Lipidomics, Akut Böbrek Hasarı Sırasında Sisplatine Bağlı Renal Lipid Değişikliklerini ve Bunların Silastatin Tarafından Azaltıldığını Ortaya Çıkardı
Feb 21, 2022
Soyut: Nefrotoksisite, sisplatin bazlı kemoterapinin önemli bir komplikasyonudur ve akutböbrek hasarıca. Klinik kullanım için önleyici müdahale veya tedavi bulunmayan hastaların yüzde 30'u. Yakın zamanda klinik deneylere girmiş olan cilastatin, in vitro ve in vivo modellerde sisplatin tedavileri için nefroprotektif bir etki gösterdiğini kanıtlamıştır. Sisplatin kaynaklı moleküler düzeyde daha derin bir anlayışböbrek hasarıve potansiyel koruyucu ajanların etkisi, başarılı nefroprotektif tedaviler geliştirmek ve yeni biyolojik belirteçler oluşturmak için anahtar olabilir.böbrek hasarıvenefro-koruma. 108 lipid türünün (fosfolipidler, sfingolipidler ve serbest ve esterlenmiş kolesterolü içeren) miktarının belirlenmesi için LC-MS/MS kullanan hedefli bir lipidomik yaklaşım kullanıldı.böbreksisplatin ve/veya cilastatin ile tedavi edilen sıçanlardan alınan korteks ve medulla özleri. Sisplatin tedavisinden sonra sırasıyla korteks ve medullada 56 ve 63'e kadar lipid türünün değiştiği bulundu. Cilastatin ile birlikte tedavi, kontrol seviyelerine göre bu lipid değişikliklerinin çoğunu ya tamamen ya da kısmen hafifletmiştir. Çok değişkenli analiz, lipit türlerinin ayırt etmek için kullanılabileceğini ortaya koydu.böbrek hasarıvenefro-koruma, kolesterol esterleri, sülfatidler ve fosfolipitlerle birlikte en ayırt edici türlerdir. Sisplatin kaynaklı potansiyel tanısal biyobelirteçler böbrek hasarıve cilastatinnefro-korumada bulundu.
Anahtar Kelimeler:lipidomik; sisplatin; Akut böbrek hasarı; silastatin; nefro-koruma; biyobelirteçler; kolesterol esterleri; sfingolipidler; fosfolipidler; kemoterapi
giriiş Nefrotoksisite, sisplatin kemoterapisinin ciddi bir yan etkisidir [1], akutböbrek hasarı(AKI) yaklaşık olarak geliştirilmektedir. Tedavi edilen hastaların yüzde 30'u [2]. Bu aynı zamanda, katı tümörler için en uygun tedavilerden biri olan sisplatin bazlı tedavilerin ana doz sınırlayıcı faktörü ve önemli bir dezavantajıdır [2]. Sisplatin birikir ve yaralanmaya neden olur.böbrekproksimal tübül epitel hücreleri (RPTEC'ler) ve hasar özellikle proksimal tübülün S3 segmentinde yer alır.böbrekkorteks kortikomedüller bileşke ve dış medullaya doğru [3]. Bununla birlikte, medüller Henle halkasına doğrudan zarar verildiği de öne sürülmüştür [4,5]. ile ilgili olarak bir dizi hücresel olay gerçekleşir.böbrekoksidatif stres, nitrozatif stres, vasküler hasar, iltihaplanma, mitokondriyal hasar veya hücre zarında Na artı, K artı - ATPaz'ın inhibisyonu ve endoplazmik retikulum stresi dahil olmak üzere sisplatin alımını takiben tübül hücre hasarı, ardından esas olarak proksimal tübül hücre ölümü apoptoz (hem içsel hem de dışsal yolları içerir) veya nekroz,böbrek fonksiyonu[2,6,7]. Bu, artan kan üre nitrojeni (BUN) ve serum kreatinin ile birlikte glomerüler fifiltrasyon hızında (GFR) ve serum magnezyum ve potasyum seviyelerinde azalma ile kendini gösterir [2].
için çeşitli yaklaşımlar araştırılmıştır.nefro-korumasisplatin tedavileri sırasında, bir dizi moleküler hedefe dayalı olarak hem in vitro hem de in vivo [7-9]. Bununla birlikte, sisplatinin tümör hücreleri üzerindeki sitotoksik etkisinin olası bozulması ve genellikle eksik bir koruyucu etki, renoprotektörlerin gelişimini sınırlamıştır [9]. Sonuç olarak, sisplatin kaynaklı ABH'yi başarılı bir şekilde önleyen veya tedavi eden klinik kullanım için herhangi bir müdahale yoktur [7]. Sisplatin kaynaklı AKI ile ilgili moleküler yolakların daha derin bir şekilde anlaşılması venefro-korumabu açıdan çok önemli görünüyor.
Cilastatin'in etkili bir şekilde koruduğu kanıtlanmıştırböbrekhem in vitro hem de in vivo modellerde sisplatin [10,11], gentamisin [12], vankomisin [13], siklosporin A ve takrolimus [14] dahil olmak üzere çeşitli ajanların neden olduğu hasardan. Silastatin, koruyucu etkisini seçici olarak inhibe ederek gösterir.böbrekdehidropeptidaz I (DHP-I), RPTEC'lerin fırça sınırındaki lipid sallarında bulunur [11]. Sonuç olarak, Fas aracılı ekstrinsik apoptoz gibi membran dışsallaştırmasını içeren süreçler, cilastatin tarafından bozulur veböbrek hasarızehirli bir hakaret gözaltına alındıktan sonra [11]. Cilastatin ile dışsal apoptoz bozukluğunun yanı sıra, oksidatif stres, iltihaplanma ve nefrotoksik bileşiklerin birikiminin hepsinin azaldığı bulundu [10-13,15,16]. Böylece,böbrek fonksiyonusisplatin ve cilastatin ile birlikte tedavi altında korunur [11]. Son zamanlarda, cilastatin nefroprotektör olarak kullanımı için faz I klinik denemelerini başarıyla tamamladı ve faz II denemelerine girmek üzere. Umut verici yakın tarihli bir çalışma, aynı zamanda, silastatin'in (imipenem artı silastatin olarak uygulandığında), hipertermik intraperitoneal sisplatin tedavisi sırasında peritoneal karsinomatozlu hastalarda renoprotektif bir etki sağlayabileceğini ortaya koymuştur [17].
Son yıllarda, omik teknolojileri, özellikle proteomik [18,19] ve metabolomik [20–23], BUN veya serumdaki kreatinin dışında AKI'nin yeni erken tanısal biyobelirteçlerinin keşfi için yararlı olduğunu kanıtlamıştır [18,20]. Ek olarak, metabolomik analiz, sisplatin nefrotoksisite mekanizmalarının [5,24] ve potansiyel nefroprotektörlerin terapötik etkisinin [25-27] anlaşılması için değerli bilgiler sağlayabilir.
Özellikle lipidomikler, ilgili bilgiler de sağlayabilir.böbrek hastalığı[28], lipidlerin temel yapısal, hücre sinyalizasyonu ve metabolizma rolleri sunduğunu ve hücre, doku ve biyoakışkanlarda değiştirilebileceğini göz önünde bulundurarak,böbrekpatolojik durumlar [29,30]. Bu bağlamda, artan trigliserit ve esterleşmemiş yağ asitleri seviyeleri bulundu.böbreksisplatin tedavisi sırasında [31], tal nötr lipidlere [32] ek olarak. Artmış sfingolipid seviyeleri (seramidler (Cer) ve heksosil seramidler (HexCer)) de gözlenmiştir.böbreksisplatin kaynaklı ABH sırasında korteks [33]. Öte yandan, fosfatidilkolin (PC), fosfatidiletanolamin (PE) ve lizofosfatidilkolin (LPC) türleri de dahil olmak üzere fosfolipid türlerinin de fosfatidilkolin (LPC) türlerinde değişiklik olduğu bulunmuştur.böbrek dokusuveya sisplatin tedavisi sırasında hücreler [26]. Sisplatin uygulamasından sonra sıçan serumunda çeşitli LPC türlerinin seviyelerinin de değiştiği bulunmuştur [23]. Ayrıca, bir kütle spektrometrisi görüntüleme hedefli olmayan yarı niceliksel yaklaşım, sıçandaki lipid dağılımını karşılaştırmaya izin verdi.böbrekbölümler ve cis platinin çeşitli fosfolipidler (PC, PE, fosfatidilgliseroller (PG), fosfatidilinositoller (PI), fosfatidilserinler (PS), fosfatidik asitler (PA)), sülfatidler (Sülf) veya kardiyolipinler üzerinde değişikliklere yol açtığını öne sürdü [34] (korteks ve medullada farklı davranışlar gösterirken), silastatin ile birlikte tedavi bu değişikliklerin bazılarını hafifletme eğilimindeydi [4].
