Kodlamayan Bir RNA Olan Nc886, Fibroblastlarda Hücresel Yaşlanmanın Yeni Bir Biyobelirteç ve Epigenetik Aracısıdır

Soyut:

Organizmalar ve insan modelleri üzerinde yapılan fonksiyonel çalışmalar, epigenetik değişikliklerin yaşlanma sürecini önemli ölçüde etkileyebileceğini ortaya koymuştur. Epigenetik düzenleyicilerden biri olan kodlayıcı olmayan RNA (ncRNA), mRNA'ların ve proteinlerinin ekspresyonunu değiştirmede önemli bir rol oynar. Hücrelerin fenotipine aracılık edebilir. Uzun bir ncRNA olan nc886'nın (=vtRNA2-1 veya pre-miR-886), tümör oluşumunu ve UVB'nin neden olduğu keratinositlerin foto-hasarlarını baskılayabildiği bildirilmiştir. Bu çalışma, nc886'nın fibroblastların replikatif yaşlanmasındaki rolünü belirlemeyi ve nc886 ekspresyonunu kontrol edebilen maddelerin hücresel yaşlanmayı düzenleyip düzenleyemeyeceğini belirlemeyi amaçladı. Replikatif yaşlanma fibroblastlarında, nc886 ekspresyonu azalırken metillenmiş nc886 arttı.

Yaşlanan hücrelerde SA{{0}gal aktivitesi ve p16INK4A ve p21Waf1/Cip1 ifadesi dahil olmak üzere yaşlanma biyobelirteçlerinde değişiklikler vardı. Bu bulgular, yaşlanma ile ilişkili nc886 azalmasının fibroblastların hücresel yaşlanması ile ilişkili olduğunu ve artan nc886 ekspresyonunun hücresel yaşlanmayı baskılama potansiyeline sahip olduğunu göstermektedir. AbsoluTea Concentrate 2.0 (ATC), yaşa bağlı biyobelirteçleri inhibe ederek nc886 ekspresyonunu arttırdı ve fibroblastların hücresel yaşlanmasını iyileştirdi. Bu sonuçlar, nc886'nın yaşlanma karşıtı yeni bir hedef olma potansiyeline sahip olduğunu ve ATC'nin güçlü bir epigenetik yaşlanma karşıtı içerik olabileceğini göstermektedir.

Yaşlanma, zaman içinde tüm bireylerde meydana gelen ilerleyici fonksiyonel ve organik gerileme sürecidir. Birçok faktör yaşlanmayı etkiler ve ekonomi, hastalık, beslenme, kalıtım, çevre ve zihinsel durum gibi çeşitli sosyal faktörlerin hepsi belirli bir rol oynar. Yaşlanma mekanizması çok karmaşıktır ve daha temsili yaşlanma teorileri temel olarak hücre mutasyonu teorisini, DNA hasarı teorisini, mitokondriyal hasar teorisini, telomer teorisini, serbest radikal teorisini, enzim olmayan glikosilasyon teorisini, bağışıklık fonksiyonu değişikliği teorisini ve nöroendokrin yaşlanma teorisini içerir. . Ülkemiz, cilt yaşlanmasını geciktirmek için üstün katkı maddeleri bulmamıza temel oluşturan geleneksel Çin tıbbı kaynakları açısından zengindir.

Örneğin araştırmada Cistanche Deserticola'nın yaşlanmayı geciktirici etkileri olduğu tespit edildi. Cistanche Deserticola'nın yaşlanma karşıtı etkisi esas olarak içindeki amino asitlere ve polisakkaritlere atfedilir. Amino asit, proteini sentezleyebilen ve vücudun normal metabolizmasını koruyabilen insan vücudu için gerekli bir besindir. Cistanche Deserticola'da amino asit içeriği çok yüksektir. Bu amino asitler vücut hücreleri için enerji sağlayabilir ve hücrelerin onarımı ve yenilenmesi için faydalı olan yeni metabolizmayı teşvik edebilir.

Cistanche Deserticola ek ürününü tıklayın

anahtar kelimeler:

fibroblastlar; replikatif yaşlanma; epigenetik düzenleme; nc886; yeşil çay özü.

1. Giriş

Hücre proliferasyonunun durdurulmasını takiben geri dönüşümsüz bir durumda olan hücresel yaşlanma, doku disfonksiyonuna ve organizmaların yaşlanmasına potansiyel olarak önemli bir katkı olarak ortaya çıkmıştır [1]. Yaşlanma, yaşlanma ile ilişkili beta-galaktosidazın (SA- -gal) yüksek aktivitesi, p16INK4A ve p21Waf1/Cip1 gibi yaşlanma biyobelirteçlerinin ekspresyonunun artması ve LaminB1'in ekspresyonunun azalması ile karakterize edilir [2]. İki temel hücresel yaşlanma türü vardır: replikatif yaşlanma ve stres kaynaklı erken yaşlanma. Replikatif yaşlanma, normal hücrelerin sınırlı sayıda bölünmeye ulaştıktan sonra bölünmeyi bırakması olgusu olarak tanımlanır. Kronolojik yaşlanma ile ilişkilidir. Sürekli hasar birikimi, hücre dışı matrisi (ECM) yeniden biçimlendirme ve organize etme yeteneğinin kaybolmasına yol açan, fibroblastların replikatif yaşlanmasına neden olabilir. Yaşlı dermisin ana özellikleri, dermisin ince ve düzensiz yapısına katkıda bulunan kollajen lif miktarının azalması ve matriks metalloproteinazların (MMP'ler) artmış üretimidir [3,4].

