Hünnap Polisakkaritleri Kronik Böbrek Hastalığı Olan Sıçanlarda Anemiyi Azalttı

İletişim: emily.li@wecistanche.com

Shiying Huang ve diğerleri

Soyut

Hünnap polisakkaritleri (JP), kan eksikliğinin tedavisi için düşünülen Ziziphus hünnapının diyet meyvesindeki aktif gıda kaynaklı glikanlardan biridir. Bu çalışmada, birkronikböbrekhastalıkJP'nin ve mekanizmasının CKD ile ilişkili anemi üzerindeki etkisini değerlendirmek için (CKD) sıçan modeli kullanıldı. CKD sıçanlarında, JP tedavisi önemli ölçüde iyileştiböbrekişlev, böbrekpatolojikincinmeve artan kırmızı kan hücreleri, hemoglobin, hematokrit ve trombosit sayısı dahil hematolojik parametreler. Ayrıca, LC-MS/MS hedefli metabolomik sonuçlar, JP'nin CKD sıçanlarında kısa zincirli yağ asitleri (SCFA'lar) salınımını desteklediğini gösterdi. Ayrıca, JP serum eritropoietin (EPO) seviyesini, böbrek EPO mRNA'sını veböbrekHIF sinyali yoluyla EPO proteini. Toplu olarak, bu sonuçlar, JP'nin CKD ile ilişkili anemi üzerindeki etkisinin, SCFA'ların salınımının ve eritropoietin üretiminin düzenlenmesinde yer alabileceğine ve CKD ile ilişkili anemi tedavisinde gıda takviyeleri olarak JP'nin daha da geliştirilmesini desteklediğine dair kanıt sağlar.

Anahtar Kelimeler: Hünnap polisakkaritleriKronikböbrek hastalıkAnemi Eritropoietin Hipoksi ile indüklenebilir faktör- Kısa zincirli yağ asitleri

Cistanche hakkında daha fazla bilgi almak için buraya tıklayın

1. Giriş

Kronikböbrek hastalık(KBH), renal yapısal anormalliklerin veya fonksiyonel bozuklukların klinik bir sendromu olarak tanımlanır ve dünya çapında giderek artan bir halk sağlığı yükü haline gelmektedir (Webster, Nagler, Morton, & Masson, 2017). Renal anemi, artan ölüm riskine katkıda bulunan KBH'nin en yaygın komplikasyonları arasındadır (Locatelli ve ark., 2019). Eritropoietin (EPO) üretiminin yetersizliği, KBH'de aneminin kabul edilen başlıca itici faktörüdür (Pappa, Dounousi, Duni ve Katopodis, 2015). EPO karaciğerde üretilir veböbrekeritrosit üretimi için gerekli olan (Lappin & Lee, 2019). Hipoksik koşullar altında, hipoksi ile indüklenebilir faktör (HIF), EPO ifadesini aktive edebilir (Sch¨ odel & Ratcliffe, 2019). EPO üretimini indüklemek için HIF'yi hedeflemek, bu nedenle, CKD ile ilişkili anemiyi tedavi etmek için yeni bir terapötik strateji olarak kabul edilmiştir.

Hünnap, Ziziphus hünnap değirmeninin meyveleridir. (Rhamnaceae), Çin tarihi olarak da bilinir. Hünnap, şifalı bir bitki ve gıda takviyesi olarak binlerce yıllık uzun bir geleneksel kullanıma sahiptir. Hünnap, hematojenik veya kronik yetersiz beslenmeden muzdarip kişiler için bir sağlık takviyesi olarak kullanılır. Hünnap polisakkaritleri (JP), farklı monosakkarit ve üronik asit oranlarıyla birleştirilmiş suda çözünür bir bileşen (Ji, Hou, Yan, Shi ve Liu, 2020), hünnap içindeki aktif bileşenlerden biridir (Ji ve diğerleri, 2017). ), hepatoprotektif etki ve immünomodülatör aktivite sergilediği ve bağırsak bariyer fonksiyonunu geliştirdiği iyi kabul edilmiştir (Liu ve diğerleri, 2015; Yue ve diğerleri, 2015). Gerçekten de, JP'nin de anemi üzerinde potansiyel etkilere sahip olduğu yaygın olarak kabul edilir. Bununla birlikte, anemi tedavisinde JP'nin moleküler mekanizması hala daha az bilinmektedir.

Son yıllarda, metabolomik, hastalığın ilerlemesine katkıda bulunan potansiyel faktörleri anlamak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Hedeflenen metabolomikler, CKD gibi karmaşık insan hastalıklarının moleküler belirteçlerinin belirlenmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır. İndoksil sülfat (IS) ve p-kresil sülfatın (PCS), CKD ilerlemesinin biyolojik belirteci olduğu doğrulandı (Meijers & Evenepoel, 2011) ve artan trimetilamin-N-oksit (TMAO) derecesi doğrudan renal tübülointerstisyel fibrozise ve işlev bozukluğuna yol açabilir. (Tang ve diğerleri, 2015). Bağırsak mikrobiyal bağımlı metabolitleri olan kısa zincirli yağ asitleri (SCFA'lar), çeşitli fizyolojik süreçleri etkileme kabiliyetine sahip enerji substratlarıdır (LeBlanc ve diğerleri, 2017) ve SCFA'ların azalmasının CKD ilerlemesine katkıda bulunduğu bildirilmiştir. (Koh, De Vader, Kovatcheva-Datchary ve B¨ akhed, 2016, Wang ve diğerleri, 2019). Ayrıca, SCFA'lar oksidatif stresin inhibisyonu yoluyla böbrek yapısını hasardan koruyabilmiştir (Li, Ma ve Fu, 2017). Bununla birlikte, SCFA'ların demir emilimi üzerinde yararlı bir etki gösterdiği ve eritropoezi indükleyen ve anemiyi düzelten embriyonik/fetal globin gen ekspresyonunu yukarı regüle ettiği bulunmuştur (Tako, Glahn, Knez ve Stangoulis, 2014). Bununla birlikte, renal anemideki SCFA'ların mekanizmasının hala açıklığa kavuşturulması gerekmektedir.

Bu çalışmada, JP'nin SCFA'ların salınımını düzenleyebileceğini ve sonucu renal anemiyi düzeltmek olan HIF aracılı EPO üretimini uyarabileceğini varsayıyoruz. Burada, böbrek fonksiyonları ve hematolojik parametreler dahil olmak üzere 5/6 nefrektomi ile indüklenen CKD sıçanlarında JP'nin böbrek anemisini iyileştirmedeki etkisini araştıracağız. Dışkıda asetik asit, propanoik asit, izobütirik asit, bütirik asit, 2-metil butirik asit, izovalerik asit, valerik asit ve heksanoik asit dahil olmak üzere sekiz SCFA'yı belirlemek için LC-MS/MS kullanan hedefli bir metabolomik yaklaşım geliştirilmiştir. böbrek numuneleri ve hedeflenen SCFA'ların seviyeleri sağlıklı ve CKD sıçanlarda değerlendirilir. Ek olarak, JP ile tedavi edilen sıçanlarda HIF sinyalinin katılımı da ortaya çıkar.

Şekil 1. JP'nin tipik GC-MS kromatografisi. (A) Aldononitril asetat türevlendirmesinden sonra monosakarit yapısal formülleri; (B) Standart monosakkaritler karışımının ve JP hidrolize monosakkaritlerin temsili GC–MS karışık iyon kromatografisi (MIC) profilleri. Kromatografi profillerindeki pikler, (A)'da gösterilen kimyasal işarete karşılık geldi: 1. ramnoz, 2. arabinoz, 3. fukoz, 4. ksiloz, 5. mannoz, 6. glukoz, 7. galaktoz, 8. inositol (ISTD ).

2. Malzemeler ve yöntemler

2.1. Hünnap polisakkarit hazırlanması

Z. jujuba'nın meyveleri, Shenzhen Huahui Pharmaceutical Co., Ltd.'den satın alındı. Malzemelerin kimliği, Çin Halk Cumhuriyeti Farmakopesi 2015 Baskısına göre Dr. Jianping Chen tarafından doğrulandı. Kupon örnekleri, 18100601 numaralı Shenzhen Geleneksel Çin Tıbbı Hastanesinde tutuldu.

Ham JP, daha önce tarif edildiği gibi küçük değişikliklerle hünnaptan çıkarıldı (Ji ve diğerleri, 2020). Kısaca hünnaplar 10 hacim su (v/w) ile 80 ◦C'de 3 saat su banyosunda inkübe edildi ve 3 kez ekstrakte edildi. Filtrasyondan sonra filtratları birleştirin ve bu kombinasyonu kontrollü bir vakum altında döner bir buharlaştırıcıda yoğunlaştırın. Konsantre çözelti, 12 saat boyunca 4 °C'de dört kat etanol (h/h) eklenerek ayrıca çöktürüldü. Çökelti santrifüjleme ile toplandı ve ham JP'yi elde etmek için düşük basınç altında kuruyana kadar kurutuldu. JP'nin saflığı kalorimetre kullanılarak yüzde 80 olarak belirlendi.