Bu çalışmada, bir adım daha ileri gittik ve vücuttaki önemli yapısal lipidlere daha yakından baktık.böbrekfosfolipidler (PC, LPC ve PE), sfingolipidler (Sulf, sfingomyelinler (SM), dihidrosfingomyelinler (dhSM), Cer, dihidroseramidler (dhCer), HexCer, dihidroheksosilseramidler (dhHexCer) ve serbest kolesterol esteri (FC) gibi formları (kolesterol esterleri (CE)), yeni lipid sınıflarını ve türlerini kapsayan ve tandem kütle spektrometrisi (LC-MS/MS) analizine bağlı sıvı kromatografisine dayalı daha güvenilir hedefli nicel bir yaklaşım kullanarak. Her ikisinde de toplam 108 lipid türü ölçülmüştür.böbrekSisplatinin nefrotoksik etkisini ve cilastatinin nefroprotektif etkisini daha iyi anlamak için tedavi edilen sıçanlardan korteks ve medulla özütleri. AKI ile ilişkili sisplatin etkisi hakkında yeni bilgilerböbreklipit türleri elde edildi ve cisplatinin neden olduğu belirli lipid değişikliklerinin bazılarında zayıflamaya yol açan silastatin'in koruyucu etkisine ilişkin ek anlayışlar elde edildi.böbrekkorteks veya medulla. Sisplatin kaynaklı çeşitli potansiyel biyobelirteçlerböbrek hasarıvenefro-korumasilastatin ile de bulundu.
Sonuçlar
Sisplatine Bağlı Böbrek Hasarına Karşı Silastatin Koruyucu Etkisi
değerlendirilmesiböbrek fonksiyonusisplatin ve/veya silastatin ile tedavi edilen sıçanlarda ilk olarak serum ve idrarda çeşitli biyokimyasal göstergeler kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Tablo 1'de gösterildiği gibi, serum kreatinin, BUN, idrar proteinleri, idrar hacmi ve fraksiyonel sodyum ve potasyum atılımı, kontrol grubuna kıyasla sisplatin tedavisi nedeniyle önemli ölçüde artarken, silastatin ve sisplatin ile birlikte tedavi, karşılaştırıldığında azalmaya neden oldu. kontrol seviyeleri ile. Öte yandan, kontrol örneklerine göre sisplatin ile tedavi edilen sıçanlarda GFR azalırken, silastatin ile birlikte uygulanması bu etkiyi azalttı. Bu sonuçlar doğruluyorböbrek hasarısisplatin tarafından indüklenir ve silastatin tarafından korunur. Tek başına silastatin üzerinde herhangi bir etki göstermedi.böbrek fonksiyonuparametreler.
Hematoksilen/eozin ile boyanmış kesitlerde histopatolojik analiz de morfolojik değişiklikleri incelemek için yapılmıştır.böbrek hasarı. Şekil 1, proksimal bölgede sisplatin kaynaklı hasar belirtilerini göstermektedir.böbrektübül şişmesi, hücre enkazı ayrılması veya fırça kenar zarının kaybı dahil olmak üzere tübüller (Şekil 1C,G,I). Korteks ve medulla tübüllerinde de protein dökümlerinin birikimi gözlendi (sırasıyla Şekil 1C,G). Bu, kortekste (sırasıyla Şekil 1A,B) ve medullada (sırasıyla Şekil 1E,F) kontrol veya cilastatin gruplarında gözlenen normal morfolojinin aksinedir. Cilastatin ile cisplatin birlikte tedavisi, korteks ve medulladaki tüm bu sisplatin kaynaklı değişikliklerin net bir şekilde azalmasına neden oldu (Şekil 1D,H,J).
Korteks ve Medulla'daki Global Renal Lipid Sınıflarının Sisplatin Değişimi. Cilastatin'in Koruyucu Etkisi
Steroller (CE, FC), fosfolipidler (LPC, PC, PE) ve sfingolipidler (Cer, dhCer, HexCer, dhHexCer, Sulf, SM, dhSM) dahil olmak üzere farklı lipid sınıflarının toplam seviyeleri belirlendi.böbrekAKI sırasında sisplatinin lipidler üzerindeki global etkisini değerlendirmek için korteks ve medulla. Lipid analizine ilişkin tam sonuçlar Tablo S1'de bulunur. Şekil 2A,B'de görüldüğü gibi, tüm gruplar için korteks ve medullada oldukça benzer eğilimler gözlendi. Kontrol gruplarına göre sisplatin tedavisi sırasında hem kortekste hem de medullada CE ve Cer anlamlı olarak artarken SM, dhSM ve PE azaldı. Bunlar arasında, Cer ve CE, gözlemlenen en belirgin sisplatin kaynaklı değişikliklerden muzdariptir. Ayrıca, sisplatin tedavisi sırasında medullada dhCer ve HexCer önemli ölçüde artarken, kortekste dhHexCer arttı ve LPC ve Sülf azaldı.
Şekil 1. Hematoksilen/eozin lekeli histopatolojik analiziböbrekbölümler, sisplatin kaynaklı hasara karşı silastatin korumasını gösterir. Görüntüler (A) kontrol korteksi için 20× büyütmede gösterilir; (B) cilastatin korteks; (C) sisplatin korteks; (D) sisplatin artı cilastatin korteks; (E) kontrol medullası; (F) silastatin medulla; (G) sisplatin medulla; ve (H) sisplatin artı cilastatin medulla. A'dan H'ye ölçek çubuğu 100 µm'yi temsil eder. detaylı görüntüleriböbrek(I) sisplatin ve (J) sisplatin artı cilastatin için 60x büyütmede tübüller görüntülenir. I ve J için ölçek çubuğu 25 µm'yi temsil eder.böbrekhasar göstergeleri temsil edilir: →: protein dökümlerinin birikmesiböbrektübüller. & bölge: tübül şişmesi. *: fırça kenar zarının kaybı. #: hücre enkazı ayrılması.
Cilastatin ve sisplatinin birlikte uygulanması, bu sisplatin kaynaklı lipid değişikliklerinin bazılarını hafifletme eğilimindeydi ve kortekste Cer ve dhHexCer seviyeleri veya dhCer, HexCer, SM, dhSM ve PE durumunda kontrol grupları açısından hiçbir fark yaratmadı. medulla seviyeleri. Ayrıca, kortekste sisplatin ile indüklenen CE artışı durumunda, sisplatin ile birlikte uygulanan silastatin, sisplatin grubu ile karşılaştırıldığında, seviyelerin önemli ölçüde azalmasına yol açtı, ancak iyileşme, koiatrol gruplarına göre kısmi oldu. Sisplatin tarafından değiştirilen lipit sınıflarının geri kalanı, cilastatisi birlikte tedavisi sırasında kurtarılmamış olarak kaldı. Öte yandan, silastatin, kontrol grubuna göre sırasıyla azalmış ve artmış gibi görünen kortekste LPC ve dhCer dışında korteks ve medulla lipitleri üzerinde hiçbir etkiye sahip değildi. Toplam FC, PC ve dhHexCer seviyeleri, sisplatin tedavisinden sonra korteks ve medullada önemli bir değişiklik göstermedi.
Şekil 2C,D, sırasıyla korteks ve medulladaki lipid sınıfları için korelasyon ısı haritalarını gösterir ve benzer eğilimler sunar.
Sisplatin Tedavisi ile Bireysel Renal Lipid Türleri Alitrasyon. Cilastatin Zayıflatıcı Egect
Kolestesol EsterleriBeş ayrı CE türünün (CE 18:1, CE 18:2, CE 18:0, CE 20:4 ve CE 22:6) analiziböbrekkorteks ve medulla, sisplatinin kontrol seviyelerine kıyasla her birini önemli ölçüde artırdığını ortaya koydu (Şekil 3). Öte yandan, silastatin ve sisplatinin birlikte uygulanması, sisplatin tedavisine göre bireysel CE tür seviyelerinde genel bir düşüşe yol açmıştır; bu, korteksteki tüm CE türleri ve medulladaki CE 18:2 için istatistiksel olarak anlamlıydı. Şekil 3'te görülmektedir. Korteks CE türlerinde cilastatin birlikte uygulanmasından kaynaklanan bu geri kazanım, kontrol grubu seviyeleri ile karşılaştırıldığında kısmi iken, cilastatinin birlikte uygulanması için çoğu medella CE türünde (CE 18:2 hariç) istatistiksel olarak anlamlı bir iyileşme gözlemlenmemiştir. sisplatin ile karşılaştırıldığında. Korteks ve medulla lipid türleri üzerindeki tam istatistiksel analiz sonuçları sırasıyla Tablo S2 ve S3'te gösterilmektedir.