Epigenetik düzenleyici mekanizmalar, genomik ve moleküler ortamdaki stresörlere ve yaşa bağlı değişikliklere uyum sağlayarak yaşlanma sürecinin kilit aracılarıdır. Bu epigenetik değişiklikler, masif çekirdek histon indirgemesi, post-translasyonel modifikasyon ve DNA metilasyonu ile histonun deformasyonu, kanonik histonların histon varyantları ile değiştirilmesi ve organizma ve replikatif yaşlanma sırasında kodlayıcı olmayan RNA'nın (ncRNA) değişmiş ekspresyonu dahil olmak üzere çeşitli seviyelerde meydana gelir [5 ,6]. nc886, bir hedef proteine ​​bağlanabilen, böylece proteinin aktivitesine aracılık eden ve gen ekspresyonunu kontrol eden 101 nükleotit uzunluğundaki ncRNA'dır [7]. nc886 ayrıca, ekspresyon paterni ve tümör baskılayıcı genin yeri olan insan kromozomu 5q31 üzerindeki genomik konumu ile büyük ölçüde anlaşılan bir tümör baskılayıcı olarak önerilmiştir. nc886 ekspresyonunun bir özelliği, promotör bölgede CpG DNA metilasyonu ile malignitelerin sıklıkla susturulmasıdır [8]. Önceki çalışmalara dayanarak, UVB ışınlamasının neden olduğu nc886 ifadesinin azalmasının, keratinositlerde protein kinaz RNA ile aktive olan (PKR) yolağı yoluyla COX-2 ve MMP-9 artışları ile ilişkili olduğunu bulduk ve nc886 ekspresyonunun desteklenmesi, UVB koruyucu materyaller geliştirmek için yararlı bir strateji olabilir [9,10].

Yeşil çay, akne, rosacea, sedef hastalığı, viral siğiller ve hatta cilt kanseri gibi çeşitli dermatolojik durumlar için bir tedavi olarak incelenmiştir. Gallik asit (GC) ve epigallocatechin gallate (EGCG) dahil olmak üzere fenolik bileşikler, yeşil çayda iyi bilinen aktif bileşiklerdir. (-)-Epigallocatechin-3-(3"-O-metil) gallat (3" Me-EGCG), EGCG'nin benzersiz bir O-metillenmiş formudur ve oolong çayında ve yeşil çayda bulunur. Özellikle Jangwon No. 3 (Amorepacific yeşil çay çeşitleri), diğer yeşil çay çeşitlerine göre daha fazla 3" Me-EGCG içerir [11]. 3" Me-EGCG'nin keratinositler üzerinde antioksidan ve fotokoruyucu etkiler gösterdiği bildirilmiştir [12] . Bu çalışmada, nc886'nın fibroblastların replikatif yaşlanmasındaki rolünü araştırdık ve nc886 ekspresyonunu artırabilen yüksek konsantrasyonlu yeşil çay 3" Me-EGCG preparasyonunun (AbsoluTea Concentrate 2.0) hücresel yaşlanmayı iyileştirip iyileştiremeyeceğini belirledik.

2. Sonuçlar

2.1. AbsoluTea Konsantresi 2'nin Kimyasal Profili.0 (ATC)

AbsoluTea Konsantresi 2.0 (ATC)'nin kimyasal profili, Şekil 1B'de gösterilmektedir. Sonuçlar, Yöntem bölümünde açıklandığı gibi hazırlanan ATC için HPLC kullanılarak elde edildi. ATC yüzde 30 veya daha fazla 3" Me-EGCG içermektedir (Şekil 1B). Yeşil çay ekstraktının 3" Me-EGCG içermediği veya yüzde 6'dan daha düşük bir konsantrasyon gösterdiği bilinmektedir [13,14]. ATC ile tedavi edilen hem genç hem de yaşlanmış fibroblastlar, nc886 ifadesinde yüzde 70 etanolik yeşil çay özütü ile tedavi edilenlere göre daha fazla artış gösterdi (Ek Şekil S1A). Ek olarak, ATC ile tedavi edilen yaşlanmış fibroblastlardaki SA- -gal ekspresyon seviyeleri, yeşil çay ekstresi ile tedavi edilenlere göre daha fazla azaldı (Ek Şekil S1B).

2.2. nc886 Fibroblastların Hücresel Yaşlanmasını Düzenler

nc886'nın fibroblastların hücresel yaşlanmasındaki rolünü gözlemlemek için, büyüyen ve alt kültürleme yoluyla replikatif bir yaşlanma modeli kullandık. Ek Şekil S2'de gösterildiği gibi, SA- -gal aktivitesi ve yaşlanmış belirteçler p16INK4A ve p21Waf1/Cip1'in ekspresyon seviyeleri artmış ve genç hücrelere kıyasla yaşlanmış fibroblastlarda Lamin B1 ekspresyonu azalmıştır. Önceki birçok çalışma, yaşlanmanın oksidatif stresten kaynaklandığını bildirmiştir. Bu oksidatif stres serisinin hücresel yaşlanma ile ilgili olup olmadığını doğrulamak için genç (p3) ve yaşlanmış fibroblastlarda (p30) ROS seviyeleri ölçüldü. Sonuçlar, ROS seviyelerinin yaşlanma ile arttığını gösterdi (Ek Şekil S2D). nc886'nın fibroblastlarda hücresel yaşlanma üzerindeki potansiyel etkisini gözlemlemek için, her pasaj sayısında nc886 gen ekspresyon seviyesi belirlendi. nc886 ifadesinin seviyesi artan pasaj sayısı ile azalmıştır (Şekil 2A).