2.2. Hünnap polisakaritinin monosakarit bileşiminin karakterizasyonu

EI kaynağı, SH-Rxi-5Sil MS kapiler kolonu (30 m) ile donatılmış bir Shimadzu GC–MS sistemi (Shimadzu GC–MS TQ8040, Shimadzu GC 2010 plus ile arayüzlenmiştir) x 0.25 mm ID, 0.25 um film kalınlığı, Shimadzu) 10:1'lik bir bölünme oranı ile türevlendirme hidrolize monosakaritleri belirlemek için kullanıldı. Enjeksiyon, iyon kaynağı ve arayüz sıcaklığı 250 ◦C, 200 ◦C ve 250 ◦C idi. Kolon başlangıç ​​sıcaklığı 1 dakika 120 ◦C'de tutuldu, daha sonra 15 ◦C/dk'da 160 ◦C'ye yükseltildi ve 4 dakika, 2 ◦C/dk ila 165 ◦C'de tutuldu ve 2 dakika, 20 ◦C'de tutuldu. /

min ila 195 ◦C, 5 ◦C/dk ila 250 ◦C ve 3 dakika tutuldu. Helyum taşıyıcı gaz akış hızı 46 cm/s'de tutuldu ve her numuneden 2 μL cihaza enjekte edildi. Analitler, seçilen iyon izleme (SIM) modunda, hedef iyon: ramnoz (m/z 129.00), arabinoz (m/z 115.00), fukoz (m/ z 103.00), ksiloz (m/z 115.00), mannoz (m/z 115.00), glikoz (m/z 115.00 ), galaktoz (m/z 115.00), inositol (m/z 126.00). Monosakkarit standartları şu şekilde sıralanmıştır: L (artı )-arabinoz (1506–200202), fukoz (112014–201902), D-ksiloz (111508–201605), D-glukoz (110833–201908), ramnoz (111683–201502) ), galaktoz (100226–201807), D-mannoz (140651–201805), Ulusal Gıda ve İlaç Kontrolü Enstitülerinden satın alındı. İnositol, Sigma'dan elde edildi (I7508-50 g).

Ekstrakte edilen JP (10 mg), 10 mL 2 mol/L trifloroasetik asit (TFA) ile 105 oC'de 3 saat boyunca monosakkaritlere hidrolize edildi ve JP'den hidrolize monosakkaritler konsantre edildi ve azaltılmış basınç altında 60 ◦C'de yıkandı. TFA'yı çıkarın ve kalıntılar 2 mL su ile yeniden oluşturuldu. 100 µL hidrolize monosakkarit çözeltisine 250 µL 20 mg/mL hidroksilamin hidroklorür/piridin çözeltisi eklendi ve 45 dakika 90 ◦C'lik su banyosunda tutuldu. Ardından 250 µL asetik anhidrit ilave edilerek 90 ◦C'lik su banyosunda 45 dakika daha tutuldu. Reaksiyonun sonunda karışım, 1 mL sikloheksan ile 5 kez özümlendi ve sikloheksan tabakası, 1 mL'ye konsantre edildi. Analiz için GC–MS'ye 1 µL süpernatant enjekte edildi (Li & Shi, 2013).

2.3. Hayvanlar

Tüm deneyler, Guangzhou Çin Tıbbı Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı Kullanım Komitesi tarafından onaylanan protokollerle yapıldı. 180-220 g ağırlığındaki erkek ve dişi Sprague-Dawley sıçanları, Guangdong Tıbbi Laboratuvar Hayvanları Merkezi'nden (Foshan, Çin, İzin No. SCXK (Yue) 2008-0002) alındı ​​ve belirli bir patojen içermeyen (SPF) içinde muhafaza edildi. ) 12 saat aydınlık-karanlık döngüsü altındaki hayvan tesisi, yiyecek ve su serbestçe.

İndüklenen böbrek yetmezliği için önceki açıklamaya göre 5/6 nefrektomi yapıldı (Chen ve ark., 2019). Tüm cerrahi operasyon anestezi altında yüzde 10 kloral hidrat ile gerçekleştirildi. Sahte operasyon grubu (n=6) karın boşluğunu açmak için aynı adımları attı ve böbreği açığa çıkardı. 5/6 nefrektomili sıçanlar rastgele iki gruba ayrıldı. Tedavi edilmeyen sıçanlar (CKD grubu, n=6) ve JP alan sıçanlar (CKD artı JP grubu, n=6) ​​gavaj yoluyla 1.2 g/kg/gün dozunda. 90 günlük operasyondan sonra 90 günlük yönetim başladı. Sıçanlara JP'nin son uygulama zamanı 90. gün oldu ve 24 saat sonra hayvanlar abdominal aorttan kan alınarak sakrifiye edildi ve her sıçandan idrar, dışkı, serum ve böbrek örnekleri alındı. Tüm numuneler, daha fazla analiz yapılmadan önce -80 ◦C'de saklandı.

2.4. biyokimyasal analiz

Üreticinin talimatlarını takiben, kan üre nitrojeni (BUN) ve serum kreatinin (Scr), kreatinin serum tespit kiti ve BUN tespit kiti (WAKO, Ginza, Japonya) ile ölçüldü ve idrar proteini, Elisa kiti (Nanjing Jiancheng Biyomühendislik Enstitüsü, Nanjing, Çin). Kırmızı kan hücresi (RBC), hemoglobin (Hb), hematokrit (HCT) ve trombosit sayısı (PLT), üreticinin talimatlarına göre Hematology Systems (Siemens 2021i, Erlangen, Almanya) tarafından analiz edildi.

2.5. histolojik inceleme

Renal patolojik hasarı değerlendirmek için periyodik asit-Schiff (PAS) ve Masson boyaması kullanıldı, bunların arasında renal tübüler atrofi ve glomerüler alanı ortaya çıkarmak için PAS boyaması kullanıldı ve Masson boyaması renal interstisyel fibrozis içindi (Xie ve ark. , 2020). Nicel analiz yöntemi önceki çalışmalara göre yapılmıştır (Chen vd., 2019). Kısaca, PAS boyamasında tübüler atrofi skoru şu şekilde tanımlanmıştır: 1. nadir tek atrofik tübül; 2. birkaç atrofik tübül kümesi; 3. masif atrofi. Glomerüler alan ZEN 3.1 yazılımı (Axio Scope A1, ZEISS, Jena, Almanya) ile ölçüldü. Masson boyamasındaki fibrotik alan, Image J yazılımı (NIH, Bethesda, MD, ABD) kullanılarak ölçüldü. Her bir mikroskobik alanda en az bir glomerulus ile atrofi skorunu, glomerüler alanı ve fibrotik alanı ölçmek için grup başına 6 sıçanın en az on mikroskobik alanı (200x) rastgele yakalandı.

2.6. İmmünohistokimya analizi

Her numuneden renal parafin kesiti (4 um) iki kez ksilen ile kademeli dehidrasyon ve gradyan etanol (yüzde 100-95-90-80-70), antijen sitrik asit tamponu (pH 6.0) ile alındı. ) 30 dakika süreyle, oda sıcaklığında 10 dakika süreyle yüzde 3 hidrojen peroksit ve 30 dakika süreyle keçi serumu ile bloke edildi. Doku bölümleri, birincil antikor HIF-1 (Bioss, bs-0737R, 1: 500, Lot: BA01279129), HIF-2 (Bioss, bs-1447 ile ayrı ayrı inkübe edildi. R, 1: 500, Lot: BJ2044786) 4 oC'de 10 saat ve HRP konjuge keçi anti-tavşan sekonder antikoru (Abcam, ab6712, 1:1000) oda sıcaklığında 30 dakika, DAB (diaminobezid in) için kullanıldı. HRP aktivitesini tespit edince, çekirdek hematoksilen ile zıt boyandı. . İmmünohistokimya, her gruptan 400x mikroskobik alanlar altında analiz edildi ve Axio Scope A1, ZEISS, Jena, Almanya tarafından=20 μm ölçek çubuğunu sabitledi. Nükleer, hematoksilin ile mavi boyamaydı ve DAB'nin immünopozitifliği kahverengiydi, daha derin DAB boyaması, daha güçlü immünohistokimya pozitif anlamına gelir.

