MES23.5 Hücrelerindeki Oksidatif Hasarı Korumak İçin Böbrek Tonlandırıcı Formül Nasıl Kullanılır?

İletişim: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-posta:audrey.hu@wecistanche.com

Yihui Xu,¹Wei Lin,²Shuifen Ye,³Huajin Wang,⁴titreyen Wang,⁵Yuyan Su, ⁵Liangning Wu,⁶Yuanwang Wang,⁷Qian Xu,⁵Chuanshan Xu,⁸ve Jing Cai 5 , *

Soyut

oksidatif hasarParkinson hastalığı (PD) dahil olmak üzere nörodejeneratif bozuklukların etiyolojisinde kritik bir rol oynar. Çalışmamızda, eski bir Çinliböbrek güçlendiriciCistanche, Epimedii ve Polygonatum cirrhifolium'dan oluşan formülün, MES23.5 dopaminerjik nöronları hidrojen peroksit- (H2O2-) kaynaklı etkilere karşı korumak için araştırıldı.oksidatif hasar. H2O2'nin hasar etkileriMES23.5 hücrelerive KTF'nin koruyucu etkilerioksitleyicistres, MTT testi, transmisyon elektron mikroskobu (TEM), immünositokimya (ICC), enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ve immünoblotlama kullanılarak değerlendirildi. Sonuçlar, 150 μM H2O2'ye 12 saat maruz kaldıktan sonra hücre canlılığının önemli ölçüde azaldığını gösterdi. TEM gözlemi, H2O'nun 2- tedavi ettiğini bulduMES23.5 hücrelerisunulan hücresel organel hasarı. Bununla birlikte, hücreler H2O2'ye maruz kaldıktan sonra 24 saat KTF (3.125, 6.25 ve 12.5 ug/ml) ile inkübe edildiğinde, H2O2-indüklenen hasara karşı önemli bir koruyucu etki gözlendi.MES23.5 hücreleri. ICC kullanarak, KTF'nin H2O2 tarafından indüklenen tirozin hidroksilazın (TH) azalmasını inhibe ettiğini, HO-1, CAT ve GPx-1 mRNA ve protein ekspresyonunu yukarı regüle ettiğini ve ekspresyonunu aşağı regüle ettiğini bulduk. kaspaz 3. Bu sonuçlar, KTF'nin iyileştirme yoluyla H2O2-indüklenen hücre hasarına karşı nöron koruması sağlayabileceğini göstermiştir.oksitleyicistres ve bulgularımız Parkinson hastalığının önlenmesi ve tedavisi için yeni bir potansiyel strateji sağlar.

CISTANCH FAYDALARI:Parkinson hastalığının tedavisi

1. Giriş

Nörodejeneratif hastalıklar son zamanlarda önemli bir halk sağlığı sorunu haline gelmiştir. Parkinson hastalığı (PD), substantia nigra'daki dopaminerjik nöronların ilerleyici kaybı ile karakterize nörodejeneratif bir hastalıktır. PD'nin nedeni açıklığa kavuşturulmaya devam etse de, birkaç kanıt dizisi güçlü bir şekilde şunu önermektedir:oksidatif hasarve mitokondriyal disfonksiyon PD'nin patolojik mekanizmalarında önemli bir rol oynar [1-3]. Artırılmışoksitleyicistres arasındaki dengesizlikten kaynaklanır.oksitleyicihücredeki reaktif oksijen türleri (ROS) ve antioksidan moleküller gibi ürünler [4]. Beyin hücrelerinin antioksidan kapasitesini arttırmak, sinir hücrelerini oksidatif stres hasarına karşı korumada etkili bir strateji haline geldi.

PD, dünya çapında yaşlıları tehdit eden tedavisi zor bir hastalıktır. Mevcut terapötik ilaçlar, ciddi yan etkilerle sınırlı etkinliğe sahiptir. Geleneksel Çin otları ve formülleri, halk hekimliğinde PD dahil nörodejeneratif hastalıkları tedavi etmek için uzun süredir yaygın olarak kullanılmaktadır. Çin tıbbı teorisine göre,böbrekPD'nin ana patolojik mekanizmasıdır. Orobanchaceae familyasına ait bir Cistanche türü olan Cistanche Deserticola YC Ma, geleneksel Çin tıbbında bilinen bir bitkidir.böbrek güçlendiricietkinliği ve tedavisinde kullanılmaktadır.böbrekeksikliği, kadın infertilitesi, morbid leucorrhea, nevrasteni ve senil kabızlık [5]. Cistanche toplam glikozitlerinin, fare modellerinde ve PD hücrelerinde önemli nigra dopaminerjik nöronlar üzerinde koruyucu etkiler gösterdiği bildirilmiştir [6, 7]. Ayrıca, Cistanche'nin aktif bileşenlerinin, antioksidan kapasiteyi artırarak ve nöronların apoptozunu inhibe ederek nöroprotektif bir etkiye sahip olduğu belgelenmiştir [8-15]. Herba Epimedii aynı zamanda geleneksel birböbrek güçlendiriciOsteoporoz ve kardiyovasküler hastalıkların tedavisinde ve cinsel ve nörolojik fonksiyonların iyileştirilmesinde yaygın olarak kullanılan önemli ölçüde antioksidan aktiviteye sahip Çin bitkisi [16]. Polygonatum sibiricum, geleneksel Çin formülünde hükümdar ilacının ve bakan ilacının etkinliğini artırmak için genellikle bir yardımcı olarak kullanılır. Yakın tarihli bir rapor, Polygonatum sibiricum'un su özlerinin doğal antioksidanlar olduğunu gösterdi.