CpG adacıklarının metilasyonu ile nc886 ekspresyonunun azaldığı bildirilmiştir. Yaşlanan fibroblastlarda nc886 aşağı regülasyonunun nc886'nın metilasyonuna aracılık edip etmediğini belirlemek için metilasyona özgü bir PCR gerçekleştirildi. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, nc886'nın metilasyonu, artan geçiş sayısıyla arttı (Şekil 2A). Bu sonuç, nc886'nın yüksek sayıda fibroblastta azalmış ifadesinin, nc886 DNA metilasyonundaki bir artıştan kaynaklandığını göstermektedir. nc886'nın fibroblast yaşlanmasındaki rolünü doğrulamak için, nc886 aşırı ekspresyonunda ve yıkım modellerinde yaşlanan işaretlerdeki değişiklikler belirlendi. Sonuçlar, nc886 aşırı ekspresyonuna sahip yaşlanmış fibroblast grubunun, azalmış SA-beta-gal aktivitesi, azalan p16INK4A ve p21Waf1/Cip1 ekspresyon seviyeleri ve artan laminB1 seviyeleri gösterdiğini ortaya koydu. Ek olarak, yaşlanan fibroblastlardaki ROS artışı, nc886 aşırı ekspresyonu ile azaltılmıştır (Şekil 2B). Tersine, nc886 yıkımına sahip genç fibroblast grubunda hücresel yaşlanma hızlandı ve p16INK4A ve p21Waf1/Cip1 gibi hücresel yaşlanma belirteçlerinin ekspresyon seviyeleri arttı (Şekil 2C). Bu sonuçlar, nc886'nın yaşlanma belirteçlerinin ekspresyonunu düzenleyerek fibroblastların hücresel yaşlanmasını düzenleyebileceğini göstermektedir (Şekil 2B, C).

2.3. ATC, nc886 İfadesini Düzenleyerek Hücresel Yaşlanmayı Azaltır

Yukarıda elde edilen sonuçlar, artan nc886 ekspresyonunun, yaşlanan işaretleyicilere aracılık ederek hücresel yaşlanmayı iyileştirebileceğini gösterdi. ATC'nin nc886 ekspresyonu üzerindeki etkisini gözlemlemek için, nc886'nın yaşlanmış fibroblastlarda ekspresyon seviyesi ve metilasyonu, sitotoksik olmayan bir konsantrasyonda ATC ile tedaviden sonra değerlendirildi (Şekil 3A). Şekil 3B ve C'de gösterildiği gibi ATC, nc886 ekspresyonunu önemli ölçüde arttırdı ve nc886'nın metilasyonunu konsantrasyona bağlı bir şekilde azalttı. Bu sonuç, ATC tarafından nc886 ekspresyonunun artışına, nc886 metilasyonunun inhibisyonunun aracılık ettiğini gösterdi. Ek olarak, ATC'nin SA- -gal aktivitesini inhibe ettiğini ve yaşlanmış fibroblastlarda p16INK4A ve p21Waf1/Cip1 yaşlanmış belirteçlerin ifade düzeylerini azalttığını gözlemledik (Şekil 3D, E). Bununla birlikte, yaşlanmayla birlikte azaldığı bilinen LaminB1'in ifadesi, ATC ile tedavi edilen yaşlanmış fibroblastlarda artmıştır (Şekil 3E). Bu sonuçlar, ATC'nin nc886 ekspresyonunu artırarak hücresel yaşlanmayı azaltabileceğini göstermektedir.

2.4. ATC, ECM ve SASP'nin Yaşa Bağlı Değişikliklerini Düzenliyor

Fibroblast yaşlanmasının bir özelliği, kollajeni parçalayan bir bileşen olan MMP-1 aktivitesinin artması, oysa kollajen sentezinin azalmasıdır [15,16]. Yüksek geçiş sayılarına sahip yaşlanmış fibroblastlarda MMP-1 artışı ve kolajenin azalması doğrulandı (Şekil 4A). Ancak ATC, MMP-1 ifadesini baskıladı ve yaşlanmış fibroblastlarda kollajen sentezini arttırdı. Bu sonuç, ATC'nin yaşlanmış fibroblastlarda MMP-1 ekspresyonu ve kollajen sentezinin düzenlenmesi yoluyla yaşa bağlı ECM değişikliğini geliştirebileceğini gösterir (Şekil 4B). Yaşlanan hücrelerin spesifik proinflamatuar faktörleri, büyüme faktörlerini ve proteolitik enzimleri salgıladığı yaşlanmayla ilişkili salgı fenotipinin (SASP) yaşlanmayla ilişkili hastalıkların başlamasına ve ilerlemesine katkıda bulunduğu bildirilmiştir [17-19]. ATC'nin SASP üzerindeki etkisini özellikle IL-1 , IL_6 ve IL-8 gibi proinflamatuar sitokinler üzerinde gözlemledik. Şekil 4C'de gösterildiği gibi ATC, yaşlanma kaynaklı IL-1 , IL-6 ve IL-8'nin ifade seviyelerini aşağı doğru düzenledi. Bu, ATC'nin SASP'yi baskılayarak yaşlanma karşıtı bir etki gösterebileceğini düşündürür.

3. Tartışma

Yaşlanan hücreler, genişlemiş ve genellikle düzensiz nükleer ve kromatin yeniden yapılanmasını içeren karakteristik morfolojik değişikliklere uğrar. Yaşlanma, DNA hasarı, replikasyon tükenmesi veya onkojen ekspresyonu ile indüklendiğinde, Lamin B1 birincil olarak kaybolur. Çeşitli dahili veya harici stresörler, p53 ve/veya p16INK4A yolunu aktive etmek için DNA hasarı tepkisi (DDR) yolunu tetikleyebilir. p16INK4A, Cdk4/6'yı inaktive edebilir, fosforile edilmiş pRb'nin birikmesine neden olabilir, E2F transkripsiyon faktörünün regülasyonunu bozabilir ve hücre döngüsü durmasını veya yaşlanmasını indükleyebilir [20,21]. Çoğunlukla işlevsiz mitokondri tarafından üretilen reaktif oksijen türlerinin (ROS) artan üretimi, DNA hasarı ve p53, p16INK4A ve p21Waf1/Cip1 [22] dahil olmak üzere yaşlanma sinyal yollarının transaktivasyonu yoluyla hücresel yaşlanmaya yol açabilir.

