C57BL/6 Farelerinin NKCC2'sindeki Beş Amino Asit Silinmesi, NKCC2 Fosforilasyonunun Analizini Etkiler, Ancak Böbrek Fonksiyonunu Etkilemez
Feb 19, 2022
GİRİİŞ
Memelinin kalın çıkan kolu (TAL)böbrekhücre dışı sıvı hacminin, idrar konsantrasyonunun, kalsiyum (Ca 2 artı ) ve magnezyum (Mg 2 artı ) homeostazının yanı sıra pH dengesinin kontrolü için çok önemlidir. 1 TAL'deki ana Na artı taşıma yolu, özellikle loopdiüretikler tarafından inhibe edilen Na artı - K artı - 2Cl - kotransporterdir (NKCC2). 1 Na artı , K artı ve 2Cl − iyonlarının NKCC2 yoluyla birlikte taşınması elektronötraldir, ancak apikal yoluyla elektrojenik K artı salgılanmasına bağlıdır. böbrekdış medulla K artı kanal ROMK. 2 NKCC2'nin ROMK ile etkileşimi, Na artı yeniden emilimini artıran ve Ca2 plus ve Mg2 plus'ın hücre dışı taşınmasını sağlayan bir lümen-pozitif elektrokimyasal gradyan yaratır. 3 TAL için NKCC2'nin önemi veBöbrek fonksiyonuNKCC2'deki fonksiyon kaybı mutasyonlarının neden olduğu genetik bir bozukluk olan Bartter tip I sendromu ile örneklenir.böbrektuz ve sıvı kaybı, hipokalemik metabolik alkaloz ve hiperkalsiüri. 3
NKCC2, aynı zamanda her yerde eksprese edilen NKCC1'i ve distal kıvrımlı tübüle (DCT) spesifik Na artı - Cl - yardımcı taşıyıcıyı (NCC) içeren membran taşıma proteinlerinin çözünen taşıyıcı ailesi 12'nin (Slc12) üyesidir. 2 NKCC2'nin aktivitesi, sitoplazmik N-terminal kuyruğundaki birkaç serin ve treonin tortusunda ortak taşıyıcının fosforilasyonu ile pozitif korelasyon gösterir. 4 Bu fosforilasyon bölgelerini çevreleyen amino asit dizileri yüksek oranda korunur ve NKCC2, NKCC1 ve NCC arasında yüksek derecede benzerlik gösterir. 2 NKCC2'nin fosforilasyonu birkaç hormonal ve hormonal olmayan yolla uyarılır. Arginin vazopressin (AVP) ve anjiyotensin II (ANGII) gibi hormonlar, artan cAMP üretimi ve protein kinaz A'nın (PKA) aktivasyonu yoluyla NKCC2'yi uyarır. 5 PKA'nın, NKCC2 içeren veziküllerin ekzositozunu ve dolayısıyla apikal plazma zarındaki taşıyıcının bolluğunu artıran Ser126'da NKCC2'yi doğrudan fosforile ettiği düşünülmektedir. 6 Benzer şekilde, hücre içi klorür konsantrasyonlarındaki değişiklikler NKCC2 fosforilasyonunu düzenler. Hücre içi Cl − konsantrasyonunda azalma, nolizin(K) kinazları WNK1 ve WNK4'ü fosforile etmek ve aşağı akış kinazları Ste20- ile ilgili prolin alaninden zengin kinaz (SPAK) veya oksidatif strese duyarlı kinaz 1'i (OXSR1) aktive etmek için uyarır ). 7- 9 NKCC2'de bir "RFxV" motifine bağlandıktan sonra, bu kinazlar daha sonra NKCC2'yi iki treonin tortusunda (T96 ve T101) fosforile eder. 2 Bu kalıntıların fosforilasyonuna fosfataz kalsinörin aracılık eder, bu da NKCC2'nin birkaç sinyal yolu için bir hedef olduğunu vurgular. 10
NKCC2 fonksiyonunu incelemek için, bizimki dahil birçok grup Thr96 ve/veya Thr101'e karşı fosfoforma özgü antikorlar geliştirdi. 11- 17 Antikorlar, 7,11,17,18,19,20 heterolog ekspresyon sistemlerinde ve sıçanlar 10,21,22,23,24,25 ve fareler dahil hayvan modellerinde NKCC2 fosforilasyonunu değerlendirmek için kullanıldı. 14,15,16,17,19,26,27 Ancak pT96/101 NKCC2 antikorumuzu kullanırken farklı fare modellerimizde tutarsız sonuçlar elde ettik. 129Sv genetik arka planda farelerden alınan böbreklerde güçlü pNKCC2 sinyalleri tespit ederken, C57BL/6 farelerinden böbreklerde güvenilir pNKCC2 sinyalleri alamadık ancak pNKCC2 antikorlarının pNCC ile çapraz reaktivitesini gözlemledik. JA McCormick ve AA McDonough (kişisel iletişim) dahil olmak üzere diğer laboratuvarlar da benzer gözlemler yaptı. 18,28,29 Ayrıca, farelerde çarpıcı suş farklılıkları tanımlanmıştır.böbrek129Sv farelere kıyasla C57BL/6'da önemli ölçüde daha düşük idrar Ca2 artı atılımı içeren fonksiyon 30. 31 Bu nedenle, C57BL/6 farelerinin, NKCC2 fosforilasyonunu etkileyen ve muhtemelen NKCC2'nin genetik bir varyantını ifade ettiğini varsaydık.Böbrek fonksiyonuBu, gözlemlenen gerinim farklılıklarını açıklar. Aşağıdaki çalışma, bu hipotezi sistematik olarak test etmek için tasarlanmıştır.
Anahtar Kelimeler:iyon dengesi, böbrek, NKCC2, fosforilasyon, gerinim farklılıkları
SONUÇLAR
2.1|C57BL/6 fareleri, NKCC2'de fosforile edilmiş NKCC2'nin saptanmasına müdahale eden beş amino asit delesyonuna sahiptir.İlk olarak, anti-pNCC ve anti-pNKCC antikorları tarafından tanınan epitoplara karşılık gelen NKCC2 ve NCC'nin (sırasıyla Şekil 1A,B) yayınlanmış N-terminal amino asit dizilerini (Tablo S1'deki transkripsiyon ID'leri) birkaç tür için hizaladık. (Şekil 1C). Hizalama, muhtemelen bizim ve başkaları tarafından gözlemlenen pNKCC2 ve pNCC antikorlarının çapraz reaktivitesini açıklayan NKCC2 ve NCC 7'nin fosforilasyon bölgelerinin yüksek derecede korunmasını doğruladı. 18,28,29 Hipotezimizle ilginç ve tutarlı bir şekilde, hizalama ayrıca C57BL/6 farelerinden (ΔF97- T101) NKCC2 dizisinde şimdiye kadar takdir edilmeyen beş amino asit silinmesini yeniden ortaya çıkardı (Şekil 1A) . ABD'deki Jackson Laboratuvarı'nda veya Fransa'daki Janvier Laboratuvarları'nda tutulan iki farklı C57BL/6 fare kolonisinden DNA'nın sekanslanması, C57BL/6 NKCC2'nin 2. ekzonunda yukarıda belirtilen amino asitlerin silinmesine karşılık gelen bir nükleotit silinmesini doğruladı (Şekil S1 ,Tablo S2).
