Demir Takviyesi Yaşlanmayı Geciktirir ve Mitokondriyal Fonksiyonu Güçlendirerek Hücresel Ömrü Uzatır

anahtar kelimeler:ütü;kronolojik yaşlanma; hücresel yaşam süresinin uzatılması; mitokondri; AMPK; Saccharomyces cerevisiae

Anti-Aging İçin Sistche Hakkında Bilgi Almak İçin Tıklayınız

1. Giriş

buYaşlanan nüfusdünya çapında dramatik bir şekilde büyüyor [1–3]. yaşlanmakanser, nörodejenerasyon, kalp hastalığı, diyabet, bilişsel bozukluk ve bağışıklık sistemi düşüşü gibi birçok kronik hastalık için en büyük risk faktörüdür.4–8]. Metabolik fonksiyonlarda kademeli bir azalma, yaşlı popülasyonda kalan yaşam için sağlığı etkileyen yaşa bağlı patolojilere karşı savunmasızlığı artırır. Tek hücreli mayadan hayvan modeli sistemlerine kadar farklı organizmalarda yapılan son araştırmalar, yaşlanma mekanizmalarının, hücresel metabolizmanın oldukça birbirine bağlı ve işlevsel olarak fazlalıklı bir gen ve protein etkileşim ağı tarafından korunduğunu ve kontrol edildiğini göstermiştir.9–11]. tomurcuklanan mayaSaccharomyces cerevisiaehücresel süreçlerinin çoğu insanlarda korunduğu için yaşlanma biyolojisini incelemek için güçlü bir model organizmadır. Maya izlenebilir kısa bir ömre sahiptir ve çeşitli çevresel koşullar altında yüksek verimli taramaya uygundur [9–12]. Maya, replikatif ömrünü (RLS) ve kronolojik ömrünü (CLS) analiz ederek insan replikatif ve kronolojik yaşlanmasını incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır [13–15]. RLS, bir ana hücrenin, kök hücreler gibi mitotik hücreler için replikatif bir insan yaşlanma modeli olan yavru hücreler oluşturmak üzere bölünme sayısını analiz eder. CLS, nöronlar gibi mitotik sonrası hücreler için kronolojik bir insan yaşlanma modeli olan, bölünmeyen bir hücrenin durağan fazda yaşayabildiği sürenin süresidir. Yaşlanma biyolojisi araştırmalarında devam eden çabalar, yaşlanmanın biyolojik süreçlerini modüle ederek yaşlanmayı geciktirmenin mümkün olduğunu göstermiştir.11,16]. Şu anda en umut verici yaşlanma karşıtı müdahaleler rapamisin ve metformin ilaçlarıdır.11,16]. Rapamisin, rapamisin kompleksi 1'in (TORC1) yüksek oranda korunmuş bir protein kinaz metabolik düzenleyici hedefini inhibe eder. Metformin, adenozin monofosfatla aktive olan protein kinaz (AMPK) aktivitesini arttırır. TORC1, proteinlerin, nükleotitlerin ve lipitlerin sentezi gibi hücresel anabolik süreçleri teşvik eder.17,18]. Öte yandan TORC1, oksidatif fosforilasyon ve otofaji dahil olmak üzere katabolik süreci inhibe eder. Bununla birlikte, AMPK, katabolik süreçleri güçlendirdiği ve anabolik süreçleri inhibe ettiği için zıt metabolik işlevlere sahiptir.19]. Besin açısından sınırlı koşullar altında, AMPK aktive edilir ve TORC1'i inhibe eder. Ortaya çıkan metabolik tepki, anabolik süreçlerde ATP kullanımındaki azalma ile koordine olan katabolik süreçleri indükleyerek hücresel enerji üretimini arttırır.19–21]. Rapamisin ve metformin, yaşlanma karşıtı terapötikler olarak kullanımları için klinik deneylerdedir.16,22]. Demir önemli bir besindir ve insanlar da dahil olmak üzere hemen hemen tüm organizmalar için gereklidir.23–26]. Hücre metabolizmasında çok önemli bir rol oynar ve çeşitli enzimatik reaksiyonlar için bir kofaktör olarak işlev görür. Hücresel metabolizma yaşlanmanın ana belirleyicisi olduğundan ve demir birkaç farklı metabolik fonksiyon için çok önemli olduğundan, demir takviyesinin yaşlanma üzerindeki etkisini araştırdık. Demir takviyesinin mayanın CLS'si üzerindeki etkisini inceledik. Demir takviyesinin yaşlanmayı geciktirdiğini ve hücre ömrünü uzattığını bulduk. Ayrıca, demir takviyesinin yaşlanma karşıtı mekanizmasının mitokondriyal fonksiyonları geliştirmekten geçtiğini de ortaya çıkardık. Demir takviyesinin mitokondriyal fonksiyonları iyileştirdiğini ve AMPK mutantının kısa ömrünü kurtardığını bulduk.

