Hipofiz Dışı Yerel Büyüme Hormonu Yaşlanma İle İndüklenir ve Epitel Hasarını Kolaylaştırır

Lütfen iletişime geçinoscar.xiao@wecistanche.comdaha fazla bilgi için

ÖZET

Yaşa bağlı DINA hasarını modüle eden mikro çevresel faktörler belirsizdir. Hipofiz dışı büyüme hormonu (np), insan kolonunda, dönüştürülmemiş insan kolon hücrelerinde ve fibroblastlarda ve yaşa bağlı DNA hasarı olan 3-boyutlu bağırsak organoidlerinde indüklenir. Otokrin/parakrin npGH, p53'ü baskılar ve TRIM29'u indükleyerek ve ATM fosforilasyonunu azaltarak DNA hasar yanıtını (DDR) hafifletir, bu da DNA onarımının ve DNA hasar birikiminin azalmasına yol açar. 4 aya kadar kültürlenen organoidler, yaşlanma belirteçleri, p16 ve SA- -galaktosidaz ve azalmış telomer uzunluğunun yanı sıra artan npGH, baskılanmış p53 ve zayıflatılmış DDR ile DNA hasarı birikimi sergiler. Yaşlı organoidlerde GH'nin baskılanması, p53'ü arttırır ve DNA hasarını azaltır. WT fareleri yaşa bağlı kolon DNA hasarı birikimi sergilerken, kolon GH sinyalinden yoksun yaşlı farelerde, yüksek p53 ile DNA hasarı düşük kalır. Yaşa bağlı npGH indüksiyonu, proliferatif bir mikro ortamı mümkün kıldığı için, npGH sinyalini ortadan kaldırmak, DNA hasarını ve yaşa bağlı patolojileri engelleyerek yaşlanma karşıtı tedavi olarak hedeflenebilir.

GİRİİŞ

Yaşlanmayla birlikte artan yaşa bağlı hastalıklarla birlikte biyolojik işlevler azalır.flavonoidlerYaşa bağlı patolojiler, birikmiş DNA hasarı ve mutasyonlara ve yaşa bağlı kromozomal anormalliklere neden olan DNA onarımındaki eksikliklerden kaynaklanır. Kalıcı DNA hasarı ayrıca hücre proliferasyonunu bloke ederek yaşlanma ve apoptoza neden olarak yaşlanma sürecini daha da hızlandırabilir (Ou ve Schumacher, 2018). DNA hasarı, çift iplikli DNA kırılmalarının (DSB'ler) bir belirteci olan artan fosforile histon 2A varyantı (yH2AX) ile kanıtlandığı gibi, vahşi tip (WT), dönüştürülmemiş insan ve murin hücrelerinde yaşla birlikte birikir (Sedelnikova ve ark., 2004) ve onarılmamış DNA hasarı (Dolle ve diğerleri, 1997; Hasty ve diğerleri, 2003; Lombard ve diğerleri, 2005; Petr ve diğerleri, 2020). Kusurlu DNA hasarı onarımından kaynaklanan genomik kararsızlık, hücresel dönüşümü destekleyebilir (Negrini ve diğerleri, 2010). DNA hasarı, tek zincirli DNA kırıklarının ve DSB'lerin onarımından sorumlu ataksi-telanjiektazi mutasyonlu (ATM) genlerinin fosforilasyonunu tetikler. ATM, tümör baskılayıcı p53'ü fosforile eder ve stabilize eder, böylece birkaç DNA onarım yolunu kolaylaştırarak DNA hasarı onarımını sağlar. Bu nedenle ATM, hem DNA hasar tepkisini (DDR) hem de DNA onarımını aktive etmede kilit bir rol oynar (Ou ve Schumacher, 2018).

Daha fazla bilgi için lütfen buraya tıklayın

ATM ekspresyonu ve aktivitesi yaşla birlikte bozulur (Feng ve diğerleri, 2007; Gutierrez-Martinez ve diğerleri, 2018), muhtemelen yaşa bağlı fonksiyonel p53 kaybına neden olur ve birikmiş DNA hasarına ve kromozomal kararsızlığa yol açar (Simon ve diğerleri, 2009) Radyasyon gibi stresörlere karşı .p53 tepkileri, yaşlı farelerde (Feng ve diğerleri, 2007) ve yaşlı bireylerden türetilen insan dermal fibroblastlarında (Goukassian ve diğerleri, 2000) daha düşüktür. Bu nedenle, yaşlanmanın ayırt edici özellikleri arasında, tümü epitelyal proliferasyon için uygun bir ortam sağlayan, birikmiş onarılmamış DNA hasarı ile azalmış DDR aktivitesi ve p53 baskılanması yer alır (Lopez-Otin ve diğerleri, 2013).