Eski Çinlilerin bu faydalarına dayanarakböbrek güçlendiriciCistanche, Epimedii ve Polygonatum cirrhifolium'dan oluşan formüle (KTF) dayanarak, KTF'nin MES23.5 dopaminerjik nöronları hidrojen peroksit- (H2O2-) kaynaklıoksidatif hasar. Burada, kavramın bir kanıtı olarak, KTF'nin hücre ölümü ve H2O2-muamele edilen H2O'da antioksidan enzim ekspresyonu üzerindeki etkilerini incelemek için bir dizi deney gerçekleştirdik.MES23.5 hücreleri.

Böbrek Tonlayıcı Formül, MES23.5 Hücrelerinde Oksidatif Hasarı koruyabilir

2. Malzemeler ve Yöntemler

2.1. Kimyasallar ve tepkimeler

HO-1, CAT, kaspaz 3 ve -aktin antikorları, Cell Signaling Technology Inc.'den (Boston, ABD) elde edildi. GPx-1 antikoru Abcam'dan (Cambridge Science Park, İngiltere) elde edildi. Tavşan Anti-Tirozin Hidroksilaz, Boster'dendi (BA1454, Çin). Yaban turpu peroksidaz etiketine konjuge edilmiş keçi anti-tavşan IgGl'i Santa Cruz Biotechnology Inc.'den (California, ABD) elde edilmiştir. Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamı (DMEM), GIBCO BRL Co. Ltd.'den (Gaithersburg, MD, ABD) satın alındı. Diğer tüm reaktifler, aksi belirtilmedikçe, Sigma Chemical Co.'dan (St. Louis, MO, ABD) idi. RevertAid™ First Strand cDNA Sentez Kiti, Fermentas Inc.'den (Burlington, ABD) elde edilmiştir. DreamTaq Green PCR Master Mix (2x), Fermentas Inc.'den (Burlington, ABD) idi. Bio DL100, BioFlux'tan (Tokyo, Japonya) temin edilmiştir. Polink-2 artı Tavşan Birincil Antikoru için Polimer HRP Tespit Sistemi (PV-9001) ve DAB (3,3'-diaminobenzidin tetrahidroklorür) (ZLI-9032), ZSGB-BIO'dan (Pekin, Çin). CAT, GPx-1 ve GSH'yi ölçmek için ELISA kitleri, Hufeng Biotechnology Inc.'den (Şanghay, Çin) alındı. Ginkgo biloba özleri (GE), Shanghai Sine Promod Pharmaceutical Co., Ltd.'den (Şanghay, Çin) alındı.

2.2. Böbrek Tonlaştırıcı Formülün Hazırlanması ve Standardizasyonu

bileşenleriböbrek güçlendiriciformülü, Cistanche Deserticola, Epimedium brevicornum ve Polygonatum sibiricum, Fujian Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi İkinci Bağlı Halk Hastanesi tarafından sağlandı ve Çin farmakopesine göre dikkatlice doğrulandı (Çin Farmakopesi Komisyonu, 2005). KTF numunelerini hazırlamak için 1 : 1: 1.2 ağırlık oranında Cistanche Deserticola, Epimedium brevicornum ve Polygonatum sibiricum karıştırılıp toz haline getirildikten sonra toplam hacim 10 kez (w/v) distile suya 1 saat süreyle daldırıldı. h ve 2 saat kaynatıldı. Çözelti süzüldükten sonra süzüntü toplandı. Tüm kalıntı toplandı ve toplam hacim 8 kez (a/h) damıtılmış su ile 2 saat daha kaynatıldı. Çözelti süzüldü ve iki süzüntü birleştirildi, konsantre edildi ve dondurularak kurutuldu. Nihai kurutulmuş ekstraktın verimi, başlangıç ​​ham bitkisel materyallerinin yüzde 25'i (a/a) idi ve kullanılıncaya kadar -20 derecede saklandı. KTF stok solüsyonu (10 mg/ml), KTF'nin fosfat tampon solüsyonu (PBS) içinde çözülmesi, ardından sonikasyon, 100 derecede sterilizasyon ve filtrasyon yoluyla hazırlandı.

2.3. Hücre Kültürü ve H2O2 Tedavisi

MES23.5 hücrelerikültürlendi ve önceki makalemizde tarif edildiği gibi H2O2'ye maruz bırakıldı [10]. Kısaca,MES23.5 hücreleriyüzde 5 (hacim/hacim) FBS (GIBCO BRL Co. Ltd., Gaithersburg, MD, ABD), 1{{12} içeren DMEM/F12 (GIBCO BRL Co. Ltd., Gaithersburg, MD, ABD) ortamında büyütüldü. }0 U penisilin/streptomisin, 2 mM L-glutamin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, ABD) ve Sato's (50 x Sato's: insülin 25 mg; transfer 25 mg; pirüvik asit, 243 mg; putresin 20 mg; 1 mg/ml sodyum selenat, 25 ul; 0.315 mg/ml progesteron) 37 derecede yüzde 5 CO2 ile. Bir gecede yetiştirilenMES23.5 hücreleri150 μM H2O2 ile 12 saat daha inkübe edildi.

2.4. KTF Tedavisi

MES23.5 hücrelerikontrol grubu (taze kültür ortamı), H2O2 grubu (H2O2 kültür ortamı), Ginkgo biloba özü (GE) grubu (H2O2 ve GE kültür ortamı) ve düşük doz KTF tedavisi, orta doz FTF tedavisi ve yüksek doz KTF tedavisi.MES23.5 hücrelerilogaritmik fazda, 24 saat boyunca poli-L-lisin (PLL) ile kaplanmış bir kültür plakasına ekildi. Kontrol grubundaki hücreler, taze kültür ortamı ile muamele edildi ve diğer tüm gruplardaki hücreler, 12 saat boyunca 150 μM H2O2 içeren kültür ortamı ile muamele edildi. GE grubundaki hücrelere 12.5 ug/ml GE içeren kültür ortamı, düşük doz KTF grubu, orta doz KTF grubu ve yüksek doz KTF grubundaki hücreler 3.125, 6.25, ve sırasıyla 24 saat boyunca 12.5 ug/ml.