Bu çalışmada, artan geçiş sayısı ile nc886 ifadesinin azaldığını ve nc886 ifadesinin yukarı regülasyonunun, LaminB1, p16INK4A, p21Waf1/Cip1 ve ROS üretimi aracılığıyla hücresel yaşlanmayı azalttığını bulduk. nc886, birçok malignitede RNA polimeraz III (Pol III) tarafından kopyalanır ve CpG DNA hipermetilasyonu tarafından susturulur [8]. Yaşlanan fibroblastlarda CpG adalarının metilasyonu ile nc886 ekspresyonunun azaldığını gözlemledik. Bu sonuç, CpG adalarının hipermetilasyonunun, hücresel yaşlanmayı baskılayıcı olarak nc886'nın işlevselliğini bozduğunu gösterir.

nc886'dan etkilenen spesifik gen ekspresyon yolları belirsizdir. Daha önce diğer ncRNA'lar için rapor edilmiş olmaları muhtemeldir. nc886, kromatin yapısı, transkripsiyon faktörü aktivitesi, transkripsiyon sonrası ve post-translasyonel gen regülasyonu seviyelerinde yaşlanma sinyal yolağına doğrudan veya dolaylı olarak aracılık ederek hücresel yaşlanmada kritik roller oynayabilir [23]. Örneğin, nc886, hücre döngüsü ilerlemesinin yaşlanan yolağına aracılık edebilir. Bir ncRNA olarak AK156230'un, otofaji ve hücre döngüsü ilerlemesindeki rolleri aracılığıyla fibroblastların replikatif yaşlanmasının indüklenmesi ile ilişkili olduğu bildirilmiştir. AK156230'un aşağı regülasyonu, sikline bağımlı kinaz 1'i (CDK1) azaltırken p53 ve p21'i aktive ederek hücrelerin yaşlanma tepkileri göstermesine neden oldu [24]. Yaşlanma ile ilişkili ncRNA1 (SAL-RNA1), MALAT1 ve MIAT, hücresel yaşlanmanın negatif düzenleyicileri olarak bilinir. Yaşlanan fibroblastlarda azalırlar. Bu genlerin aşağı doğru düzenlenmesi, SA-gal, p16, p21 ve p53 gibi yaşlanma belirteçlerinde artışa yol açabilir [25]. MALAT1'in hücresel yaşlanma üzerindeki etkisi, onkojenik transkripsiyon faktörü b-Myb/Mybl2'nin azalmasıyla sağlandı.

Çeşitli ncRNA'ların ekspresyonu yaşlanma sırasında etkilenmesine rağmen, sadece birkaçı yaşlanmaya işlevsel olarak dahil olur. ncRNA'ların lokalizasyonu, işlevde yer alan mekanizmaları anlamak için önemli olduğundan, yaşlanmayı etkileyen moleküler mekanizmalar açıklanırken nükleer ve sitoplazmik ncRNA'lar ayrı ayrı tartışılır [26]. Sitoplazmada bulunan ncRNA, hedef mRNA ile baz eşleşmesi yoluyla bir çeviri düzenleyici olarak işlev görebilir [27]. ncRNA, mRNA stabilitesini artırarak veya azaltarak protein ekspresyon seviyelerini etkileyebilir [28].

Örneğin, RAS kaynaklı yaşlanma sırasında, sitoplazmik UCA1, hnRNPA1'i tecrit ederek p16 mRNA stabilizasyonuna katkıda bulunur [29]. nc886, bir protein kinaz RNA ile aktive edilmiş (PKR) bağlanma bölgesi içerir. PKR–nc886 bağlanması, PKR aktivitesini inhibe edebilir. Çift sarmallı RNA (dsRNA) için bir sitoplazmik reseptör olan PKR, enfeksiyon, sitokinler, oksidatif stres ve ışınlama (UV dahil) tarafından aktive edilen serin/treonin protein kinaz tarafından düzenlenir ve ardından inflamasyon ve apoptoz indüksiyonuna yol açar [20 ,21] [30,31]. nc886, dsRNA ile karşılaştırılabilir bir afinite ile PKR'ye bağlanır ve PKR'nin etkinleştirilmesini önler. nc886 yıkımı, ökaryotik başlatma faktörü 2 alt biriminin (eIF2) PKR yolu aracılığıyla fosforilasyonuyla sonuçlanır, bu da hücre ölümüne neden olur ve global hücresel protein sentezini inhibe eder. TNF- tarafından COX-2, IL-8 ve MMP'lerin üretimine, insan kondrositlerinde PKR yolunun aracılık ettiği bildirilmiştir [32]. Daha önceki bir çalışmada, UVB'nin neden olduğu enflamasyonun keratinositlerde nc886-PKR yolu aracılığıyla düzenlenebileceğini de göstermiştik [10].

Ayrıca PKR, neonatal kardiyak miyositlerde oksidatif stresin neden olduğu hasarla ilişkilidir. PKR'nin inhibisyonu, apoptoz ve enflamasyonu azaltarak H2O2-kaynaklı yaralanmaya karşı koruma sağlar [33]. Enflamasyon ve oksidatif stres, yaşlanma sürecini indükleyen başlıca faktörlerdir. Bu nedenle, PKR yolu, nc886 tükenmesi ile indüklenen fibroblastların hücresel yaşlanmasına aracılık edebilir. nc886'nın fibroblastların hücresel yaşlanması üzerindeki etkisine dahil olan ayrıntılı düzenleyici mekanizmayı aydınlatmak için daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır.