Hipofiz büyüme hormonu (GH) salgılanması yaşla birlikte azaldığından, değişen GH sinyali yaşlanma sürecine dahil edilmiştir (Ho ve Hoffman, 1993). Bununla birlikte, bir dizi kanıt, GH zayıflamasının yaşlanma üzerindeki yararlı etkilerini desteklemektedir. ve insan hastalık modellerinde (Brown-Borg ve diğerleri, 1996; Junnila ve diğerleri, 2013), GH eksikliğinin yararları, öncelikle artan insülin duyarlılığı, azalmış hepatik protein oksidasyonu dahil olmak üzere yaşam süresini uzatan ikincil faktörleri destekleyen gözlemlerden kaynaklanmaktadır. , azalan kanser insidansı ve azalan yaşa bağlı inflamasyon (Aguiar-Oliveira ve Bartke,2019; Bartke,2016; Junnila ve diğerleri,2013; Spadaro ve diğerleri,2016). çevreyle uyumlu kontrollerden daha düşük entegre dolaşımdaki GH seviyelerine sahipken (van der Spoeletal.,2016), GHexcess akromegali hastalarında görüldüğü gibi yaşam süresini kısaltır (Chesno-kova ve diğerleri,2019a; Melmed,2020; Waters ve Barclay,200 7) ve GH'yi aşırı ifade eden transgenik fare modellerinde (Bartke, 2003).hesperidin kullanırBazıları, insanlarda (He ve diğerleri, 2014; Samaras ve Storms, 1992) ve köpeklerde (Greer ve diğerleri, 2007) boy ve uzun ömür arasında negatif bir ilişki olduğunu öne sürdüler. kısmen birikmiş DNA hasarına atfedilebilir(Ches-nokova ve Melmed,2020). Bu önermeyi desteklemek için, akromegali hastalarından elde edilen lenfositler, artan kromozomal anormalliklerle birlikte DNA hasarı sergiler (Bayram ve diğerleri, 2014), bir zebra balığı akromegali modelinin karaciğerinde onarılmamış DNA hasarı birikir (Elbialy ve diğerleri, 2018). Yüksek dolaşımdaki GH seviyeleri, murin kolon DNA onarımını zayıflatarak DNA hasarı birikimini tetiklerken, insan kolon hücrelerinde ve iptal edilmiş GHR sinyaline sahip farelerde GH reseptörünü (GHR) bloke ettikten sonra DNA hasarı hafifletilir (Chesnokova ve diğerleri, 2019a).

Periferik dokularda lokal olarak sentezlenen hipofiz dışı GH (np), hipofiz tarafından üretilen endokrin GH1 ile aynıdır ve hem hipofiz GH hem de npGH ligandlarını tanıyan yaygın olarak ifade edilen GHR (Ballesteros ve diğerleri, 2000) aracılığıyla otokrin/parakrin mekanizmaları aracılığıyla etki eder ( Waters ve Barclay, 2007; Waters ve diğerleri, 2006).kayıp imparatorluk cistancheDDR aktivasyonu npGH'yi indüklediğinden (Chesnokova ve diğerleri, 2013), yaşa bağlı birikmiş kolon DNA hasarının npGH ekspresyonunu indüklediğini ve bunun da DNA hasar onarımını daha da kısıtlayacağını varsaydık.

Cistanche yaşlanmayı geciktirebilir

Yaşlanmayı yansıtan hem in vitro hem de ex vivo insan modellerini kullanarak, burada artan H2AX fosforilasyonunun (yH2AX) kanıtladığı gibi, npGH'nin indüklendiğini ve yaşlı insan dokularında DNA hasarının biriktiğini gösteriyoruz. Ayrıca, yaşlı WT farelerinde kolon DNA hasarı önemli ölçüde artarken, epitelyal DNA hasarı, GH sinyalinden yoksun yaşa uygun GHR-- farelerde ve kolona özgü GHR nakavt farelerde (GHRcolKO) düşük kalır.

Lokal npGH, indüklenmiş insan pluripotent kök hücrelerinden (iPSC'ler) üretilen yaşlı 3-boyutlu (3D) testis içi organoidlerde de indüklenmiştir (Barrett ve diğerleri, 2014; Chesnokova ve diğerleri, 2019a). Organoid npGH, sırayla, p53'ü bastırdı ve DNA hasar onarımını zayıflattı.mikronize saflaştırılmış flavonoid fraksiyonu 1000 mg kullanırnpGH'nin etkileri muhtemelen parakrindi, çünkü GH eksprese eden fibroblastların insan kolonoidleri ile gömülü Kolon Bağırsak-Çip mikroakışkan cihazları ile birlikte kültürlenmesi, bastırılmış p53/p21'e ve arttırılmış DNA hasarına yol açtı. Buna karşılık, yaşlı organoidlerde GH'nin baskılanması DNA hasarını önledi.

Böylece, yaşlanma sırasında epitelyal npGH'nin güçlü bir şekilde indüklendiğini ve npGH'nin DNA onarımını azalttığını ve yaşa bağlı DNA hasarı birikimini kolaylaştırdığını gösterdik. Genel olarak, sonuçlar lokal kolon epitelyal npGH'nin bir mukozal alan değişikliğini tetiklediğini ve yaşlanan dokuda neoplastik gelişim için uygun olan bir kromozomal instabilite ortamı yarattığını göstermektedir.

Önemli olarak, yaşlanma süreci üzerinde zorlayıcı bir etkisi olmamasına rağmen, GH'nin "yaşlanma karşıtı" bir hormon olarak yaygın bir şekilde uygunsuz kullanımı olmasına rağmen (Blackman ve diğerleri, 2002; Clemmons ve diğerleri.. 2014; Lieut diğerleri, 2007; Melmed,2019), sonuçlarımız yerel GH sinyalinin doku mikroçevresine katkıda bulunduğunu ve yaşa bağlı patolojilerin gelişimini desteklediğini göstermektedir. Olumsuz epitelyal DNA hasarını sınırlamak için lokal npGH sinyalini bastırmak, bu nedenle, bir anovülan yaşlanma terapötik hedef sunabilir. Bu çalışmaların sonuçları, yaşam süresinin uzatılmasına yönelik yenilikçi bir yaklaşımı bilgilendirmektedir (yani, yerel GH sinyalinin uyarılmasından ziyade bastırılması). SONUÇLAR

İnsan kolon DNA hasarı ve npGH yaşlanma ile birikir

Yaşa bağlı DNA hasarı, 3 yaş grubunu kapsayan hasta kohortlarından elde edilen tümörlü olmayan insan kolon parafin doku örneklerinde değerlendirildi: genç (18-39 yıl), orta yaşlı (40-60 yıl) ve yaşlı ( {{6 yıl). yH2AX için puanlandığında, genç kohorttaki 11 numuneden 3'ü (yüzde 27) DNA hasarı, 16'dan 8'i (yüzde 50) orta yaşta DNA hasarı sergiledi ve 18 yaşlı numuneden 8'i (yüzde 45) DNA hasarı sergiledi (Şekiller). 1A-1C ve 1J).