2.5. Hücre Canlılığı

20 saat KTF işleminden sonra hücreler, 37 derecede 4 saat MTT (0,5 mg/ml) ile inkübe edildi ve ortam dikkatlice çıkarıldı ve her bir oyuğa 150 uL DMSO ilave edildi. Formazan kristalleri 10 dakika eritildi ve absorbans 490 nm'de ölçüldü. Her kuyunun optik yoğunluğu (OD), spektrofotometre (BIO-TEK ELX 800, BioTek Instruments Inc., Vermont, ABD) ile ölçüldü. Negatif kontrol olarak taze hücre kültürü ortamı kullanıldı.

Böbrek Tonlayıcı Formül, MES23.5 Hücrelerinde Oksidatif Hasarı koruyabilir

2.6. Ultrastrüktürel Morfoloji Gözlemi

24 saat KTF işleminden sonra hücreler toplandı, süspanse edildi ve yüzde 1.5 paraformaldehit çözeltisi (pH 7.3) içinde yüzde 3 glutaraldehit ile 4 derecede 24 saat sabitlendi. Hücre süspansiyonları daha sonra iki kez PBS ile durulandı ve yüzde 1 ozmik asit ve yüzde 1.5 potasyum hekzasiyanoferrat (II) çözeltisi (pH 7.3) ile sonradan sabitlendi ve 4 derecede 2 saat inkübe edildi; daha sonra hücre süspansiyonları, her biri 5 dakika boyunca dereceli bir alkol serisinde dehidre edildi. Kurutulmuş peletler 1 saat boyunca propilen oksit ile üç kez gömüldü ve 2 saat boyunca 1: 1 oranında bir reçine/propilen oksit karışımı ile ve daha sonra oda sıcaklığında 12 saat boyunca reçine ile süzüldü. İnklüzyon, epoksi reçine 618 ve Araldite ile yapılmış ve 48 saat boyunca 60 derecede polimerizasyon gerçekleştirilmiştir. Son olarak, ultra ince kesitler (80 nm) uranil asetat ile boyandı ve 5 dakika boyunca kurşun sitrat ile zıt boyandı. Boyanan hücreler H7650 transmisyon elektron mikroskobu (Hitachi, Japonya) ile incelendi.

2.7. Tirozin Hidroksilaz (TH) İmmünositokimyasal Testi

24 saat KTF işleminden sonra hücreler, 2 dakika boyunca iki kez PBS ile yıkandı ve 15 dakika boyunca yüzde 4 paraformaldehit ile sabitlendi. Sabit hücreler 3 kez yıkandı ve ardından 20 dakika boyunca 0%0.5 Triton X-100 ile işlendi. Daha sonra hücreler 3 kez yıkandı ve 10 dakika boyunca yüzde 3 H2O2 ile işlendi. H2O2- ile muamele edilmiş hücreler 3 kez yıkandı ve ardından 20 dakika boyunca keçi serumu ile lekelendi. Blot işleminden sonra, her numuneye gece boyunca 4 derecede tavşan anti-TH (1:400) ilave edildi. Numuneler daha sonra 3 kez yıkandı ve 20 dakika Polymer Helper ile işlendi. Polimer muamelesinden sonra hücreler 3 kez yıkandı ve 20 dakika boyunca poli-HRP anti-tavşan IgG ile muamele edildi. Hücreler 3 kez yıkandı ve 3 dakika DAB ile işlendi. Son olarak, numuneler akan su ile yıkandı ve 1 dakika süreyle hematoksilen zıt boyama ile işleme tabi tutuldu ve ardından akan su ile yıkandı ve üstün montaj ortamı ile kapatıldı.

2.8. ELISA ile Antioksidatif Enzimlerin Ölçümü

24 saatlik KTF tedavisinden sonra, hücre içi CAT, GPx-1 ve GSH'nin aktivite seviyesi, üreticinin talimatına göre bir ELISA kiti (Hufeng Biotechnology Inc., Şangay, Çin) kullanılarak ölçüldü. Kısaca, tedavi edilen hücrelerin lizatının 100 μL homojenat süpernatanı ELISA kuyucuklarına ilave edildi ve ardından 37 derecede 30 dakika inkübe edildi. Beş kez yıkanıp kurutulduktan sonra her kuyucuğa (beklenen kontrol tüpü) 50 µL enzim etiketli antikor çalışma solüsyonu eklendi. Elde edilen çözelti 37 derecede 30 dakika inkübe edildi ve beş kez yıkandı ve kurutuldu. Her kuyucuğa substrat çalışma solüsyonu (150 µL) eklendi ve 37 derecede 15 dakika inkübe edildi. Son olarak her kuyucuğa bir durdurma solüsyonu (50 μL) eklendi ve otomatik ELISA okuyucu (XL800, BioTex, Incorporated, Houston, TX, ABD) kullanılarak 450 nm'de absorbans değeri belirlendi.

