (Şekil 5C). EC aktivasyonu sırasında gen ekspresyonu değişikliklerini daha iyi karakterize etmek için sözde zaman analizi yapıldı, Hücreler arası durum yörüngesi (Şekil 5D, E), UBE2D1, YWHAG ve GBP5, MVI ile ilişkili endotel aktivasyonu sırasında sürekli arttı. MHC ile ilişkili genler HLA-A, -B ve -DRA için değil, aynı zamanda bonafid endotel aktivasyonu ve VCAM1, CXCL9 ve CXCL10 gibi inflamasyon belirteçleri için de çok benzer yörüngeler bulundu; bu, tüm bu genlerin endotel aktivasyonu sırasında eşzamanlı olarak eksprese edildiğini düşündürmektedir. Toplamda, bu sonuçlar miR-139-5p'nin MV lezyonları sırasında azaldığını ve aktive EC'de MHC antijen sunum yolunu artık baskılamadığını göstermektedir.

miR-222-3p Her İkisini de EtkilerböbrekMVI Sırasında Epitel Hücrelerinde Fizyolojik ve Bağışıklıkla İlişkili Yollar Daha sonra, MVI örneklerinde yukarı regüle edilmiş bir miRNA olan miR-222-3p'ye odaklandık.böbrekepitel hücre orijini ve ABMR ile ilişkili histolojik lezyonlarla daha özel bir korelasyon (Şekil 2A, D,4A). Toplu allogreft dokusunda, hedef genlerinin 43'ünün ekspresyonu aşağı regüle edildi (Şekil 3B) ve ayrıca tek bir testte değerlendirildi. farklı hücre çözünürlüğüböbrekdaha önce tanımladığımız epitel popülasyonları (Şekil 4B, C). Tanımlanan tüm bu 43 genin (yüzde 95) 41'inde büyük bir azalmaböbrekepitel hücre kümeleri bir gen susturma önerir

VMI'deki profil(Şekil 6A). İlginç bir şekilde, dahil olan 4 genböbrekfizyolojik yollar (ERBB4, ATPIB1, TIMM50 ve KIF3B), aynı zamanda bağışıklıkla ilgili genler (TRAPI ve PEBPI) ağdaki merkezi genler olarak tanımlandı(Şekil 6B). 43 genlerinin gen ontolojisi, ErbB sinyal yollarında ve aynı zamanda bağışıklıkla ilgili yollarda ve sitokin tepkisinde (Şekil 6C) zenginleşmeyi ortaya çıkardı ve ERBB4 ekspresyonu, hepsinde daha fazla doğrulandı.böbrekhücreler(Şekil 6D). Toplamda, bu sonuçlar VMI sırasında yüksek düzeyde bir-222-3p olduğunu göstermektedir.böbrekepitel hücreleri, her ikisinde de yer alan genlerin güçlü bir şekilde bastırılmasıyla ilişkilidir.böbrekepitelde elektrolit homeostaz yolları ve bağışıklıkla ilgili yollar.

miR-150-5p MVI Sırasında T Lenfositlerinde NF-kB Aktivasyonunu Düzenler Benzer şekilde, MVI sırasında (artan) miR-150-5p'nin T hücre kümesindeki düzenleyici rolünü araştırdık, burada en baskın olarak ifade edildi (Şekil 4A). Toplu allogreft biyopsi örneklerinde tanımlanan 58 azalmış MVI ile ilişkili DEG'yi çizdik (Şekil 3B) ve bunu sc-RNAseq T-hücre kümesindeki gen ekspresyonu ile karşı karşıya getirdik(Şekil 7A). Hem miR150-5p tarafından hedeflenen hem de MVI sırasında T-hücrelerinde spesifik olarak eksik ifade edilen genlerin oranı şaşırtıcı derecede düşüktü (yüzde 15/58,25,9) ve bu genlerin in vivo küresel azalmasının yalnızca T lenfosit bölmesi. Yine de, bu yüksek oranda seçilmiş 15 gen listesinden ve OMICSnet platformunu kullanarak bir gen ağı oluşturduk(Şekil 7B) ve gen ontoloji analizi yaptık (Şekil 7C).miR-150-5p aşırı ifadesinin NF ile ilişkili olduğunu gözlemledik. MVI sırasında T lenfositlerinde -KB regülasyonu.