Beş amino asit delesyonunun toplam ve fosforile edilmiş NKCC2'nin immünodeteksiyon üzerindeki etkisini karakterize etmek için, immünohistokimya ve immünoblotlama yoluyla C57BL/6 ve 129Sv farelerinin böbreklerini sistematik olarak inceledik. Toplam NKCC2'ye karşı bir antikor ile immünofloresan, 129Sv ve C57BL/6 farelerinin TAL'lerinin apikal plazma membranında güçlü bir floresan sinyali gösterdi. Bununla birlikte, daha önce geliştirilen pT96/T101 NKCC2 antikorumuz, yalnızca 129Sv farelerde TAL'lerin güçlü bir apikal etiketlemesini gösterirken, C57BL/6 farelerinin TAL'leri çok zayıf bir immün boyamaya sahipti (Şekil 1D). Bununla tutarlı olarak, Western blot analizi, her iki fare türünde de toplam NKCC2 için güçlü bir bant ortaya çıkarırken, pT96/T101 NKCC2 antikoru, yalnızca 129Sv farelerde beklenen boyutta (170 kDa) güçlü bir bant tespit etti (Şekil 1E). Bunun yerine, C57BL/6 farelerinin böbrekleri, NCC'nin beklenen boyutuna karşılık gelen 130 kDa'da bir bant ortaya çıkardı (Şekil 1E). Daha önce NKCC2 fosforilasyonunu incelemek için kullanılan diğer antikorlarla benzer sonuçlar elde edildi (Şekil S2). pT212/T217 NKCC1 R5 antikoru 11, pNCC sinyaline ek olarak, pNKCC2 için beklenen boyutta zayıf bir sinyal gösterdi (Şekil S2). pNKCC2 için immünoreaktif bant, taze olduğunda daha yoğun hale geldi.böbreklizatlar kullanıldı. Deterjanlı bir lizis tamponunun (RIPA tamponu) kullanılması sinyal yoğunluğunu iyileştirmedi ancak azalttı (Şekil S3).
ŞEKİL 1 pT96/T101 NKCC2 antikoru, C57BL/6 farelerinde görünür bir pNKCC2 sinyali algılamaz. A, NKCC2 amino asitleri, farklı türlerin dizi hizalaması ve iki fare suşu 129Sv ve C57BL/6. Farklı türler için NKCC2 dizi kimlikleri Tablo S1'de listelenmiştir. Murin Thr96'ya murin Thr101'e karşılık gelen yüksek oranda korunmuş bölge gri renkle işaretlenmiştir. B, NCC'nin farklı türlerde amino asit dizi hizalaması. Farklı türler için NCC dizi kimlikleri Tablo S1'de listelenmiştir. C, Thr96 ila Thr101 civarında korunmuş lokusta pT53 veya pT58NCC'yi ve ayrıca pNKCC2'yi tanıyan yaygın olarak kullanılan ve yayınlanmış antikorların epitoplarının listesi. D, 129Sv ve C57BL/6 arka planına sahip farelerin ardışık kriyo-kesitlerinde toplam ve pT96/T101 NKCC2'nin immüno-lekelemesi. Ölçek çubuğu=50 µm. E, toplam immünoblot ve 129Sv ve C57BL/6 arka planına sahip farelerin pT96/T101 NKCC2'si. Değerler ortalama ± SEM, grup başına n=5 faredir, yeşil oklar belirli bantları gösterirken kırmızı ok uçları spesifik olmayan bantları gösterir. Moleküler ağırlık belirteçleri dahildir. Toplam ve pT96/T101 NKCC2 bantlarının 170 kDa'da olması bekleniyor. F, farklı geçmişlere sahip NCC WT ve NCC nakavt (KO) farelerinde toplam ve pT96/T101 NKCC2, total ve pT53 ve pT58 NCC için immünoblotlar. Yeşil oklar belirli bantları gösterirken kırmızı ok başları spesifik olmayan bantları gösterir. Moleküler ağırlık belirteçleri dahildir. Total ve pT58 ve pT53 NCC bantlarının 130 kDa'da, total ve pT96/T101 NKCC2 bantlarının 170 kDa'da olması bekleniyor
pT96/T101 NKCC2 antikorumuzun C57BL/6 farelerinde fosforile edilmiş NCC ile gerçekten çapraz reaksiyona girip girmediğini test etmek için, şunları araştırdık:böbrek129Sv ve C57BL/6 vahşi tip farelerden ve toplam NKCC2, pT96/T101 NKCC2, toplam NCC ve fosforlanmış NCC'ye (pT53 ve pT58 NCC) karşı antikorları olan C57BL/6 NCC nakavt farelerinden lizatlar (Şekil 1F). pT96/T101 NKCC2 antikoru ve total NCC ve pNCC'ye karşı antikorlar, C57BL/6 NCC nakavt farelerinde 130- 170 kDa'da bant tespit etmedi (Şekil 1F). İlginç bir şekilde, immünoblot ve ek immünohistokimya deneyleri (Şekil S4), sadece pNKCC2 antikorlarının C57BL/6 farelerinde NCC ile çapraz reaksiyona girmediğini, aynı zamanda pNCC antikorlarımızın (pT53 NCC ve pT58 NCC) 129Sv'de NKCC2 ile çapraz reaksiyona girdiğini gösterir. kullanılan konsantrasyonlarda fareler.