Sfingolipidler : Cer, dhCer, HexCer, dhHexCer, SM, dhSM ve SülfToplamda 43 sfingolipid türü ölçülmüştür.böbrekŞekil 4'te gösterildiği gibi sisplatin ve cilastatin tedavisinin seviyeleri üzerindeki etkisini değerlendirmek için korteks ve medulla. Cer (Şekil 4A), dhCer (Şekil 4B), HexCer (Şekil 4C) ve dhHexCer (Şekil 4D) türleri ile ilgili olarak, Görüldüğü gibi, sisplatin tedavisi, dört sınıftan 19 türde önemli bir artışa neden oldu.böbrekkorteks ve medulla. Yine, sisplatin ve silastatin ile birlikte tedavi, korteks ve medullada sisplatin tarafından değiştirilen lipid düzeylerinde genel bir azalma ile sisplatinin etkisini azaltma eğilimi gösterir. Aslında, dhCer (Şekil 4B) ve dhHexCer (Şekil 4D) türleri için, sisplatin artı cilastatin ile tedavi edilen gruplar ve bu sisplatin değiştirilmiş türler için kontrol grupları arasında hiçbir fark gözlenmedi, bu da tam bir iyileşmeye işaret ediyor. Cer (Şekil 4A) ve HexCer (Şekil 4C) söz konusu olduğunda, bu kazanç aynı zamanda HexCer 34:1 (korteks ve medulla) ve HexCer 38:1 ve HexCer 42:1 (medulla) gibi bazı değiştirilmiş türler için de geçerliydi. ); kortekste Cer 36:1, Cer 38:1, Cer 40:1, Cer 42:1 ve Cer 42:2; ve medullada Cer 34:1 ve Cer 42:2, tamamen veya kısmen iyileşmiştir. Tersine, sisplatin artı cilastatin tedavisi, medullada Cer 36:1, Cer 38:1, Cer 40:1, Cer 42:1 ve HexCer 36:1 için kontrol gruplarına göre hala anlamlı farklılıklar gösterdi, iyileşme olmadı, işaret etti Cer ve HexCer için silastatin tarafından kortekste medullada uygulanandan çok daha iyi bir iyileşme etkisine.
SM (Şekil 4E) ve dhSMt (Şekil 4F) türleri söz konusu olduğunda, sisplatin, SM 34:1, dhSM 34 için istatistiksel olarak anlamlı olan en kısa ve en uzun zincir türleri için korteks ve medullada bir azalmaya yol açmıştır:{{ 5}}, SM 42:2, SM 42:1 ve dhSM 42:1. Buna karşılık, korteks ve medulladaki ara zincir SM ve dhSM türleri üzerinde sisplatin tedavisi için gözlenen etki, dhSM 36:0 (hem korteks hem de medullada) ve dhSM 4{{ için istatistiksel olarak anlamlı olan bir artıştı. 15}}:0, SM 36:1, SM 38:1 ve SM 40:1 medullada. Sisplatin ve cilastatinin birlikte uygulanması, SM 34:1, SM 36:1, SM 38:1, SM 40:1, SM 42:2, SM 42:1, dhSM 36:0, dhSM 40:0 ve dhSM 42:1 medulladaki kontrol gruplarına göre farklılık göstermemektedir. Son olarak, bazı Sülf türleri de sisplatin tedavisi ile değiştirildi.böbrekŞekil 4G'de gösterildiği gibi korteks ve medulla. Sisplatin tedavisinden sonra hem kortekste hem de medullada Sulf 40:1'in önemli ölçüde arttığı bulunurken, Sulf-OH 40:1 veya uzun zincirli Sulf-OH 42:2, Sulf-OH gibi diğer türler 42:2 kortekste azalmış, Sulf 42:0 ve Sulf-OH 42:1 de hem kortekste hem de medullada azalmıştır. Sisplatin ile birlikte uygulanan cilastatin, özellikle Sulf 40:1 (korteks ve medulla) ve Sulf 40:2 ve Sulf-OH 42:1 (medulla) için, kontrol gruplarıyla karşılaştırıldığında hiçbir fark göstermeyerek, tekrar hafif bir iyileşme etkisine yol açtı.
Fosfolipitler: PC, PE ve LPC60 fosfolipid türünün (28 PC, 20 PE ve 12 LPC) miktar tayini gerçekleştirildi.böbrekpotansiyel sisplatin kaynaklı değişikliklerin ve silastatin renoprotektif etkisinin değerlendirilmesi için korteks ve medulla. PC türleri için sonuçlar sırasıyla Şekil 5A,B'de gösterilmektedir. Görülebileceği gibi, sisplatin, korteks veya medullada 19'a kadar PC türünü önemli ölçüde değiştirmiştir. Bu PC türlerinin çoğu, kortekste artan PC 40:2, PC 40:4 ve PC 34:2 dışında sisplatin tarafından azaltıldı. Şekil 5C,D'de görülebileceği gibi, iki çift bağ içeren türlerin fraksiyonu önemli ölçüde artarken, hem medulla hem de kortekste yüksek oranda atüre PC türlerinin oranı önemli ölçüde azaldı. Hem sisplatin hem de cilast atin ile tedavi, daha önce gözlemlenenlere benzer etkiler gösterdi, bazı zayıflatıcı etkiler gözlendi, bazı durumlarda kontrol grubu ile önemli farklılıklar olmaksızın PC seviyelerinde tam bir iyileşmeye veya kısmi bir iyileşmeye yol açtı. Bu geri kazanım esas olarak, korteks ve medulladaki PE türlerinin belirlenmesine ilişkin sonuçlarda sırasıyla Şekil 6A,B'de gösterilmektedir. Toplam 16 PE türü, sisplatin tarafından kortekste veya medullada önemli ölçüde değiştirildi ve en fazla değişen tür medullada bulundu. Kortekste, medullada veya hem kortekste hem de medullada artan PE 38:2, PE 40:6 ve PE 40:4 dışında, olguların çoğunda sisplatin tedavisi ile PE türleri azalmıştır, sırasıyla. Buna göre medulladaki PE türlerinde toplam yağ asidi zincir uzunluğu dikkate alındığında, Şekil 6C'de gösterildiği gibi 34, 36 ve 38 C'lik toplam PE miktarı sisplatin ile önemli ölçüde azalırken, 40 C'lik türler artmıştır. . Cilastatin ile cisplatin birlikte tedavisi, medullada bulunan bireysel PE türlerinde sisplatin kaynaklı değişikliklerin çoğunu hafifletti ve medulladaki 15 sisplatin-değiştirilmiş türden 11'inde kontrol grupları ile karşılaştırıldığında anlamlı farklar olmayan seviyeler sundu ve 2 PE türü daha kısmen iyileşti. Bununla birlikte, kortekste, sisplatin ile değiştirilmiş 11 türden sadece 2'si silastatin ile kontrol seviyelerine geri kazanıldı, 2 ek PE türü kısmen geri kazanıldı. PC türleri için gözlemlere benzer şekilde, yüksek derecede doymamış PE türlerinin oranı medullada önemli ölçüde azalırken, 1-3 çift bağ içeren türlerin oranı Şekil 6D'de gösterildiği gibi önemli ölçüde artmıştır.
LPC tür analizi ile ilgili olarak, gözlemlenen sisplatin kaynaklı değişikliklerin çoğu,böbrekkorteks, burada LPC 16:1, LPC 16:0, LPC 18:1, LPC 18:0 , LPC 20:3, LPC 22:6 ve LPC 22:5 ile önemli ölçüde azaldı Şekil 7A'da görülebileceği gibi kontrol örneklerine göre. Öte yandan, sisplatin tedavisi sırasında medullada LPC 17:1 ve LPC 18:2'nin arttığı bulundu (Şekil 7B). Sisplatin ve silastatin ile birlikte tedavinin korteks LPC türleri üzerinde hiçbir iyileşme etkisi olmamıştır. Tersine, LPC 17:1 ve LPC 18:2, kontrol numuneleri ile karşılaştırıldığında önemli bir farklılık olmaksızın medullada geri kazanılmıştır.