miR-155-5p, MV Sırasında APC'lerde mRNA Eklemesini Düzenler Son olarak, MVI sırasında yetersiz ifade edilen 52miR-155-5p-hedef genleri için tam olarak aynı strateji uygulandı(Şekil 3B).T lenfositlerdeki miR-150-5p'nin aksine, neredeyse üçte ikisinin miR-155-5p hedefli genlerin yüzdesi, APC sc-RNAseq kümesinde tutarlı bir şekilde azaldı (yüzde 31/52,59,6, Şekil 8A). Gen ağı analizi, AIFMI ve CIAO1'in merkezi genler olduğunu ortaya çıkardı (Şekil 8B). Ayrıca, gen ontolojisi, mRNA eklenmesiyle ilgili yollarda güçlü bir zenginleşme ortaya çıkardı (Şekil 8C).

TARTIŞMABenzersiz tasarımıyla BIOMARGIN çalışması, çoklu omik veri entegrasyonu için tipik bir çerçevedir. Gerçekten de, farklı transplantasyon merkezlerinden çok sayıda hastayı kapsayan hem keşif, hem seçim hem de doğrulama kohortlarında çok sağlam boru hatları kullanıldı. Üç bağımsız kohortta, MVI sırasında 6 miRNA'nın kendine özgü ifade profilini eşzamanlı olarak gözlemledik ve doğruladık: miR-139-5p azalırken miR-142-3p/150-5p/{{5} }p/222-3p ve miR-223-3p artırıldı. Önemli olarak, bu 6 miRNA'nın her birinin seviyesi, doza bağlı bir düzenleme mekanizmasını öne sürerek MVI şiddeti ile korele idi. Daha sonra her miRNA hücresel kökenini araştırmak için silikon platformlarda kullandık. Çarpıcı bir şekilde, iki farklı miRNA grubu gözlemlendi: ilki sızan bağışıklık hücrelerinden türetilmiş ve ikincisi yerleşiklere daha spesifikböbrekhücreler. Daha sonra, hem miRNA'lar hem de mRNA'lar, aynı keşif biyopsi örnekleri setinde ölçülmüştür ve MVI ile ilişkili in vivo doğrulanmış farklı şekilde eksprese edilmiş mRNA'ların/miRNA'ların entegre bir analizine izin vermiştir. Son olarak, toplu doku çözünürlüğünde mRNA'lar/miRNA'lar ilişkisini tanımladıktan sonra, tanımlanan 6 miRNA'dan dördü için mRNA'ların/miRNA'ların tek hücreli çözünürlükte etkileşime girdiğini doğruladık.

İlginç bir şekilde, miR-139-5p, MVI lezyonları ile negatif korelasyon gösteren tek miRNA idi. Esas olarak EC kaynaklıdır ve MHC ile ilgili genleri düzenlediği bildirilmiştir. Hedef genleri arasında UBE2D1, MVI ile ilişkili endotel aktivasyonu sırasında yüksek oranda regüle edildi. UBE2D ailesi, ubikuitin-proteazom sistemindeki (29, 30) bir E2 ubikuitin-konjuge edici enzim ailesidir ve UBeD1'in, MHC sınıf II proteinlerinin (31) yukarı düzenlenmesine yol açan March-I ubiquitinasyonunu geliştirdiği gösterilmiştir. Ek olarak GBP5, MVI sırasında en çok temsil edilen gen inaktive edilmiş EC idi ve bu, GBP5'in ABMR biyopsilerinde(17) ve aynı zamanda kan örneklerinde(32) yüksek oranda yukarı regüle edildiğini gösteren son raporlarımızla uyumludur. İlginç bir şekilde, GBP5 ekspresyonunun, CXCL9 ve CXCL10(33) ile birlikte insan uterin mikrovasküler endotelyal hücrelerinde tip II interferon tarafından indüklenebilir olduğu gösterilmiştir. Bu iki proinflamatuar kemokinin akut rejeksiyon süreçlerindeki erken rolü iyi belgelenmiştir ve böbrek transplant alıcılarının rutin sürveyansında akut rejeksiyon riskini izlemek için idrardaki seviyeleri önerilmektedir (34). Başka bir miR-139-5p hedefi YWHAG.YWHAG'dir ve HLA-F protein ailesini kodlar ve diyabetik nefropatide aktif profibrotik süreç sırasında farklı şekilde eksprese edildiği tarif edilmiştir (35). miR-139-5p'nin enflamasyondan sonraki son ortak yol olan fibrozisteki olası rolü, ABMR'den sonra böbrek allogreft sağkalımını tahmin etmek için IFTA'nın yakın zamanda bir bileşik skora dahil edilmiş olmasıyla çok daha alakalıdır(36). Toplamda, bu sonuçlar, miR-139-5p'nin artık MVI sırasında Anethum yüzeyinde MCH antijen ekspresyonunu baskılamadığını ve kemo-çekilme ve fibroz sürecine katılması gerektiğini, ancak bu mekanizmaların MVI sırasında endotel yüzeyinde deneysel olarak doğrulanmış ekspresyon olarak kaldığını ve kemoatraksiyon ve fifibroz süreçlerine katılabilir, ancak bu mekanizmalar deneysel olarak doğrulanmaya devam etmektedir.