İdrar kalsiyum ve magnezyum atılımı 129Sv ve C57BL/6 fareler arasında farklılık gösterir
NKCC2'deki silme işleminin (F97- T101) 129Sv ve C57BL/6 fareleri arasındaki fizyolojik farklılıklarla ilişkili olup olmadığını belirlemek için, iki fare suşu arasında su alımını, plazma iyon seviyelerini ve idrar sıvısı ve iyon atılımını karşılaştırdık. Tablo 1'de özetlendiği gibi, değerlendirilen parametrelerin çoğu suşlar arasında farklılık göstermedi. Bununla birlikte, C57BL/6 fareleri, 129Sv farelerine göre daha düşük idrar Ca2 artı ve daha yüksek idrar Mg2 artı atılımı gösterdi. Plazma Ca2+ ve Mg2+ seviyeleri her iki grup için benzerdi; bu, farelerin, homeostatik bir bağırsak yeniden emilim dengesi, doku mobilizasyonu (örneğin kemikten) veböbrekCa 2 plus ve Mg 2 plus iyonlarının atılımına ulaşıldı. Farklı idrar Ca2 artı ve Mg2 artı atılım oranlarının, bu iyonların bağırsak alımındaki farklılıklardan kaynaklanıp kaynaklanmadığını test etmek için, ikisi için günlük besin alımını, fekal çıktıyı ve fekal Ca2 artı ve Mg2 artı atılımını karşılaştırdık. fare soyları. Şekil S5'te gösterildiği gibi, gıda alımı ve dışkı Ca2 artı çıkışı benzerdi, ancak günlük dışkı Mg2 artı atılımı C57BL/6 farelerinde 129Sv farelere göre daha düşüktü, bu da C57BL/6 farelerinin daha yüksek bağırsak Mg2 artı yeniden emilimine sahip olduğunu gösteriyor. 129Sv fareler. Bu varsayımla tutarlı olarak, C57BL/6 fareleri, magnezyum kanalı TRPM6'nın (Şekil S6) daha güçlü kolonik ekspresyonunun yanı sıra, 129Sv farelere kıyasla daha yüksek plazma Mg2 artı seviyelerine yönelik bir eğilime sahipti, ancak farklılıklar istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı. Kemiğin olası katkısını değerlendirmek için mikro-CT ile her iki suştaki kemik mineral yoğunluğunu analiz ettik. Önceki raporlara benzer şekilde, 32 C57BL/6 faresi oldukça düşük bir kemik mineral yoğunluğuna sahipti (Şekil S7);böbrekCa 2 artı atılım. Arttırılmış tübüler Ca2 artı yeniden emilim oranı ile uyumlu olarak, C57BL/6 farelerinin böbrekleri
protein seviyelerinde 129Sv farelerin böbreklerinden daha fazla TRPV5 Ca2 artı kanalı ifade etti (Şekil 2). C57BL/6 fareleri ayrıca 129Sv farelerinden önemli ölçüde daha yüksek bir NCC mRNA ve protein ekspresyonuna sahipti (Şekil 2A). Benzer şekilde, toplam NKCC2, toplam ve fosforlanmış NCC ve toplam - ENaC'nin protein bolluğu, C57BL/6'da 129Sv farelerine göre daha yüksekti (Şekil 2B,C). Proteolitik olarak bölünmüş ve dolayısıyla aktif - ve - ENaC formlarının bolluğu farklı değildi, bu daböbrekENaC aktivitesi her iki suş için de benzerdi (Şekil 2B,C).
129Sv farelere kıyasla C57BL/6 farelerinde değişen kalın artan uzuv fonksiyonu için kanıt yok
C57BL/6 farelerinin böbreklerinde toplam NKCC2, toplam NCC ve fosforlanmış NCC'nin daha yüksek bolluğu, azaltılmış NKCC2 fosforilasyonu için telafi edici bir yanıt olabilir. NKCC2 ve NCC aktivitesinin fare suşları arasında farklılık gösterip göstermediğini test etmek için sırasıyla bir bumetanid ve tiyazid testi yaptık. Tek bir bumetanid veya hidroklorotiyazid enjeksiyonu, hidroklorotiyazidden çok bumetanid için daha belirgin olan güçlü bir natriürezi tetikledi. Bununla birlikte, diüretik tepkiler her iki suşta da tamamen benzerdi, bu da NKCC2 ve NCC'nin fonksiyonel aktivitelerinin C57BL/6 ve 129Sv fareleri arasında farklı olmadığını düşündürdü (Şekil 3A-D). Görünüşe göre, protein bolluğu ve fosforilasyon seviyeleri, proteinlerin fonksiyonel aktiviteleriyle mutlaka eşleşmez.böbrekYakın zamanda Hunter ve çalışma arkadaşları tarafından da belirtildiği gibi iyon taşıma proteinleri. 33 TAL işlevini daha fazla değerlendirmek için, farelerin 24 saat boyunca ıslak yiyeceğe erişebildiği, ancak musluk suyuna erişemediği bir su kısıtlama testi gerçekleştirdik. Bu koşullar altında, her iki fare türü de idrar ozmolaritesini benzer değerlere yükseltti (Tablo 1). Ayrıca, C57BL/6 fareleri ve 129Sv fareleri, TAL hücrelerinin fonksiyonel aktivitesine bağlı olarak üretilen ve idrara atılan üromodulinin (Tamm- Horsfall proteini) (Tablo 1) aynı idrar atılımını gösterdi. 3
129Sv ve C57BL/6 farelerinin melezlenmesi, NKCC2'deki beş amino asit silinmesinin belirli bir fenotipi ayırmadığını gösterir.
Sunulan veriler, üriner iyon atılımlarındaki zorlanma farklılıklarının veböbrekprotein bolluğu, C57BL/6 NKCC2'deki beş amino asidin silinmesiyle ilgili değildir, ancak iki fare suşu arasındaki diğer genetik farklılıklarla ilgilidir. Bunu daha fazla test etmek için, 129Sv ve C57BL/6 farelerini, genetik suş farklılıklarının (NKCC2'dekiler dahil) rastgele olması gereken F2 nesline melezledik.
farelere dağıtıldı. Daha sonra, tam uzunluktaki NKCC2 (f/f) için homozigot, NKCC2 delesyonu (Δ/Δ) için homozigot veya NKCC2 delesyonu (f/Δ) için heterozigot olan F2 farelerini karşılaştırdık. NKCC2 ve NCC'ye karşı fosfoforma özgü antikorların beklenen farklı bağlanma paternleri (ve mRNA'da belirsiz bir ROMK ekspresyonu farkı, ancak protein seviyesinde değil) dışında, iki suş arasında daha önce tanımlanmış farklılıkların hiçbiri belirgin değildi. F2 neslinin f/f, Δ/Δ veya f/Δ fareleri (Şekil 4 ve Tablo 2). Özellikle, üriner Ca2 artı veya Mg2 artı atılımında ve ayrıca plazma Ca2 artı veya Mg2 artı seviyelerinde hiçbir farklılık yoktu, bu da 129Sv ve C57BL/6 fareleri arasındaki suş farklılıklarının bağımsız olduğunu düşündürür. NKCC2'deki beş amino asit silinmesi.