2.7. EPO algılama

Serum EPO içeriği, ELISA kiti (Abcam, ab274398) tarafından tespit edildi ve deney, ELISA kiti protokolüne atıfta bulundu. Özetlendiği gibi, numuneye EPO antikor kokteyli eklendi ve 1 saat inkübe edildi. inkübasyondan sonra, her kuyu 3 kez yıkama tamponu ile yıkandı, 15 dakika süreyle inkübe edilen ikinciye TMB eklendi ve reaksiyon durduruldu.

Böbrek toplam mRNA'sı, Trizol kullanılarak donmuş böbrek dokusundan ekstre edildi ve mRNA'yı cDNA'ya çevrildi. Real-time PCR, üreticinin protokolüne göre Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA, K0223) ile gerçekleştirildi. SYBR yeşil sinyali ABI Prism 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA) tarafından alındı ​​ve ölçüldü. Primerler şunlardı: sıçanlar EPO (214 bps, NM_017001) için 5′-CCG TCC CAG ATA CCA AAG TC-3′ ve 5′-ACC CGA AGC AGT GAA GTG-3′. 2); GAPDH (181 bps, NM_017008.3) için 5′- GTC GGT GTG AAC GGA TTT G-3′ ve 5′-TCC CAT TCT CAG CCT TGA C- 3′, her durumda bir iç kontrol olarak housekeeping gens. Ve gen ekspresyonunun nispi niceliği, normalleştirilmiş gen ekspresyon yöntemiyle (2− ΔΔCT) hesaplandı.

Eşit miktarda böbrek korteks lizat proteini yüklendi ve yüzde 10 SDS jeli ile ayrıldı ve ardından nitroselüloz membranlara aktarıldı. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca yüzde 5 yağsız süt içinde bloke edildikten sonra membranlar, gece boyunca 4 ◦C'de primer antikor ile inkübe edildi. Daha sonra membranlar HRP (horseradish peroxidase)-konjuge anti-mouse IgG (Life Technologies) ile oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edildi. HRP aktivitesi, Clarity Western ECL Substrate kullanılarak görselleştirildi ve Tanon görüntüleme sistemi ile analiz edildi. Bu çalışmada şu birincil antikor kullanıldı: farelerden monoklonal EPO (B- 4) (Santa Cruz Biotechnology, sc-5290, 1/500 seyreltme), farelerden monoklonal -aktin (Hücre sinyalleme teknolojisi, 8H10D10, 1/1000 seyreltme).

2.8. Kısa zincirli yağ asitleri analizi

ESI kaynağı ile donatılmış bir Shimadzu UHPLC-LCMS/MS sistemi (Shimadzu LC-MS 8045, Shimadzu LC-20AD ile arayüzlü).

Kromatografik ayırmalar, Shim-pack GIST C18 (2,1 × 100 mm, 2 μm) kolonu üzerinde, su içinde yüzde {{10}}}%1 formik asit kullanılarak gerçekleştirilmiştir ( çözücü A) ve asetonitril (çözücü B) bir gradyan elüsyonuyla 0,3 mL/dk'lık bir akış hızında: 0-9 dakika, yüzde 25-30 B; 9-11 dakika, yüzde 30-40 B; 11-20 dakika, yüzde 40-50 B; 20–20.1 dakika, yüzde 50–100 B; 20.1–23 dakika, yüzde 100 B; Yeniden dengeleme için 23,1 dk – yüzde 25 B. Kolon sıcaklığı 35 ◦C idi ve otomatik örnekleyici analiz sırasında 4 ◦C'de tutuldu, her örnekten 1 μL cihaza enjekte edildi. Analit tespiti, pozitif iyon modunda çalıştırılan çoklu reaksiyon izleme (MRM) modunda gerçekleştirilmiştir. MS parametreleri: Nebulize edici gaz akışı: 3.0 L/dak; Kurutma Gaz akışı: 10 L/dak; Isıtma Gaz akışı: 10 L/dak; DL sıcaklığı: 250 ◦C; arayüz sıcaklığı: 300 ◦C; Isıtma bloğu: 400 ◦C. MRM geçişleri ve çarpışma enerjisi (CE), her bir standart türevin doğrudan infüzyonu ile seçilmiş ve optimize edilmiştir. Analit miktarları MRM geçişleri Tablo S1'de özetlenmiştir.

Fekal SCFA'lar: 3 mg liyofilize dışkıya 100 μL yüzde 50 asetonitril eklendi ve 2 dakika vortekslendi. Daha sonra karışım 12000 rpm'de 10 dakika 4 ◦C'de santrifüjlendi ve süpernatantı pipetlendi.

Böbrek SCFA'ları: 100 mg böbrek dokusu tartıldı ve doku homojenatı hazırlamak için 4 kat normal salin (100 mg/400 μL) ile buz üzerinde vortekslendi. 300 μL doku homojenatına 3 kez soğuk metanol eklenip 2 dakika vortekslendikten sonra karışım 12000 rpm'de 10 dakika 4 ◦C'de santrifüj edildi ve süpernatantı pipetlendi. Süpernatan, N2 ile kurutuldu ve 100 uL yüzde 50 asetonitril ile yeniden oluşturuldu.

500 mmol/L N-(3-dimetil aminopropil)-Ń-etil karbodiimid hidroklorür (EDC, Aladdin, Şangay, Çin), 50 mmol/L 3H-[1,2,3]-Triazolo[4, eklendi. 5-b] piridin-3-ol (HOAT, Aladdin, Şangay, Çin) ve 50 mg/mL 12C-Dansilhidrazin (12C-DnsHz, J&K, Beijing, Çin) 20 μL numune ekstraksiyonuna aynı hacimde dizi. EDC ve HOAT, taze 500 mmol/L 2-(N-Morfolino) etansülfonik asit (MES, Macklin, Şanghay, Çin) ile hazırlandı. 20 ◦C'de 90 dakika inkübe edildikten sonra, türevlendirme reaksiyonunu 40 ◦C'de 30 dakika söndürmek için karışıma 20 μL 50 mmol/L CuCl2 (Macklin, Shanghai, China) ilave edildi (Zhao & Li, 2018). Türevlendirmenin sonunda, karışım yüzde 25 asetonitril ile 10 kez seyreltildi. Analizden önce, 100 µL süpernatan, 100 µL dahili standart çözelti ile karıştırıldı. 13C-DnsHz etiketi, aynı türevlendirme reaksiyonuna göre dahili standartlar (ISTD1-8) olarak kullanıldı. SCFA standardı: asetik asit (AA, A116173), propanoik asit (PA, P110446), izobutirik asit (IBA, I103524), butirik asit (BA, B110438), 2-metil butirik asit (2- BA, M107377) izovalerik asit (IVA, I108280), valerik asit (VA, V108271), heksanoik asit (HA, H103632) Aladdin'den (Şanghay, Çin) tedarik edildi.

2.9. istatistiksel analiz

Her grubun verileri ortalama ± standart sapma (SD) olarak ifade edildi. Gruplar arasındaki istatistiksel anlamlılık, tek yönlü ANOVA ve Student-Newman-Keuls (SNK) testi veya Dunnett's T3 testi ile post hoc analiz ile yapıldı. P < 0.05="" değeri="" istatistiksel="" olarak="" anlamlı="" kabul="" edildi.="" tüm="" veriler="" spss="" istatistik="" yazılımı="" (sürüm="" 22.0,="" spss="" inc.,="" chicago,="" il,="" abd)="" kullanılarak="">

3. Sonuçlar

3.1. JP, CKD sıçanlarının böbrek fonksiyonlarını iyileştirdi

JP'nin monosakariti, hayvanlar üzerinde tedaviden önce karakterize edildi. Bu çalışmada kullanılan JP yedi monosakkaritten, yani ramnoz (yüzde 1.62), arabinoz (yüzde 15.79), fukoz (yüzde 0.21), ksiloz (yüzde 4.56), mannozdan (3. 00 yüzde ), glikoz (yüzde 73.44 ) ve galaktoz (yüzde 4.99 ) (Şek. 1). Analiz yöntemimiz doğrusallık, kesinlik, tekrarlanabilirlik, kararlılık ve geri kazanım ile doğrulandı (Tablo S2–S3). Analitlerin oda sıcaklığında 24 saat stabil olduğu doğrulandı. JP'nin verimi yüzde 8.63'ten yüksek olmalı ve saflık yüzde 77.16'dan az olmamalıdır. JP'nin yukarıda bahsedilen kimyasal analizi, aşağıdaki hayvan çalışmalarının tekrarlanabilirliğini sağlamak için kalite kontrol yaklaşımı olarak hizmet etti.