İkinciböbrekTanımladığımız türetilmiş miRNA, ekspresyonunun MVI lezyonlarına daha spesifik olduğu bulunan miR-222- 3p'dir: C4d birikiminin yanı sıra g ve PTC skorları ile ilişkilidir, ancak i veya t lezyonları ile ilişkili değildir. Bununla birlikte, esas olarak epitel hücrelerinden kaynaklanır. Hücre çözünürlüğünde multi-omik entegrasyondan sonra miR-222-3p'nin esas olarak çoğalma, göç, büyüme ve farklılaşma gibi temel hücresel işlevler için çok önemli olan ErbB sinyalini baskıladığını belirledik (37). İnsan biyolojisinde, fizyolojik ErbB sinyallemesi için gereklidir.böbrekelektrolit dengesi ve böbrek bütünlüğünün korunması (38). Sonuçlarımız ayrıca ADAM22, NRG1, ZNF91'i, MVI sırasında epitelde belirgin şekilde bastırılan ErbB sinyali ile ilgili genler olarak tanımladı. ATP1B1 ve KIF3B gibi böbrek fizyolojisi için gerekli olan diğer genler de MVI sırasında böbrek epitelinde miR-222-3p tarafından bastırılmıştır. Daha önce, Baker ve ark. ATP1B1'in (Na artı /K artı -ATPase'in b1 alt birimi) sürdüğünü gösterdiböbreksodyumun tübüler geri emilimi (39). Ayrıca Aguado-Fraile ve ark. Kinesin Ailesi Üyesi 3B'yi (KIF3B) sıçan proksimal tübül hücrelerinde hücre kaçakçılığına dahil olarak tanımladılar. KIF3B, potansiyel uygulama ile iskemi/reperfüzyona proksimal epitelyal tübül hücre yanıtının önemli bir aracısı olarak görünmektedir.böbrekiskemik hasar yönetimi (40). Bu nedenle miR-222-3p'nin epiteldeki MVI sırasında temel fizyolojik yolları bastırdığını tahmin edebiliriz. Ayrıca, bağışıklıkla ilgili yollar da miR-222-3p aşırı ekspresyonu tarafından düzenlenir: TRAP1 ve PEBP1 gibi önemli genler, güçlü MVI'ye sahip numunelerde tamamen inhibe edilmiştir. İlginç bir şekilde, TRAP1'in iyileştirdiği gösterildiböbrekkoruyarak tek taraflı üreter tıkanıklığı olan farelerde tubulointerstisyel fifibrozböbrektübüler epitel hücreli mitokondri (41). Ayrıca PEBP1, homeostatik/bazal koşullar altında hem MAPK hem de NF-kB yolaklarının inhibisyonu yoluyla anti-inflamatuar etkiler sağlar (42). İçindeböbrekepitel, Marko ve ark. iskemik sonrası NF-kB aktivasyonunun tübüler hasarı şiddetlendirdiğini ve inflamasyonu alevlendirdiğini zarif bir şekilde gösterdi (43). Elimizde, PEBP1 miR-222-3p tarafından tamamen bastırılmıştır, bu da NF kB yolunun MVI sırasında serbest bırakıldığını düşündürür. Toplamda, bu sonuçlar MVI sırasında epitel