Yeni bir pT96 NKCC2 antikoru, her iki suşta da pNKCC2'yi tespit eder
NKCC2'deki beş amino asit delesyonu, mevcut antikorları kullanırken C57BL/6 farelerinde NKCC2 fosforilasyonunun güvenilir bir şekilde saptanmasını engellediğinden, C57BL/6 farelerinde T96 fosfositesine karşı yönlendirilmiş yeni bir antikor oluşturduk. Tavşanlar, T96'yı (YYLQ(p)TMDA) çevreleyen C57BL/6 NKCC2'nin amino asit dizisine karşılık gelen bir fosfopeptit ile bağışıklaştırıldı. Antiserumlar afinite ile saflaştırıldı ve immünoblotlama ve immünohistokimya ile karakterize edildi (Şekil 5). Antikor, 129Sv, C57BL/6 vahşi tip ve C57BL/6 NCC nakavt böbreklerinde beklenen 170 kDa büyüklüğünde tek bir bant tespit etti.
fareler (Şekil 5A). Bant, 130 kDa'da NCC için tespit edilenden açıkça farklıydı. 129Sv'nin fosforilasyonuböbrekbuzağı bağırsağı alkalin fosfataz (CIAP) içeren numuneler, yeni pT96 NKCC2 antikoru ile elde edilen sinyali tamamen ortadan kaldırırken, fosfoforma spesifik olmayan NKCC2 antikoru ile sinyal, kontrol ve fosforu giderilmiş numunelerde görülebilirdi (Şekil 5B). İlginç bir şekilde, NKCC2 fosforilasyonu da büyük ölçüde ortadan kaldırıldı.böbreklizatlar, CIAP olmadan (muhtemelen proksimal tübüllerdeki endojen alkalin fosfataz aktivitesinden dolayı) 37 derecede 1 saat süreyle inkübe edildi. C57BL/6 farelerinin ardışık parafin-böbrek kesitlerinde lambda fosfataz kullanan defosforilasyon deneyleri ayrıca yeni antikorun sadece fosforile edilmiş NKCC2'yi tanıdığını doğruladı (Şekil 5C). Ayrıca, ardışık kriyoseksiyonlarda immün floresan, yeni antikorun yalnızca NKCC2- pozitif TAL'lerin apikal plazma membranını boyadığını, ancak 129Sv ve C57BL/6 farelerinde NCC-pozitif DCT'leri boyamadığını gösterdi (Şekil 5D), yeni pNKCC2 antikoru, pNCC ile çapraz reaksiyona girmez. Bu sonuç, insan NKCC2 (hNKCC2) ve insan NCC (hNCC) ifade eden MDCKI hücrelerinden hücre lizatları kullanılarak da doğrulandı. İmmünopresipitasyonların (IP) ve tam hücre lizatlarının immünoblotları, yeni pT96 NKCC2 antikorunun insan NKCC2'sini tanıdığını ancak insan NCC'sini tanımadığını gösterdi (Şekil S8A). İlginç bir şekilde, yeni antikor, C57BL/6 farelerinin pNKCC2'sine karşı yükseltilmiş olmasına rağmen, yeni antikor, hem immünohistokimya (Şekil 6A) hem de immünoblotlama (Şekil 6B) ile her iki fare türünün böbreklerinde NKCC2 fosforilasyonunu eşdeğer şekilde tespit etti.
Yeni pT96 NKCC2 antikoru, düzenlenmiş NKCC2 fosforilasyonunun analizine izin verir
NKCC2 ve NCC'nin fosforilasyonu ve dolayısıyla aktivitesi, hücre dışı iyon konsantrasyonları tarafından düzenlenir. Düşük bir [Cl - ] ex, WNK/SPAK/OSR1 yolunun aktivasyonu yoluyla Thr96 ve Thr101'de NKCC2'nin ve Thr53 ve Thr58'de NCC'nin fosforilasyonunu arttırır. 7,8,18,29,35 Benzer şekilde, yüksek bir [K plus ], NCC fosforilasyonunu hızlı bir şekilde azaltır, ancak NKCC2 fosforilasyonu üzerinde çok az veya hiç etkisi olmadığı düşünülür. 12,36,37,38 Yeni geliştirilen pT96 NKCC2 antikorunun, NKCC2 fosforilasyonunun bu tür diferansiyel düzenlemesini tespit edip edemediğini test etmek için,böbrekC57BL/6 farelerinin dilimleri ex vivo olarak sırasıyla 110 veya 5 mM [Cl - ] ex ve 3 veya 10 mM [K plus ] ex'e maruz bırakıldı. Beklendiği gibi, düşük [Cl ] ex, NCC ve NKCC2 fosforilasyonunu güçlü bir şekilde artırırken (Şekil 7A,B), yüksek [K plus ] ex sadece NCC fosforilasyonunu azalttı, ancak NKCC2 fosforilasyonunu değiştirmedi (Şekil 7C,D). Benzer şekilde, yeni antikor eşit derecede iyi değiştirilmiş olarak tespit edildi.
ŞEKİL 4 Majör mRNA ve protein ekspresyonunda önemli bir değişiklik yokböbrekmelez F2 neslindeki iyon taşıyıcılar ve kanallar. A, Üç fare grubundaki nispi mRNA ekspresyon seviyelerinin Bar grafiği. Tüm değerler f/f farelerine normalleştirildi. Değerler ortalama ± SEM'dir. B, Farede protein bolluğuböbrekF2 neslinin hayvanlarından lizatlar. Üç grup, tam uzunluklu NKCC2'ye (f/f), silme için NKCC2 homozigotuna (Δ/Δ) veya silme için NKCC2 heterozigosuna (f/Δ/) karşılık gelir. Moleküler ağırlık belirteçleri dahildir. NKCC2 ve pNKCC2'nin 170 kDa'da, NCC ve pNCC'nin 130 kDa'da, TRPM6'nın 260 kDa'da, - ENaC'nin 95 kDa'da ve 34 kDa'da (parçalanmış), - 100 kDa'da ENaC'de, - 100 kDa'da ve 85 kDa'da ENaC'nin (yarılmış) olması beklenmektedir. , 55 kDa'da ROMK (olgun glikosile edilmiş), 43 kDa (çekirdek glikosile edilmiş) ve 34 kDa (glikosile edilmemiş). Yeşil oklar belirli bantları, kırmızı ok uçları ise belirli olmayan bantları gösterir. C, f/f ve Δ/Δ farelerini karşılaştıran protein bolluğunun dansitometrik analizi. Δ/Δ farelerinden gelen bant yoğunlukları, f/f'den gelenlere normalize edilir. (Değerler ortalama ± SEM; n=5 fare/grup; *P < .05,="" †="" p="">< .01,="" ‡="" p=""><>
İnsan NKCC2'sini (hNKCC2) veya fare NKCC2'yi (mNKCC2(C57BL/6)) eksprese eden MDCKI hücrelerinde hipotonik düşük hücre dışı klorür koşullarıyla tetiklenen NKCC2 fosforilasyonu (Şekil S8B). İçindeböbrek5 mM [Cl − ] ex 'de inkübe edilen dilimler, ayrıca daha önce açıklanan anti-fare pT96/T101 NKCC2 39 ve anti-insan pT212/T217 NKCC1 R5 11 antikorları, NKCC2 ve NCC için zayıf sinyalleri tespit eder, daha fazla protein yüklendiğinde ve gelişmiş ayarlarda immünoblotlar görüntülendiğinde daha belirgin hale gelir (Şekil S9).