Yeşil çay ekstraktının antiaging etkileri önceki çalışmalarda geniş çapta rapor edilmiştir. Yeşil çayın antioksidan ve antienflamatuar aktiviteleri, yaşlanma karşıtı etkisine katkıda bulunan iyi bilinen mekanizmalardır. Bir ön testte, ATC'nin nc886 ifadesini yeşil çayın yüzde 70'ten fazla etanolik ekstraktı kadar önemli ölçüde arttırdığını bulduk (Ek Şekil S1A). Bu sonuç, 3" Me-EGCG içeren konsantre kateşinlerin, nc886 ekspresyonunun yukarı regülasyonu ile ilişkilendirilebileceğini göstermektedir. nc886 uyarıcı ajanın hücresel yaşlanmayı önleyip önleyemeyeceğini belirlemek için, ATC'nin yaşlanan fibroblastlar üzerindeki etkisini gözlemledik. ATC, nc886 ekspresyonunu şu kadar artırdı: yaşlanan fibroblastlarda nc886 geninin metilasyon seviyesinin inhibe edilmesi (Şekil 3B, C). ATC ayrıca SA- -gal aktivitesi, LaminB1, p16INK4A ve p21Waf1/Cip1 gibi yaşlanan biyobelirteçlere aracılık ederek hücresel yaşlanmayı rahatlattı (Şekil 3E) ).

Ayrıca, hücresel yaşlanmanın neden olduğu artan MMP-1 ve azalan kollajen üretimi, ATC tarafından geri yüklendi (Şekil 4B). SASP faktörleri, hücre tipine ve yaşlanmanın neden olduğu stres tipine bağlı olarak biraz farklılık gösterir. Bunlar genellikle IL-6 ve IL{{6} gibi proinflamatuar sitokinleri düzenleyen NF-κB için hedef genler olarak bilinirler. }. Bu çalışmada, yaşlanan hücrelerde artan IL-1 , IL_6 ve IL-8 ifadesinin ATC tarafından bastırıldığını doğruladık (Şekil 4C). Yeşil çayın hücresel yaşlanma üzerindeki iyileştirici etkisinin, nc886 düzenlemesi, anti-oksidasyon ve anti-inflamasyon dahil olmak üzere çoklu mekanizmalar tarafından elde edilmesi olasılığını göz ardı edemeyiz. Bununla birlikte, sonuçlarımız, ATC tarafından artan nc886'nın, hücresel yaşlanmanın baskılanmasında kritik bir rol oynadığını ve ardından fibroblastların ECM üretimini etkilediğini göstermektedir.

4. Malzemeler ve Yöntemler

4.1. ATC'nin hazırlanması

Bu çalışma için kullanılan kurutulmuş yeşil çay yaprakları (Camellia sinensis var. sinensis cv. Jangwon No. 3), Jeju, Güney Kore'deki Dolsongi çay bahçesinde (33◦16023.900 K 126◦28058.300 D) yetiştirilen çay bitkilerinden elde edilmiştir. Kuru çay yaprakları (170 g), oda sıcaklığında 16 saat boyunca yüzde 70 EtOH (h/h) ile özümlendi. Ekstrakt daha sonra bir liyofilizatör (TF10D, TEFIC BIOTECH, Xian, Çin) kullanılarak toz haline getirildi. ATC'yi hazırlamak için, EtOH ekstraktı bir döner buharlaştırıcı ile on kat konsantre edildi ve AB-8 reçinesi (iç çap 5 cm, uzunluk 45 cm) ile paketlenmiş bir kolona yüklendi. Kolonun solvent elüsyonu, yüzde 20, yüzde 30 ve yüzde 100 EtOH (v/v) yatak hacminin (BV) 4 katı ile gerçekleştirildi. Bu çalışmada kolonda kalan solventler elüsyondan önce hava kompresörü ile uzaklaştırılmıştır. Yüzde 30 EtOH elüatı yirmi kat konsantre edildi ve bir poliamid kolona (iç çap 2.5 cm, uzunluk 40 cm) uygulandı. Poliamid kolon, yüzde 10'luk BV ve yüzde 100 EtOH'nin 5 katı elute edildi. Yüzde 100 EtOH eluatı dikkatli bir şekilde konsantre edildi ve liyofilize edildi.

4.2. ATC ile Hücre Kültürü ve Hücre Tedavisi

İnsan dermal fibroblastları (HDF'ler) ATCC'den (Manassas, VA, ABD) satın alındı. Hücre kültürü, yüzde 10 fetal sığır serumu (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD) ve yüzde 1 penisilin ile takviye edilmiş Dulbecco'nun değiştirilmiş Eagle ortamı (WELGENE, Daegu, Kore) kullanılarak yüzde 5 CO2 ile 37 ◦C'de kontrollü koşullar altında gerçekleştirildi. -streptomisin (WELGENE, Daegu, Kore). Hücreler, 2 x 105 hücre/plaka yoğunluğunda 6-gözlü plakalara ekildi. Yüzde 60 birleşmeye ulaştıktan sonra, 72 saat boyunca belirtilen ATC konsantrasyonu ile muamele edildiler.

4.3. SA- -Gal Boyama ve Akış Sitometrisi Analizi

Hücreler, üreticinin talimatlarına göre bir SPiDER- -Gal (Dojindo, Kumamoto, Japonya) kullanılarak boyandı. Hücreler, bir EVOS® FL Hücre Görüntüleme Sistemi (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD) ve bir BD FACS Calibur akış sitometresi (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, ABD) ile analiz edildi.