2.9. Western Blot Analizi

24 saat KTF işleminden sonra hücreler buz gibi soğuk PBS ile yıkandı ve proteinler 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, yüzde 1 Nonidet P{{ içeren bir lizis tamponu içinde özümlendi. 9}}, 1 mM fenilmetilsülfonil florür ve 10 ug/mL aprotinin. Protein konsantrasyonu, BCA Protein Test Kiti (Thermo Scientific Pierce, Rockford, Illinois, ABD) kullanılarak belirlendi. Protein, SDS-PAGE elektroforezi ile ayrıldı ve PVDF'ye (Bio-Rad, Hercules, CA, ABD) aktarıldı. Bloklama yüzde 5 yağsız kuru süt ile yapıldı; zar, tavşan anti-sıçan HO-1, CAT, kaspaz 3, -aktin antikoru (1 : 1000, Hücre Sinyali) ve tavşan anti-sıçan GPx-1 antikoru (1 : 1000) ile inkübe edildi. , Abcam) bir gecede 4 derecede . Muamele edilen zar yıkandı ve daha sonra oda sıcaklığında 2 saat boyunca bir yaban turpu peroksidaz etiketine (1 : 5000, Santa Cruz, ABD) konjuge edilmiş keçi anti-tavşan IgGl'e maruz bırakıldı. Beş yıkamadan sonra çapraz reaktivite Elektrokemilüminesans (ECL) Western blot saptama reaktifleri kullanılarak görselleştirildi ve bir Görüntü Sisteminde (Bio-Rad, Hercules, CA, ABD) tarama dansitometrisi kullanılarak analiz edildi.

2.10. RT-PCR Analizi

HO-1, CAT, GPx-1 ve -aktin PCR primerleri Sangon Biotech Co. Ltd.'den (Şanghay, Çin) satın alındı. 24 saatlik KTF işleminden sonra, üreticinin talimatına göre Trizol reaktifi kullanılarak hücrelerin toplam RNA'sı izole edildi. Ters transkripsiyon (RT), AMV ters transkripsiyon sistemi (Fermentas, Burlington, ABD) kullanılarak yapıldı. cDNA fragmanı ve -aktin, Green PCR master MIX Kit (Fermentas, Burlington, ABD) kullanılarak amplifiye edildi. DNA, -aktin için 94 derecede 5 dakika ve 30 döngüde 94 derecede 30 saniye ve 58 derecede 30 saniye ve 72 derece ile 30 saniyede tek bir döngü ile hemen amplifiye edildi ve 72 derecede son bir uzatma adımı yapıldı. 10 dk. Etidyum bromür lekeli jeller, Tanon Image Software kullanılarak tarandı ve nitelendi. Her bandın yoğunluğu -aktin yoğunluğuna karşı normalleştirildi.

2.11. İstatistiksel analiz

İstatistiksel analiz SPSS 18.0 (SPSS Inc., Chicago, IL) ile yapıldı. Tüm veriler ortalama ± SD (standart sapma) olarak gösterildi ve farkın istatistiksel önemi, tek yönlü ANOVA ve LSD (doğrusal standart sapma) ile yapıldı. P < 0.05'te="" bir="" farkın="" anlamlı="" olduğu="" kabul="">

Böbrek Tonlayıcı Formül, MES23.5 Hücrelerinde Oksidatif Hasarı koruyabilir

3. Sonuçlar

3.1. H2O2'nin MES23.5 Hücreleri Üzerindeki Hasar Etkileri ve KTF'nin Oksidatif Strese Karşı Koruyucu Etkileri

Şekil 1(a)'da gösterildiği gibi, H2O2, MES23.5 dopaminerjik nöronal hücrelerin yaşayabilirliğinde doza ve zamana bağlı bir inhibisyon sergilemiştir. 50 μM H2O2'ye 12 saat maruz kaldıktan sonra, önemli bir hücre canlılığı kaybı kaydedildi ve hücre canlılığı kaybı, 150 μM'ye yükselen H2O2 dozu ile kademeli olarak arttı. Bununla birlikte, H2O2 dozunun 200'den 500 μM'ye yükseltilmesi, hücre canlılığında önemli ölçüde daha yüksek bir kayıpla sonuçlanmadı. GenişleyenMES23.5 hücreleri12 saatten 24 saate ve 48 saate kadar H2O2'ye maruz kalma, daha düşük H2O2 konsantrasyonlarında hücre canlılığı kaybını arttırdı. 25 μM H2O2'ye 24 saat ve 12.5 μM H2O2'ye 48 saat maruz kaldıktan sonra önemli bir MES23.5 hücre canlılığı kaybı kaydedildi. Test edilen tüm H2O2 konsantrasyonlarında zamana bağlı hücre canlılığı kaybı gözlendi.

Şekil 1 H2O2'nin hasar etkileriMES23.5 hücrelerive KTF'nin koruyucu etkilerioksitleyicistres, MTT testi kullanılarak değerlendirildi. (a) Farklı konsantrasyonlarda H2O2 tedavisinin hücre hasarı üzerindeki etkileri. MES23.5 hücreleri, 12, 24 ve 48 saat boyunca 12.5, 25, 50, 100, 150, 200, 300, 400 ve 500 μMol/L H2O2 ile işlendi. (b) Farklı konsantrasyonlarda KTF işleminin H2O2-indüklenen hücre hasarı üzerindeki koruyucu etkileri. KTF tedavisi, H2O2 ilavesinden sonra MES23.5 hücrelerinin canlılığında bir artışla sonuçlandı.MES23.5 hücreleriH2O2 eklendikten sonra 24 saat GE (12.5 ug/ml) veya KTF (3.125, 6.25, 12.5 ug/ml) ile inkübe edildi. Hücre canlılığı MTT ile ölçüldü. Veriler, üç bağımsız deneyde ortalama ± SD (standart sapma) olarak ifade edilir. #P < 0.05="" kontrol="" grubuyla="" karşılaştırıldığında.="" ∗p="">< 0.05,="" h2o2-tedavi="" grubuyla="">

ifşaMES23.5 hücreleriKTF konsantrasyonu 100 ug/ml'ye kadar olduğunda bile tek başına KTF'ye önemli bir sitotoksik etkiye sahip değildi. 12 saat boyunca 150 μM H2O2 ile birlikte kültürlenen MES23.5 hücreleri, yüzde 46,76 hücre canlılığı kaybına neden oldu. H2O2'nin MES23.5 hücreleri üzerindeki sitotoksik etkisi, 24 saat boyunca KTF tedavisi üzerine önemli ölçüde zayıfladı (Şekil 1(b)). Tedavi edilen H2O2'nin artırılmış canlılığıMES23.5 hücrelerisırasıyla 3.125, 6.25 ve 12.5 ug/ml konsantrasyonlarında KTF ile muamele edilerek yüzde 95.86 yüzde ± 7.18, yüzde 96.49 ± yüzde 15.07 ve yüzde 99.04 ± yüzde 10.57'ye geri yüklendi.