Daha önce DNA hasarının npGH'yi indüklediğini gösterdiğimiz gibi (Chesnokova ve diğerleri, 2013), yaşa bağlı DNA hasarı birikiminin tümörlü olmayan kolon dokusunda GH ekspresyonu ile ilişkili olup olmadığını belirlemeye çalıştık. Nöroendokrin kolon hücrelerinde hiçbir ifade edilmediğinden(Chesnokova ve diğerleri, 2016), bu hücreleri analizden çıkardık.

Epitelyal GH ekspresyonu, orta yaşlı ve yaşlı kohortlardan (sırasıyla 38 ve 42 numune) elde edilen normal kolon numunelerinin yüzde 16'sında -17, ancak genç kohortun sadece yüzde 2'sinde (37 numune) tespit edilirken, Orta yaşlı kohortta GH ekspresyon skoru arttı ve yaşlı kohort örneklerinde daha da arttı (p<0.01) (figures="" 1d-1f="" and="" 1k).="" furthermore,="" colon="" mrna="" gh="" expression="" increased="" in="" both="" middle-aged="" (30%="" of="" 10="" samples)="" and="" aged="" (26%="" of="" 14="" samples)="" versus="" young="" cohort="" samples(17%="" of9=""><0.01 and=""><0.05, respectively)(figures="" 1g-1).="">ot flavonoidÖzetle, bu sonuçlar, yaşlanan kolonda indüksiyon olmaksızın DNA hasarı birikimine işaret etmektedir.

DDR aktivasyonu, yerel npGHin murin ve insan kolonunu indükler

Daha sonra, aktive edilmiş DDR'nin lokal kolon npGH ekspresyonunu tetikleyip tetiklemediğini ve p53'ü stabilize etmek için fareleri nutlin3 ile tedavi edip etmediğini (Vassilev ve diğerleri, 2004) ve indüklenmiş kolon p53 ve yukarısını gözlemledik (Şekil 2A). Ek olarak, aynı hastalardan elde edilen kolon adenokarsinom örneklerinde DNA'ya zarar veren tedavilerden önce ve sonra (Tablo S1), çalışılan 6 hasta örneğinin tümünde tedavi öncesi bazal epitelyal npGH ekspresyonu ve tedaviden sonra artan npGH ekspresyonu gözlemledik (p<0.01) (figure="" 2b).="" enhanced="" gh="" expression="" was="" also="" observed="" in="" tumor-associated="" fibroblasts="" after="" dna="" damage(figure="" 2c),="" indicating="" that="" these="" findings="" are="" likely="" not="">

DDR, GH ekspresyonunu in vitro olarak aktive eder

Hem tek zincirli DNA kırılmaları hem de DSB'ler (Walles ve diğerleri, 1996) üretmek ve DDR'nin in vitro olarak GH'yi aktive edip etmediğini belirlemek için topoizomeraz II inhibitörü etoposidi kullandık. NCC, hNCF ve HCT116insan kolon adenokarsinom hücrelerinde DNA hasarına bağlı npGH (Şekil 3A ve S1A-S1C); organoidlerde, etoposide bağlı GH ve GH mRNA'sı(Şekil 3B ve S1D), IGF1 ve prolaktin mRNA seviyeleri değişmemiştir (Şekil S1E). Bir aşağı akış GH sinyali olan STAT5 fosforilasyonu (Waters, 2016), tüm hücre tiplerinde indüklendi (Şekil 3A-3C ve S1A-S1C). Buna karşılık, npGH'nin GH küçük enterferans yapan RNA (siRNA) ile iptal edilmesi, etoposidin pSTAT5'i indüklemesini önledi (Şekil 3C ve S1F), DNA hasarının neden olduğu kolon npGH'nin fonksiyonel olarak aktif olduğuna dair kanıt sağladı. 24 saat boyunca etoposid ile tedavi edilen NCC'nin görüntülenmesi, çoklu hücrelerde GH ve yH2AX birlikte ekspresyonu gösterdi (Şekil 3D).

DNA hasarına maruz kalan epitel hücreleri GH salgılar İndüklenmiş hücre içi npGH'nin otokrin/parakrin etkiler gösterip göstermediğini belirlemek için, etoposid tedavisinden sonra NCC ve organoid kültür ortamına salgılanan GH seviyelerini değerlendirdik. Tedaviden 8 ve 24 saat sonra ANCC'den ve tedaviden 4-48 saat sonra organoidlerden toplanan ortam, DDR aktivasyonundan sonra zamana bağlı GH artışları gösterdi (Şekil 3E). NCC ve organoidler, insan kolon dokusunda olduğu gibi GH reseptörlerini eksprese ettiğinden (Chesnokova ve diğerleri, 2016), bu sonuçlar, DNA hasarına yanıt olarak indüklenen lokal GH'nin, yaşlanan dokuyu otokrin/parakrin etkilerine maruz bırakabileceğini düşündürmektedir.

