Mahanimbine, Geliştirilmiş Kolinerjik İletim ve Bastırılmış Oksidatif Stres, Amiloid Seviyeleri ve Nöroinflamasyon Yoluyla Farelerde Yaşlanmaya Bağlı Hafıza Eksikliklerini İyileştirdi Bölüm 2

2.6. Malondialdehit (MDA) ve Glutatyon (GSH) Düzeylerinin Değerlendirilmesi

Ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak beyin örneklerinde MDA ve GSH seviyeleri analiz edildi (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, ABD).

Bilim ve teknoloji ilerlemeye devam ettikçe bilim insanları hafıza, düşünme ve bilinç gibi insanın gizemli ve önemli psikolojik faaliyetlerinin gizemlerini ortaya çıkarmaya çalışıyor. Bunlar arasında beyin örneklerinin incelenmesi, hafıza ile beyin arasındaki ilişkiyi daha derinlemesine anlamamıza yardımcı olabileceği için büyük ilgi gören bir alan olarak kabul ediliyor.

Belleği güçlendirmek için ekleri bil'e tıklayın

Öncelikle beyin örneği nedir? Basitçe söylemek gerekirse, nöronları (beyin hücreleri) ve bunların beyindeki bağlantılarını yakalama, koruma ve analiz etme yöntemini ifade eder. Meslekten olmayanların ifadesiyle, farklı alanlar arasındaki bağlantıları ve işlevleri gösterebilen bir beyin haritası gibidir.

Şimdi beyin örnekleri ile hafıza arasındaki ilişkiden bahsedelim. Bilimsel araştırmalar hafızamızın beyin yapısıyla yakından ilişkili olduğunu göstermiştir. Yeni bilgiler öğrendiğimizde beyinde yeni nöronal bağlantılar oluşur ve bu bağlantılar zamanla güçlenir. Bilim insanları, beyin örnekleri üzerinde çalışarak bu beyin bağlantılarını incelemek ve bunlar aracılığıyla öğrenmeyi ve hafızayı nasıl geliştirebileceklerini anlamaya çalışıyorlar.

Ayrıca beyin örneklerinin analizi yoluyla bilim insanları bazı ilginç şeyler de bulabilirler. Örneğin insan beynindeki hipokampusun hafızayla yakından ilişkili bir alan olduğunu buldular. Bunun nedeni hipokampusun insan beyninde bilgiyi kısa süreli hafızadan uzun süreli hafızaya dönüştürme konusunda önemli bir fonksiyona sahip olmasıdır.

Bu nedenle, beyin örneği araştırmasının değeri yalnızca beyin ve hafıza arasındaki ilişkiyi daha iyi anlamamıza yardımcı olması değil, aynı zamanda hafıza bozukluklarının veya bilişsel hastalıkların temel nedenlerini keşfetmemize yardımcı olması ve böylece ilgili hastalıkların tedavisini ve önlenmesini teşvik etmesidir.

Son olarak, beyin örneği araştırmalarının hafıza üzerindeki yardımına olumlu bakmalıyız. Hala çözülmesi gereken birçok bilimsel problem olmasına rağmen, bilim ve teknolojinin sürekli gelişmesiyle birlikte gelecekte daha fazla atılımların olacağına inanıyoruz. Geleceğe birlikte bakalım ve bilimsel araştırmalarla beynimizi daha akıllı hale getirmeyi sabırsızlıkla bekleyelim! Belleği geliştirmemiz gerektiği görülebilir. Cistanche hafızayı önemli ölçüde geliştirebilir çünkü Cistanche'nin antioksidan, anti-inflamatuar ve anti-aging etkileri vardır, bu da beyindeki oksidatif ve inflamatuar reaksiyonları azaltmaya yardımcı olabilir, böylece sinir sisteminin sağlığını korur. Ek olarak Cistanche, sinir hücrelerinin büyümesini ve onarımını da destekleyerek sinir ağlarının bağlantısını ve işlevini geliştirebilir. Bu etkiler hafızayı, öğrenme yeteneğini ve düşünme hızını geliştirmeye yardımcı olabilir ve ayrıca bilişsel işlev bozukluklarının ve nörodejeneratif hastalıkların ortaya çıkmasını önleyebilir.

MDA ve GSH seviyeleri sırasıyla nanomol/miligram protein ve mikromol/miligram protein cinsinden ölçüldü. Beyin dokularındaki protein içeriğini tahmin etmek için Bradford tekniği izlendi.