biyolojisinin bozulduğunu veböbrekepitel hücreleri, MVI yaralanmalarına aktif olarak yanıt verirken, bu dokunun MVI'daki katılımı nadiren ele alınmaktadır. Bu moleküler bulgular, köklü, ancak uzun süredir ihmal edilen bir ABMR kriteri olan akut tübüler yaralanma lezyonlarına yeni bir ışık tutabilir. Ayrıca epitel hücrelerinin eksozomal miR-222-3p salgılayabildiği ve makrofajlarda M2 fenotipini indükleyebildiği gösterilmiştir (44). Bu arada, Li ve ark. çok yakın zamanda, M2 makrofajlarının miR-155'yi aşırı eksprese ettiğini ve bu miRNA'yı eksozomlar salgılayarak mikroçevreye ilettiğini bildirdi. Böbrek naklinde miR-155 çeşitli durumlarda (IFTA, akut rejeksiyon ve TCMR) ve vücut sıvısı veya dokularında artmıştır (45). İlginç bir şekilde miR- 155, epitel hücrelerinde RASSF4'ü hedefleyerek epitelyal-mezenkimal geçişi destekleyebilir (46). Makrofajlar ve arasındaki bu miRNA tabanlı karışmaböbrekepitel hücreleri değerlendirilmeyi beklemektedir.böbrek naklive daha özel olarak MVI bağlamında. Bu bulgular doğrultusunda miR-155-5p'nin temel olarak monositleri ve makrofajları kapsayan APC'ler tarafından ifade edildiğini gözlemledik. Bu özel alt kümede, miR- 155-5p-hedef-genleri ontolojisi, premRNA birleştirme yollarında zenginleşmeyi ortaya çıkardı. İlginç bir şekilde, Janssen ve ark. akciğer iltihabının alveolar makrofajlarda mRNA öncesi ekleme yollarını indüklediğini bildirdi. Ayrıca, mRNA öncesi ekleme aktivasyonu, dokuda yerleşik makrofajlarda (kandan alınan) monosit türevli makrofajlara kıyasla farklılık gösterdi. İşe alınan makrofajlarda çekirdek metabolizmasındaki değişiklikler, glikoliz yoluyla artan akış ve trikarboksilik asit döngüsü (TCA döngüsü, yani Krebs döngüsü) yoluyla azalan akış ile rapor edilmiştir (47). MiR-150-5p ile ilgili olarak, MVI sırasında aşırı ekspresyonunun hem doğuştan gelen NKT hücrelerini hem de adaptif T hücrelerini kapsayan lenfosit kümesindeki NF-kB yolu ile ilişkili olduğunu bulduk. İlginç bir şekilde miR-150-5p, olgun ve fonksiyonel NK hücreleri (48) oluşturmak için çok önemlidir ve miR-150-5p eksikliği olan CD8 artı T hücrelerinin daha az sitotoksik olduğu rapor edilmiştir (49). Ayrıca, CD8 T hücreleri eksozomlarda (50) miR-150-5p salgılayabilir ve bu da tübüler epitel hücrelerinde fibroblast aktivasyonunu ve ardındanböbrekson raporlarda önerildiği gibi fifibroz (51, 52).