Otokrin/parakrin GH, insan kolon hücresi p53'ü baskılar

Endokrin GH, murin kolonu p53'ü baskıladığından (Chesnokova ve diğerleri, 2016), yerel GH'nin insan epitelyal kolon hücrelerinde benzer au-otokrin/parakrin etkileri gösterip göstermediğini belirledik. hGH ile nükleofection veya lentivirüs eksprese eden GH (lenti-GH) (Şekil 4A, 4B ve S2) ile enfeksiyondan sonra iki farklı hastadan türetilen iki ayrı NCC hattının analizi ve ayrıca stabil olarak hGH eksprese eden organoidler (Şekil 4C) baskılanmış gösterdi p53 ve eşlik eden aşırı ekspresyon. Bromodeoksiüridin (BrdU) ile darbeli lenti-GH veya boş vektör (lenti-V) ile enfekte olmuş organoidlerden türetilen hücreler, p53 baskılaması gösterdi, ardından floresanla aktive olan hücre sınıflandırması (FACS) ile değerlendirilen mütevazı ancak önemli ölçüde artan BrdU katılımı gösterdi (Şekil S3A). Buna karşılık, küçük firkete GH (GH) eksprese eden lentivirüs ile GH baskılaması, NCC'de koloni oluşumunun ve koloni boyutunun azalmasına yol açtı (Şekil S3B ve S3C), literatür yanlısı npGH eylemlerini gösterir.

İnsan Kolon Bağırsak Çipinde Parakrin GH etkileri npGH'nin bağırsak mukozal epitel hücreleri üzerindeki parakrin etkilerini değerlendirmek için, lenti-GH ile enfekte olmuş UNCF ve sağlıklı kolonik ile tohumlanmış Kolon Bağırsak-Çip mikroakışkan cihazları (Kasendra ve diğerleri, 2020) birlikte kültürledik. 8 gün boyunca organoid kaynaklı epitel hücreleri. Ortama hNCF'den yerel GH salgılanması, ELISA (338ng/mL/1×10 derece hücreler) ile doğrulandı.5-Etinil-2'-deoksiüridin （EdU） （20 μM） 7. günde eklendi , çipler 24 saat sonra sabitlendi ve EdU ve H2AX için boyandı ve EdU artı çekirdekler epitel hücrelerinde sayıldı. Ayrı bir dizi cips ekildi

Western blot ile p53/p21'i değerlendirmek için epitel hücreleri ile kullanıldı. Çip epitel hücrelerinin proliferasyonu arttı (p<0.05), likely="" due="" to="" decreased="" p53="" and="" p21="" (figures="" 4d="" and="" 4e).="" moreover,="" dna="" damage="" accumulation="" was="" evident,="" with="" increased="" numbers="" of="" cells="" expressing="" γh2ax="" （p=""><0.01） （figure="">

Otokrin/parakrin GH DDR'yi bastırır

DNA hasarı üzerine ATM'nin aktivasyonu, DDR'yi etkinleştirmek ve onarımı desteklemek için hasarlı DNA bölgelerini işaretleyen H2AX'ı fosforile eder (Turinetto ve Giachino, 2015). ATM ayrıca p53'ü fosforile ederek DNA onarımını daha da artırır (Blackford ve Jackson 2017). hNCC'de ve ayrıca pIRES2-ZsGreen1hGH veya mercimek-GH ile enfekte olmuş organoidlerde, GH aşırı ekspresyonu, her ikisi de DNA onarımında yer alan ATM ve DNA-protein kinaz (PK)cs'nin fosforilasyonunu bastırdı (Blackford ve Jackson. 2017) ve hedef protein p53'ün fosforilasyonunun azalması (Şekil 5A-5C).

Tip60 histon asetilaz, ATM'yi aktive eder(Jackson ve Bartek, 2009) ve TRIM29 tarafından negatif olarak düzenlenir (Sho ve diğerleri, 2011; Sun ve diğerleri, 2005). NCC'de ve organoidlerde GH aşırı ekspresyonunun ayrıca TRIM29 indüksiyonu ile sonuçlandığını ve bunun da Tip60'ı baskıladığını gözlemledik (Şekil 5A-5C). Benzer sonuçlar, GH eksprese eden bir plazmit ile nükleofeksiyondan 48 saat sonra ve lenti-GH ile enfeksiyondan 6 gün sonra ikinci NCC hattında gözlendi (Şekil S4A ve S4B).

Otokrin/parakrin GH DNA onarımını azaltır

Daha sonra DSB onarım mekanizmaları, özellikle hataya açık homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ)(Jackson ve Bartek, 2009) ve hatasız homolog rekombinasyon (HR) (Beucher ve diğerleri, 2009) üzerindeki etkileri ölçtük. ; Blackford ve Jackson, 2017; Chapman ve diğerleri, 2012). NHEJ ve HR raportör kasetlerini stabil bir şekilde eksprese eden NCC'yi pcDNA3 ile nükleofekte ettik.1-insan GH1 (hGH1) plazmitleri, I-Excel endonükleazını kodlayan bir plazmit ile birlikte transfekte ederek DSB'leri indükledik ve DSB onarım raportörlerinin yeniden birleşmesini ölçtük. Transfeksiyon verimliliği, DsRed'i kodlayan plazmit ile birlikte transfekte edilerek kontrol edildi (Seluanov ve diğerleri, 2010). pcDNA3'ten sonra NHEJ verimliliği.1-hGH1 nükleofection 0.77-0.83 idi ve 48 saat(p)'de azaldı<0.05)(figure5d), and="" hr,while="" low(0.05),="" consistent="" with="" other="" reports="" (chitnis="" et="" al,2014;gatei="" et="" al.,2011),showed="" consistently="" decreased="" efficiency="" by="" up="" to="" 38.7%±3.5%="" (n="4" independent=""><0.05) at="" 72="">