Scr, BUN ve üriner protein böbrek fonksiyonlarını en çok temsil ediyordu. CKD sıçanlarında Scr, BUN ve idrar protein seviyeleri, sahte grubunkinden önemli ölçüde yüksekti (P ​​< {{0}}.01).="" jp="" ile="" 90="" günlük="" tedaviden="" sonra,="" ckd="" grubuna="" kıyasla="" scr,="" bun="" ve="" idrar="" protein="" seviyeleri="" azaldı="" (p="">< 0.01)="" (şekil="">

3.2. JP, CKD sıçanlarında böbrek patolojik hasarını iyileştirdi

Sham grubu için tüm sağ böbreğin ağırlığı ve CKD ve CKD artı JP grubu için kalan sağ böbreğin ağırlığı, böbrek ağırlığı (KW) ve böbrek ağırlığı/vücut ağırlığı (KW/BW) ile böbrek morfolojisi değerlendirmesi için kullanıldı. Deneylerin sonunda, CKD grubunun KW ve KW/BW'si sahte gruba kıyasla arttı (tümü P < {{{0}}.05).="" 5/6="" nefrektomi="" ile="" indüklenen="" ckd="" modelinde,="" renal="" proteinaz="" aktivitelerindeki="" azalma="" kompansatuar="" renal="" büyümeye="" neden="" oldu,="" renal="" hipertrofisi="" olan="" şirketler="" (morton="" &="" griffiths,="" 1985)="" ve="" bizim="" bu="" ifadeyi="" doğruladık.="" jp="" tedavisinden="" sonra,="" kw="" önemli="" ölçüde="" azaldı="" (p="">< 0.05)="" ve="" sahte="" bir="" gruba="" kapatıldı="" (p="" ˃="" 0.05);="" kw/bw="" biraz="" azaldı="" (p="" ˃="" 0.05).="" (şekil="">

Şekil 2. JP, CKD sıçanlarında böbrek fonksiyonunu korumuştur. Farklı grupta Scr (A), BUN (B) ve idrar proteini (C) düzeyi. (D) böbrek ağırlığı, (E) KW/VW. Veriler ortalama ± SD, grup başına n=6 olarak sunuldu (**P < 0.01="" sham="" grubuyla="" karşılaştırıldığında;="" #p="">< 0.05="" ,="" ##p="">< 0.01,="" ckd="" grubuyla="">

KBH grubunda, sham grubuna kıyasla renal tübüler masif atrofi gösterdi (P < {{0}}.01)="" ve="" glomerulus="" alanı="" ve="" renal="" interstisyel="" fibrozis,="" sham="" grubuna="" kıyasla="" neredeyse="" iki="" kat="" daha="" fazlaydı.="" kantitatif="" analizdeki="" sham="" grubununki="" (p="">< 0.01).="" jp="" tedavisinden="" sonra,="" tübüler="" atrofi="" skoru="" yaklaşık="" iki="" kat="" azaldı="" (p="">< 0.01),="" glomerül="" alanı="" neredeyse="" sahte="" bir="" gruba="" geri="" döndü="" (p="">< 0.01)="" ve="" renal="" interstisyel="" fibrozis="" üçte="" bir="" oranında="" azaldı="" (p="">< 0.01).="" kbh="" grubu="" ile="" karşılaştırıldığında="" (şekil="">

Şekil 3. JP, CKD sıçanlarında böbrek yapısını korumuştur. (A) PAS boyama. (B) Masson boyama. (C) Tübüler atrofi skoru. (D) Glomerüler alan (E) Fibrotik alan. Tüm görüntüler aynı büyütme, 200×, ölçek çubuğu=100 μm ile sunulur. Veriler ortalama ± SD, grup başına n=6 olarak sunuldu (**P < 0.01="" sham="" grubuyla="" karşılaştırıldığında;="" #p="">< 0.05,="" ##p="">< 0.01="" ckd="" grubuyla="" karşılaştırıldığında="">

3.3. JP, CKD sıçanlarında hematolojik parametreleri modüle etti

Hematolojik parametreler için biyokimyasal analiz, RBC, Hb, HCT ve PLT ölçüldü. CKD sıçanlarında, RBC seviyesi 9,06'dan 7,20 × 1012 /L'ye, Hb 15,28'den 13,22 g/dL'ye, HCT yüzde 47,1'den 40,4'e ve PLT yükseltildi 1012'den 1526 x 109 /L'ye sham grubuyla karşılaştırıldığında (P < 0.01),="" bu="" da="" anemi="" belirtilerinin="" ckd="" sıçanlarında="" gözlendiğini="" gösterdi.="" jps="" ile="" tedavi="" edilen="" ckd="" sıçanlarında="" azalmış="" rbc,="" hb,="" hct="" ve="" plt="" seviyeleri="" restore="" edildi="" (p="">< 0.01)="" (şekil="">

Şekil 4. JP, CKD sıçanlarında hematolojik parametreleri iyileştirdi. PLT (A), RBC (B), Hb (C), HCT (D) seviyesi. Veriler ortalama ± SD, grup başına n=6 olarak sunuldu (**P < 0.01="" sham="" grubuyla="" karşılaştırıldığında;="" #p="">< 0.05="" ,="" ##p="">< 0.01,="" ckd="" grubuyla="">

3.4. JP, EPO ifadesini uyardı

Sham grubuyla karşılaştırıldığında, serum EPO seviyesi ve böbrek EPO mRNA miktarı, CKD-anemili sıçanlarda önemli ölçüde azaldı (P < 0.01).="" western="" blot="" analizi,="" epo="" protein="" seviyesinin="" ckd="" grubunda="" anlamlı="" bir="" fark="" olmaksızın="" hafif="" düşüşler="" sunduğunu="" ortaya="" koydu.="" jp="" tedavisinden="" sonra,="" serum="" epo="" seviyesi,="" böbrek="" epo="" mrna'sı="" ve="" protein,="" ckd="" grubuyla="" karşılaştırıldığında="" önemli="" ölçüde="" yükseltildi="" (p="">< 0.01="" veya="" p="">< 0.05)="" (şekil="">

Böbrek korteksinde HIF-1 esas olarak renal tübüler epitel hücreleri tarafından üretilirken, HIF-2 esas olarak endotelyal hücrelerde ve renal interstisyel fibroblastlarda eksprese edildi (Sch¨ odel & Ratcliffe, 2019). İmmünohisto kimya analizi, HIF-1 için olduğu gibi, CKD sıçanlarında tübülerlerin sahte gruptan daha güçlü boyandığını gösterdi. JP tedavisinden sonra, renal tübüler, Şekil 5E'de gösterilen kırmızı ok gibi, CKD grubuna kıyasla daha güçlü ve daha geniş alan boyamasına sahipti. HIF-2, Sham grubunda renal interstisyelde nispeten zayıf immünohistokimya pozitifliği gösterdi. CKD grubunda HIF-2 immünohistokimya pozitif gösterdi. JP tedavisinden sonra HIF-2, CKD grubuna kıyasla daha güçlü immünohistokimya gösterdi (Şekil 5F).

Şekil 5. JP, EPO ifadesini uyardı. (A) Serum EPO içeriği. (B)BöbrekEPO göreli mRNA. GAPDH, temizlik geni olarak kabul edildi. (C) EPO protein ekspresyonunun temsili western blot görüntüleri. (D) EPO'nun dansitometrik analizi. (E) HIF{{0}} İmmünohistokimyası . (F) -aktin içeriğine normalize edilmiş HIF- 2 immünohistokimyası. İmmünohistokimya görüntüleri aynı büyütmede, 400}×, ölçek çubuğu=20 μm'de sunulur. Nükleer, hematoksilin ile mavi boyamaydı ve DAB'nin immünopozitifliği kahverengiydi, daha derin DAB boyaması, daha güçlü immünohistokimya pozitif anlamına gelir. Kırmızı ok, immünohistokimyanın pozitif olduğunu gösterir. Veriler, grup başına ortalama ± SD, n=6 (sham grubuyla karşılaştırıldığında *P < 0.05;="" ckd="" grubuyla="" karşılaştırıldığında="" #p="">< 0.05,="" ##p="">< 0.01)="" olarak="">

3.5. JP, SCFA'ların salınımını tetikledi

Dışkı örneklerinde sekiz SCFA'nın salınımını ölçmek için LC-MS tabanlı hedefli bir metabolomik yaklaşım geliştirildi. Oluşturulan yöntem, doğrusallık, duyarlılık, kesinlik, matris etkisi, doğruluk ve kararlılık değerlendirilerek doğrulandı. Duyarlılık, kesinlik, doğruluk ve stabilite doğrulaması için düşük, orta ve yüksek konsantrasyonlu kalite kontrol numuneleri (LQC, QMC, HQC), matris standart eğrisinin en düşük, orta ve en yüksek konsantrasyon noktalarına ve sonuçlara göre seçilmiştir. Tablo S4–S6'da gösterilmiştir. Analitlerin 4 ◦C'de 48 saat boyunca stabil olduğu doğrulandı. SCFA'ların LC-MS/MS kromatogramı Şekil 6'da gösterilmiştir.