2.7. Asetilkolin (ACh) ve Asetilkolinesteraz (AChE) Aktivitelerinin Tahmini

Beyin homojenatındaki ACh ve AChE seviyeleri, sırasıyla EnzyChromTM Asetilkolin Tahlili kiti ve QuantiChromTM Asetilkolinesteraz Tahlili kiti olan ticari kitler (BioAssay System, Hayward, CA, ABD) kullanılarak analiz edildi.

Renk oluşumunun yoğunluğu bir mikroplaka okuyucusunda sırasıyla 570 ve 412 nm'de tespit edildi. Elde edilen ACh seviyesi µM olarak, AChE aktivitesi ise U/L olarak ifade edildi.

2.8. -Amiloid Düzeylerinin Ölçümü

Beyin homojenatlarındaki A 1-40 ve A 1-42 seviyelerini değerlendirmek için Cloud Clone Corp'tan (Katy, TX, ABD) ELISA kitleri kullanıldı. Renk oluşumunu ölçmek için 450 nm'ye ayarlanmış bir mikroplaka okuyucu kullanıldı.

Örnekteki A 1-40 ve A 1-42 konsantrasyonu, renk yoğunluğuyla ters orantılıydı. Sonuçlar pg/mLof toplam protein cinsinden ifade edildi.

2.9. Fare Beyninde -Secretaz (BACE-1) Aktivitesinin Değerlendirilmesi

Homojenattaki BACE-1 aktivitesi ticarileştirilmiş bir kit (SensoLyte® -Secretase Assay Kit, AnaSpec, Fremont, CA, ABD'den) kullanılarak ölçüldü. Kitin saptanması, BACE-1 tarafından parçalanan bir peptit temel alınarak yapılır ve sinyal, 490/520 nm'de uyarım/emisyonlu aspektrofotometre kullanılarak saptanır.

2.10. Toplam Siklooksijenaz (COX) Aktivitesinin Ölçümü

Beyin homojenatındaki toplam COX'in aktivitesi bir ELISA kiti (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, ABD) kullanılarak tahmin edildi. Renk oluşumu toplam COX aktivitesiyle doğru orantılıydı. 590 nm'de absorbansı okumak için bir mikroplaka okuyucu kullanıldı.

2.11. BACE-1 ve COX-2'in Gen İfadesi

İzole edilmiş beyin RNA'sındaki BACE-1 ve COX-2'nin ifadesi RT-PCR kullanılarak analiz edildi. İlgili üç ana adım şunlardı: RNA ekstraksiyonu, RNA'nın tocDNA'ya dönüştürülmesi ve gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR).

Tüm adımlar Qiagen Valencia, CA, ABD tarafından sağlanan kitleri içeriyordu. İlk olarak, RNA'da saklanan beyin örneğinden RNA ekstrakte edildi. Bu adımda, yaklaşık 100 mg beyin dokusu örneği, 1 mL QIAzol lizis reaktifinde TissueRuptor kullanılarak yıkanır ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir.

Beyin lizatı ve QIAzol lizis reaktifi karışımına kloroform eklendi ve 15 saniye kuvvetli bir şekilde çalkalandı, ardından oda sıcaklığında 2-3 dakika inkübasyon yapıldı.

Karışım 12,000x g'de 15 dakika boyunca 4 ◦C'de santrifüj edildi ve üç faz, RNA'dan oluşan renksiz bir faz (üst faz) oluşturdu ve üzerine 1 hacim %70 etanol eklenerek toplandı. BT.

Daha sonra numunenin 700 µL'si bir döndürme kolonuna aktarıldı ve oda sıcaklığında 8000 x g'de 15 saniye süreyle santrifüj edildi; akış atıldı. 700 µL tampon RW1 (kit içerisinde temin edilmiştir) eklenmesi ve 15 saniye boyunca 8000xg’de santrifüj edilmesinin ardından akış atlanmıştır. 500 µL tampon RPE (kit içerisinde temin edilmiştir) ilavesi ile adıma devam edilmiştir. ve 8000× g'de 15 saniye boyunca santrifüjleme.

Bu adım, RNA'daki herhangi bir organik kontaminasyonu temizlemek için iki kez tekrarlandı. Son olarak RNA, 50 µL RNAse içermeyen su eklenerek elüte edildi ve 8000 x g'de 1 dakika santrifüj edildi.