TARTIŞMA
C57BL/6 ve 129Sv fareleri, biyomedikal araştırmalar için en yaygın kullanılan fare suşlarından ikisidir. C57BL/6 farelerinin genomu, fare 40 için sekanslanan ilk genomdu ve o zamandan beri fare suşları arasındaki genetik ve fenotipik varyasyonların analizi için referans genom olarak hizmet etti. 41- 44böbrekAraştırmada, C57BL/6 ve 129Sv fareleri arasındaki temel bir fark, renin geninin ifadesi ile ilgilidir. İnsanlar gibi, C57BL/6 fareleri sadece bir renin geni barındırırken, 129Sv fareleri iki kopyaya sahiptir; bu, bu fare suşunun hipertansiyon 45,46 ve hipertansif hasara daha yüksek duyarlılığını açıklayabilir. 47 Bu çalışma ile, dikkate alınması gereken bir diğer önemli genetik farklılığı ekliyoruz. NKCC2'de (ΔF97- T101), C57BL/6'da bulunan, ancak 129Sv farelerinde olmayan, daha önce mevcut olan antikorların çoğuyla NKCC2 fosforilasyonunun saptanmasına müdahale eden, ancak önemli ölçüde darbeBöbrek fonksiyonu.
Fare NKCC2 N-terminal fosforilasyon bölgeleri T96 ve T101, türler arasında ve NKCC2, NKCC1 ve NCC arasında yüksek oranda korunur (Şekil 1). 48 Bu nedenle, bu fosforilasyon bölgelerine yönelik antikorların diğer ortak taşıyıcılarla çapraz reaksiyona girmesi şaşırtıcı değildir. Önceki çalışmalar, fosforile edilmiş NCC'ye karşı antikorların ayrıca fosforile edilmiş NKCC'yi2 7,18,28,29 tespit ettiğini ve bir pNKCC1 antikorunun hem NKCC1 hem de NKCC2'nin fosforilasyon seviyelerinin analizine izin verdiğini bildirmiştir. 11 Bununla tutarlı olarak, pNCC (pT53 ve pT58) antikorlarımızın fosforile NKCC2 ile ve pT96/pT101 NKCC2 antikorumuzun fosforile NCC ile çapraz reaktivitesini gözlemledik. Bununla birlikte, pNCC antikorlarının NKCC2 ile çapraz reaktivitesi sadece 129Sv farelerinin böbreklerinde görüldü, ancak C57BL/6 farelerinin böbreklerinde görülmedi. Tersine, daha önce geliştirdiğimiz NKCC2 pT96/pT101 antikoru, C57BL/6 farelerinin böbreklerinde pNKCC2 için hiç veya en iyi ihtimalle çok zayıf bir sinyal gösterdi ve bu suşta esas olarak fosforile edilmiş NCC tespit etti. Şimdi, bu kafa karıştırıcı gözlemleri, C57BL6 farelerinin NKCC2'sindeki (ΔF97- T101) beş amino asit silinmesine bağlıyoruz. NKCC2 fosforilasyonunun düzenlenmesi araştırılmıştır.
çeşitli deneysel ortamlarda ve vazopressin, 14,21,24,25,49 uromodulin 19,20,50 ve kalsinörin inhibitörleri dahil olmak üzere çeşitli uyaranlar için ied. 10,26 Çalışmaların çoğu heterolog ekspresyon sistemlerinde 10,19,20,25,50 veya tam uzunlukta NKCC2 eksprese eden sıçanlarda 10,24 ve farelerde 19,26 gerçekleştirilirken, bazı çalışmalar C57BL/6 farelerinde de gerçekleştirilmiştir. 7,18,27,28,29,51 Burada bildirdiğimiz gibi, C57BL/6 fareleri, NKCC2 fosforilasyonunun doğru saptanmasını engelleyen ve standart pT96/T101 NKCC2'nin antikorları ve R5 anti fosfo- NKCC1 antikoru, en azından bizim çalışmamızda kullanılan koşullarda fosforlanmış NCC ile çapraz reaksiyona girer. Bu çapraz reaksiyonun önceki deneysel sonuçlar üzerindeki etkisini yargılamak mümkün değildir, ancak gözlemlerimize göre, C57BL/6 farelerinden alınan veriler tekrar gözden geçirilmeli ve dikkatle yorumlanmalıdır. Beş amino asit silinmesinin NKCC2 fosforilasyonunun saptanması üzerinde güçlü bir etkisi olmasına rağmen, silmenin ortak taşıyıcının fonksiyonel aktivitesini önemli ölçüde etkilediğine dair hiçbir kanıtımız yok. C57BL/6 fareleri aslında 129Sv farelere göre daha yüksek üriner Mg2 artı atılımı ve daha düşük idrar Ca2 artı atılımı 31'e sahipti, ancak bu farklılıkların muhtemelen bu katyonların TAL boyunca değişen paraselüler taşınmasıyla ilgili olmadığını bulduk, ancak bağırsakta artan TRPM6- bağımlı Mg2 artı alımının ve DCT2 ve CNT'de artan TRPV5- bağımlı Ca2 artı yeniden emilim sonucudur. İkincisi, C57BL/6 farelerinin düşük kemik mineral yoğunluğunu arttırmaya yardımcı olabilecek pozitif bir Ca2 artı dengesine neden olur. C57BL/6 ve 129Sv farelerinin aynı şeyi gösterdiği bulgusuböbrekilmek ve tiyazid diüretiklerine ve su kısıtlamasına verilen tepkiler ayrıca NKCC2'deki beş amino asit silinmesinin TAL işlevini önemli ölçüde bozmadığını gösterir. En önemlisi, melez C57BL/6 ve 129Sv farelerinin F2 neslinin fareleri aynıböbrekfarelerin tam uzunlukta (f/f) NKCC2 veya NKCC2 ifade etmesinden bağımsız fenotip
silme için homozigot (Δ/Δ). Farelerdeki bu gözlemler, heterolog ifade sistemlerinden elde edilen önceki fonksiyonel verilerle tutarlıdır. NKCC1'deki (insanda T217, farede T211) veya NCC'deki (insanda T60, farede T58) tek kalıntıların mutasyonları bu kotrans taşıyıcıların aktivitesini ortadan kaldırırken, NKCC2'deki karşılık gelen kalıntının mutasyonları (insanda T105, farede T101) ) başlangıç ve uyarılmış NKCC2 aktivitesi üzerinde oldukça az etkiye sahiptir veya hatta hiç etkisi yoktur. 35,52,53 NKCC2'deki her iki treonin tortusu alanine mutasyona uğratıldığında bile, NKCC2'nin fonksiyonel aktivitesi maksimum aktivitenin ~%70'ine ulaşır, 35 bu sitelerin fosforilasyonunun gösterge olduğunu ancak NKCC2 aktivitesi için gerekli olmadığını gösterir.