Otokrin/parakrin GH onarılmamış DNA hasarını artırır

npGH'nin DNA hasarını artırıp artırmadığını inceleyerek, lenti-GH ile stabil bir şekilde transfekte edilmiş NCC ve organoidlerin Comet tahlili ile ölçüldüğü gibi endojen onarılmamış DNA hasarında artış gösterdiğini gözlemledik (p< 0.05)="" (lee="" and="" paull,="" 2007)(figures="" 5e="" and="" 5f).="" levels="" of="" unrepaired="" dna="" were="" also="" markedly="" increased="" in="" a="" second="" ncc="" line="" in="" cells="" nucleofected="" with="" a="" plasmid="" expressing="" gh="" or="" infected="" with="" lenti-gh="" (figures="" s4c="" and="" s4d).="" overall,="" these="" results="" show="" that="" npgh="" is="" induced="" in="" response="" to="" dna="" damage="" and="" enhances="" dna="" damage="" accumulation="" by="" interfering="" with="" both="" ddr="" and="" dna="" repair="">

GH, yaşlı 3D insan bağırsak organoidlerinde indüklenir ve DDR'yi zayıflatır

Yaşlı insan kolon örneklerinde gözlenen artan GH ekspresyonu ve DNA hasarının ardından, yaşlanan insan dokusunun bir modelini özetlemek için üç bağımsız iPSC hattından üretilen organoidleri "yaşlandırdık". Bu organoidler enterositler, kadeh hücreleri, Paneth hücreleri ve enteroendokrin hücrelerden oluşur ve kaudal tip homeobox 2'yi(CDX2) ifade eder(Barrett ve diğerleri..2014; Gao ve diğerleri,2009; Workman ve diğerleri,2017). Üç iPSC hattından ikisi (hat 1 ve 3) 60 yaşından büyük bireylerden elde edildi ve üçüncü iPSC hattı (satır 2), 30-yaşındaki bir bireyin fibroblastlarından elde edildi. Hat 1 ve 3'ten üretilen organoidler 2 aya kadar kültürlendi, bu noktada hücre proliferasyonu önemli ölçüde yavaşladı. Buna karşılık, 2. hattan üretilen organoidler, kültürde 4 aya kadar sağlam bir şekilde çoğaldı. Hücresel yaşlanma, artan p16 ve ayrıca azalan telomer uzunluğu (p<0.05)(figures 6a="" and="" 6b).="" in="" aged="" organoids,="" we="" also="" found="" increased="" senescence-associated="" β-galactosidase="" (sa-β-galactosidase)="" activity,="" which="" has="" been="" shown="" to="" increase="" with="" age="" (kurz="" et="" al.,="" 2000;="" lee="" et="" al.,="" 2006),="" as="" well="" as="" increased="" β-galactosidase="" protein="" expression,="" which="" correlates="" with="" sa-β-galactosidase="" enzymatic="" activity(figures="" 6a="" and="">

Bu in vitro organoid özelliklerin, yaşlanan insan dokusuyla uyumlu hücresel değişiklikleri aslına uygun olarak özetlediği göründüğünden (Baker ve diğerleri,2011;Lieut diğerleri,2019; Lopez-Otin ve diğerleri,2013), bunu kullandık. İnsan kolon epitel yaşlanmasının altında yatan sinyal mekanizmalarını daha fazla incelemek için bir model. 1. satırda, GH mRNA seviyeleri kültürde 1 ay sonra indüklendi ve 2 ay sonra daha da arttı (p < 0.05)(şekil="" 6c),="" bu="" hem="" western="" blot="" hem="" de="" immünohistokimyada="" (ihc)="" yaşlı="" organoidlerde="" görülen="" önemli="" ölçüde="" artan="" npgh="" ile="" tutarlıdır.="" (şekil="" 6d,="" 6e="" ve="" s5b).="" yh2ax="" ayrıca="" uzun="" süreli="" kültür="" ile="" güçlü="" bir="" şekilde="" indüklendi,="" bu="" da="" in="" vitro="" yaşlanma="" ile="" birikmiş="" endojen="" dna="" hasarını="" gösterir.="" ncc'de="" bastırılmış="" p53'ü="" ve="" gh="" ile="" transfekte="" edilmiş="" organoidleri="" gösteren="" sonuçlarla="" tutarlı="" olarak="" (şekil="" 4a-4c),="" 1="" ve="" 2="" aylık="" kültürde="" baskılanmış="" p53'ü,="" artan="" npgh="" ile="" uyumlu="" olarak="" gözlemledik="" (şekil="" 6e="" ve="" s5b).benzer="" sonuçlar="" (="" a="" ve="" b)="" (a)="" ancc,="" hncf="" ve="" hct116="" hücrelerinin="" ve="" (b)="" organoidlerinin="" western="" lekesi.="" hücreler,="" belirtilen="" dozlarda="" etoposid="" ile="" muamele="" edildi="" ve="" 24="" saat="" sonra="" analiz="" edildi.="" organoidler="" 3="" um="" etoposid="" (etop)="" ile="" tedavi="">

(C) 24 saat boyunca kontrol olarak GH siRNA (siGH RNA) veya karıştırılabilir RNA (Scr RNA) ile nükleofected NCC, belirtilen dozlarda etoposid (Etop) ile tedavi edildi ve 24 saat sonra analiz edildi. Western blotların ImageJ niceliği, Şekil S1'de gösterilmektedir.