RNA konsantrasyonu, ananodrop (nanodrop 2000c, Thermofisher Scientific, Waltham, MA, ABD) kullanılarak ölçüldü. Çıkarılan RNA daha sonra RT-PCR gerçekleştirmek için kullanılan cDNA'ya dönüştürüldü.

İlk olarak, 6 µL ters transkripsiyon ana karışımına (1 µL Quantiscript ters transkriptaz, 4 µL Quantiscript RT tamponu, 1 µL RT primer karışımı) 14 µLof şablon RNA eklendi. Karıştırma sonrasında 15 dakika 42 ◦C'de inkübe edildi, ardından Quantiscript ters transkriptazı inaktive etmek için 95 ◦C'de 3 dakika inkübe edildi.

Oluşan ürün cDNA oldu ve son olarak RT-PCR gerçekleştirildi. RT-PCR koşulları 5 dakika boyunca 95 ◦C olarak sabitlendi, ardından 10 dakika boyunca 95 ◦C'de ve 30 dakika boyunca 60 ◦C'de 40 döngü yapıldı.

BACE-1 ve COX-2 genlerinin ifadesi ölçüldü ve iki temizlik genine ( -actin ve GAPDH) göre normalleştirildi. Nükleotid dizilerinin primerleri fare BACE-1 (ön50-GCATGATCATTGGTGGTATC-30: ters 50-CCATCTTGAGATCTTGAC-CA-30) ​​ve COX-2'ye dayanıyordu. (ileri 50-GTGTGCGACATACTCAAGCAGGA) cDNA dizileri. -30: ters 50-TGAAGTGGTAACCGCTCAGGTG-30), GAPDH (ileri 50-TGACAGGATGCAGAAGGAGA-30: ters 50-GCTGGAAGGTGGACAGTGAG-30) ve -aktin (ileri 50-TGACAGGATGCAGAAGGAGA-30: ters 50-GCTGGAAGGTGGACAGTGAG-30).

Floresans ölçümleri elde edildi ve bunları değerlendirmek için Rotor-Gene 6000 yazılımı kullanıldı (Qiagen, Hilden, Almanya).

Sonuçlar, karşılaştırmalı CT (eşik döngüsü) yaklaşımı kullanılarak B-aktin ve GAPDH olan temizlik genine normalleştirmeyi takiben ekspresyon seviyeleri olarak sunuldu. Numunenin gen ifadesini hesaplamak için denklem (1) kullanıldı.

Her örneğin CT değeri, her gen (hedef gen ve referans gen) için oluşturulan standart eğriye dayalı olarak elde edildi.

∆∆CT=∆CT örneği − ∆CT kontrolü (1)

Neresi

∆CT örneği: Hedef genin CT değeri − Referans genin CT değeri

∆CT kontrolü: Hedef genin CT değeri − Referans genin CT değeri

2.12. İstatistiksel Analiz

Deneysel veriler ortalama ± SEM olarak sunuldu. İstatistiksel varyasyonları kategorize etmek için tek yönlü ANOVA prosedürü (Graph Pad versiyon 9, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, ABD) ve Tukey – Kramerpost hoc testi kullanıldı. Anlamlı, 0,05'lik olasılık değeri olarak tanımlandı.

3. Sonuçlar

3.1. Yaşlı Farelerde Mahanimbine İle Geliştirilmiş Bellek

Fare modelinde mahanimbinin uzaysal öğrenme ve hafıza yeteneği MWM testi kullanılarak incelendi. Kaçış gecikmesi (EL), kaçış mesafesi (ED) ve hedef çeyrekte geçirilen süre ölçüldü.

Ayrıca, farelerin ortalama yüzme hızına dayalı olarak lokomotor aktivitesi de dikkate alındı. Şekil 2A, yaşlı kontrol grubunun 1. günden 3. güne kadar belirgin şekilde daha uzun EL'ye sahip olduğunu göstermektedir (22.05 ± 1.70 s, 21,35 ± 1,85 s, 19,96 ± 2,34 s; p < 0,001; sırasıyla) genç kontrolle karşılaştırıldığında (sırasıyla 12,75 ± 1,30, 10,12 ± 0,98, 7,60 ± 1,31).

MWM testinde yaşlı farelerin öğrenme ve hafıza fonksiyonlarında önemli bir eksiklik oluşturduğu ortaya çıktı. Bununla birlikte, farklı dozajlarda (1 ve 2 mg/kg) mahanimibin ile yapılan oral tedavi, yaşlı farelerin EL'sinde yukarıda belirtilen değişikliklerin tersine döndüğünü gösterdi.