Fosforilasyon bölgeleri genellikle proteinler arasında homologdur. Bu nedenle, fosfoforma özgü antikorların çapraz reaktivitesi sorunu, fosforile edilmiş NCC, NKCC2 ve NKCC1'e karşı yönlendirilen antikorlar için benzersiz değildir, ayrıca sikline bağımlı kinazlar 1 ve 2 54 ve hücre dışı proteinler gibi diğer proteinler için de rapor edilmiştir. sinyal düzenlemeli kinazlar 1 ve 2. 55 Tutarlı bir şekilde, fosforilasyon durumuna özgü antikorlar kullanıldığında, saptanan sinyallerin özgünlüğünü doğrulamak için sıkı deneysel kontrollere ihtiyaç vardır. Bu, (a) kullanılan antikorun proteini beklenen moleküler ağırlıkta (immünoblotlama) ve/veya beklenen hücresel ve hücre altı lokalizasyonda (immünofloresan) tespit ettiğinin doğrulanmasını, (b) antikorun fosforile epitop ile spesifik olarak etkileşime girdiğinin doğrulanmasını içerebilir. fosforile edilmiş ve fosforile edilmemiş peptitler ile rekabet deneylerinin kullanılması ve (c) aşağıdakilerin gösterilmesi
antikor, fosforile edilmiş ve fosforile edilmemiş doku numunelerini karşılaştırarak fosfoforma özgüdür. Bu kontroller, nakavt hayvanlardan ve/veya ilgilenilen proteini heterolog olarak eksprese eden hücrelerden alınan dokuların test edilmesini içeren genetik kontrollerle tamamlanabilir. Bu çalışmada, fosforile edilmiş NKCC2'yi tespit eden yeni bir pT96 NKCC2 antikorunu tam olarak karakterize etmek için yukarıda bahsedilen yaklaşımları kullandık.böbrekC57BL/6 ve 129Sv farelerinden alınan örnekler eşit derecede iyi. Antikor fosfoforma özgüdür ve test edilen koşulların hiçbirinde fosforile edilmiş NCC ile belirgin bir çapraz reaktivite göstermez. Bu antikoru kullanarak, düşük hücre dışı klorür konsantrasyonlarının, bu bölgede NKCC2'nin fosforilasyonunu 7,8 arttırdığını, değiştirilmiş hücre dışı potasyum konsantrasyonlarının ise önemli bir düzenleyici rolü olmadığını doğruladık. 24 Sonuç olarak, çalışmamız, fare NKCC2'nin amino asit dizisinde, algılamayı ve dolayısıyla NKCC2 fosforilasyonu ve düzenlemesinin analizini etkileyen kritik bir suş farklılığını ortaya koymaktadır. Yeni geliştirilen bir pT96 NKCC2 antikoru, bu teknik uyarıyı ortadan kaldırır ve fare modellerinin genetik arka planından bağımsız olarak değiştirilmiş NKCC2 fosforilasyonunun güvenilir bir şekilde saptanmasına olanak tanır. Ayrıca, çalışmamız, fare modellerini analiz ederken genetik arka plan farklılıklarının dikkate alınması gerektiğini bir kez daha vurgulamaktadır.
MALZEMELER VE YÖNTEMLER
hayvanlar,Erkek yaş eşleştirilmiş (6- 8 hafta) fareler, ya 129S6/SvEvTac, C57BL/6J, bundan sonra 129Sv ve C57BL/6 olarak anılacaktır, ya da F2 neslinde karma bir hibrit 129S/B6 soyundandı. Tüm hayvan deneyleri, İsviçre Hayvan Refahı yasalarına göre yapıldı ve İsviçre, Zürih Kantonu veteriner idaresi tarafından onaylandı (Lisanslar: 141/2014, 185/2017 ve 135/2018). Fareler, Tablo S3'te sağlanan primerler ile standart PCR kullanılarak 15 bazın silinmesi için genotiplendi. Tam uzunluklu (f/f) NKCC2'nin beklenen PCR ürünü 87 bp'dir, silinmiş NKCC2 dizisi (Δ/Δ) ise 70 bp'de beklenir.
Doku işlemeFarelere, izofluran (yüzde 2 - 4, 0.5 l/dak; Provet; CH) ve Temgesic (Buprenorfin; 0.05- 0) kombinasyonu ile anestezi uygulandı. 4 mg/kg vücut ağırlığı; Bireysel; CH). Biyokimyasal analiz için, farelere anestezi uygulandı ve kalbin sol ventrikülü yoluyla fosfat tamponlu salin (PBS) ile perfüze edildi. Böbrekler ve distal kolonlar toplandı, sıvı nitrojen içinde donduruldu ve sonraki işlemeye kadar -80 derecede saklandı. İmmünohistokimya için, böbrekler 0.1 M fosfat tamponu (pH 7,4, 300 mOsm) içinde yüzde 3 paraformaldehit (PFA) kullanılarak derin anestezi uygulanmış farenin retrograd perfüzyonu yoluyla sabitlendi. abdominal aort, ardından 0.1 M fosfat tamponu (0.2 M NaH2P04 x H20, 0.2 M NaH2P04 x 2H20, 0.1 M CaCl2) ile kısa bir durulama. Daha sonra böbrekler çıkarıldı, parçalara ayrıldı ve sıvı propan içinde donduruldu ve -80 derecede saklandı.