TEM, kontrol grubundaki normal hücrelerin, birçok oluk ve mikrovillus benzeri yapılara sahip, sağlam hücre zarı ile oval şekil sergilediğini gösterdi. Hücre çekirdeği, merkezde tek bir nükleol ile eliptikti ve normal ökromatine ve dağınık heterokromatine sahipti. Mitokondri, çubuk benzeri veya eliptik, dağınık ve normal cristae mitokondri ile sergiledi. Kaba endoplazmik retikulum iyi gelişmiştir ve belirgin bir degranülasyona sahip değildir (Şekil 2(a)). Ancak H2O2 ile muamele edilen hücreler tipik olarakoksidatif hasardaha küçük, düzensiz çekirdekler ve şişmiş mitokondri ile. Kaba endoplazmik retikulumda bariz degranülasyon bulundu (Şekil 2(b)). KTF ile tedavi edilen hücrelerde iyileştirilmiş H2O2-indüklenmişoksidatif hasar, mitokondri, çubuk benzeri veya eliptik, dağınık ve daha fazla cristae mitokondriyal sergiledi. Kaba endoplazmik retikulumda belirgin bir degranülasyon yoktu (Şekil 2(d), 2(e) ve 2(f)).

Şekil 2 KTF'nin H2O2- ile indüklenen hücresel ultrastrüktür üzerindeki etkisiMES23.5 hücreleri. TEM altında hücresel ultrastrüktür gözlemlendi. Normal sitoplazma morfolojisi, kontrol grubundaki hücre organelleri ((a), ×15,000), karakteristik ultrastrüktürel morfolojioksidatif hasarH2O2-tedavi edilen grupta ((b), ×15,000), KTF grubuyla tedavi (sırasıyla 3.125, 6.25 ve 12.5 ug/ml) ((d), (e), (f), ×15,000) veya Ginkgo özütü (12,5 ug/ml) ((c), ×15,000).

3.2. KTF Tedavisinden Sonra MES23.5 Hücrelerinde TH Ekspresyonunun Artması

TH, amino asit L-tirozinin, dopamin nörotransmiterlerinin öncüsü olan L-3,4-dihidroksifenilalanin (L-DOPA)'ya dönüştürülmesinde kritik bir katalize edici enzimdir. TH'nin normal ifadesi, aktif nöronların işaretidir. Bu nedenle, inkübe edilen H2O2-içindeki TH ifadesini karşılaştırdık.MES23.5 hücreleriimmünohistokimya ile KTF tedavisini takiben veya olmadan. Sonuç, H2O2'nin MES23.5 hücrelerinde TH ekspresyonunu azalttığını ve KTF tedavisinin ardından TH ekspresyonunu önemli ölçüde iyileştirebileceğini gösterdi (Şekil 3). Bu, KTF tedavisinin H2O2- ile tedavi edilen MES23.5 hücrelerinin işlevini geri yüklediğini gösterir.

Şekil 3 KTF, H2O2-'da TH'nin indüklediği azalmayı iyileştirdiMES23.5 hücreleri. Hücreler yüzde 4 paraformaldehit ile sabitlendi ve TH ekspresyonu immünositokimya ile tespit edildi. (a) Tan, TH pozitif ifadesini temsil eder (×400). (b) Negatif kontrol. (c) Sonuçlar, ortalama gri derece olarak ifade edilir. Veriler, üç bağımsız deneyde ortalama ± SD'dir. #P < 0.05,="" kontrol="" grubuyla="" karşılaştırıldığında.="" ∗p="">< 0.05,="" h2o2-tedavi="" grubuyla="">

3.3. MES23.5 Hücrelerinde KTF Bastırılmış H2O2-İndüklenmiş Kaspaz 3 Aktivasyonu

MES23.5 hücre hasarının mekanizmasını daha fazla araştırmak için, immünoblotlama ile proapoptozis faktör kaspaz 3'ün ekspresyonunu değerlendirdik. Sonuç, H2O2 tedavisinin procaspaz 3 ekspresyonunu belirgin şekilde aşağı regüle ettiğini ve kaspaz 3 ekspresyonunu yukarı regüle ettiğini gösterdi. ). Bu bulgular, KTF tedavisinin kaspaz 3 aktivasyonlarını etkili bir şekilde inhibe ettiğini göstermektedir.

Şekil 4 KTF'nin kaspaz 3'ün H2O2- ile indüklenen protein ekspresyonu üzerindeki etkisiMES23.5 hücreleri. (a) Kaspaz 3'ün protein ifadesi western blot ile belirlendi ve (b)'de nicelendirildi. Veriler, üç bağımsız deneyde ortalama ± SD olarak ifade edilir. #P < 0.05="" kontrol="" grubuyla="" karşılaştırıldığında.="" ∗p="">< 0.05,="" h2o2="" -tedavi="" edilen="" grupla="">