2. Malzemeler ve Yöntemler

2.1. Maya Suşları ve Gen Silme

prototrofikSaccharomyces cerevisiaeAmino asit oksotrofisinin hücre büyümesi ve hayatta kalması üzerindeki etkilerinden kaçınmak için tüm deneylerde CEN.PK vahşi tip suşu kullanıldı [27,28]. Gen nakavt suşu, PCR aracılı homolog rekombinasyon ile üretildi, bu sayede tüm lokus, hedef genin yukarı akış ve aşağı akış yan dizilerini içeren güçlendirilmiş bir seçim işaretçisi ile değiştirildi [29]. PCR, güçlendirilmiş seçim işaretçisinin kararlı entegrasyonunu doğruladı.2.2. Orta Kompozisyon ve KimyasallarZengin ortam YPD, yüzde 1 maya özü, yüzde 2 pepton ve yüzde 2 glikoz, YPD agar (yüzde 2,5 Bacto agar) ve SD ortamı, amino asitler (Difco) ve amonyum sülfat olmadan 6,7 g/L maya nitrojen bazı içeriyordu ve yüzde 2 glikoz FeSO4.7H2O, FeCl3, CaSO4.2H2O, MgS044.7H2O, CaCl2.2H2O, MgCl2.6H2O, ve BPS, Sigma'dan satın alındı ​​ve stok çözeltileri suda hazırlandı. Antimisin A (Sigma, St. Louis, MO, ABD), DiOC6(3) (3,3)0 -Dihexyloxacarbocyanin Iodide) (Invitrogen™, Waltham, MA, USA) ve MitoTracker™ Deep Red stok (Invitrogen™) solüsyonu dimetil sülfoksit (Sigma) içinde hazırlandı. DMSO'nun nihai konsantrasyonu hiçbir tahlilde yüzde 1'i geçmedi.

2.3. Maya Büyüme Koşulları

Yabani tip ve delesyon suşları, YPD'de donmuş gliserol stoğundan geri kazanılmıştır.agar besiyeri 30'da◦C. Maya hücreleri, gece boyunca 30°C'de SD ortamında büyütüldü.◦C ile220 rpm'de sallayarak. Gece boyunca büyütülen hücre kültürleri, yeni SD ortamında OD600nm~0.2'ye seyreltilerek 96-kuyulu bir plaka veya şişede veya şişede büyüme tahlili başlatıldı.kimyasallar ve 30'da inkübe edildi◦C. Hücre büyümesi (OD600nm) farklıbir mikroplaka okuyucu veya spektrofotometre kullanılarak zaman noktaları.

2.4. Kronolojik Yaşlanma Testi

Kronolojik yaşlanma, daha önce bildirildiği gibi hafif modifikasyonlarla maya hücrelerinin kronolojik yaşam süresi (CLS) ölçülerek belirlendi.30,31]. CLS deneyi, bir {{0}}gözlü plaka üzerinde gerçekleştirildi. Gecelik hücre kültürü, taze SD ortamında OD600nm~0.2'ye seyreltildi ve farklı konsantrasyonlarda kimyasallar içeren 96-kuyulu plakaya aktarıldı ve 30°C'de inkübe edildi.◦C. Hücreler, CLS analizi için 1. Gün (%100 hücre sağkalımı) olarak kabul edilen durağan bir faza büyütüldü. Maya hücrelerinin hayatta kalması, çeşitli yaş zaman noktalarında bir büyüme tahlili ile ölçüldü. Kronolojik olarak yaşlanmış hücreler (3µL) farklı yaş zaman noktalarında ikinci bir 96-kuyu plakasına aktarıldı. YPD ortamı (200µL) bir 96-kuyu plakasına eklendi ve 24 saat 30°C'de inkübe edildi◦C. Hücre büyümesi, mikroplaka okuyucu kullanılarak absorbans (OD600nm) ile ölçülmüştür. Farklı yaş noktaları için hücre sağkalımı, hesaplama formülü kullanılarak 1. Güne (yüzde 100 hücre sağkalımı olarak kabul edildi) göre ölçüldü: Sağkalım yüzdesi=[Aşırı Büyüme OD600nm (yaş noktası)/Aşırı Büyüme OD600nm (1. Gün)]× 100 2.5. Oksidatif Direnç TestiMaya hücreleri, SD ortamında durağan faz aşamasına (72 saat) büyütüldü. Bundan sonra, hücreler yıkandı ve farklı konsantrasyonlarda H içeren bir YPD ortamında OD600nm~0.2'ye seyreltildi.2O2 ve 30 yaşında büyüdü◦C. Oksidatif stres direnci, H2O2-ile işlenmiş hücrelerin hücre büyümesi, işlenmemiş kontrolle karşılaştırılarak analiz edildi.