Şekil 6. SCFA'ların UHPLC-MS/MS kromatografisi. (A) Üst kısım SCFA'ların türevlendirme kimyasal denklemiydi; altında, dansilhidrazin türevlendirmesinden sonra SCFA'ların yapısal formülü vardı; (B) Karışım standartlarının ve dışkı örneğinin UHPLC/MRM-MS Kromatogramı, (B)'deki kromatografik pikler, (A):1'de gösterilen kimyasal işarete karşılık geldi. 12C-asetik asit; 2. 13C-asetik asit (ISTD1); 3. 12C-propanoik asit; 4. 13C-propanoik asit (ISTD2); 5. 12C-izo butirik asit; 6. 12C-bütirik asit; 7. 13C-izobütirik asit (ISTD3); 8. 13C-bütirik asit (ISTD4); 9. 12C-2-metilbutirik asit; 10. 12C-izovalerik asit; 11. 12C valerik asit; 12. 13C-2-metilbutirik asit (ISTD5); 13. 13C-izovalerik asit (ISTD6); 14. 13C-valerik asit (ISTD7); 15. 12C-heksanoik asit; 16. 13C-heksanoik asit (ISTD8).

Dışkı örneğine gelince, CKD grubunda, AA ve PA seviyeleri, sahte gruba kıyasla neredeyse 4 kat ve 5 kat belirgin şekilde azaldı (P < 0.01);="" jp="" tedavisinden="" sonra,="" aa="" ve="" pa="" miktarları="" sahte="" grubun="" 4/5'ine="" geri="" yüklendi="" (p="">< {{10}}.01).="" benzer="" şekilde,="" ba="" ve="" va="" seviyeleri,="" sahte="" bir="" gruba="" kıyasla="" ckd="" grubunda="" neredeyse="" 30="" kat="" ve="" 4="" kat="" güçlü="" bir="" şekilde="" azaldı="" (p="">< 0.01).="" jp="" tedavisi="" artan="" bir="" eğilim="" gösterdi="" ancak="" önemli="" bir="" gelişme="" göstermedi.="" iba,="" iva="" ve="" 2-ba'nın="" içeriği,="" ckd="" ve="" sham="" grubu="" arasında="" kayda="" değer="" bir="" değişiklik="" göstermedi.="" jp="" tedavisinden="" sonra="" iba,="" iva="" ve="" 2-ba="" seviyesi="" arttı="" (p="">< 0.01).="" ancak="" ha,="" üç="" grup="" arasında="" belirgin="" bir="" değişiklik="" göstermedi="" (şekil="" 7a).="" ayrıca,="" böbrek="" dokusuna="" gelince,="" ckd="" grubunda,="" sekiz="" scfa'nın="" miktarı="" önemli="" ölçüde="" azalırken="" (p="">< 0.01),="" jp="" tedavisinden="" sonra,="" ba="" ve="" ha="" hariç="" scfa'ların="" seviyeleri="" arttı="" (p="">< 0.01="" veya="" p="">< 0,5).="" ba,="" anlamlı="" olmadan="" biraz="" arttı="" ve="" ha,="" jp="" tedavisinden="" sonra="" değişiklik="" göstermedi="" (şekil="">

Şekil 7. Farklı gruptaki SCFA içeriği. (A) Fekal SCFA'lar. (B) böbrek SCFA'ları. Veriler ortalama ± SD, grup başına n=6 olarak sunuldu (**P < 0.01="" sham="" grubuyla="" karşılaştırıldığında;="" ##p="">< 0).="" 01,="" #p="">< 0.05,="" ckd="" grubuyla="">

4. Tartışma

Mevcut 5/6 nefrektomi CKD sıçan modelinde,böbrekişlevgöstergeler (Scr, BUN ve idrar proteini) önemli ölçüde arttı, kalan böbrek hipertrofisi ve böbrek patolojik hasarı ortaya çıktı, buna hematolojik parametreler değişti. Bu veriler önceki çalışmalarla uyumludur (Garrido ve diğerleri, 2015, Morton & Griffiths, 1985). Yukarıdaki göstergeler, 5/6 nefrektomi ile indüklenen CKD-anemi sıçanlarının başarılı bir şekilde kurulduğunu ve JP'nin CKD-anemi sıçanlarının tedavisinde yararlı etkisi için doğrulanabileceğini gösterdi. İleböbrekişlevdaha da kötüleşti, anemi, hastaların yaşam kalitesini olumsuz yönde etkileyen, bilinen bir fırsatçı KBH komplikasyonu olarak kabul edildi (Locatelli, Fishbane, Block, & Macdougall, 2017). Renal aneminin seyri ile ilgili risk faktörlerinin anlaşılması tedavi yaklaşımlarının geliştirilmesine yardımcı olacaktır. Günümüzde, hastalık ve bağırsak mikrobiyota metabolizması arasındaki bağlantı giderek daha fazla dikkat çekerken, SCFA'lar ve renal anemi arasındaki ilişki hala daha az bilinmektedir. Esas olarak Clostridium, Coprococcus ve Bacteroides tarafından metabolize edilen SCFA'lar (Koh ve diğerleri, 2016), bağırsak ortamı dengesinin ve tüm vücut sağlığının korunmasında önemli bir rol oynayan spesifik membrana bağlı reseptörleri hedef almaktadır. SCFA'ların CKD ile ayrılmaz bir ilişkisi olduğu zaten kanıtlanmıştır ve CKD'de asetik asit, propiyonik asit, butirik asit seviyeleri düşmüştür (Wang ve diğerleri, 2019). Adenin kaynaklı CKD sıçanlarında, bağırsak mikrobiyota bolluğu ve çeşitliliği önemli ölçüde değişti, şirketler propanoik asit, bütirik asit ve valerik asit seviyesini azalttı (Lakshmanan, Al, Ali ve Terranegra, 2021). Önceki çalışmamıza dayanarak, 16S rDNA dizilemesi, sahte gruba kıyasla 5/6 nefrektomi ile indüklenen CKD sıçanlarında bağırsak mikrobiyota disbiyozunun sergilendiğini gösterdi. Clostridium, Coprococcus'tan özellikle bütirik asit üreten SCFA'ların bazıları, CKD sıçanlarında farklılıklar gösterdi (Zheng ve diğerleri, 2020). Buna paralel olarak, sonuçlarımız asetik asit, propiyonik asit, bütirik asit, valerik asit miktarlarının CKD sıçanlarda yaklaşık yüzde 60, yüzde 80, yüzde 85 ve yüzde 60 oranında azaldığını gösterdi, bu da SCFA'ların azalmasının karşılık geldiğini gösteriyor. bağırsak ortamı dengesizliği ile. Not olarak, CKD'nin neden olduğu bağırsak ortamı bozukluğu, bağırsak mikrobiyota metabolizması anormalliğini tetikledi (Feng ve diğerleri, 2019). Ek olarak, CKD-anemi sıçanlarında sekiz çeşit SCFA seviyesinin azaldığını bulduk. Örneğin, metabolik son ürünlerin anormalliği, yani SCFA'lar, CKD ilerlemesinden kaynaklanabilir.

Aktif bileşenlerden biri olan polisakkaritler, Dioscoreae Rhizoma, Schisandra Chinensis, Astragali Radix ve Jujubae Fructus gibi çeşitli bitkilerde bulunmuştur. Polisakkaritler, bağırsak mikrobiyotası tarafından fermente edilebilir ve parçalanabilir. Sonuç olarak, polisakaritler, SCFA'lara metabolize edilmesi için bağırsak mikrobiyotası için bir substrat olarak sunulur veya SCFA'ların üretimini kolaylaştırmak için bağırsak mikrobiyotasının bileşimini iyileştirmek için prebiyotik benzeri bir etkiye sahip olduğu kabul edilir (Cai ve diğerleri, 2019). Bu çalışmada, bulgularımız hünnaptan elde edilen polisakkaritlerin, CKD sıçanlarında asetik asit, propanoik asit, izobutirik asit, 2-metil butirik asit gibi SCFA'ların bağırsak mikrobiyota salınımını uyardığını ortaya koydu. Ayrıca, JP tedavisinden sonra, CKD-anemi sıçan böbreklerinde SCFAs seviyesi iyileştirildi ve değişim eğilimi fekal numune ile tutarlıydı. Mevcut araştırmalara dayanarak, SCFA'lar ve CKD arasındaki ilişki giderek netlik kazanmıştı. Örneğin, asetik asidin bağışıklık sistemini modüle ettiği ve akut hastalığı iyileştirdiği bildirildi.böbrekincinmeT hücrelerinde NADPH oksidaz sinyalleşmesini engelleyerek (Al-Harbi ve diğerleri, 2018). Propanoik asidin, serbest yağ asidi reseptörü 2 (FFA2) ve FFA3 yoluyla adenin kaynaklı CKD'nin ilerlemesini önlediği kanıtlanmıştır (Mikami ve diğerleri, 2020). Bu nedenle, böbrek SCFA seviyesinin geri kazanılmasının hastalıklı bir böbrek için faydalı olduğu sonucuna vardık. JP'nin bağırsak mikrobiyota çeşitliliğini arttırdığı ve kolorektal kanser farelerinde SCFA'ların aktif mikrobiyota (Bacteroides) nispi bolluğunu arttırdığı bildirilmiştir (Ji ve diğerleri, 2020). Ayrıca JP, dışkı örneklerinde toplam SCFA'ların konsantrasyonunu arttırdı (Ji ve diğerleri, 2019). Bu nedenle, JP'nin CKD ilerlemesini geciktirme amacına ulaşmak için SCFA üretimini teşvik edebileceğini çıkardık. JP ayrıca CKD'de SCFA'ların üretimini uyarmak için SCFA'ların baskın mikrobiyotası için bir metabolizma substratı veya bağırsak ortamını, özellikle SCFA'ların baskın mikrobiyota çeşitliliğini restore etmek ve ayrıca SCFA'ların salınımını teşvik etmek için prebiyotik benzeri bir bileşen olabilir. CKD ilerlemesini önlemek.