Sınıflandırma Değişkenleri Olarak Renal LipidlerBöbrek hasarıve Koruma
Bu türlerin grup sınıflandırması için hizmet edip edemeyeceğini ve sisplatin kaynaklı ayırt ediciliği değerlendirmek için korteks ve medullada ölçülen tüm lipid değişkenleri kullanılarak çok değişkenli analiz yapıldı.böbrek hasarıvenefro-korumacilastatin tarafından. Temel bileşen analizi (PCA) ve gizli yapılar ayrım analizine (OPLS-DA) ortogonal projeksiyonlar, Şekil 8'de gösterildiği gibi ayrı ayrı korteks veya medulla lipidleri kullanılarak gerçekleştirildi. Korteks (Şekil 8A) ve medulla (Şekil 8B) PCA analizi. lipitler, modellere, sisplatin grubunun kontrol ve cilastatin gruplarına göre net bir şekilde ayrılmasını gösterme yeteneği sundu, son ikisi yakından kümelendi. Öte yandan, sisplatin artı cilastatin ile tedavi edilen grup, sisplatin grubundan ayrılma eğilimindeydi ve kontrol ve sisplatin grupları arasında yer aldı, bu da gruplar arasında farklılıklar olduğunu düşündürdü. Tüm PCA modelleri, 0.7'den yüksek R2 ve 0.5'ten yüksek Q2 değerleri sundu.
Çok gruplu OPLS-DA analizi ayrıca hem korteks (Şekil 8C) hem de medulla (Şekil 8D) lipid değişkenleri kullanılarak farklı grupların açıkça ayrılmış kümelenmesini gösterdi. OPLS-DA modelleri, kabul edilebilir Q2 değerleri ve 0.7'den daha yüksek R2 değerleri sundu ve Şekil 8E,F'de gösterildiği gibi 100 yineleme için permütasyon testi sırasında geçerli olduğu kanıtlandı. 1'den yüksek projeksiyon (VIP) puanlarında değişken öneme sahip özellikler, grupların ayrılması üzerinde daha yüksek bir etkiye sahip olan sırasıyla korteks veya medulla lipidlerini gösteren Şekil 8G,H'de bulunabilir. Bunlar, CE, sfingolipid ve fosfolipid sınıflarından çeşitli lipid türlerini içermektedir. Sisplatin tedavisi ile ilgili bireysel gruplar arasındaki spesifik lipid farklılıklarını belirlemek venefro-koruma, sırasıyla Şekil 9 ve 10'da görülebileceği gibi korteks ve medulla lipidleri ile ayrı ayrı OPLS-DA analizi yapıldı. OPLS-DA modelleri kontrol grubu ile karşılaştırıldığında sisplatin, sisplatin ile karşılaştırıldığında sisplatin artı silastatin ve kontrol grubu ile karşılaştırıldığında sisplatin artı silastatin için oluşturulmuştur. En ayırt edici OPLS-DA modelleri, en yüksek R2 ve Q2 değerleri göz önüne alındığında, kontrol ve sisplatin veya sisplatin artı cilastatin ile tedavi edilen gruplar arasında, 100 döngü ile permütasyon test sonuçlarına dayalı uygun doğrulama ile olanlardır (Şekil 9A,B,D, E ve Şekil 10A,B,D,E).
Öte yandan, hem korteks (Şekil 9C) hem de medulla (Şekil 10C) lipidleri kullanan sisplatin artı cilastatin ve sisplatin grupları için OPLS-DA modelleri de makul R2 ve Q2 değerleriyle grup ayrımcılığına izin verdi. ve 100-döngü permütasyon testlerinden uygun doğrulama sonuçları (Şekil 9F ve 10F), medulla lipidleri daha iyi tahmin edilebilirlik sunar. Farklı OPLS-DA modelleri için S-grafikleri, korteks veya medulla lipid özellikleri için Şekil 9G,H,I ve Şekil 10G,H,I'de yer almaktadır. |p(corr)| olan türler 0,5'ten yüksek ve 1'den yüksek VIP puanları, S-grafiklerinde grupların ayrımcılığına en uygun özellikler olarak işaretlenmiştir. OPLS-DA modellerinden p (corr) ve VIP değerleri dahil olmak üzere eksiksiz veriler, her lipit türü için tek değişkenli istatistiklerle birlikte Ek Tablolar S2 (korteks lipitleri) ve S3'te (medulla lipitleri) bulunabilir. Açık görünüyor kiböbrekkorteks ve medulla lipidleri, sisplatin ile indüklenen için ayırt edici kriterler olarak hizmet edebilir.böbrek hasarıve cilastatin içinnefro-korumasisplatin tedavisi sırasında
Sisplatin ile İndüklenen Böbrek Hasarının Potansiyel Biyobelirteçleri Olarak Renal Lipidler Böbrek hasarının potansiyel lipid biyobelirteçlerini seçmek için
sisplatinin neden olduğu, tek değişkenli sisplatin analizinden kontrol gruplarına karşı istatistiksel olarak anlamlı p-değerlerinin ve ayrıca karşılık gelen OPLS-DA modelinde bulunan p(corr) ve VIP değerlerinin çok kriterli bir kombinasyonu kullanıldı. p değerleri < 0="" olan="" seçilmiş="" lipidler.05;="" fdr="">< 0.1;="" |p(düzelt)|=""> 0,5 ve VIP > 1, alıcı çalışma karakteristiği (ROC) eğrileri için kat değişiminin (FC) ve eğrinin altındaki alanların (AUC) da dahil edildiği Tablo 2'de (korteks lipidleri) ve Tablo 3'te (medulla lipidleri) bulunabilir.
Görülebileceği gibi, sırasıyla Tablo 2 ve 3'te medulladan 4'e kadar lipid ve korteksten 27 lipide kadar CE, sfingolipidler ve fosfolipid türleri seçilmiştir. Her lipit için elde edilen ROC eğrileri için AUC değerleri 0.85'ten yüksekti ve çoğu durumda 1'e yakındı, bu da türün sisplatin ve kontrol grupları arasında iyi bir ayrım kapasitesi olduğunu gösteriyordu. Dikkat çekici bir şekilde, sisplatin ile artan CE türleri (CE 18:1, CE 18:2, CE 18:0, CE 20:4 ve CE 22:6) en ayırt edici görünmektedir. en yüksek FC, VIP, p(corr) ve AUC değerlerini gösteren hem medulla hem de korteksteki özellikler. dhHexCer 34:0, kortekste yüksek FC ve ilgili puanlarla artan bir başka lipiddir. Öte yandan, Sulf 42:0, Sulf-OH 40:1 veya Sulf-OH 42:1 gibi sülfatidler de korteksle oldukça alakalıyken, PE 36:5, PE 38:6, PE 38:5 PC 36:5 veya PC 36:6 da medullada çok önemlidir, hepsi sisplatin tedavisi sırasında azalır.
Silastatin Nefroproteksiyonunun Potansiyel Biyobelirteçleri Olarak Renal Lipidler
Sisplatin nefro toksisitesine karşı silastatin korumasının potansiyel lipid biyobelirteçlerini seçmek için, Bölüm 2.5'tekiyle aynı çoklu kriter yaklaşımı, sisplatin artı silastatin ile sisplatin gruplarının tek değişkenli analizi ve ilgili OPLS-'de bulunan p(korr) ve VIP değerleri kullanılarak uygulandı. DA modeli. p değerleri < 0="" olan="" seçilmiş="" lipidler.05;="" fdr="">< 0.1;="" |p(düzelt)|=""> 0,5 ve VIP > 1, ROC eğrileri için FC ve AUC'nin de hesaplandığı Tablo 4 (korteks lipidleri) ve Tablo 5'te (medulla lipidleri) bulunabilir.
Tablo 4'te görülebileceği gibi, tüm CE türleri (CE 18:1, CE 18:2, CE 18:0, CE 20:4 ve CE 22:6). korteks, cisplatinin neden olduğu değişiklikleri aynı zamanda önemli ölçüde azaltan, silastatin tarafından uygulanan korumanın en güçlü göstergeleri olarak kabul edilebilir. Korteksteki PE 36:5 ve dhHexCer 34:0 aynı zamanda silastatin korumasının önemli potansiyel biyobelirteçleridir, özellikle de silastatin nedeniyle kontrol seviyelerine doğru tam bir iyileşme gösteren ikincisi. Medulla lipidleri ile ilgili olarak, Tablo 5'te gösterildiği gibi, kortekste olduğundan daha yüksek miktarda cilastatin korumasının potansiyel biyobelirteçleri bulundu. Özellikle, en yüksek FC ve VIP puanları dikkate alındığında, Sulf 40:2 medulladaki en ayırt edici tür gibi görünmektedir. Cer'e ek olarak, PE 36:5, PE 38:5, PE 38:6, PE 36:4, PE 34:3 ve PC 36:6 dahil olmak üzere çeşitli PC ve PE türleri de bulundu. 42:2, dhHexCer 36:0 ve HexCer 34:1, medullada cilastatin korumasının önemli biyolojik belirteçleri olarak. Vakaların tümünde, bu lipidler, sisplatin tarafından değiştirilen seviyelerine kıyasla, kısmi veya toplam silastatin ile indüklenen kontrol seviyeleri geri kazanımı ile ilişkilendirildi. Tüm türler için elde edilen ROC eğrileri için AUC değerleri 0.85'ten yüksekti ve iyi ayırt etme yeteneklerini kanıtladı.