4.4. Hücre içi ROS Ölçümü

Hücre içi ROS üretimi, bir flüoresan ROS göstergesi olan C20,70 -diklorodihidrofloresein diasetat (H2DCFDA; Molecular Probes) kullanılarak izlendi. Hücreler, 37 ◦C'de 30 dakika boyunca H2DCFDA (5 uM) ile inkübe edildi. Hücre ile ilişkili floresan, bir BD FACS Calibur akış sitometresi (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, ABD) ile saptandı.

4.5. Gerçek Zamanlı PCR ve Metilasyona Özgü PCR

Toplam RNA, TRIzol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD) kullanılarak ekstre edildi. RNA'nın kantitatif ölçümü, bir Epoch mikroplaka spektrofotometresi (BioTek, Winooski, VT, ABD) kullanılarak yapıldı. cDNA, bir am-fiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix (GenDEPOT, Barker, TX, ABD) kullanılarak sentezlendi. Genomik DNA, AccuPrep® Genomic DNA Extraction Kit (BIONEER, Daejeon, Kore) kullanılarak ekstre edildi. Bisülfit dönüşümü, EZ DNA metilasyon kiti (Zymo Research, CA, ABD) kullanılarak gerçekleştirildi. qRT-PCR gerçekleştirmek için bir AMPIGENE® cDNA Sentez Kiti (Enzo Life Sciences Inc., Farming-dale, NY, ABD) ve bir ABI7500 gerçek zamanlı PCR sistemi (Ambion Inc, Austin, TX, ABD) kullanıldı. Bu çalışmada kullanılan primer dizileri Tablo 1'de açıklanmıştır.

4.6. Laktat Dehidrogenaz Testi

Hasarlı hücrelerden salınan laktat dehidrojenaz (LDH) aktivitesini ölçerek sitotoksisiteyi belirlemek için LDH tahlili kullanıldı. Test, üreticinin talimatlarına göre bir LDH Sitotoksisite WST Test kiti (Enzo life sciences, Farmingdale, NY, ABD) kullanılarak yapıldı.

4.7. nc886 Aşırı Ekspresyonu için DNA Transfeksiyonu ve nc886 Knockdown için siRNA Transfeksiyonu

Hücrelerde nc886'nın aşırı ekspresyonu için DNA elde etmek amacıyla DNA, şablon olarak HDF'lerin genomik DNA'sı ve Tablo 2'de açıklanan aşağıdaki primerler kullanılarak AccuPower® PCR PreMix (BIONEER, Daejeon, Kore) ile amplifiye edildi.

4.8. Western lekeleme

Hücre lizatları, PRO-PREP™ Protein Ekstraksiyon Solüsyonu (iNtRON Biotechnology, Gyeonggi do, Kore) ile hazırlandı. Toplam proteinler, bir NuPAGE elektroforez sistemi (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD) ile ayrıldı ve poliviniliden diflorür (PVDF) zarlarına aktarıldı. İmmunoblotlama, p16INK4A, p21Waf1/Cip1 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, ABD), MMP1, Col1A2 ve -actin'e (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, ABD) karşı birincil antikor kullanılarak yapıldı. Bantların tarama dansitometrik değerleri, ImageJ, yazılım versiyonu 1.52a (Ulusal Sağlık Enstitüleri, Bethesda, MD, ABD) kullanılarak analiz edildi.

4.9. Enzim bağlı immünosorbent deneyi

Belirtilen inkübasyondan sonra, kültür süpernatanındaki kollajen (Procollagen Type I C-Peptide EIA Kit, Takara, Shiga, Japonya) ve MMP-1 (R&D Systems, Minneapolis, MN, ABD), enzim bağlantılı immünosorbent deneyi kullanılarak ölçüldü. (ELISA) kiti üreticinin talimatlarına göre.

4.10. İstatistiksel analiz

Tüm sonuçlar ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunulur. İki grup arasındaki farklar, GraphPad Prism kullanılarak t-testi veya varyans analizi (ANOVA) ile değerlendirildi. İstatistiksel anlamlılık, p < 0.05 veya p < 0.01 olarak gösterildi.

5. Sonuçlar

Sonuç olarak, nc886 ekspresyonunun düzenlenmesi, fibroblastlarda potansiyel bir hücresel yaşlanma hedefi olabilir ve ATC, güçlü bir epigenetik yaşlanma karşıtı bileşen olabilir.

Yazar Katkıları:

Kavramsallaştırma, YK, KH ve EJ; metodoloji YK, HJ, N.-HP ve K.-SL; veri iyileştirme, YK, HJ ve EC; soruşturma, YK, HJ, EC, K.-SL, N.-HP ve EJ; proje yönetimi, WP, DP ve EJ; kaynaklar, WP ve DP; süpervizyon, DP ve EJ; yazı— orijinal taslak, YK; yazma—inceleme ve düzenleme, N.-HP, KH, WP, DP ve EJ Tüm yazarlar makalenin yayınlanan sürümünü okumuş ve kabul etmiştir.

Finansman:

Bu araştırma herhangi bir dış finansman almamıştır.

Kurumsal İnceleme Kurulu Beyanı:

Uygulanamaz

Bilgilendirilmiş Onam Beyanı:

Uygulanamaz.

Veri Kullanılabilirliği Beyanı:

Veriler istek üzerine sunulacaktır.