（D） 24 saat boyunca 20 μM etoposid ile tedavi edilen NCC'nin temsili görüntüsü. GH, kırmızı; yH2AX, yeşil; falloidin, gri; DAPI, mavi. Parlak yeşil bir çekirdek apoptozu gösterir. Ölçek çubuğu, 20 um. Kontrol, işlenmemiş hücreler.

(E) Sırasıyla 20 veya 5 uM etoposid ile muamele edilmiş ANCC ve organoidlerin kültür ortamında GH'nin batı lekesi. Ortam, işlemden 8 ve 24 saat sonra ısıdan ve 4-48 saatte organoidlerden toplandı. Ponceau, yükleme kontrolü olarak kullanıldı. En az 3 bağımsız deneyden temsili lekeler gösterilmektedir.

sırasıyla 4 ve 2 ay boyunca iPSC hatları 2 ve 3'ten üretilen organoidlerin kültürlenmesiyle elde edildi (Şekil S6A-S6D).

Ayrıca, yaşlı organoidlerde artan npGH, hem ATM hem de DNA-PKcs'nin baskılanmış fosforilasyonu ve daha düşük fosforlanmış p53 seviyeleri ile zayıflatılmış DDR ile ilişkilendirildi (Şekil 6E ve S5B). Bu sonuçlar, bastırılmış DDR aktivitesinin, yH2AX indüksiyonunun da gösterdiği gibi, birikmiş onarılmamış DNA hasarına yol açtığını göstermektedir (Şekil 6E ve S5B). Kültürde 2 ay sonra, GH shRNA ile enfekte olmuş yaşlı organoidler, Comet testi ile ölçülen artan p53(Şekil 6F ve S7A) ve DNA hasarında azalma gösterdi (p<0.01)(figure 6g),="" indicating="" a="" requirement="" for="" npgh="" in="" age-related="" dna="" damage="" accumulation="" in="" this="">

GH sinyal eksikliği, yaşlanan farelerde in vivo kolon DNA hasarını azaltır

Yaşlı organoidlerde elde ettiğimiz sonuçları doğrulamak için yaşlı WT ve GHR-7 farelerini in vivo olarak inceledik. Kolon DNA hasarı, yaşlı (24-aylık) ile genç (3-aylık) WT farelerinde önemli ölçüde arttı(p<0.01), but,="" strikingly,="" was="" not="" increased="" in="" aged="" ghr-mice="" (figures="" 7a="" and="" s7b),="" likely="" due="" to="" p53="" in-duction.="" we="" also="" generated="" transgenic="" mice="" with="" colon-specific="" ghr="" excision="" (car1-cre/ghr"loxmox,="" ghrcolko)(figure="" s7d).="" control="" mice="" were="" derived="" from="" the="" same="" breeding,="" but="" they="" did="" not="" harbor="" the="" cre="" enzyme.="" colon="" dna="" damage="" was="" much="" reduced="" in="" 20-month-old="" male="" ghrcolko="" mice="" with="" ghr="" excision="" compared="" to="" control="" mice,="" but="" not="" in="" the="" small="" intestine="" with="" intact="" ghr(figure="" 7d).="" thus,="" it="" appears="" that="" dna="" is="" repaired="" more="" efficiently="" in="" mice="" devoid="" of="" gh="" signaling,="" likely="" due="" to="" the="" higher="" colon="" p53="" expression="" we="" observed="" in="" both="" ghr-/-and="" in="" ghrcolko="" animals(figures="" 7b,7c,="" 7e,="" s7c,="" and="" s7e).="" these="" in="" vivo="" results="" buttress="" our="" hypothesis="" that="" npgh="" en-hances="" age-associated="" colon="" dna="" damage="">

TARTIŞMA

Burada npGH'nin insan kolon dokusunda ve 3D insan bağırsak organoidlerinde yaşla birlikte arttığını gösteriyoruz. Yaşlı insan kolon dokusunda, npGH'nin, epitelyal tümörlü olmayan hücreler, normal kolon fibroblastları, organoidler ve DNA'ya zarar veren terapiler uygulanan hastaların kolon kanseri dokusu dahil olmak üzere insan modellerinde gözlemlendiği gibi, DNA hasarı tarafından indüklendiğini gösteren birkaç kanıt gösteriyoruz. ; aynı zamanda, aktive edilmiş DDR'li farelerin kolonlarında in vivo olarak da benzer bulgular gösteriyoruz.

3D insan bağırsak organoidlerini kullanarak, tümü insan dokusundaki yaşa bağlı değişikliklerle tutarlı olarak artan p16, yaşlanma ve telomer kısalması gözlemledik (Baker ve diğerleri, 2011; Liu ve diğerleri, 2019; Lopez-Otin ve diğerleri, 2013). ). Organoid modelin sınırlamalarına rağmen, sonuçlarımız bağırsak organoidlerini, yaşa bağlı kolon değişikliklerinin altında yatan sinyal mekanizmalarını incelemek için sadık bir insan özeti olarak desteklemektedir (Hu ve diğerleri, 2018).