TartışmaBu çalışmada, fosfolipitler, sfingolipidler ve kolesterol gibi önemli yapısal lipitleri içeren toplam 108 lipit türünü, esterlenmiş formları ile birlikte kantitatif olarak nicelleştirdik.böbreksisplatin ve/veya cilastatin ile tedavi edilen sıçanlardan alınan korteks ve medulla. Bu, sisplatinin nefrotoksik etkisini ve silastatinin koruyucu etkisini daha iyi anlamak için yapıldı. Sisplatin tedavisi ile medullada 63'e kadar lipit türünün önemli ölçüde değiştiği bulunurken, kortekste 56 lipit türünün etkilendiği,böbrek hasarıher iki bölgede. Her ne kadar geleneksel olarak sisplatin kaynaklı AKI çalışmalarının çoğu proksimal tübül hücrelerine odaklansa da veböbrekesas olarak ilaç birikiminin odaklandığı korteks hasarı, son çalışmalar medulladaki hasarın TUNEL apoptoz analizlerine dayalı olarak korteksteki kadar şiddetli olabileceği gerçeğine işaret etmektedir [5]. Bu, Henle döngüsünün potansiyel doğrudan ve ikincil hasarının yanı sıra, proksimal tübüllerin S3 segmentinde [3,5], dış medullaya doğru inen sisplatin birikimi ile ilişkili olabilir [4]. Ayrıca medulla en hassas bölge olarak belirtilmiştir.böbrekkorteks ile karşılaştırıldığında sisplatin ile ilişkili global metabolit değişikliklerini gözlemlemek için alan [5]. Önceki sonuçlarımız ayrıca medulla hücrelerinde (ikincil hasarın yanı sıra) sisplatin tarafından çeşitli fosfolipid ve kardiyolipin değişikliklerinde yansıyan doğrudan bir hasara işaret etti [4]. Bu yeni sonuçlar, sisplatin tarafından değiştirilen ilave lipid türleri ve sınıfları ile bu gözlemleri genişletir ve sisplatin kaynaklı AKI'de medulla hasarının ilişkisini güçlendirir.
FC'de olmasına rağmenböbreksisplatin tedavisi ile önemli ölçüde değişmemiştir, hem toplam CE hem de ölçülen tüm bireysel CE türleri, sisplatin ile indüklenen ile bağlantılı olarak hem kortekste (toplam CE için sekiz kat artış) hem de medullada (toplam CE için dört kat artış) önemli ölçüde artmıştır.böbrek hasarı.Kolesterol, fosfolipidler arasında yer alan ve akışkanlığı, yüzey yükünü ve polar baş gruplarının etkileşimlerini etkileyen plazma membranlarının önemli bir bileşenidir [35,36]. Varlığı ayrıca lipid sallarında temeldir, SM ile hidrofobik etkileşimler kurar ve moleküllerin ayrılması ve zardaki diğer bileşenlerle etkileşimlerini kontrol etmek için esastır [37]. Hücreler, endoplazmik retikulumda (ER) de novo sentez ile LDL aracılı alım arasında bir kolesterol dengesi sağlar. Kolesterolün çoğu plazma zarında bulunur, ancak FC'nin (ACAT aracılı esterifikasyon yoluyla) kolesterolün sitozolik depolama formu olarak kabul edilen CE'ye dönüştürülebildiği ER'ye geri dönebilir [36]. CE ayrıca kolesterol ester döngüsünü oluşturan FC'ye geri hidrolize edilebilir [36]. Sisplatin tedavisi sırasında FC'nin değişmemiş olması, ancak hem kortekste hem de medullada CE'nin artması gerçeği, sisplatin tedavisinin değiştiğini düşündürmektedir.böbreksisplatin kaynaklı ABH ile ilişkili kolesterol metabolizması. Önceki çalışmalar, akut iskemik sırasında hem HK-2 insan proksimal tübül hücrelerinde hem de farelerin renal korteksinde oldukça benzer gözlemler gösterdi.böbrek hasarı, değiştirilmemiş FC ve artan CE seviyeleri ile [36]. Bu durumda, zardan ER'ye artan FC trafiğini tetikleyen plazma zarı hasarı, artan bir CE oluşumuna neden olan en makul açıklama gibi görünüyordu. Bu bağlamda, ER'ye artan kolesterol trafiğinde plazma membranından ziyade kolesterolden zengin lipid sallarına verilen hasarın daha etkili olduğu görülmüştür [36]. CE'nin sitoprotektif rolü, bu tür önceki çalışmalarda da ima edilmiştir. Sıçanlarda da CE düzeylerinde bir artış rapor edilmiştir.böbrekerken evre diyabetik nefropati sırasında korteks [29]. Sonuçlar aynı zamanda nötr lipidlerde küresel bir artışla da uyumludur.böbreksisplatin tedavisi sırasında bildirilen proksimal tübüller [32]. Sonuçlarımız, ilk kez bireysel CE türlerine ek olarak toplam CE'de küresel bir artışa işaret ediyor.böbreksisplatin kaynaklı AKI sırasında korteks ve medulla. Öte yandan, cilastatin'in kendisi, toplam FC veya CE seviyeleri değişmemiş olmasına rağmen, CE 18:0 ve CE 22:6'yı yalnızca kortekste hafifçe artırıyor gibi görünüyordu. Bu hafif etki, hedefinin, DHP-I'nin proksimal tübüldeki (esas olarak kortekste) lipid sallarında yer alması gerçeğinden kaynaklanıyor olabilir ve etkileşimi sırasında zarda küçük bir bozulma olduğu ima edilebilir. Öte yandan, sisplatin ve silastatin birlikte uygulanması kortekste sisplatin ile artan tüm CE türlerinde bir azalmaya yol açarken, medullada neredeyse hiç iyileşme etkisi gözlenmedi, sadece kısmi bir CE18:2 geri kazanımı oldu. . Bu, cisplatinin korteksteki lipid salları ve plazma zarı üzerindeki doğrudan hasarı ile ilgili hücre ölümü genişlemesinde önemli bir koruma sağlayan proksimal tübül hücrelerinde silastatin spesifik etkisine işaret ederken, tüm medulladaki kolesterol dengesizliği ile ilgili hücre hasarı gibi görünmektedir. büyük ölçüde korunmasız kalmak.
Sfingolipidler, esas olarak hücre zarlarında bulunan aktif lipidlerdir ve lipid salları açısından oldukça zengindir [37]. Seramidler, hücre büyümesi, apoptoz, farklılaşma, ilaç direnci ve yaşlanma gibi hücresel süreçlerde önemli rolleri olan çeşitli molekülleri ve enzimleri içeren sfingolipid metabolizmasının merkezi metabolitleridir [38,39]. Ek olarak, sfingolipidler, sisplatin kanser hücresi ölümü ve AKI ile ilgili yolaklara katılır [33]. Seramidler, de novo sentez, sfingomiyelinin hidrolizi veya kompleks sfingolipidlerin geri dönüşümü dahil olmak üzere çeşitli yollarla üretilebilir [38]. De novo sentez ana yoldur ve ER'de palmitoil-CoA ve serinden, bir dizi enzimatik yoldan sfinganin üretmek için gerçekleşir, bu da dihidroseramid sentaz (CerS) yoluyla dihidroseramidlere yol açar. Son olarak, dhCer'in desatürasyonu Cer [40]'ı oluşturur. SM ayrıca sfingomyelinazlar tarafından hidrolize edilerek Cer üretebilir. Cer, Golgi aygıtında daha karmaşık sfingolipidlere dönüştürülebilir: bir sinyal molekülü olan Cer-1-P'yi üretmek için fosforile edilir; SM sentaz eylemiyle SM'ye dönüştürülür; veya sülfatidlerin öncüleri olan hesoksilseramidleri (glukosil- veya galaktosil-seramidler) üretmek için glikosile edilir [38]. Cer ayrıca, hücrenin hayatta kalması ve çoğalması, iltihaplanma ve ilaç direncinde önemli rolleri olan sfingosin-1-fosfatın (S1P) bir öncüsü olan sfingosine indirgenebilir [39]. Son olarak, S1P'nin etanolamin ve heksadesenal'e degradasyonu bu yolun çıkış yoludur [38].