Metabolik kafes çalışmalarıMetabolik kafeslere (Techniplast) adapte edildikten sonra, fareler, musluk suyuna ve standart laboratuvar yemeğine (Ssniff, Spezialdiäten GmbH) ücretsiz erişim ile art arda dört gün boyunca metabolik kafeslerde tutuldu. Vücut ağırlığı, yiyecek ve su alımı günlük olarak kaydedildi ve 24 saatlik idrar ve dışkı toplandı.
Su kısıtlama protokolüFareler, musluk suyuna erişimi olmayan metabolik kafeslerde (Techniplast) 24 saat tutuldu. Standart laboratuvar yemi tozu (Ssniff, Spezialdiäten GmbH) 1:1 su ile karıştırıldı, 24 saatlik idrar ve dışkı toplandı ve analiz edildi. 24 saat sonra fareler normal kafeslere (T 2L (IVC), LASC, UZH) geri yerleştirildi.
biyokimyasal ölçümlerNa artı , K artı , Ca 2 artı idrar konsantrasyonları alev fotometrisi (EFOX 5053, Eppendorf) ile analiz edildi. Mg 2 plus'ın idrar ve plazma konsantrasyonları, bir SYNCHRON LX ® Sistem(ler)i, UniCel ® DxC 800 Synchron ® Clinical System ve Synchron ® System Multi Calibrator ile Zürih Bütünleştirici Kemirgen Fizyolojisi Merkezinde ölçülmüştür. Jaffe yöntemine göre idrar kreatinin ölçümü yapıldı. Heparinize tam kanda kan gazı ve iyon konsantrasyonları, vena kavadan kan alındıktan hemen sonra ABL825Flex Kan Gazı Analizörü (Radyometre) kullanılarak ölçüldü. Plazma aldosteron seviyeleri ve üromodulin (UMOD) idrar konsantrasyonu, ticari olarak temin edilebilen ELISA kitleri (sırasıyla Cayman tarafından Aldosteron ELISA kiti; #501090 ve Abcam tarafından Mouse Uromodulin ELISA kiti; ab245726) ile ölçülmüştür.
Gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT- qPCR)
RNA, SV total RNA izolasyon kiti (PROMEGA) kullanılarak böbreklerden ve distal kolondan izole edildi. Eşit izole edilmiş RNA konsantrasyonları (129Sv'de 250 ng ve C57BL/6 veya f/f, Δ/Δ ve f/Δ'de 500 ng), GoScript™ Ters Transkriptaz kiti (PROMEGA) ile cDNA'lara ters kopyalandı. Üretilen cDNA'lar ayrıca DNAse/RNAse içermeyen su (1:5) ile seyreltildi. Primerler, toplam Slc12a1, Slc12a3, Trpm6, Trpv5, Scnn1a, Scnn1b, Scnn1g ve Kcnj1'in nicelleştirilmesi için tasarlanmıştır (Tablo S3). İlgili genlerin ekspresyon seviyelerini ölçmek için LightCycler® 480 (Roche) kullanılarak nicel PCR analizi yapıldı. Nispi gen ekspresyonu, referans gen olarak -aktin kullanılarak delta Ct yöntemi kullanılarak hesaplandı.
Western blot analiziBöbrekler, mannitol 200 mM, HEPES [4- (2- hidroksiletil)- 1piperazineethanesülfonik içeren deterjansız bir lizis tamponu (DFLB) içinde homojenize edildi. asitler] 80 mM, potasyum hidroksit 41 mM, proteaz inhibitörleri (Complete Ultra, Roche) ve fosfataz inhibitörleri (PhosSTOP, Roche) bir Precellys 24 doku homojenleştiricide (Bertin Instruments, Montignyle- 32 Magna Lyser Yeşil Boncuk (Roche) kullanarak). Bretonneux). Boncuklar 10 dakika (1987 rcf) santrifüj edilerek çökeltildi ve protein içeren süpernatant -80 derecede tek kullanımlık alikuotlarda saklandı. Western blot için, 50 ug protein, Laemmli Tamponunda denatüre edildi, yüzde 8'lik jeller kullanılarak SDS-PAGE ile ayrıldı ve ardından nitroselüloz membranlara aktarıldı. Spesifik olmayan bağlanma bölgeleri 1x Odyssey Blokaj Solüsyonu (Li-COR Biosciences) kullanılarak membranlar 0.2x Odyssey Blokaj Solüsyonunda 12 saat 4 derecede seyreltilmiş primer antikorlarla (Tablo S4) inkübe edilmeden önce bloke edildi. PBS- 0%0.1 Tween içinde yıkandıktan sonra, membranlar ikincil antikorlarla (keçi-anti-tavşan IRDye 800 veya keçi-anti-fare IR boyası 680, 1:10'000, LI) inkübe edildi. - COR Biosciences) 0.1x Kazein Engelleme tamponu (Sigma) içinde seyreltildi. Tespit edilen bantlar Odyssey kızılötesi görüntüleme sistemi (Li-COR Biosciences) ile görselleştirildi. Eşit protein yüklemesini sağlamak için, membranlar ya aktin'e karşı bir antikor ile birlikte boyandı ya da antikor tespiti öncesinde REVERT Total Protein Stain (Li-COR Biosciences) kullanılarak toplam protein boyandı. İmmünoreaktif bantlar Fiji'de (ImageJ) ölçüldü ve sırasıyla - aktin sinyaline veya REVERT Total protein boyasına karşı normalleştirildi.
immünohistokimyaKriyostat kesitleri (kalınlık 4 um), spesifik olmayan antikor bağlanması için yüzde 10 normal keçi serumu ile bloke edildi ve ardından birincil antikorlarla inkübe edildi (Tablo S4)
gece 4 derecede. 1X PBS ile yıkandıktan sonra, slaytlar ikincil antikorlar (Cy3 – konjuge keçi-anti-tavşan IgG, ürün numarası 111- 165- 144, 1:1000 ve FITC – konjuge keçi-anti-fare IgG) ile inkübe edildi. , ürün numarası 115- 095- 068, sırasıyla 1:100, her ikisi de Jackson Immuno Research Laboratories'den) 2 saat oda sıcaklığında. Tüm antikorlar yüzde 1 BSA/1xPBS içinde seyreltildi. Hücre çekirdekleri 0.1 µg/mL konsantrasyonda DAPI (4′,6- Diamidino- 2- fentil-indol, Sigma- Aldrich, Co.) ile boyandı. Görüntüleme, bir Leica DFC350 FX floresan monokrom dijital kamera (Leica Microsystems, 35578) ile bir Leica DM6000 B floresan mikroskobu (Leica Microsystems, 35578) kullanılarak yapıldı. Görüntüler Fiji'de (ImageJ) işlendi.