CISTANCH BÖBREK/BÖBREK FONKSİYONUNU İYİLEŞTİRECEK

Çalışmamızın bazı sınırlamaları vardır. Araştırmamızı, çok adımlı tasarımımızda tutarlı bir şekilde tanımlanan 6 miRNA'ya odakladık. Bununla birlikte, doğrulama kohortunda ölçülen tüm bilinen miRNA'ların yalnızca bir kısmı ile adım adım bir miRNA seçimi ile devam ettik. miRNA seçimi için istatistiksel yol, BIOMARGIN'in çoklu uç noktalar (ABMR, ayrıca TCMR ve IFTA) için tanısal biyobelirteçleri tanımlamaya uygun ilk tasarımına dayanıyordu. Bu nedenle, keşif ve seçim kohortlarında önemli ölçüde artmış olsa da (Şekil 2A), miR-146a doğrulama kohortunda ölçülmemiştir. Böylece, literatür böbrek transplantasyonunda iskemi/reperfüzyonda (53) ve alloimmün yanıtların Treg aracılı kontrolünde (54) bir rol öne sürse de, miR-146a seçim sürecimizden fiilen hariç tutulmuştur. Ayrıca, daha güçlü bir numune boyutunun, seçim kohortunun ABMR durumlarında farklı şekilde ifade edilen miR-138 (aşağı) ve miR-511 (yukarı) gibi daha fazla miRNA üreteceğini göz ardı edemeyiz ve keşif kohortunda da aynı yönde bir eğilim göstermiştir. Ayrıca, kendi biyopsi numunelerimizde sc-RNAseq analizi yapmadık, ancak çevrimiçi olarak mevcut bir sc-RNAseq veri setini kullandık. Çalışma tasarımı ve biyopsi örneklerinin toplanması sırasında, scRNAseq teknolojisi gerçekten de henüz mevcut değildi ve taze toplanmış örneklere duyulan ihtiyaç, dondurulmuş veya parafine gömülmüş örneklerin geriye dönük kullanımına izin vermiyordu. Benzer şekilde, mRNA profili oluşturma, o zamanlar yeni nesil RNA-seq tarafından daha iyi performans gösteren kıyaslama teknolojisi olan mikrodiziler kullanılarak yapıldı. Çevrimiçi olarak mevcut bir sc-RNAseq veri kümesinin kullanılması, hastaların temel demografik özelliklerini bildirme yeteneğimizi sınırlandırmaktadır. Bu eksik bilgi, nüfus gruplarının temsil edilebilirliği konusunda endişe uyandırabilir. Ayrıca, sıralamanın herhangi bir teknik yönünü kontrol etmedik. Bu nedenle seçilen çözünürlükte sc-RNAseq analizimiz bu örneklerde herhangi bir nötrofil veya NK hücre kümesi saptamadı. Bu nedenle, miR-142-3p ve miR-223-3p'nin aşağı akış analizlerimiz, ilgili hedef gen ağlarını ve ontolojilerini oluşturmakla sınırlıydı (Ek Şekil S2) ve herhangi bir tek hücreli çözünürlük araştırmasına izin vermedi. Bununla birlikte, miR-223-3p'nin 27 hedef geninin gen ağı ve ontolojisi, ERBB sinyali ile birlikte TCA döngüsünün (Ek Şekil S2) zenginleştirildiğini ortaya koydu. Dolayısıyla hem monositlerdeki miR-155-5p'nin hem de nötrofillerdeki miR-223-3p'nin MVI sırasında bu hücreler tarafından devreye giren metabolizma ve inflamatuar yanıtta rol oynadığını tahmin edebiliriz. Ayrıca, miR-142-3p'nin böbrek allogreft reddinde arttığı zaten gösterilmiştir (9, 55, 56), ancak şimdiye kadar spesifik olarak ABMR ile ilişkilendirilmemiştir. Çalışmamızın bir diğer sınırlaması, nadir görülen infiltre hücrelerdeki spesifik gen ekspresyon değişikliklerinin toplu gen ekspresyon analizinde maskelenebilmesidir. Bu nedenle, tüm, hatta nadir hücre alt tiplerinin uygun şekilde araştırılmasına izin vermek için daha fazla numune içeren ileri çalışmalar gereklidir, ancak şu anda tekniğin nispeten yüksek maliyeti nedeniyle sınırlıdır.

Sonuç olarak, burada ABMR ile ilgili ana histolojik hasar olan MVI ile ilişkili moleküler yolları araştırdık. Kullanılan entegre omik yaklaşımı, MVI ile ilgili yeni yolları ortaya çıkarmamızı sağladı ve tübüler epitelyal metabolizma değişikliklerinin, yakındaki endotel bölmesinin ötesinde ABMR'nin bir sonucu olarak meydana geldiğini öne sürdü. Çalışmamız, multi-omiklerin hastalık mekanizmalarını çözme konusundaki büyük potansiyelini göstermekte ve aralarındaki karşılıklı konuşmayı daha fazla aydınlatmak için yeni araştırmaların yolunu açmaktadır.böbrekyerleşik ve allogreft infiltre hücre alt kümeleri.