Genel olarak, küçük moleküler ağırlığa ve yüksek kimyasal polariteye sahip SCFA'ların (6'dan az karbonsuz) kromatografi yaklaşımlarıyla doğrudan analiz edilmesi zordur. SCFA stratejisinin izotop etiketli bir kimyasal türevlendirmesi, cihaz hassasiyetini iyileştirebilir ve LC-MS/MS analizinde SCFA'ların belirlenmesi için yararlı bir strateji sağlayan analiz hatalarını azaltabilir (Higashi & Ogawa, 2016). Son zamanlarda, karboksilik asit içeren hedef insan plazma metabolitlerinin tespitinde dansil hidrazin etiketli yaklaşımlar tatmin edici bir şekilde kullanılmıştır (Chen & Zhang, 2020). Bunu desteklemek için, bu çalışmada, sıçan dışkısında 8 SCFA'nın belirlenmesi için LC-MS/MS yaklaşımına dayalı kimyasal türevlendirmeyi daha da geliştirdik. SCFA'lar bağırsak mikrobiyotası tarafından üretilir ve SCFA'ların yaklaşık yüzde 10'u dışkı yoluyla atılır (Boets ve diğerleri, 2015). Bu nedenle, SCFA'ların dışkı örneği analizi, bağırsak ortamındaki değişiklikleri doğrudan yansıtabilir ve SCFA'lar ile bağırsak mikrobiyotası arasındaki multi-omik eklem analizinde daha fazla referansa sahiptir. Özellikle, kararsızlık doğrulaması, dansil hidrazin etiketli SCFA'ların oda sıcaklığında kararsız olduğunu ve kütle spektrumundaki yoğunluklarının zamanla düşüş eğilimi gösterdiğini, ancak 4 °C'de 48 saat boyunca sabit kalabildiğini bulduk. Bu nedenle SCFA'ların türetilmesinden sonra analitler analizden önce 4 ◦C'de tutulmalıdır.

İleri evre 4–5 CKD'de, EPO üretiminin eksikliği, renal anemi gelişiminde en kritik faktöre katkıda bulunan eritropoezi kısıtlar (Sakashita, Tanaka ve Nangaku, 2019). Anemi için eritropoezi uyarıcı ajanlarla (ESA) rutin tedavi, klinik uygulama kılavuzlarında önerilmektedir. Bununla birlikte, artan ölüm riski ve kardiyovasküler olaylar ile ilişkili olan ESA'ların güvenliği dikkate alınmalıdır (Thavarajah & Choi, 2019). Renal anemi hastalarında, EPO ekspresyonu, sağlıklı vücutlara kıyasla tutarlı veya göze çarpacak şekilde yüksek olmalıdır (Babitt & Lin, 2012). Erken bir aşamada, EPO seviyesi yükseltme eğilimini sunarken, geç aşamada, EPO seviyesi erken aşamaya kıyasla normalden daha düşük bir düşüş eğilimi gösterdi (Panjeta, Tahirovi´c, Sofi's, ´ Cori's, & Derviˇsevi c, 2017). Önceki deneylere karşılık gelen (Chen ve diğerleri, 2019; Wang ve diğerleri, 2020), sonuçlarımız, CKD-anemi sıçanlarında serum EPO seviyesinin düştüğünü gösterdi. CKD ratlarda sırasıyla böbrek EPO mRNA'sını ve protein düzeyini saptadık ve böbrek EPO protein düzeyinin sham grubuna göre bir miktar azaldığı, böbrek EPO mRNA'sının ise bozulduğu ve derecesinin serum EPO düzeyinden büyük olduğu belirlendi. Böbrek, yetişkinlerde ve ERSD hastalarında birincil EPO sentezi kaynağıdır.böbreklerhala eritropoietin üretme yeteneğini korur (Bernhardt ve diğerleri, 2010). Endojen serum EPO seviyelerini düzeltmek ve renal anemiye uyum sağlamak için böbrek EPO üretimi aktive edildi, ancakböbrekincinmeazaltılmış EPO mRNA ifadesi (Sch¨ odel & Ratcliffe, 2019). JP tedavisinden sonra hem serum EPO seviyesi hem de böbrek EPO mRNA ve protein seviyeleri yükseltildi. Önceki çalışmamızda JP, HRE transkripsiyonel aktivitesini uyarabilir ve EPO genini geliştirebilir (Chen ve diğerleri, 2014). Bu nedenle, JP'nin, mRNA düzeyinde uyarılmış böbrek EPO gen ekspresyonunun katkıda bulunabileceği, düzenlenmiş böbrek anemisine CKD sıçan serum EPO seviyesini geri getirebileceğini tahmin ettik.

Kortekste, HIF-1 esas olarak tübüler ve HIF-2 renal interstisyumda bulundu. EPO esas olarak HIF-2'in birlikte yer aldığı fibroblastlar tarafından üretildiğinden, bu HIF-2'in EPO üretimini düzenlemekten sorumlu olabileceğini desteklemektedir (Maxwell, 2003). Çalışmamızda, CKD sıçanlara kıyasla HIF-1 ve HIF-2'nin CKD tarafından aktive edilebileceğini ve JP tedavisinin HIF-1 ve HIF-2 aktivitesini uyarabildiğini bulduk. . HIF-2'ın EPO üretiminin düzenlenmesinde önemli bir rolü olduğu kanıtlanmıştır (Kapitsinou ve diğerleri, 2010), HIF-1 upregülasyonu böbrekte böbrek koruma etkisi oynayabilir (Jiang et al. al., 2020), bu da EPO üretimini dolaylı olarak iyileştirir. Böbrek EPO üretimi ilk olarak anemi veya hipoksi altında mRNA seviyesinde düzenlenirken, EPO mRNA ekspresyonu HIF protein stimülasyonu ile arttırılabilir. Daha önce farmakolojik araştırmalar, hünnabin hücresel modelde HIF-protein seviyesinin düzenlenmesi yoluyla EPO ekspresyonunu uyardığını göstermiştir (Chen ve diğerleri, 2014, Lam ve diğerleri, 2016). Bu nedenle, renal anemiyi hafifletme amacına ulaşmak için JP'nin HIF-proteini aracılığıyla EPO mRNA ekspresyonunu yukarı regüle edebileceği sonucunu çıkardık.

Ayrıca, mevcut sonuçlara dayanarak, SCFA'lardaki azalmanın, CKD-anemisine katkıda bulunan HIF aracılı EPO ifadesinde çok önemli rollere sahip olabileceğini tahmin ediyoruz. Bununla tutarsız olarak, artan asetik asit seviyesinin HIF-2 asetilasyonu ve CREB bağlayıcı protein-HIF 2 kompleksi oluşumu için faydalı olduğu ve ayrıca EPO ekspresyonunu indüklediği gösterilmiştir (Xu ve diğerleri, 2014). Propiyonik asit, HIF-1 /ERK yolu yoluyla mitokondriyal bozulmayı, hipokampal apoptozu ve nörolojik defisitleri zayıflattı (Cheng ve diğerleri, 2019). Ek olarak, bütirik asidin, kolon hücreleri üzerindeki aktif HIF hedef genleri olan HIF-1'ı stabilize ettiği ve kolon inflamatuar yanıtını azalttığı bulundu (Kelly ve ark., 2015). Çalışmamızda asetik asit, propanoik asit ve bütirik asit düzeylerinin HIF- protein anormal ekspresyonuna eşlik eden CKD sıçanlarda önemli ölçüde azaldığını bulduk, bu da HIF-'in stabilitesinin SCFA'ların azalmasıyla ilişkili olabileceğini ve SCFA'ların azalmış olabileceğini gösterdi. EPO ifadesini düzenlemek için HIF'yi stabilize etmenin etkisi.