2.6. RNA Ekstraksiyonu, cDNA Sentezi ve Kantitatif

Gerçek Zamanlı PCRÜreticinin mekanik parçalama protokolü izlenerek RNeasy mini kiti (Qiagen, Hilden, Almanya) kullanılarak hücrelerden toplam RNA özümlendi. RNA konsantrasyonu ve kalitesi spektrofotometre (NanoDrop 2000 Thermo Scientific, Waltham, MA, ABD) ile belirlendi. Tipik olarak, 1µg toplam RNA, QuantiTect Ters Transkripsiyon Kiti (Qiagen) kullanılarak cDNA'ya ters kopyalanmıştır. cDNA'nın sentezi sırasında, ters transkriptaz ve RNA şablonsuz olmak üzere iki negatif kontrol de yapıldı. Tüm RT-PCR, 20'lik son hacimde gerçekleştirildi.µSYBR Fast Universal qPCR Kit (Kapa Biosystems, Boston, MA, ABD) kullanılarak 20 ng cDNA içeren L ve Quant Studio 6 Flex sistemi (Applied Biosystems, Waltham, MA, ABD) kullanılarak analiz edildi. RT-PCR koşulu, {95'te bir tutmaydı◦C, 180 s}, ardından 40 döngü {95◦C, 1 sn} ve {60◦C, 20 s} adımlar. Amplifikasyondan sonra, PCR özgüllüğünü ve primer dimerlerin yokluğunu doğrulamak için bir erime eğrisi gerçekleştirildi. Her genin kantitatif bolluğu, temizlik transkripti ACT1'e göre belirlendi. Kontrol ve tedavi edilen koşullar arasındaki bağıl gen ifadesi, 2 kullanılarak hesaplandı.−∆∆Ctyöntem [32]. RT-PCR için kullanılan primerlerin bir listesi Ek Tablo S1'de verilmiştir.

2.7. Mitokondriyal Membran Potansiyeli ve Yapı Analizi

Maya kültürleri 1 ile yıkandı.× PBS (fosfat tamponlu salin) ve inkübekaranlıkta 30 dakika boyunca DiOC6(3) (100 nM) ile. İnkübasyondan sonra hücreler yıkandı ve1'de yeniden askıya alındı× PBS. Floresans okuması (482 nm'de uyarma, 504 nm'de emisyon)numunelerin sayısı mikroplaka okuyucu tarafından ölçüldü. Her birinin floresan yoğunluğunumune OD600nm ile normalleştirildi. Mitokondriyal yapının analizi için hücreler,1 ile yıkandı× PBS ve MitoTracker koyu kırmızı (100 nM) ile 30 dakika inkübe edildi.karanlık. Numuneler, 100°C'de bir FL floresan mikroskobu ile görüntülendi.× büyütmeve görüntüler ImageJ yazılımı tarafından işlendi.

2.8. ATP Analizi

150 µL yüzde 5 trikloroasetik asit ve Precellys üzerinde cam boncuklarla parçalandı® 24 homojenleştirici(Bertin Technologies, Montiny Le Bretonne, Fransa). ATP seviyesi, bir luminometrede bir Enliten lusiferin/lusiferaz reaktif kiti (Promega, Madison, WI, ABD) kullanılarak ölçüldü.(Biotek, Winusky, VT, ABD). Protein konsantrasyonu Bradford reaktifi ile tahmin edildi(Bio-rad, Hercules, CA, ABD). Numunelerdeki ATP seviyesi toplam proteine ​​göre normalleştirildikonsantrasyon.