3.4. KTF Tedavisi ile MES23.5 Hücrelerinde Antioksidatif Enzimlerin Artan Ekspresyonu

ELISA testi, hücre içi CAT, GPx-1 ve GSH'nin MES23.5 hücrelerinde 150 uM H2O2 işleminden sonra aşağı regüle edildiğini ortaya koydu. Not olarak, KTF tedavisinin ardından hücre içi CAT, GPx-1 ve GSH ifadesi restore edilmiştir. RT-PCR analizi, H2O2 tedavisinin CAT ve GPx-1 mRNA ifadesini aşağı regüle ettiğini gösterdi; ancak, KTF tedavisi, CAT ve GPx-1 mRNA'nın ifadelerini geri yükledi.MES23.5 hücreleri. Spesifik antikorlara sahip immünoblot ayrıca CAT ve GPx-1 protein ekspresyonununMES23.5 hücreleriH2O2 tedavisi ile aşağı regüle edildi ve KTF tedavisi CAT ve GPx-1 protein ekspresyonunu geri yükleyebildi. Ayrıca, mRNA ekspresyonuoksitleyicistrese yanıt veren protein HO-1 da H2O2 tedavisinden sonra inhibe edildi ve ardından KTF tedavisinin ardından restore edildi. İmmünoblotlama ayrıca HO-1 protein ekspresyonunun H2O2 tarafından belirgin şekilde aşağı regüle edildiğini kanıtladı, ancak KTF tedavisi HO-1 protein ekspresyonunu geri yükleyebildi. Beklendiği gibi, araştırmamızda kullanılan en yüksek KTF konsantrasyonu, CAT, GPx-1, GSH ve HO-1 ifadesinin geri yüklenmesinde en iyi etkiye sahiptir (Şekiller (Şekil 55 ve 6). 6). Birlikte ele alındığında, elde edilen sonuçlar, KTF tedavisinin H2O2- ile muamele edilmiş MES23.3 hücrelerinde antioksidan substratları önemli ölçüde yukarı regüle ettiğini göstermektedir.

Şekil 5 KTF'nin H2O2- ile indüklenen hücre içi CAT, GPx-1 ve GSH düzeyi üzerindeki etkisiMES23.5 hücreleri. Hücre içi CAT, GPx{{0}} ve GSH'nin aktivite seviyesi, bir ELISA kiti kullanılarak ölçüldü. Veriler, üç bağımsız deneyde ortalama ± SD olarak ifade edilir. #P < 0.05,="" kontrol="" grubuyla="" karşılaştırıldığında.="" ∗p="">< 0.05,="" h2o2-tedavi="" grubuyla="">

Şekil 6 KTF, H2O2- ile indüklenen antioksidan enzimlerin protein ve mRNA ekspresyonunu arttırdıMES23.5 hücreleri. (a) HO{{0}}, CAT ve GPx-1'in protein ifadeleri Western blot ile belirlendi ve (c)'de nicelendirildi. (b) HO-1, CAT ve GPx-1 mRNA ifadeleri RT-PCR ile belirlendi ve (d)'de ölçüldü. Veriler, üç bağımsız deneyde ortalama ± SD olarak ifade edilir. #P < 0.05,="" kontrol="" grubuyla="" karşılaştırıldığında.="" ∗p="">< 0.05,="" h2o2="" -tedavi="" grubuyla="">

4. Tartışma

Redoks sisteminin önemli bir bileşeni olarak ROS, hücre fonksiyonunun düzenlenmesinde önemli bir rol oynar. Orta düzeyde ROS, hücre çoğalmasını ve hayatta kalmasını teşvik etmek için sinyaller olarak işlev görebilir. Fizyolojik koşullar altında, ROS'un oluşumu ve ortadan kaldırılması arasındaki denge, redoksa duyarlı sinyalizasyon sisteminin uygun işlevini korur. Redoks homeostazı, ROS üretimindeki bir artış veya ROS temizleme kapasitesinin azalmasıyla bozulabilir, bu da genel olarak bir artışa yol açar.oksitleyicistres [17, 18], daha sonra hücre içi yapıda geri dönüşü olmayan hasara neden olur ve hücre ölümüne neden olur.

Beyindeki yüksek O2 tüketimi ROS birikimine yol açar; bu nedenle, nöronlar özellikle saldırıya karşı savunmasızdır.oksitleyicistres. Postmortem araştırmalar lipid peroksidasyonunu göstermiştir veoksidatif hasarPD hastalarında beyin hücrelerine [19]. Büyüyen çalışmalar bunu doğruluyoroksidatif hasarAD, PD, HD ve ALS gibi nöron dejeneratif hastalıkların patogenezinde kritik bir rol oynar [18, 20]. Bu çalışmada, 12 saat boyunca 50 μM H2O2, 24 saat boyunca 25 μM H2O2 veya 48 saat boyunca 12.5 μM H2O2'ye maruz kaldıktan sonra MES23.5 dopaminerjik nöronal hücrelerde önemli bir hücre canlılığı kaybı gözlendi. Morfoloji gözlemi ile gösterildiği gibi, 12 saat ila 150 μM H2O2'ye maruz kalan hücreler, sitoplazmada çoklu membranöz vakuoller, endoplazmik retikulum ve mitokondrinin bozulması ve hücre çekirdeğinde ökromatinin yoğunlaşması dahil olmak üzere tipik bir oksidatif hasar sergiledi.

Çin tıbbı teorisine göre,böbrekPD'nin ana patolojik mekanizmasıdır. canlandırıcıböbrekPD tedavisinde önemli bir stratejidir. Bu çalışmada, gelenekselböbrek güçlendiriciCistanche, Epimedii ve Polygonatum sibiricum'dan oluşan formül KTF, hücre canlılığını ve tedavi edilen H2O'nun TH ifadesini önemli ölçüde arttırdı2-MES23.5 hücreleri.