5. Sonuçlar

Sonuç olarak, JP'nin mekanizması SCFA'ların salınımı ve EPO üretiminin düzenlenmesinde yer alan CKD'yi ve bununla ilişkili anemiyi iyileştirdiğini kanıtladık. Ve JP, anemi tedavisi için hünnabın biyoaktif bileşeni olabilir. Bu bulgular, CKD ile ilişkili aneminin tedavisi için gıda takviyesi olarak JP'nin daha da geliştirilmesi için kanıt sağlayabilir.

etik beyan

Araştırmamızdaki tüm hayvan deneyleri, Guangzhou Çin Tıbbı Üniversitesi Etik Kurulu tarafından onaylanan protokollerle ve laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımına ilişkin Ulusal Sağlık Enstitüleri Kılavuzuna (NIH Publications No. 80-23, gözden geçirilmiş 1996). Araştırmamızda yukarıdaki yönergelerin ihlali yoktur.

Teşekkür

Bu çalışma, Guangdong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (2018A030313305), Çin Doğa Bilimleri Vakfı (81804052, 81973577 ve 82004248), Shenzhen Bilim ve Teknoloji Planı Projesi (JSGG20191129102216637 ve ZDSYS201606081515458), Guangdong Eyaleti Geleneksel Çin Tıbbı Bürosu ( 20201320).

Referanslar

Al-Harbi, NO, Nadeem, A., Ahmad, SF, Alotaibi, MR, AlAsmari, AF, Alanazi, WA, … İbrahim, KE (2018). Kısa zincirli yağ asidi, asetat sepsis kaynaklı akut durumu iyileştirirböbrekincinmeT hücrelerinde NADPH oksidaz sinyallemesinin inhibisyonu ile. Uluslararası İmmünofarmakoloji, 58, 24-31.
Babitt, JL ve Lin, HY (2012). KBH'de anemi mekanizmaları. Amerikan Nefroloji Derneği Dergisi, 23(10), 1631-1634.
Bernhardt, WM, Wiesener, MS, Scigalla, P., Chou, J., Schmieder, RE, Günzler, V., …Eckardt, KU (2010). Prolil hidroksilazların inhibisyonu, ESRD'de eritropoietin üretimini arttırır. Amerikan Nefroloji Derneği Dergisi, 21(12),
2151–2156.
Boets, E., Deroover, L., Houben, E., Vermeulen, K., Gomand, SV, Delcour, JA, … Verbeke, K. (2015). İnülinden in vivo kolonik kısa zincirli yağ asidi üretiminin miktar tayini. Besinler, 7(11), 8916-8929.

Cai, Y., Liu, W., Lin, Y., Zhang, S., Zou, B., Xiao, D., … Xie, Z. (2019). Bileşik polisakaritler, bağırsak mikrobiyota bileşimini ve işlevini modüle ederek deneysel koliti iyileştirir. Gastroenteroloji ve Hepatoloji Dergisi, 34(9),1554–1562.

Chen, G. ve Zhang, Q. (2020). Dansilhidrazin etiketleme ve sıvı kromatografi-üçlü dört kutuplu kütle spektrometrisi kullanılarak plazma numunelerinde serbest yağ asitleri ve açilkarnitinlerin eş zamanlı ölçümü. Analitik ve BiyoanalitikKimya, 412(12), 2841–2849.

Chen, J., Lam, CT, Kong, AY, Zhang, WL, Zhan, JY, Bi, CW, … Tsim, KW (2014). Ziziphus hünnap meyvesinin (hünnap) özü, kültürlenmiş Hep3B hücrelerinde hipoksi ile indüklenebilir faktör-1 aracılığıyla eritropoietin ekspresyonunu indükler. bitkiMedica, 80(17), 1622-1627.

Chen, J., Wang, F., Huang, S., Liu, X., Li, Z., Qi, A., … Li, S. (2019). Jian-Pi-Yi-Shen kaynatma, 5/6 nefrektomize sıçanlarda renal anemiyi hafifletir: Hipoksi ile indüklenebilir faktör sinyali yoluyla eritropoietin üretimi. Kanıta Dayalı Tamamlayıcı ve Alternatif Tıp, 2019, 1–8.
Cheng, Y., Mai, Q., Zeng, X., Wang, H., Xiao, Y., Tang, L., … Ding, H. (2019). Propionate, farelerde pentilentetrazolün neden olduğu nöbetleri, bunun sonucunda mitokondriyal bozulmayı, nöron nekrozunu ve nörolojik defisitleri giderir. Biyokimyasal Farmakoloji, 169, Madde 113607.
Feng, YL, Cao, G., Chen, DQ, Vaziri, ND, Chen, L., Zhang, J., … Zhao, YY (2019). Mikrobiyom-metabolomik, kronik böbrek hastalığında glisin konjuge metabolitleri ve poliamin metabolizması ile ilişkili bağırsak mikrobiyotasını ortaya çıkarır. Hücresel ve Moleküler Yaşam Bilimleri, 76(24), 4961-4978.
Garrido, P., Ribeiro, S., Fernandes, J., Vala, H., Bronze-da-Rocha, E., Rocha-Pereira, P., … Reis, F. (2015). Kalan böbrek sıçan modelinde Demir-Hepsidin dismetabolizması, anemi ve renal hipoksi, inflamasyon ve fibrozis. PLoS BİR, 10(4), Madde e124048.
Higashi, T. ve Ogawa, S. (2016). Biyolojik numunelerdeki metabolitlerin LC/MS ile diferansiyel analizi, miktarının belirlenmesi ve profilinin çıkarılması için izotop kodlu ESI geliştirici türevlendirme reaktifleri: Bir inceleme. Farmasötik ve Biyomedikal Analiz Dergisi, 130, 181–193.
Ji, X., Hou, C., Gao, Y., Xue, Y., Yan, Y., & Guo, X. (2020). Bir kolorektal kanser fare modelinde hünnap (Ziziphus jujuba Mill.) polisakkaritlerinin bağırsak mikrobiyota modülatör etkilerinin metagenomik analizi. Gıda ve İşlev, 11(1), 163-173.
Ji, X., Hou, C., Yan, Y., Shi, M. ve Liu, Y. (2020). Hünnap (Ziziphus jujuba Mill.) meyvesinden elde edilen polisakkaritlerin yapısal karakterizasyonu ve antioksidan aktivitelerinin karşılaştırılması. Uluslararası Biyolojik Makromoleküller Dergisi, 149, 1008-1018.

Ji, X., Hou, C., Zhang, X., Han, L., Yin, S., Peng, Q., … Wang, M. (2019). Zizyphus jujuba cv'nin etkisinin mikrobiyomemetabolomik analizi. Kolorektal kanser fareleri fekal mikrobiyota ve metabolitler üzerinde Muzao polisakaritler tüketimi.Uluslararası Biyolojik Makromoleküller Dergisi, 131, 1067-1076.