Çıkar çatışmaları:

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Referanslar

1. Campisi, J.; d'Adda di Fagagna, F. Hücre yaşlanması: İyi hücrelerin başına kötü şeyler geldiğinde. Nat. Rahip Mol. Hücre Biol. 2007, 8, 729–740. [CrossRef] [PubMed]

2. Kapoor, VK; Dureja, J. Yaşlanma: Kontrolüne yönelik yaklaşımlar. İlaç Keşfi Bugün Ther. Strateji. 2010, 7, 43–44. [ÇaprazRef]

3. Balıkçı, GJ; Kang, S.; Varani, J.; Bata-Csorgo, Z.; Van, Y.; Datta, S.; Voorhees, JJ Fotoyaşlanma ve kronolojik cilt yaşlanmasının mekanizmaları. Ark. Derm. 2002, 138, 1462–1470. [ÇaprazRef]

4. Tigges, J.; Krutmann, J.; Fritsche, E.; Haendeler, J.; Şaal, H.; Fischer, JW; Kelfalah, F.; Reinke, H.; Reifenberger, G.; Stuhler, K.; et al. Fibroblast yaşlanmasının ayırt edici özellikleri. makine Yaşlanma Dev. 2014, 138, 26–44. [ÇaprazRef]

5. Brunet, A.; Berger, SL Yaşlanma ve yaşlanmaya bağlı hastalıkların epigenetiği. J. Gerontol. Biol. bilim Med. bilim 2014, 69, S17–S20. [CrossRef] [PubMed]

6. Moskalev, AA; Aliper, AM; Smit-McBride, Z.; Buzdin, A.; Zhavoronkov, A. Yaşlanma ve uzun ömürlülüğün genetiği ve epigenetiği. Hücre Döngüsü 2014, 13, 1063–1077. [CrossRef] 7. Lee, K.; Kunkeaw, N.; Jeon SH; Lee, I.; Johnson, BH; Kang, GY; Bang, JY; Park, HS; Leelayuwat, C.; Lee, YS Precursor miR-886, kanserde baskılanmış yeni bir kodlamayan RNA, PKR ile birleşir ve onun aktivitesini modüle eder. RNA 2011, 17, 1076–1089. [CrossRef] [PubMed]

8. Park, JL; Lee, YS; Şarkı, MJ; Hong, SH; Ahn, JH; Seo, EH; Şin, SP; Lee, SJ; Johnson, BH; Stampfer, Bay; et al. Erken meme tümörü oluşumunda RNA polimeraz III transkripsiyonlarının epigenetik düzenlenmesi. Onkojen 2017, 36, 6793–6804. [CrossRef] [PubMed]

9. Lee, KS; Shin, S.; Cho, E.; Ben, WK; Jeon SH; Kim, Y.; Park, D.; Frechet, M.; Chajra, H.; Kodlayıcı olmayan bir RNA olan Jung, E. nc886, insan keratinositlerinde PKR yolu yoluyla UVB kaynaklı MMP-9 ve COX-2 ifadesini inhibe eder. biyokimya biyografiler. Res. komün. 2019, 512, 647–652. [CrossRef] [PubMed]

10. Lee, KS; Cho, E.; Weon, JB; Park, D.; Frechet, M.; Chajra, H.; Jung, E. nc886-PKR Yolu Düzenlemesi Yoluyla Laminaria japonica Ekstresi Tarafından UVB Kaynaklı Enflamasyonun Engellenmesi. Besinler 2020, 12, 1958. [CrossRef]

11. Ji, HG; Lee, YR; Lee, MS; Hwang, KH; Kim, EH; Park, JS; Hong, YS Çeşitli çay (Camellia sinensis L.) çeşitlerinde epigallocatechin-3-O-(3-Ometil)-gallat (EGCG300Me) ve amino asit profillerinin tanımlanması. Veri Özeti. 2017, 14, 607–611. [ÇaprazRef]

12. Kim, E.; Han, SY; Hwang, K.; Kim, D.; Kim, EM; Hüseyin, MA; Kim, JH; Cho, JY (-)-Epigallocatechin-3-(300-O-metil) Gallate'in Antioksidan ve Sitoprotektif Etkileri. Int. J. Mol. bilim 2019, 20, 3993. [CrossRef]

13. Huang, LH; Liu, CY; Wang, LY; Huang, CJ; Hsu, CH Yeşil çay ekstraktının yüksek düzeyde düşük yoğunluklu lipoprotein-kolesterol (LDL-C) olan aşırı kilolu ve obez kadınlar üzerindeki etkileri: Randomize, çift kör ve çapraz geçişli plasebo kontrollü bir klinik çalışma. BMC Tamamlayıcı. Altern. Med. 2018, 18, 294. [CrossRef] [PubMed]

14. Soares, S.; Soares, S.; Brandao, E.; Guerreiro, C.; Mateus, N.; de Freitas, V. Yeni bir hücre tabanlı model kullanarak yeşil çay flavanol özü ve kırmızı şarap antosiyanin özü arasındaki oral etkileşimler: Farklı oral epitellerin etkisi üzerine görüşler. bilim Rep. 2020, 10, 12638. [CrossRef] [PubMed]

15. Levi, N.; Papismadov, N.; Solomonov, I.; Sağ, İ.; Krizhanovsky, V. Yaşlanmada yaşlanmanın ECM yolu: Bileşenler ve düzenleyiciler. FEBS J. 2020, 287, 2636–2646. [CrossRef] [PubMed]

16. Pitozzi, V.; Mocali, A.; Laurenzana, A.; Giannoni, E.; Cifola, I.; Battaglia, C.; Chiarugi, P.; Dolara, P.; Giovannelli, L. Kronik Resveratrol Tedavisi Yaşlanmış İnsan Fibroblastlarında Hücre Adhezyonunu İyileştirir ve Enflamatuar Fenotipi Azaltır. J. Gerontol. Sör. 2013, 68, 371–381. [CrossRef] [PubMed]

17. Coppe, JP; Patil, CK; Rodier, F.; Güneş, Y.; Munoz, DP; Goldstein, J.; Nelson, PS; Deprez, PY; Campisi, J. Senesence ile ilişkili salgı fenotipleri, onkojenik RAS ve p53 tümör baskılayıcının hücre-otonom olmayan fonksiyonlarını ortaya koymaktadır. PLoS Biol. 2008, 6, 2853–2868. [ÇaprazRef]