1 mg/kg mahanimbin grubunun EL değerleri 22,01 ± 1,60 s, 15,88 ± 1,54 s (p < 0.01) ve8 idi. 1, 2 ve 3. günler için 0,26 ± 0,93 s (p < 0.001), buna karşılık olarak yaşlı kontrol ile karşılaştırıldığında, EL 2 mg/kg mahanimbin grubu için değerler 16.09 ± 0,33 s(p < 0,05), 17,14 ± 0,57 s (p < 0,05), 10,57 ± 0,86 s (p <) idi. 0,01), eski kontrole paralel olduğunda sırasıyla. 3. günde, her iki grubun (1 ve 2 mg/kg) mahanimibin EL'si genç kontrolden önemli ölçüde farklı değildi.

Şekil 2. Mahanimibin'in (A) kaçış gecikmesi, gizli platformu bulmak için geçen süre üzerindeki etkisi. (B) Kaçış mesafesi, başlangıç ​​noktasından gizli platformu bulana kadar kat edilen mesafe; (C) ortalama hız, gizli platformu bulmak için hayvanın yüzme hızı; (D) prob testi, Morris su labirenti testi kullanılarak yaşlı farelerin hedef kadranda harcanan zamanın yüzdesi. Yaşlı farelerde mahanimbin ile kaçış gecikmesi ve kaçış mesafesinde önemli iyileşmeler oldu.

Ek olarak tedavi, yaşlı farelerin hedef çeyreğinde geçirilen süreyi arttırdı. Tüm veriler ortalama ± SEM (n {{0}}) olarak ifade edildi. Tek yönlü ANOVA (1. gün: F(3,20)=11.74, p < 0.001, 2. gün: F(3,20)=17.38,p < 0.001 ve 3. gün: F(3,2{{69) }})=14.88, p < 0.001, kaçış gecikmesi için; 1. gün: F(3,20) {{ 26}}.22, p < 0.001, 2. gün: F(3,20)=28.62, p < 0,001 ve 3. gün: F(3,20) {{40 }}.15, kaçış mesafesi için p < 0.001; gün 1:F(3,20)=1.939, p > 0.05, gün 2: F(3,20)=3.467, p > 0,05 ve 3. gün: Ortalama hız için F(3,20)=2.497, p > 0.05; prob testi için F(3,20)=7.185, p < 0.01 ve ardından Tukey–Kramer çoklu karşılaştırma testi.** Genç kontrolle karşılaştırıldığında ** p < 0,01 ve *** p < 0,001, yaşlı kontrolle karşılaştırıldığında # p < 0,05, ## p < 0,01 ve ### p < 0,001.

Şekil 2B, mahanimibin'in başlangıç ​​noktasından gizli platformu bulana kadar kat edilen mesafe üzerindeki etkisini göstermektedir. Yaşlı kontrol grubu gizli platformu bulmadan önce 1, 2 ve 3. günlerde en uzun mesafeyi kat etti (4,79 ± 0,73 m,4,34 ± {{10}},11 m ve 4,38) ± 0,59 m; p < {{20}}.001; sırasıyla) genç kontrolle ilgili olduğunda (1,36 ± 0,31 m, 1,35 ± 0,24 m ve 0,78 ± 0,14 m;

1 mg/kg mahanimbin ile beslenen yaşlı fareler ED'yi önemli ölçüde azalttı (2,17 ± 0,11 m (p < 0.01),2,10 ± { {13}},24 m (p < 0.001), 0,89 ± 0,18 (sırasıyla p < 0,001); yaşlı kontrolle eşleştirilmiş 1. günden 3. güne kadar.

1., 2. ve 3. günlerde 2 mg/kg mahanimibin uygulanan farelerde ED'de önemli bir paralel düşüş gözlendi (2,43 ± 0,28 (p < 0.01) , 2,78 ± 0,32(p < 0.001), 1,47 ± 0,30 (sırasıyla p < 0,001);

Görev sırasındaki ortalama yüzme hızlarına ilişkin olarak gruplar arasında herhangi bir fark gözlenmedi(Şekil 2C). Bu, mahanimibinin yaşlı farelerde motor fonksiyonla ilişkili herhangi bir lokomotor aktiviteyi değiştirmediğini gösterir.