Otokrin/parakrin tarzında hareket eden yerel npGH'nin p53'ü baskıladığını ve komşu hücre çoğalmasını arttırdığını bulduk. İndüklenmiş GH ayrıca DDR ve DNA onarımını baskılayarak DNA hasarı birikimini daha da artırır. Sonuçlar ayrıca GH salgılayan insan hipofiz tümörlerinde DNA hasarı birikimi üzerinde gözlemlenen etkilerle de tutarlıdır (Ben-Shlomo ve diğerleri, 2020).

Normal kolon dokusundaki GH eylemleri, yaşa bağlı artan kolon polip oranlarının altında yatan proliferatif bir ortamın gelişimini desteklemektedir; yaşla ilişkili DNA hasarı ve kromozomal instabilite ile yaşla ilişkili hastalarda kolon kanseri prevalansının itici güçleri olarak görülmektedir. 50 yıl (Aunan ve diğerleri, 2017). Burada gösterdiğimiz yaşa bağlı artan DNA hasarı, normal kolon örneklerinde yH2AX'in yaşla doğrusal olarak arttığına dair raporlarla da tutarlıdır (Risques ve diğerleri, 2008). Yaşlanan organoidlerde gözlemlenen yH2AX'in belirgin şekilde düzenlenmesi, DNA hasar birikiminin göstergesidir, çünkü yH2AX, DNA onarım proteinlerini çekmek için DNA hasar bölgelerini işaretler (Turinetto ve Giachino, 2015). Bu sonuçlar, yaşlanan hücrelerde indüklenen GH'nin H2AX fosforilasyonunu baskıladığı gerçeğiyle görünüşte tutarsız olabilir. Bununla birlikte, bu gözlemleri, GH'nin ATM'nin fosforilasyonunu azaltarak DDR aktivitesini azalttığını ve bunun da H2AX dahil olmak üzere aşağı akış proteinlerinin fosforilasyonunu azalttığını (ancak tamamen ortadan kaldırmadığını) göstermek için yorumluyoruz. DDR uygun şekilde etkinleştirilmediğinde, DNA onarımı değişir, ancak yH2AX, onarılmamış DNA hasar bölgelerini işaretlediğinden yine de birikir. Bu nedenle, yaşlanan insan dokusunda ve organoidlerde gözlemlenen yH2AX seviyeleri, DDR aktivitesinin net sonucunu ve onarılmamış DNA miktarını yansıtır.

Muhtemelen DNA hasarına p53 yanıtının kaybından dolayı baz eksizyon onarımının kaybı nedeniyle yaşlanan dokuda DNA hasarı birikebilir (Cabelof ve diğerleri, 2006; Simon ve diğerleri, 2009, 2012). Deneylerimizde, p53'ü baskılayan GH'nin daha önceki bulgularıyla tutarlı olarak, kolon hücrelerinde ve npGH'yi ifade eden organoidlerde p53 azaldı (Chesnokova ve diğerleri, 2016). Buna karşılık, kansere dirençli ve daha uzun bir ömre sahip olan yaşlı GHR-/- fareleri (Basu ve diğerleri, 2018) ve ayrıca kolona özgü GHRcolKO fareleri, artan bir kolon p53 ekspresyonu sergiler, bu da muhtemelen DNA onarımını arttırır. GH, p53'ü baskıladığından (Chesnokova ve diğerleri, 2013), npGH indüksiyonu, yaşa bağlı azalmış p53 ile tutarlı olarak yerel mikro çevrede değişikliklere neden olabilir (Feng ve diğerleri, 2007; Goukassian ve diğerleri, 2000). GH promotörü, bir p53 bağlanma bölgesi içerir (Chesnokova ve diğerleri, 2013) ve DNA hasarına bağlı p53, GH ekspresyonunu aktive eder (Chesnokova ve diğerleri. 2013,2019a). Bu nedenle, sonuçlarımız yaşlı organoidlerde DNA hasarı birikiminin npGH'yi indüklediğini ve bunun da p53'ü aşağı regüle ettiğini göstermektedir.

Önemli olarak, npGH, DNA-hasarlı hücrelerden lokal olarak salgılandığından, komşu hücrelerde salgılanan GH için bir parakrin etkisi etkin olabilir. GH eksprese eden hNCF'yi Kolon Bağırsak Çipi ile birlikte kültürlerken, fibroblast türevli parakrin etkilerine maruz kalan çip gömülü epitel hücrelerinde artan DNA hasarı ve proliferasyonu ve p53/p21'i aşağı regüle ettiğini gözlemledik. Bu sonuçlar, insan dokusunda lokal uyarılmamış yaşlanmanın, tümör baskılayıcı proteinleri baskılayarak ve epitelyal proliferasyonu ve DNA hasarını artırarak doku mikro ortamını değiştirdiğini göstermektedir.

Sonuçlar, DJ-1 KO farelerinde eksojen GH tedavisinin proliferatif kapasiteyi, koloni oluşumunu ve metastazları artırdığına dair gözlemlerle (Chien ve diğerleri, 2016) ve insan tümör hücrelerinde GH indüksiyonunun aşağıdakilerle ilişkili olduğuna dair kanıtlarla tutarlıdır. birkaç kanserin ilerlemesi(Perry ve ark.,2017); bunlar, daha az koloni oluşumu ve GH bastırma ile daha küçük koloni boyutu gösteren sonuçlarımızla uyumludur.