18. Tchkonia, T.; Zhu, Y.; van Deursen, J.; Campisi, J.; Kirkland, JL Hücresel yaşlanma ve yaşlanan salgı fenotipi: Terapötik fırsatlar. J. Clin. Araştırmak 2013, 123, 966–972. [CrossRef] [PubMed]

19. Munoz-Espin, D.; Serrano, M. Hücre yaşlanması: Fizyolojiden patolojiye. Nat. Rahip Mol. Hücre Biol. 2014, 15, 482–496. [ÇaprazRef]

20. Lagger, G.; O'Carroll, D.; Rembold, M.; Khier, H.; Tischler, J.; Weitzer, G.; Schuettengruber, B.; Hauser, C.; Brunmeir, R.; Jenuwein, T.; et al. Proliferasyon kontrolü ve CDK inhibitörü baskılamasında histon deasetilaz 1'in temel bir işlevi. EMBO J. 2002, 21, 2672–2681. [CrossRef] [PubMed]

21. Freitas-Rodriguez, S.; Folgueras, AR; Lopez-Otin, C. Matriks metaloproteinazların yaşlanmadaki rolü: Doku yeniden şekillenmesi ve ötesi. Biyokimya. biyografiler. Acta Mol. Hücre Res. 2017, 1864, 2015–2025. [ÇaprazRef]

22. Victorelli, S.; Passos, Yaşlanmış Hücrelerde JF Reaktif Oksijen Türlerinin Tespiti. Yöntemler Mol. Biol 2019, 1896, 21–29. [PubMed]

23. Hücresel Yaşlanmada Puvvula, PK LncRNA'ların Düzenleyici Ağları. Int. J. Mol. bilim 2019, 20, 2615. [CrossRef] [PubMed]

24. Chen, YN; Cai, MY; Xu, S.; Meng, M.; Ren, X.; Yang, JW; Dong, YQ; Liu, X.; Yang, JM; Xiong, XD Fare embriyonik fibroblastlarında hücresel yaşlanmanın yeni bir düzenleyicisi olarak lncRNA, AK156230'un tanımlanması. Oncotarget 2016, 7, 52673–52684. [CrossRef] [PubMed]

25. Abdelmohsen, K.; Panda, A.; Kang, MJ; Xu, J.; Selimyan, R.; Yoon, JH; Martindale, JL; De, S.; Ahşap, WH, 3.; Becker, KG; et al. Yaşlanma ile ilişkili lncRNA'lar: Yaşlanma ile ilişkili uzun kodlamayan RNA'lar. Yaşlanan Hücre 2013, 12, 890–900. [ÇaprazRef]

26. Montes, M.; Lund, AH Yaşlanmada lncRNA'ların ortaya çıkan rolleri. FEBS J. 2016, 283, 2414–2426. [CrossRef] [PubMed]

27. Carrieri, C.; Çimatti, L.; Biagioli, M.; Beugnet, A.; Zucchelli, S.; Fedele, S.; Peşçe, E.; Ferrer, I.; Collavin, L.; Santoro, C.; et al. Uzun kodlamayan antisens RNA, yerleşik bir SINEB2 tekrarı aracılığıyla Uchl1 çevirisini kontrol eder. Doğa 2012, 491, 454–457. [ÇaprazRef]

28. Kretz, M.; Sipraşvili, Z.; Chu, C.; Webster, DE; Zehnder, A.; Qu, K.; Lee, CS; Flockhart, RJ; Groff, AF; Chow, J.; et al. Uzun kodlamayan RNA TINCR ile somatik doku farklılaşmasının kontrolü. Doğa 2013, 493, 231–235. [CrossRef] [PubMed]

29. Kumar, PP; Emechebe, Ü.; Smith, R.; Franklin, S.; Moore, B.; Yandel, M.; Lessnick, SL; Moon, AM Yaşlanmanın lncRNA ve yeni bir T-box3 ortak baskılayıcı kompleksi tarafından koordineli kontrolü. Elife 2014, 3, e02805. [ÇaprazRef]

30. Freund, A.; Laberge, RM; Demaria, M.; Campisi, J. Lamin B1 kaybı, yaşlanmayla ilişkili bir biyobelirteçtir. Mol. Biol. Hücre 2012, 23, 2066–2075. [ÇaprazRef]

31. Gal-Ben-Ari, S.; Barrera, I.; Ehrlich, M.; Rosenblum, K. PKR: Hatırlanması Gereken Bir Kinaz. Ön. Mol. Nörobilim. 2018, 11, 480. [CrossRef] [PubMed]

32. Ma, CH; Vu, CH; Jou, IM; Tu, YK; Asılı CH; Hsieh, PL; Tsai, KL PKR aktivasyonu, insan dejenere eklem kondrositlerinde iltihaplanmaya ve MMP-13 salgılanmasına neden olur. Redox Biol. 2018, 14, 72–81. [CrossRef] [PubMed]

33. Wang, Y.; Erkekler, M.; Xie, B.; Shan, J.; Wang, C.; Liu, J.; Zheng, H.; Yang, W.; Xue, S.; Guo, C. PKR'nin inhibisyonu, apoptozu ve enflamasyonu hafifleterek yenidoğan kardiyak miyositlerinde H2O2 -kaynaklı hasara karşı koruma sağlar. bilim 2016, 6, 38753–38763. [CrossRef] [PubMed]Yuna Kim 1 , Hyanggi Ji 1 , Eunae Cho 1 , Nok-Hyun Park 2 , Kyeonghwan Hwang 2 , Wonseok Park 2 , Kwang-Soo Lee 1 , Deokhoon Park 1 ve Eunsun Jung 1.

For more information:1950477648nn@gmail.com