Afinite saflaştırılmış tavşan-anti-fare pT96 NKCC2 antikorunun üretilmesiAntikor üretimi Pineda antikor servisi (Berlin, Almanya) tarafından yapıldı. Tavşanlar, C57BL/6 fare NKCC2 dizisinin (NH2- YYLQ(p) TMDAV-COOH) amino asitlerini 105- 114 içeren bir fosfo-peptid ile bağışıklaştırıldı. Monospesifik IgG fraksiyonu, fosfopeptid'e karşı afinite saflaştırıldı ve ardından defosfopeptit ile önceden emildi ve fosfoforma özgü bir antikor fraksiyonu ile sonuçlandı. Bu fraksiyonun antikor özgüllüğü, immünohistokimya ve Western blot analizi ile test edildi (Şekil 5 ve Şekil S4).
fosfataz tedavisiProtein lizatları, pT96'nın spesifik bağlanmasını inhibe eden fosforillenmiş proteinlerin 5'-fosfat gruplarının hidrolizini indüklemek için buzağı bağırsak alkalin fosfataz (CIAP) (1 U/1 µg protein) ile 37 derecede 1 saat inkübe edildi. Nitroselüloz Western blot membran üzerindeki proteinlere karşı NKCC2 antikoru (Şekil 5B). C57BL6 farelerinden arşivlenmiş parafine gömülü böbrekler kullanıldı. Buzağı bağırsağı alkalin fosfataz (Sigma Aldrich) kullanılarak bölümlerin tedavisi, küçük modifikasyonlarla daha önce tarif edildiği gibi yapıldı. 56 Serbest aldehit gruplarının bloke edilmesinden sonra, kesitler alkalin fosfataz tamponunda (100 mm Tris, 50 um CaCl2 , 0.1 mm MgCl2 , 8.4 um leupeptin, 4 mm Pefablock, pH 9.0). Daha sonra kesitler alkalen fosfataz tamponu içinde buzağı bağırsağı alkalin fosfatazlı veya alkalin fosfatazsız (~130 ünite/mL) 35 derecede 2 saat inkübatörde inkübe edildi. İmmünohistokimya ve ışık mikroskobu daha sonra ayrıntılı olarak yapıldı. 57
Amino asit dizi hizalamasıFarklı türler ve fare türleri için amino asit dizileri, "Ensembl Genome Browser" açık veri tabanından (www.ensem bl.org, Sanger Institute) elde edildi. 42 Transkript kimliklerinin kaynakları Tablo S1'de listelenmiştir. Diziler, Qiagen © CLC Main Workbench 20 kullanılarak hizalandı.
böbrek dilimleriBöbrekC57BL/6 farelerinin dilimleri, daha önce tarif edildiği gibi ex vivo deneyler için kullanıldı. 12 Kısaca, diyet iyon alımının NKCC2 ve NCC fosforilasyon seviyeleri üzerindeki herhangi bir potansiyel etkisini önlemek için fareler suya serbest erişim ile gece boyunca aç bırakıldı. Anestezi uygulanmış hayvanlardan böbrekler çıkarıldı, titreşimli bir mikro dilimleyici (Vibratome, Microm; Thermo Scientific) kullanılarak 280 um kalınlığında dilimler halinde kesildi ve bir Ringer çözeltisine (mM olarak) yerleştirildi: 98.5 NaCl, 25 NaHC03, 3 KCl, 1 Na2 HPO 4 , 2.5 CaCl2 , 1.8 MgCl2 ve 25 glukoz 30 dakika 30,5 derecede %95 O2 ve %5 CO2 ile sabit kabarcıklanma ile. Daha sonra, Ringer solüsyonu benzer solüsyonlarla değiştirildi, ancak farklı Cl - (düşük Cl - için 5 mM, normal Cl - için 110 mM) ve K plus konsantrasyonları (normal K plus için 3 mM, yüksek K plus için 10 mM) ile değiştirildi. ek 30 dakika. Son olarak, dilimler sıvı nitrojen içinde anında donduruldu.
İstatistikUnpaired Student t testi ve eşit olmayan varyanslar durumunda Welch testi, iki grubu karşılaştırmak için kullanıldı (GraphPad Prism, Sürüm 8.0.2). Çoklu karşılaştırma için, tek yönlü veya iki yönlü ANOVA'nın ardından Tukey'nin çoklu karşılaştırma son testi uygulandı (GraphPad Prism, Sürüm 8.0.2). Veriler, ortalama ± SEM olarak görüntülenir (Tablo ve Şekillerde). P < .05="" olduğunda="" farklılıklar="" anlamlı="" kabul="">
TEŞEKKÜRLER Yazarlar, NCC-KO farelerini sağladığı için Dr Gary Shull'a (Cincinnati Üniversitesi, Cincinnait, OH), "R5" pNKCC1 antikoru için Dr Biff Forbush'a (Yale Tıp Fakültesi, New Haven, CT) ve Dr Henrik Dimke'ye ( Güney Danimarka Üniversitesi, Odense, Danimarka) fare monoklonal toplam NCC antikoru için. Yazarlar ayrıca teknik yardım için Monique Carrell ve Inger Merete Paulsen'e ve sağladığı için Dr Eszter Banki'ye teşekkür eder.böbrekörnekler. Kemik mineral yoğunluğu ölçümleri ve idrar ve plazma analizinin bir kısmı sırasıyla Dr Petra Seebeck ve Nadine Nägele (Zürih Bütünleştirici Kemirgen Fizyolojisi, Zürih Üniversitesi) tarafından yapılmıştır. Dr Alicia McDonough (Güney Kaliforniya Üniversitesi) ve Dr Olivier Devuyst'un (Zürih Üniversitesi) çok yararlı katkıları çok takdir edildi.
ÇIKAR ÇATIŞMASI JL grubu, sırasıyla Milipore ve Abcam'dan NCC ve fosforile edilmiş Nedd4- 2'e karşı lisanslı antikorlar için telif ücreti alır. Her iki antikor da mevcut çalışmada kullanılmamıştır. Ayrıca JL, VIFOR tarafından düzenlenen bir sempozyumda sözlü sunum için VIFOR'dan 2019'a onur ödülü aldı.