2.9. İstatistiksel analiz

3. Sonuçlar

3.1. Demir Takviyesi Mayanın Hücresel Ömrünü Uzatır

Demir(II) sülfatın (FeSO4) bir 96-kuyu plakasındaki mayanın kronolojik ömrü (CLS) üzerine ekleme. İlk olarak, hücreler farklı konsantrasyonlarda FeSO ile inkübe edildi.4 sentetik tanımlı (SD) bir ortamda ve büyüme farklı zaman noktalarında (16 saat, 24 saat ve 48 saat) analiz edildi. Hücre büyümesi, FeSO ile inkübe edildikten yaklaşık 24 saat sonra doygunluğa ulaştı4 konsantrasyonlar (Ek Şekil S1a,b). Daha sonra, farklı konsantrasyonlarda FeSO ile inkübe edilmiş hücrelerin CLS'sini belirledik.4. CLS analizi için 48 saatlik durağan faz hücre kültürünü 1. Gün olarak değerlendirdik. Farklı noktalardaki yaşlı hücrelerin canlılığı, 1. Gün (%100 canlı) ile normalleştirildi ve hayatta kalma grafiği üzerinde çizildi. Farklı FeSO konsantrasyonlarının4 ortamdaki takviye, mayanın CLS'sini uzattı (Şekiller1a ve S1c). Ayrıca Demir(III) klorürü (FeCl3) ve FeSO'ya benzer bir sonuç buldu4 (Rakamlar1b ve S2a). FeSO olup olmadığını netleştirmek için4 ve FeCl3 tuzları, bileşenleri Demir(II) ve Demir(III) veya sülfat ve klorür CLS'yi uzatırken, diğer sülfat ve klorür içeren tuzları inceledik. Maya hücreleri CaSO ile inkübe edildi4, MgS044, CaCl2 veMgCl2 FeSO dahil4, ve FeCl3 SD ortamda. Farklı tuzlarla inkübe edilen hücrelerin büyümesi, 24 saat sonra doygunluğa ulaştı (Ek Şekil S2b). Daha sonra hayatta kalmayı ölçtük ve FeSO hariç olduğunu bulduk.4 ve FeCl3, diğer sülfat veya klorür içeren tuzlar mayanın ömrünü uzatmadı (Şekil1C). Bu sonuçlar, sülfat ve klorürün değil, demirin mayanın CLS'sini uzattığını ortaya koydu. Daha fazla doğrulama için demiri tükettik ve mayanın CLS'sini analiz ettik. Bathophe nanthrolinedisulfonic asit (BPS), demiri tutan ve hücrelerde demir eksikliğine yol açan spesifik bir demir şelatör bileşiğidir.33]. Maya hücreleri, SD ortamında demir ve farklı konsantrasyonlarda BPS ile inkübe edildi. Farklı konsantrasyonlardaki hücre büyümesi, 24 saat sonra doygunluğa ulaştı (Ek Şekil S2c). Hücre sağkalımını ayrıca ölçtük ve BPS ilavesinin demir takviyeli hücrelerin ömrünü azalttığını bulduk (Şekil1D). Toplamda, bu sonuçlar demir takviyesinin mayanın ömrünü uzattığını doğruladı.

Şekil 1.Demir takviyesi mayanın kronolojik ömrünü uzatır. Prototrofik maya suşu, sentetik tanımlı (SD) ortamda farklı kimyasal koşullarla inkübe edildi ve 30 ◦C'de {{0}}gözlü plakalarda büyütüldü. Kronolojik yaşam süresi (CLS) analizi için durağan faza büyütülen hücreler 1. Gün (%100 hücre sağkalımı) olarak kabul edildi. Hücre canlılığı, çeşitli yaş zaman noktalarında bir aşırı büyüme tahlili ile nicelleştirildi. (a) Farklı konsantrasyonlarda FeSO4 ile desteklenmiş hücrelerin CLS'si. (b) Farklı konsantrasyonlarda FeSO4 ve FeCl3 ile desteklenmiş hücrelerin CLS'si. (c) 100 uM FeSO4, FeCl3, CaSO4, MgSO4, CaCl2 ve MgCl2 ile desteklenmiş hücrelerin CLS'si. (d) Farklı BPS konsantrasyonlarının varlığında 100 uM FeS04 ile desteklenmiş hücrelerin CLS'si. İstatistiksel anlamlılık (* p < 0.05) Student t testi ile belirlendi.