Sfingolipid türlerinin miktar tayini sırasında, sisplatin tedavisi sırasında Cer, dhCer, HexCer ve dhHexCer'in toplam seviyelerinde küresel bir artış gözlemlendi ve bu özellikle Cer için önemliydi. Kontrole göre farklılıklarböbreksisplatin tedavisi ile 22 türden 19'unun kortekste (11 tür) ve/veya medullada (18 tür) artmasıyla, bireysel alt türler nicelleştirildiğinde daha belirgindi. Bu, farede Cer ve HexCer'de bir artışa işaret eden önceki gözlemlerle uyumludur.böbrekkorteks sisplatin tedavisi ile ilişkilidir [33], ancak burada medullanın da bu etkiden etkilendiğini bulduk.
Bu gözlemler, artan bir Cer/dhCer ve HexCer/dhHexCer metabolik üretimini yansıtabilir. Bir yandan, bu, daha önceki gözlemlerin ışığında, artan CerS aktivitesi yoluyla gerçekleşebilir.böbreksisplatin tedavisi sırasında uzun zincirli CerS aktivitesinin ölçüldüğü korteks ve CerS'nin inhibisyonu, gözlemlenen Cer/HexCer birikiminde bir azalmaya yol açtı [33]. Ayrıca, korteks ve medullada bulunan SM/dhSM düzeylerinde sisplatin ile indüklenen bir azalma, sfingomyelinaz (SMase) yolu yoluyla SM/dhSM'nin hidrolizi yoluyla ek bir Cer/dhCer üretiminin arttığını düşündürür [38], bunun üzerinde özel bir etkisi vardır. uzun zincirli Cer/dhCer, tümü AKI modellerinde zararlıdır [40]. Bu aynı zamanda, uzun zincirli Cer türlerinin AKI [40] sırasında alakalı göründüğü gerçeğiyle veböbreksisplatin tedavisi sırasında korteks [33]. Cer, hem içsel hem de dışsal yollarda sinyalleme yoluyla sisplatin kaynaklı apoptozda yer alır [39]. İç mitokondriyal yolda, sisplatin mitokondriyal dış zar geçirgenleşmesine neden olur. Cer'deki artış, aşağı akış metabolitleri ile birlikte, bu geçirgenleşmeye katkıda bulunabilir ve Cer tarafından kanalların oluşumu, mitokondriyal zarda apoptozu kolaylaştırarak, Bax'ın mitokondriyal dış zara girmesine ve ayrıca dışarı akışına izin verir. sitokrom C [39]. Ayrıca, Fas aracılı ekstrinsik apoptoz, kümelenmesine sisplatin kaynaklı SMase aktivasyonu ve Cer yüksekliğinin aracılık ettiği lipid sallarında bulunan Fas reseptörünü kullanır [39]. Bu nedenle Cer, sisplatin ile indüklenen AKI'de apoptozu belirlerken, bunların HexCer'e dönüşümleri yoluyla seviyelenmesi koruyucu gibi görünmektedir [33] ve sisplatine direnç ile ilişkilidir [39]. Büyük miktarlarda üretilen Cer, zarların fiziksel özelliklerini de etkileyebilir ve kolesterolün yerini alabilir ve esterleşmesini sağlayabilir [35]. Öte yandan, SM esas olarak plazma zarlarında bulunur ve özellikle lipid sallarında önemli olan kolesterol molekülleri ile doğrudan bir ilişkiye sahiptir [41]. SM rejenerasyonunun olmaması, uygun membran fonksiyonu için negatif olabilir [41].
Kükürt bol miktarda bulunurböbrek,özellikle distal tübüllerin apikal membranında [42]. Normal yaşam için gerekli olmasalar daBöbrek fonksiyonu, bir Sülf eksikliğinin, artan sülfatlanmış glikolipidler ve koles terol üretimi ile telafi edildiği bulunmuştur [42]. Sülfatid, önemli bir L-selektin ligandıdır.böbrek,monosit infifiltrasyonunda hayati bir role sahiptir.böbrekinterstisyum [42]. Öte yandan, lipid-sal ilişkili miyelin ve lenfosit proteini (MAL), sülfatidler ve glikosfingolipidlerle kompleksler oluşturur.böbrekmembranlar, glikosfingolipid ile zenginleştirilmiş mikro alanların stabilizasyonuna ve sınıflandırılmasına katkıda bulunur [42]. Korteks ve medulladaki Sülf değişiklikleriyle ilgili sonuçlarımız, böbrekte sisplatin tarafından farklı sülfatid türlerinin de değiştirildiği düşünülen önceki çalışmaları doğrulamaktadır [34].
Kortekste cisplatin tarafından değiştirilen tüm Cer, dhCer, HexCer ve dhHexCer türleri, silastatin birlikte uygulanmasıyla kısmen veya tamamen geri kazanılırken, medullada büyük miktarda Cer türü geri kazanılmadı ve neredeyse tamamen dhCer geri kazanımı sağlandı. , HexCer ve dhHexCer. Cer türlerinin Fas aracılı dış apoptoza dahil olması ve bunun proksimal tübüldeki lipid sallarında DHP-I'ye bağlanan cilastatin tarafından bloke edilmesi göz önüne alındığında, bu, koruyucu etkiyi ve esas olarak korteks hücrelerinde meydana gelen Cer geri kazanımını açıklayabilir. SM, dhSM ve Sulf'a gelince, silastatin geri kazanımı medullada korteksten daha alakalı görünüyordu, bu da sekonder hasarın dış medullaya ulaşan proksimal tübüllerdeki silastatin etkisi ile bozulduğunu gösteriyor.böbrek hasarıyoğunlaşmıştır [4].
Fosfolipidler, PC'nin ve daha az ölçüde PE'nin baskın olduğu, luminal tarafta daha yüksek PC mevcudiyeti ve sitozolik yaprakçıkta PE'nin daha bol olduğu hücre zarlarında en bol bulunan türlerdir [35,43]. Lizofosfolipidler ise, LPC dahil olmak üzere gliserofosfolipidlerin hidrolizinden üretilebilen sinyal türleridir [35]. Sayısı belirlenen 60 PC, PE ve LPC türünün çoğunun, ya kortekste ya da medullada sisplatin tedavisi ile değiştirildiği, PC ve LPC'nin kortekste daha yüksek miktarda değişiklik gösterdiği, PE ile ilişkili değişikliklerin ise daha fazla olduğu bulundu. ve medullada belirgindir. DeğişikliklerböbrekSisplatin tedavisinin bir sonucu olarak PC, PE veya LPC türleri, daha önce rapor edilen gözlemlerle uyumludur.böbrekAKI sırasında [4,5,26,34,44]. Sonuçlarımız, değiştirilmiş PE, PC ve LPC türlerinin çoğunun hem kortekste hem de medullada sisplatin tarafından azaldığını göstermektedir. Cilastatinin nefroprotektif etkisi ile ilgili olarak, çarpıcı bir şekilde, sisplatin ile değiştirilmiş lipidler için medullada kortekse göre daha yüksek derecede bir kısmi veya tam iyileşme etkisi gözlemlenmiştir. Bir başka ilginç gerçek ise, korteks ve medulladaki tüm bu sisplatin ile artan PC, PE ve LPC türlerinin cilastatin tarafından geri kazanılması, korteksteki sisplatini azaltan türlerin çoğunun, cilastatin ile birlikte tedavi sırasında hala değişmiş olmasıdır. Bu, kortekste sisplatin birikiminin neden olduğu, silastatin tarafından korunmadan kalan ve hücre ölümüne ve ilişkili PC, PE (hücre zarının ana bileşenleri) ve apoptotik cisimlerde LPC salınımına yol açan daha yüksek derecede doğrudan hasarı gösterebilir ve, bu nedenle, seviyelerindeki azalma. Buna karşılık, ekstrinsik apoptoz ve bunun sonucunda proksimal tübüllerde protein dökümü birikimi ile ilişkili ikincil hasar, cilastatin ile korunabilir. Bu, PC, PE ve LPC türlerinin medullada azaldığını ve daha çok sisplatin kaynaklı ikincil hücre hasarı ile ilişkili olduğunu gösterir. Öte yandan, artan PC, PE ve LPC türleri, bu sonuçlara göre, silastatin tarafından korunan ikincil dışsal apoptoz sisplatinin neden olduğu hasarla daha ilgili olabilecek, hücre zarı rejenerasyonu veya sinyal süreçleri ile ilişkili olabilir.