Asıl görevden 24 saat sonra, hayvanların hafızada tutulmasını değerlendirmek için bir araştırma testi oturumu (3. gün0) gerçekleştirildi. Yaşlı kontrol grubu (Şekil 2D) hedef çeyrekte daha az zaman harcadı (10.10 ± %1,14 (p < 0,001)) ve hedef çeyrekte geçirilen sürenin önemli ölçüde azaldığını gösterdi. genç kontrol (%19,53 ± 2,56), oysa oral gavaj yoluyla 1 mg/kg (%20,27 ± 4,84, p < 0,01) ve 2 mg/kg (%17,85 ± 1,56, p < 0,05) mahanimbin ile tedavi edilen yaşlı fareler, önemli ölçüde hedeflenen çeyrekte yaşlı kontrole kıyasla daha uzun süre harcandı.

3.2. Yaşlı Fare Beyninde Mahanimbinin MDA ve GSH Düzeyleri Üzerine Etkisi

Yaşlı kontroldeki (Şekil 3A) MDA seviyeleri, genç kontrole (4,37 ± 0,09) göre oldukça yüksekti (11,54 ± 0,88 µM;p < 0.001). uM). Yaşlı farelerin beyin homojenatındaki MDA seviyesindeki artış, daha yüksek bir LPO aktivitesini yansıtıyordu; bu da beyin dokusunda oksidatif streste bir artışa işaret ediyordu.

Tersine, mahanimbinin (1 mg/kg, po) uygulanması yaşlı farelerde beyin MDA düzeylerini önemli ölçüde azalttı (7,56 ± 0,35 µM;p < 0.001) yaşlı kontrolüne. 2 mg/kg mahanimbin (9,65 ± 0,51 µM) ile önemli bir değişiklik kaydedilmedi.

Beyin homojenatındaki glutatyon (GSH) miktarı mahanimbinin antioksidan potansiyelini akla getiriyordu. GSH'nin istatistiksel analizi (Şekil 3B), yaşlı kontrol grubu (0.0028 ± 0.0004 µmol/) arasında önemli bir zayıflama gösterdi. mg; p < 0,001) genç kontrolle ilişkilendirildiğinde (0,0447 ± 0,0029 µmol/mg).

Mevcut çalışma aynı zamanda mahanimibin (1 ve 2 mg/kg, po) tedavisinin GSH seviyesini tersine çevirdiğini ve bu seviyenin önemli ölçüde daha yüksek olduğunu (0.0372 ± 0.{{8}) bulmuştur. {{10}}38 µmol/mg, p < 0,001 ve 0,0282 ± 0,0041 µmol/mg,p < 0,001); yaşlı kontrolle eşleştirilmiştir.

3.3. Mahanimbine Yaşlı Fare Beynindeki Kolinerjik Aktiviteyi İyileştirdi

Şekil 4A fare beynindeki ACh seviyelerini göstermektedir. ACh, genç kontrolle (34,82 ± 0) eşleştiğinde yaşlı kontrolde (17,79 ± 1,54 µM) nispeten azaldı (p < 0.001). 31 uM). Ancak mahanimbinin (1 ve 2 mg/kg) uygulanması önemli ölçüde arttı (35,61 ± 0,85 µM, (p < 0,001); 39,42 ± 0,88 µM (p < 0,001); sırasıyla) yaşlı kontrolle ilişkili olarak beyindeki ACh düzeyi.

Şekil 4B, mahanimibin'in beyindeki ACHE aktivitesine karşı etkisini temsil etmektedir. Yaşlı kontrol grubundaki AChE aktivitesi (204,80 ±1,55 U/L), genç kontrole (51,06 ± 1,36 U/L) paralel olarak önemli ölçüde yüksekti (p < 0,001).

Bununla birlikte, AChE düzeyinin 1 mg/kg (62.03 ± 4.64 U/L; p < 0.001) ve 2 mg/kg (43.73 ± 4.76 U) tedavisiyle anlamlı şekilde inhibe edildiği /L; p < 0,001) yaşlı kontrolle ilişkilendirildiğinde mahanimbin. Genel olarak, yüksek dozda mahanimbinin (2 mg/kg, po) uygulanması, ACh seviyesini arttırdığı ve AChE aktivitesini baskıladığı için kolinerjik aktivite açısından daha iyi sonuçlar üretti.

For more information:1950477648nn@gmail.com