Hücre apoptozu, dış veya iç yolları aktive eden çeşitli uyaranlar üzerine programlanmış hücre ölümünün bir modudur. Sisteinil aspartat spesifik proteazlar (kaspazlar) çok hücreli organizmalarda yüksek oranda korunur ve apoptozun merkezi düzenleyicileri olarak işlev görür. Kaspazların aktivasyonu, tüm apoptoz olaylarının ana eksenidir. Bu kaspazlar arasında, kaspaz 3, hücre apoptozunun önemli bir aracısı ve göstergesi olarak tanımlanmıştır. Diğer kaspazlar gibi, kaspaz 3 genellikle aktif olmayan bir proenzim (procaspaz 3) olarak bulunur. Proteolitik işlemden sonra, aktif kaspaz 3 oluşturmak için dimerize olabilen ve ardından hücre apoptozunu indüklemek için birçok biyokimyasal ve biyofiziksel değişikliği uyandıran iki alt birim üretecektir [21]. Mevcut çalışmamız, H2O2 tedavisinin kaspaz 3'ü önemli ölçüde artırdığını ortaya koydu, ancak bu eğilim KTF tedavisi ile tersine çevrildi.MES23.5 hücreleri, KTF'nin H2O2- ile tedavi edilen MES23.5 hücrelerinin hücre apoptozunu azalttığını gösterir.

Süperoksit dismutaz (SOD), CAT, GPx-1, GSH ve HO-1 gibi antioksidan enzimler hücrelerin önemli savunma mekanizmalarıdır.oksitleyicistres. Antioksidatif bir enzim olarak SOD, süperoksit radikallerini daha sonra CAT ve GPx tarafından H2O'ya dönüştürülen hidrojen peroksite dönüştürebilir [22]. GSH ayrıca önemli bir antioksidandır. İndirgenmiş glutatyonun (GSH) GPx tarafından oksitlenmiş glutatyona (GSSG) katalitik dönüşümü, H2O2'yi O2'ye dönüştürmeye yardımcı olur. PD model farelerde antioksidan aktivitesinin azaldığı bildirilmiştir [23-25]. Bu nedenle, enzimatik antioksidanların ekspresyonunu düzenleyen ilaçlar, PD tedavisi için potansiyel adaylar olarak hizmet edebilir. Verilerimiz H2O2 tedavisinin CAT, GPx, GSH ve HO-1'u baskıladığını gösterdi.MES23.5 hücreleri, farklı konsantrasyonlarda KTF tedavisi etkili bir şekilde CAT, GPx, GSH ve HO-1 ifadesini geri yükledi.

Sonuç olarak, bulgularımız geleneksel Çin bitkisininböbrek güçlendiriciCistanche, Epimedii ve Polygonatum sibiricum'dan oluşan formülasyon, güçlü bir antioksidan kapasiteye ve önemli nöroprotektif etkilere sahiptir. Bu çalışma, geliştirme için bir ipucu sağlar.böbrek güçlendiriciParkinson hastalığını önlemek ve tedavi etmek için potansiyel bir terapötik ajan olarak formülasyon.

Böbrek Tonlayıcı Formül, MES23.5 Hücrelerinde Oksidatif Hasarı koruyabilir

Teşekkür

Bu çalışma, Çin Halk Cumhuriyeti Ulusal Sağlık ve Aile Planlaması Komisyonu Bilimsel Fonu (WKJ-FJ-38), Chen Keji Bütünleyici Tıp Geliştirme Fonu (CKJ2014012) ve Temel Disiplin Fonu ( X2014010-deprem). Yazarlar, yardımları için Bayan Xin Pan'a içten teşekkürlerini sunarlar.

Rekabet İlgi Alanları

Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişki olmaksızın yürütüldüğünü beyan eder.

Yazar katkıları

Yihui Xu ve Wei Lin makaleye aynı katkıyı paylaşıyor. Chuanshan Xu ilgili yazardır.

Referanslar

1. Fahn S., Cohen G. Parkinson hastalığında oksidan stres hipotezi: onu destekleyen kanıtlar. Nöroloji Annals. 1992;32(6):804-812. doi: 10.1002/ana.410320616. [PubMed] [CrossRef] [Google Akademik]

2. Jenner P., Olanow CWoksidatifstres ve Parkinson hastalığının patogenezi. Nöroloji. 1996;47(ek 3): S161–S170. doi: 10.1212/wnl.47.6_tedarik_3.161s. [PubMed] [CrossRef] [Google Akademik]

3. Akaneya Y., Takahashi M., Hatanaka H. MPP'de serbest radikallerin katılımı artı kültürde sıçan dopaminerjik nöronlarına karşı nörotoksisite. Nörobilim Mektupları. 1995;193(1):53–56. doi: 10.1016/0304-3940(95)11668-M. [PubMed] [CrossRef] [Google Akademik]

4. Emerit J., Ideas M., Bricaire F. Nörodejeneratif hastalıklar veoksitleyicistres. Biyotıp ve Farmakoterapi. 2004;58(1):39-46. doi: 10.1016/j.biopha.2003.11.004. [PubMed] [CrossRef] [Google Akademik]

5. Çin Farmakopesi Komisyonu. Çin Halk Cumhuriyeti Farmakopesi. Cilt 1. Pekin, Çin: Halkın Tıbbi Yayınevi; 2010. [Google Akademik]

6. Cai J., Tian Y., Lin R., Chen X., Liu Z., Xie J. Koruyucu etkileriböbrek güçlendiriciParkinson hastalığının bir fare modelinde önemli nigra nöronları üzerinde Çin bitkisel preparatı. Nöral Rejenerasyon Araştırması. 2012;7(6):413–420. [PMC ücretsiz makale] [PubMed] [Google Akademik]

7. Li WW, Yang R., Cai DF Cistanche toplam glikozitlerinin Parkinson hastalığının model farelerinin önemli nigra'sındaki bir dopaminerjik nöron üzerindeki koruyucu etkileri. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 2008;28(3):248–251. [PubMed] [Google Akademik]

8. Wei W., Jing C. Parkinson hastalığı için TCM modeli ve formülünün bir analizi. Geleneksel Çin Tıbbı Dergisi. 2013;54(20):1778–1782. [Google Akademik]