Ek olarak, yüksek oranda doymamış yağ zincirlerine sahip PC ve PE türlerinin yüzdesinde sisplatin kaynaklı bir azalma da gözlendi, bu da lipid peroksidasyon süreçleriyle ilişkili olabilir ve silastatin tarafından azaltılabilir [4,10,11].
Global olarak, burada nicelendirilen lipid türleri içinde, cisplatin ile değiştirilmiş 56 lipidin 26'sında kortekste ve medullada 63 sisplatin ile değiştirilmiş lipidin 50'sinde silastatin iyileştirme etkisi gözlendi. Belki de bu, sisplatin tarafından medullaya kıyasla esas olarak kortekste uygulanan korumasız doğrudan mitokondriyal hasarla ilişkili yüksek derecede lipit değişikliklerini yansıtır ve tüm medullada tespit edilen ikincil hasar koruması ile ilişkili daha fazla lipit değişikliği. Ayrıca, çok değişkenli analiz, hem sisplatin kaynaklı AKI hem de cilastatin için potansiyel yeni lipit biyobelirteçlerinin tanımlanmasına izin verdi.nefro-koruma, Bölüm 2.5 ve 2.6'da açıklandığı gibi CE, Sulf, PE, PC, Cer veya HexCer türleri dahil. Bulgularımıza göre, CE 18:2 ve PE 36:5, sisplatin hasarını ve cilastatini aynı anda ayırt edebilen olası aday biyobelirteçlerdir.nefro-korumahem kortekste hem de medullada. Bununla birlikte, bu iki türün cilastatin ile geri kazanımı kısmi olduğundan, biyolojik belirteçler olarak daha uygun türler kortekste dhHexCer 34:0 ve medullada Sulf 42:{3}} olacaktır, her ikisini de ayırt edebilecektir.böbrek hasarıve silastatin ile sisplatin tarafından değiştirilen seviyelerini kontrol grubunun seviyelerine tamamen geri kazandıran koruma. Bu, herhangi bir Fas/Fas ligand aracılı böbrek hasarı için tahmin edilebilir, ancak gelecekteki çalışmalarda doğrulanmalıdır. Son yıllarda, başlıca proteinler (örneğin, KIM-1 [45] veya NGAL [46]) olmak üzere birçok yeni AKI biyobelirteç önerilmiştir. Sisplatin kaynaklı AKI ve ilişkili silastatin korumasının potansiyel yeni biyobelirteçlerini bulduğumuz gerçeği,böbrekdoku, mevcut bilgileri genişletir ve daha iyi tanı, prognoz ve takip için tamamlayıcı seçenekler sunar. Aslında, biyolojik belirteçlerin saptanmasının bir kombinasyonu, potansiyel olarak, belirli bir nefrotoksik maddenin (cisplatin gibi) veya başka bir nedenin neden olduğu belirli bir AKI'nin bir göstergesi olarak kullanılabilir ve hatta hastalık durumunu/ilerlemeyi ayırt edebilir. Daha ileri bir adım, sonuçlarımızın değişip değişmediğini belirlemek olacaktır.böbreklipid paternleri ayrıca kanda veya idrarda dolaşan lipidlere de yansır. Bu, sisplatin kaynaklı AKI ve cilastatin için biyobelirteç tespiti yapacaktır.nefro-korumahastalarda daha uygundur.
Lipid seviyelerinde sisplatin ile indüklenen AKI ile ilgili değişiklikler çok sayıda ve çeşitlidir ve tam olarak önemli yapısal lipidleri içerir.böbrekyapı: korteks ve medulla. Bu değişikliklerin birçoğunun silastatin tarafından zayıflatılması, iyileştirme için büyük potansiyelini göstermektedir.böbrek fonksiyonuve lipitle ilişkili yapısal değişiklikleri normalize edilmiş birböbrekmorfoloji. Yine, cilastatinin, sisplatinin neden olduğu korunmasız doğrudan hücre hasarını ve Fas aracılı apoptotik yolun cilastatin blokajı ile proksimal tübüllerde bozulabilen birincil hasara bağlı ikincil değişiklikleri ayırt etmede yararlı olduğu kanıtlanmıştır.
Malzemeler ve yöntemler
reaktiflerCilastatin (lütfen Merck Sharp ve Dohme SA, Madrid, İspanya tarafından sağlanmıştır) ve sisplatin (Pharmacia Nostrum (Madrid, İspanya) kullanılmıştır. Yüzde {{0}}%0,9 NaCl solüsyonu (Braun Medical SA, Barselona, İspanya) uygulama için ilaç çözeltilerinin hazırlanması için kullanıldı N-dodekanoil-D-eritro-sfingosilfosforilkolin [SM 30:1 (d18:1/12:0)], D-glukosil- ß-1,10-N-dodekanoil-D-eritro-sfingosin [HexCer 30:1 (d18:1/12:0)], N-dodekanoil D -eritro sfinganilfosforilkolin [dhSM 3{{50}}:0 (d18:0/12:0)], 1,2-dimiristoleoil-sn glisero-3- fosfokolin [PC 28:2 (14:1/14:1)], 1-heptadekanoil-2-hidroksi-sn-glisero-3- fosfokolin [LPC (17:0)] ve 1, 2- dipalmitoleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin [PE 32:2 (16:1/16:1)] Avanti Polar Lipids'ten (Alabaster, Alabama, ABD) satın alınmıştır. D-eritro-sfingosin [Cer 42:1-d7 (d18:1/24:0)], N-stearoil D-eritro-dihidrosfingosin [dhCer (36:0-d3)] ve C16-30-sulfogalaktosilseramid [Sulf 34:1(d18:1/16:0)], Matreya LLC'den (State College, PA, ABD) satın alınmıştır. Kolesterol-d7 (FC-d7) ve kolesteril-d7 palmitat [CE (16:0-d7)] Sigma-Aldrich'tendi.
Eş için metanol (MeOH), asetonitril (ACN) ve izopropanol (iPrOH) (VWR International Eurolab, Barselona, İspanya) ve eş için kloroform, diklorometan ve amonyum dahil HPLC veya LC-MS dereceli çözücüler ve reaktifler özel olarak kullanılmıştır. (NH4COOH) (Sigma-Aldrich, Merck Life Science SL, Madrid, İspanya). Ultra saf su, bir Milli-Q saflaştırma sisteminden (Millipore, Merck Life Science SL, Madrid, İspanya) elde edildi.
Hayvan ModeliYetişkin erkek wistar sıçanları (WKY, Criffa, Barselona, İspanya) Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañón'da (IiSGM, Madrid, İspanya) yetiştirildi. Bunlar kontrollü sıcaklık, ışık ve nem koşullarında, yiyecek ve suya serbest erişim ile tutuldu. Tedaviler, daha önce tarif edildiği gibi [4,11] dört sıçan grubuna (grup başına n=6 hayvan) intraperitoneal olarak uygulandı: Grup 1: Kontrol (CNT)—0.9 yüzde NaCl enjekte edildi. sıçanlar, grup 3 ve 4 için tedavilerle aynı şekilde; Grup 2: Silastatin (CIL)- enjekte edilmiş (günde 150 mg kg 1 vücut ağırlığı (vw)); Grup 3: Cisplatin (CISPL)-enjekte edilmiş (0. günde 5 mg kg 1 canlı ağırlık); ve Grup 4: Cisplatin artı cilastatin (CISCIL)- 0. günde 5 mg kg 1 canlı ağırlık ve cilastatin enjekte edildi (günde 150 mg kg 1 canlı ağırlık). Tedaviye başlandıktan beş gün sonra hayvanlar kurban edildi. Bundan önce, her sıçandan metabolik kafeslerde 24 saatlik idrar toplandı. Kan serumu da santrifüjleme ile izole edildi. 4 °C'de yüzde 0.9 salin solüsyonu ile perfüzyondan sonra böbrekler çıkarıldı, ardından dekapsülasyon yapıldı. Sol korteks ve medullaböbrekve sağın enine kesitli yarısıböbrekeksize edildi, sıvı N2 içinde donduruldu ve son olarak t 80 ◦C'de saklandı. Sağın diğer yarısıböbrekyüzde 4 paraformaldehit içinde sabitlendi ve histolojik çalışmalar için parafine gömüldü.