DNA hasar onarım yolları, hücresel dönüşümü sağlayan kromozomal kararsızlığa karşı koruma sağlar (Negrini ve ark. 2010). Örneğin, Tip60 ATM'yi etkinleştirir (Jackson ve Bartek, 2009) ve DDR'nin merkezi düzenleyicisi olan ATM, p53'ü fosforile eder ve stabilize eder. Yaşlanan hücreler, azaltılmış ATM ve p53 baskılanmasının yanı sıra, daha sonra onarılmamış DNA hasarı ile birlikte DNA onarım düzensizliği sergiler (Lan ve diğerleri, 2019). Bu nedenle, kolon hücrelerinde DNA hasarı yaşla birlikte birikir (Risques ve diğerleri, 2008; Schu-macher ve diğerleri, 2008), en azından kısmen DDR etkinliğinin azalması nedeniyle (Jackson ve Bartek, 2009) ve p53'ü bastırır. Yaşlanan farelerde y-ışınlamasına verilen yanıt, p53-stabilize edici ATM'deki yaşa bağlı düşüşe bağlandı(Feng ve diğerleri, 2007). Deneylerimizde, DNA hasarına yanıt olarak indüklenmemiş olan Tip60'ı da baskıladı, bu da muhtemelen neden oldu sırasıyla zayıflatılmış ATM ve p53 fosforilasyonu ile kanıtlandığı gibi DNA onarımını azaltmak için. Bu sonuçlar, yerel npGH aşırı ifadesinin yaşa bağlı düzensiz DDR ve DNA onarımına katkıda bulunabileceğini düşündürmektedir. Yaşlanmış organoidlerde, GH indüksiyonu DDR'yi zayıflatırken, GH baskılaması DDR'yi aktive etti, bunun kanıtı, DNA hasarının azalmasıyla kanıtlandı. Bu sonuçlar, ANCC'de GH sinyalini bloke etmenin DNA hasarının azalmasına yol açtığına dair daha önceki gözlemlerimizle desteklenmektedir (Chesnokova ve diğerleri, 2019a). Ayrıca, eksize edilmiş GHR'li kolon hedefli GHRcolKO farelerinde kolon DNA hasarının birikmediğini, ancak GHR'nin sağlam olduğu ince bağırsakta biriktiğini gösterdik. Bu sonuçlar, yaşlı GHR-7-farelerin kolon DNA hasarını biriktirmediğini göstermemizle birlikte, yerel npGH indüksiyonunun agemayrender hücreleri ile transformasyona duyarlı olduğu ve belki de kanser tedavisi direncine katkıda bulunduğu hipotezi için in vivo destek sağlar. önerilmiştir (Basu ve Kopchick,2019).

Burada gösterilen sonuçlar ayrıca GH etkilerinin insülin benzeri büyüme faktörü 1 (IGF1) tarafından aracılık edilebileceği olasılığını da arttırmaktadır. GH'den farklı olarak, IGF1 sinyali, tümörlü olmayan ve tümörlü hücrelerde DNA onarımını aktive eder (Chesnokova ve Melmed, 2020; Chitnis ve diğerleri, 2014; Turney ve diğerleri, 2012) ve GH'nin p53'ü baskıladığını ve DNA'nın indüklendiğini gösterdik. normal kolon dokusunda IGF1'den bağımsız olarak hasar oluşur (Ches-nokova ve ark.,2019a, 2019b). Bununla birlikte, GH'nin IGF1'i aktive ettiği hücrelerde ve dokularda, ikinci büyüme faktörü, genom stabilitesi üzerindeki GH etkisini engellemek için hücreye özgü bir şekilde sinyal verebilir.

Bulgular, birikmiş DNA hasarına yanıt olarak yaşlanan kolon dokusunda indüklenen npGH'nin daha fazla DNA hasarını kolaylaştırdığını ve DNA hasar onarımının olumsuz bir belirleyicisi gibi göründüğünü göstermektedir. Bu bulguların ekstrapolasyonu, birkaç potansiyel klinik uygulama için bir platform sağlar. DNA hasarı birikimi yaşa bağlı hastalıkların ayırt edici özelliği olduğundan, otokrin/parakrin bloke etmek için GH sinyalini hedeflemek, yaşa bağlı epitelyal DNA hasarını engellemek ve nihayetinde yaşa bağlı epitelyal patolojilerin ilerlemesini iyileştirmek için hiçbir etki yararlı olmayabilir(Miman ve ark. ,2016) Böyle bir yaklaşım, otokrin/parakrin tarafından oluşturulan epitel alan değişikliklerinin normal komşu dokuya zarar vermediği, DNA'ya zarar veren tedaviler uygulanan kanser hastalarına da fayda sağlayabilir. Bu bağlamda, onaylanmış bir GHR antagonisti ile GH sinyalini bozmak (List ve diğerleri, 2011; Trainer ve diğerleri, 2000) klinik faydalar sağlayabilir. Önemli olarak, insan GH'si onaylanmamış bir yaşlanma karşıtı ve güç arttırıcı terapi olarak uygunsuz bir şekilde tanıtılmıştır (Giordano ve diğerleri, 2008; Holt ve Ho, 2019; Medeiros ve Siegel Watkins, 2018; Melmed, 2019). Burada bildirdiğimiz npGH'nin zararlı parakrin etkileri göz önüne alındığında, yaşlanma karşıtı bir iksir olarak uzun süreli uygunsuz GH uygulaması, GHR sinyalini ortaya çıkarabilir ve epitel hücre DNA hasarının gelişiminin yanı sıra gizli proliferatif lezyonların potansiyel aktivasyonunu riske atabilir.

Bu makale Cell Reports 37, 110068, 14 Aralık 2021, ª 2021 Yazar(lar)'dan alınmıştır. 1 Bu, CC BY-NC-ND lisansı kapsamında açık erişimli bir makaledir (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)