9. Tian Y., Cai J., Chen X.böbrek güçlendiriciNigra striatal nöronlar üzerindeki Çin bitkisi, Parkinson hastalığı olan fareler. Çin Gerontoloji Dergisi. 2011;31(3):440–443. [Google Akademik]

10. Lin SG, Ye SF, Huang JM, et al. Tonik yapan Çin ilaçları nasıldır?böbrekdopaminerjik nöron apoptozunu inhibe eder mi? Nöral Rejenerasyon Araştırması. 2013;8(30):2820–2826. doi: 10.3969/j.issn.1673-5374.2013.30.004. [PMC ücretsiz makale] [PubMed] [CrossRef] [Google Akademik]

11. Wang H., Li W.-W., Cai D.-F., Yang R. Cistanche ekstraktlarının MPP artı Parkinson hastalığı hücre modelinin neden olduğu yaralanma üzerindeki koruyucu etkisi. Çin Bütünleştirici Tıp Dergisi. 2007;5(4):407–411. doi: 10.3736/jcim20070409. [PubMed] [CrossRef] [Google Akademik]

12. Geng X., Tian X., Tu P., Pu X. Parkinson hastalığının fare MPTP modelinde ekinakozitin nöroprotektif etkileri. Avrupa Farmakoloji Dergisi. 2007;564(1–3):66–74. doi: 10.1016/j.ejphar.2007.01.084. [PubMed] [CrossRef] [Google Akademik]

13. Tian X.-F., Pu X.-P. Cistanches salsa kaynaklı feniletanoid glikozitler, nöronlarda 1-metil-4-fenilpiridinyum iyonunun neden olduğu apoptozu inhibe eder. Etnofarmakoloji Dergisi. 2005;97(1):59-63. doi: 10.1016/j.jep.2004.10.014. [PubMed] [CrossRef] [Google Akademik]

14. Geng X., Song L., Pu X., Tu P. Cistanches salsa'dan elde edilen feniletanoid glikozitlerin 1-metil-4-fenile-1,2,3,{{ karşı nöroprotektif etkileri,{{ 6}}C57 farelerinde tetrahidropiridin (MPTP) kaynaklı dopaminerjik toksisite. Biyolojik ve Farmasötik Bülten. 2004;27(6):797-801. doi: 10.1248/bpb.27.797. [PubMed] [CrossRef] [Google Akademik]

15. Wong HS, Ko KM Herba Cistanches, H9c2 kardiyomiyositlerinde mitokondriyal solunumdan üretilen reaktif oksijen türleri tarafından hücresel glutatyon redoks döngüsünü uyarır. Farmasötik Biyoloji. 2013;51(1):64-73. doi: 10.3109/13880209.2012.710242. [PubMed] [CrossRef] [Google Akademik]

16. Wing Sze SC, Tong Y., Ng TB, Yin Cheng CL, Cheung HP Herba Epimedii: anti-oksitleyiciözellikleri ve tıbbi etkileri. Moleküller. 2010;15(11):7861-7870. doi: 10.3390/moleküller15117861. [PMC ücretsiz makale] [PubMed] [CrossRef] [Google Akademik]

17. Trachootham D., Lu W., Ogasawara MA, Valle NR-D., Huang P. Hücre sağkalımının Redox düzenlemesi. Antioksidanlar ve Redoks Sinyali. 2008;10(8):1343-1374. doi: 10.1089/ars.2007.1957. [PMC ücretsiz makale] [PubMed] [CrossRef] [Google Akademik]

18. Moore DJ, West AB, Dawson VL, Dawson TM Parkinson hastalığının moleküler patofizyolojisi. Nörobilimin Yıllık İncelemesi. 2005;28:57-87. doi: 10.1146/annurev.neuro.28.061604.135718. [PubMed] [CrossRef] [Google Akademik]

19. Sian J., Dexter DT, Lees AJ, et al. Parkinson hastalığında glutatyon seviyelerindeki değişiklikler ve bazal gangliyonları etkileyen diğer nörodejeneratif bozukluklar. Nöroloji Annals. 1994;36(3):348–355. doi: 10.1002/ana.410360305. [PubMed] [CrossRef] [Google Akademik]

20. Halliwell B., Gutteridge JMC İnsan hastalıklarında serbest radikallerin rolü: genel bir bakış. Enzimolojide Yöntemler. 1990;186:1–85. [PubMed] [Google Akademik]

21. Venderova K., Park DS Parkinson hastalığında programlanmış hücre ölümü. Tıpta Cold Spring Harbor Perspektifleri. 2012;2(8) doi: 10.1101/cshperspect.a009365.a009365 [PMC ücretsiz makale] [PubMed] [CrossRef] [Google Akademik]

22. Fridovich I. Reaktif oksijen türlerinin temel yönleri veya oksijenle ilgili sorun nedir? New York Bilimler Akademisi Annals. 1999;893:13–18. doi: 10.1111/j.1749-6632.1999.tb07814.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Akademik]

23. Xiong Q., Kadota S., Tani T., Namba T. Feniletanoidlerin Cistanche Deserticola'dan antioksidan etkileri. Biyolojik ve Farmasötik Bülten. 1996;19(12):1580–1585. doi: 10.1248/bpb.19.1580. [PubMed] [CrossRef] [Google Akademik]

24. Koppula S., Kumar H., More SV, Lim H.-W., Hong S.-M., Choi D.-K. Parkinson hastalığının deneysel modellerinde bitkisel ürünlerin redoks düzenlemesi ve serbest radikal süpürücü etkileri konusundaki son güncellemeler. Moleküller. 2012;17(10):11391–11420. doi: 10.3390/moleküller171011391. [PMC ücretsiz makale] [PubMed] [CrossRef] [Google Akademik]

25. Fang Z., Wang Y. PD model farelerde isatinin antioksidaz aktiviteleri üzerindeki etkisi. Çin Eczanesi. 2008;19(22):1696-1697. [Google Akademik]