Histolojik Çalışmalar5 µm sagital sıçan üzerinde hematoksilin/eozin (Sigma-Aldrich, Steinhem, Almanya) boyaması yapıldı.böbrekbölümler. Histolojik inceleme için 20x ve 60x büyütmede mikrofotoğraflar çekmek için ters çevrilmiş bir IX70 mikroskobu (Olympus, Hamburg, Almanya) kullanıldı.
Böbrek Fonksiyon GöstergeleriSerum örneklerinde BUN, kreatinin, sodyum ve potasyum tayini için bir AutoAnalyzer Cobas 711 (Roche, Basel, İsviçre) kullanıldı. GFR hesaplaması için kreatinin klirens oranı kullanıldı. Toplam protein, sülfosalisilik asit yöntemi kullanılarak idrarda belirlendi [47].
Doku Homojenizasyonu Böbrekkorteks ve medulla dokuları (her biri yaklaşık 50 mg), 800 uL lizis tamponu çözeltisi içeren 1.5 mL vidalı plastik tüplere eklendi: 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 125 mM NaCl, 5 mM NaF,1.4 mM Na4O7P2, 1 mM Na3V04 ve proteaz inhibitörü (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, ABD) ve 1.5 mm zirkonyum boncuklar. Dokular bir BeadBug-6 Homojenizatörde (Benchmark D1036-E, Bechmark Scientifific, Sayreville, NY, ABD) 4500 rpm'de, 90 s'lik üç döngüde ayrıştırıldı. Homojenat ayrıca genliğin yüzde 10'unda 40 s sonikasyona tabi tutuldu ve 4 °C'de 1 dakika boyunca 600 x g'de santrifüjlendi. Elde edilen süpernatantan bir kısım, bisinkoninik asit (BCA) protein tahlili (Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL, ABD) ile toplam protein tayini için 1:10 oranında seyreltildi. Protein ekstraktının geri kalanı lipidomik analize kadar t 80 ◦C'de saklandı.
LC-MS/MS ile Lipidomik AnalizFolch yöntemi [48] izlenerek dokulardan lipidler çıkarıldı (250 µg toplam proteine eşdeğer). Daha önce tarif edildiği gibi [49] lipid türlerinin nispi molar kantifikasyonunu elde etmek için lipid ekstraksiyonundan önce on mikrolitre dahili standart (IS) karışımı eklenmiştir. IS-karışımı şunlardan oluşuyordu: CE (16:0-d7), FC-d7, Cer (42:{{10}} d7), HexCer (30 :1), LPC (17:0), PC (28:2), PE (32:2), SM (30:1), dhSM (30:0), dhCer (35:0) ve Sülf (34 :1), Tablo S4'te verilen konsantrasyonlarda. Lipid ekstraktları bir nitrojen akışı altında kurutuldu ve 250 uL asetonitril/izopropanol (1:1, hacim:hacim) içinde yeniden oluşturuldu, 10 dakika sonikasyona tabi tutuldu ve daha sonra bir enjeksiyon şişesine aktarıldı.
Beş mikrolitre lipid özütü, bir LC sistemi Eksigent UltraLC{{0}} (AB-Sciex LLP, Framingham, MA, ABD) üzerine enjekte edildi. Türler, 55 ◦C'de çalışan bir Kinetex C18 kolonu (100 x 2.1 mm, 1.7 um; Phenomenex, Macclesfifield, UK) üzerinde ayrıldı. Çözücü A (su içinde yüzde 60 asetonitril, 10 mM NH4COOH) ve çözücü B (asetonitril içinde yüzde 90 izopropil alkol, 10 mM NH4COOH) ikili bir karışımı ve 12'de yüzde 60 A'dan yüzde 100 B'ye doğrusal bir gradyan kullanılarak elüsyon uygulandı. dakika ve yüzde 100 B'den yüzde 60 A'ya 8 dakikada, 0,4 mL min悆1'lik bir akış hızında. Lipid tespiti için Analyst 1.6.2 yazılımı ile bir QTrap 4000 cihazı (AB-Sciex LLP, Framingham, MA, ABD) kullanıldı. Azot, hem kurutma gazı (T: 500 ◦C, basınç: 30 psi) hem de nebulizasyon gazı (50 psi) olarak kullanılmıştır. Tespit, ESI negatif modunda analiz edilen Sülf hariç tüm lipid sınıfları için elektrosprey (ESI) pozitif modunda ayarlandı. CE ve FC, pozitif iyon modunda atmosferik basınçlı kimyasal iyonizasyon (APCI) kaynağı kullanılarak analiz edildi. Her lipid türü için alıkonma sürelerinde çoklu reaksiyon izleme (MRM) geçişlerini ayarlayan lipid tespiti için hedefli bir yaklaşım kullanıldı (Tablo S5). LC-MS/MS tepe kromatogramları, Skyline yazılım versiyonu 4.1 (MacCoss Lab, Seattle, WA, ABD) [50] kullanılarak işlendi. Lipid türleri, daha önce tarif edildiği gibi, her tür için alan ile lipid sınıfları için IS'nin alanı arasında doğrudan karşılaştırma yapılarak nicelendirildi [49]. Sonuçlar nmol/mg protein olarak ifade edildi. Toplam lipid sınıfı seviyeleri, nicelendirilen bireysel lipid sınıfı türlerinin toplamı olarak belirlendi. Lipid türleri, önerilen gösterime göre belirlendi [51].
İstatistiksel analizDeğerler ortalama ± standart sapma olarak ifade edildi. Tanımlayıcı istatistikler ve gruplar arası değişkenlerdeki istatistiksel farklılıkları varyans analizi ile değerlendirmek için SPSS 11.5 (SPSS, Chicago, IL, ABD) kullanıldı. Lipid değişkenlerinin iki eşlenmemiş grup karşılaştırması için, normallik testinden (Shapiro-Wilk) sonra parametrik (iki kuyruklu eşleştirilmemiş Student's t) veya parametrik olmayan (Mann-Whitney) testler yapıldı. Benjamini-Hochberg yöntemi, çoklu lipid bireysel türlerini karşılaştırırken p değerlerinin yanlış keşif oranı (FDR) düzeltmesi için kullanıldı. İki taraflı bir p değeri < 0.05="" ve="" fdr="">< 0.1,="" potansiyel="" biyobelirteç="" adaylarını="" kaçırmamak="" için="" istatistiksel="" olarak="" anlamlı="" farklılıkların="" tanımlanması="" için="" kabul="" edildi.="" x="" grubunun="" y="" grubuna="" karşı="" kat="" değişimi,="" ilgili="" x:y="" gruplarının="" değişkenleri="" için="" ortalama="" değerlerin="" oranı="" olarak="">
Çok değişkenli veri analizi (MVDA), SIMCA sürüm 14.1 (MKS Umetrics, Uppsala, İsveç) ve MetaboAnalyst 5.0 (https://www.metaboanalyst.ca (30 Eylül'de erişildi) kullanılarak yapıldı. {{20}}21)) [52], denetlenmeyen PCA ve denetlenen OPLSDA dahil. Eksik değerler, k-en yakın komşular yöntemi kullanılarak değiştirildi. Değişkenler, MVDA'dan önce log-transforme edilmiş ve pareto-ölçeklendirilmiştir. Modeller R2 ve Q2 değerlerine göre değerlendirilmiştir. OPLS-DA, permütasyon testi (100 döngü) ile doğrulandı. OPLS-DA modellerinden VIP puanları ve S-grafikleri, CISPL'e karşı CNT, CISCIL'e karşı CNT ve CISCIL'e karşı CISPL grup ayrımcılığındaki ilgili değişkenleri belirlemek için kullanıldı. VIP > 1 ile eş zamanlı uyumluluk, yüklemeler korelasyon katsayısı |p(corr)| İki grup karşılaştırması için > 0,5 ve iki taraflı p değeri < 0.05="" ve="" fdr="">< 0.1,="" potansiyel="" biyobelirteç="" seçimi="" için="" kullanılan="" kriterlerdi.="" auc="" değerleri,="" roc="" eğrisi="" grafiklerinden="" elde="">
PatentlerAşağıdaki patentler kısmen bu el yazmasında sunulan çalışma ile ilgilidir: "Çeşitli bileşiklerin nefrotoksisitesini azaltmak için silastatin kullanımı" (patent numaraları EP2,143,429 B1; US 9,216,185 B2; US 9,522,128 B2; ve US9,757,349 B2). Bunlar Fundación para la Investigación Biomedica Hastanesi Gregorio Marañón'a (FIBHGM) atanmıştır ve FIBHGM tarafından Telara Pharma SL'ye lisanslanmıştır Telara Pharma SL şu anda Arch Biopartners ile bir lisans anlaşması yapmıştır.