Ji, X., Peng, Q., Yuan, Y., Shen, J., Xie, X., & Wang, M. (2017). Hünnap meyvesinden polisakkaritlerin izolasyonu, yapıları ve biyoaktiviteleri (Ziziphus jujuba Mill.): Bir inceleme. Gıda Kimyası, 227, 349-357.
Jiang, N., Zhao, H., Han, Y., Li, L., Xiong, S., Zeng, L., … Sun, L. (2020). HIF-1, mitokondriyal dinamiklerin HO-1-aracılı kontrolü yoluyla diyabetik nefropatide tübüler hasarı iyileştirir. Hücre Çoğalması, 53(11), Makale e12909.
Kapitsinou, PP, Liu, Q., Unger, TL, Rha, J., Davidoff, O., Keith, B., … Haase, VH (2010). Hepatik HIF-2 renal anemide hipoksiye verilen eritropoietik tepkileri düzenler. Kan, 116(16), 3039–3048.
Kelly, CJ, Zheng, L., Campbell, EL, Saeedi, B., Scholz, CC, Bayless, AJ, … Colgan, SP (2015). Mikrobiyotadan Türetilmiş Kısa Zincirli yağ asitleri ile bağırsak epitelyal HIF arasındaki karışma, doku bariyeri fonksiyonunu arttırır. Hücre Konağı ve Mikrop, 17 (5), 662–671.
Koh, A., De Vadder, F., Kovatcheva-Datchary, P., & B¨ ackhed, F. (2016). Diyet lifinden konak fizyolojisine: Temel bakteriyel metabolitler olarak Kısa Zincirli yağ asitleri. Hücre, 165(6), 1332-1345.
Lakshmanan, AP, Al, ZM, Ali, BH ve Terranegra, A. (2021). Deneysel kronik böbrek hastalığı olan sıçanlarda prebiyotik sakız akasyasının bağırsak mikrobiyom bileşimi üzerindeki etkisi. Biyotıp ve Farmakoterapi, 133, Makale
110992.
Lam, C., Chan, PH, Lee, P., Lau, KM, Kong, A., Gong, A., … Tsim, K. (2016). Hünnap (Ziziphus jujuba) içeren bitkisel kaynatmaların kimyasal ve biyolojik değerlendirmesi: Kültürlerde eritropoietin ekspresyonunun indüksiyonu. Journal of Chromatography BAnalytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, 1026, 254-262.
Lappin, TR ve Lee, FS (2019). HIF: EPO yolundaki mutasyonlar ve eritrositozdaki rolleri hakkında güncelleme. Kan İncelemeleri, 37, Madde 100590.
LeBlanc, JG, Chain, F., Martín, R., Bermúdez-Humaran, ´LG, Courau, S., & Langella, P. (2017). Kommensal ve probiyotik bakteriler tarafından üretilen kısa zincirli yağ asitleri ve vitaminlerin konak enerji metabolizması üzerinde faydalı etkileri. Mikrobiyal Hücre Fabrikaları, 16 (1), 79.
Li, L., Ma, L. ve Fu, P. (2017). Bağırsak mikrobiyota kaynaklı kısa zincirli yağ asitleri ve böbrek hastalıkları. İlaç Tasarımı Geliştirme ve Tedavisi, 11, 3531–3542.
Li, L. ve Shi, JY (2013). Cinnamomi korteksin polisakkarit ve lipid bileşenlerinin GC-MS ile analizi. Zhong Yao Cai, 36(4), 578–580.
Liu, G., Liu, X., Zhang, Y., Zhang, F., Wei, T., Yang, M., … Zhao, Z. (2015). Zizyphus hünnap cv'den ekstrakte edilen polisakkaritlerin hepatoprotektif etkileri. Huanghetanzao. Uluslararası Biyolojik Makromoleküller Dergisi, 76, 169–175.

Locatelli, F., Fishbane, S., Block, GA ve Macdougall, IC (2017). Kronik böbrek hastalığı hastalarında anemi tedavisi için hipoksinin hedeflenmesi indüklenebilir faktörler. Amerikan Nefroloji Dergisi, 45(3), 187-199.

Locatelli, F., Hannedouche, T., Fishbane, S., Morgan, Z., Oguey, D., & White, WB (2019). Metoksi polietilenin kardiyovasküler güvenliği ve Tüm Nedenli ölüm oranları

CKD anemisinde Glikol-Epoetin beta ve diğer Eritropoezi-Stimüle edici ajanlar: Randomize bir eşitsizlik denemesi. Amerikan Nefroloji Derneği'nin klinik dergisi: CJASN, 14(12), 1701-1710.
Maxwell, P. (2003). HIF-1: Böbrekle özel ilgisi olan bir oksijen yanıt sistemi. Amerikan Nefroloji Derneği Dergisi, 14(11), 2712-2722.
Meijers, BK ve Evenepoel, P. (2011). Bağırsak-böbrek ekseni: İndoksil sülfat, p-kresil sülfat ve CKD ilerlemesi. Nefroloji Diyaliz Nakli, 26(3), 759-761.
Mikami, D., Kobayashi, M., Uwada, J., Yazawa, T., Kamiyama, K., Nishimori, K., … Iwano, M. (2020). Kısa zincirli yağ asidi, FFA2 ve FFA3 yolları yoluyla adenin kaynaklı kronik böbrek hastalığını hafifletir. Biochimica Biophysica Açta-Moleküler ve Hücre Biyolojisi Lipidleri, 1865(6), Madde 158666.
Morton, DB ve Griffiths, PH (1985). Deney hayvanlarında ağrı, sıkıntı ve rahatsızlığın tanınmasına ilişkin kılavuzlar ve değerlendirme için bir hipotez. Veteriner Kaydı, 116(16), 431-436.
Panjeta, M., Tahirovi´c, I., Sofi´c, E., Cori´ ´c, J., & Derviˇsevi´c, A. (2017). Kronik böbrek hastalığının çeşitli evreleri olan hastalarda eritropoietin ve hemoglobin düzeylerinin yorumlanması. Tıbbi Biyokimya Dergisi, 36(2), 145-152.
Pappa, M., Dounousi, E., Duni, A., & Katopodis, K. (2015). Diyabetik nefropatili hastalarda aneminin daha az bilinen patofizyolojik mekanizmaları. Uluslararası Üroloji ve Nefroloji, 47(8), 1365–1372.
Sakashita, M., Tanaka, T. ve Nangaku, M. (2019). Kronik böbrek hastalığında anemiyi tedavi etmek için Hipoksi ile İndüklenebilir Faktör-Prolil hidroksilaz alanı inhibitörleri. Nefrolojiye Katkılar, 198, 112-123. https://doi.org/10.1159/000496531.
Schodel, ¨ J. ve Ratcliffe, PJ (2019). Hipoksi sinyalleme mekanizmaları: Nefroloji için yeni çıkarımlar. Doğa İncelemeleri Nefroloji, 15(10), 641–659.
Tako, E., Glahn, RP, Knez, M., & Stangoulis, JC (2014). Buğday prebiyotiklerinin demir eksikliği olan etlik piliçlerin bağırsak bakteri popülasyonu ve demir durumu üzerine etkisi. Beslenme Dergisi, 13, 58.
Tang, WH, Wang, Z., Kennedy, DJ, Wu, Y., Buffa, JA, Agatisa-Boyle, B., … Hazen, SL (2015). Bağırsak mikrobiyotasına bağlı trimetilamin N-oksit (TMAO) yolu, kronik böbrek hastalığında hem böbrek yetmezliği gelişimine hem de ölüm riskine katkıda bulunur. Dolaşım Araştırması, 116(3), 448–455.
Thavarajah, S. ve Choi, MJ (2019). KBH ve kanserli hastalarda eritropoezi uyarıcı ajanların kullanımı: Klinik bir yaklaşım. Amerikan Böbrek Hastalıkları Dergisi, 74(5), 667-674.
Wang, F., Yu, H., Huang, S., Zheng, L., Zheng, P., Zhang, S., … Chen, J. (2020). Jian-PiYi-Shen, kronik böbrek hastalığı olan anemik sıçanlarda EPO ve demir geri dönüşüm protein ekspresyonlarını düzenler: ERK sinyali yoluyla hipoksi ile indüklenebilir faktör-2 birikimi. Kanıta Dayalı Tamamlayıcı ve Alternatif Tıp, 2020, 8894257.
Wang, S., Lv, D., Jiang, S., Jiang, J., Liang, M., Hou, F., … Chen, Y. (2019). Kısa zincirli yağ asitlerinde, özellikle bütiratta kantitatif azalma, kronik böbrek hastalığının ilerlemesine katkıda bulunur. Klinik Bilim, 133(17), 1857-1870.
Webster, AC, Nagler, EV, Morton, RL ve Masson, P. (2017). Kronik böbrek hastalığı. Lancet (Londra, İngiltere), 389(10075), 1238-1252.
Xie, X., Yang, X., Wu, J., Ma, J., Wei, W., Fei, X., … Wang, M. (2020). Trib1, renal makrofajların polarizasyonunu düzenleyerek İskemi/Reperfüzyona Bağlı akut böbrek hasarından iyileşmeye katkıda bulunur. İmmünolojide Sınırlar, 11, 473.
Xu, M., Nagati, JS, Xie, J., Li, J., Walters, H., Moon, YA, … Garcia, JA (2014). Bir asetat anahtarı, stres eritropoezi düzenler. Doğa Tıbbı, 20(9), 1018-1026.
Yue, Y., Wu, S., Li, Z., Li, J., Li, X., Xiang, J., … Ding, H. (2015). Yabani hünnap polisakkaritleri, gelişmiş bağırsak bariyeri işlevi sağlayarak deneysel inflamatuar bağırsak hastalığına karşı koruma sağlar. Gıda ve İşlev, 6(8), 2568–2577.

Zhao, S. ve Li, L. (2018). Kapsamlı karboksilik asit alt metabolom profillemesi için LC-MS etiketleme Dansilhidrazin izotopu. Analitik Kimya, 90(22), 13514–13522.

Zheng, L., Chen, S., Wang, F., Huang, S., Liu, X., Yang, X., … Chen, J. (2020). Bağırsak mikrobiyotasının Jian-Pi-Yi-Shen kaynatma işlemine belirgin tepkileri, 5/6 nefrektomi uygulanmış sıçanlarda iyileştirilmiş klinik sonuçlarla ilişkilidir. Farmakolojide Sınırlar, 11, 604.